DD299213A7 - Verfahren zur stabilisierung eines lebendvirusimpfstoffes gegen temperatureinwirkung - Google Patents
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Abstract
Es wird ein Verfahren zur Stabilisierung von Lebendvirusimpfstoff gegen Temperatureinwirkung beschrieben. Die Stabilisierung erfolgt durch Zusatz eines Stabilisatorgemisches, das aus Aminosaeuren, einer Polyhydroxyverbindung und einem Polysaccharid besteht und durch Wahl einer geeigneten Lyophilisationsbedingung.{Lebendvirusimpfstoff; Stabilisator; Aminosaeure; Polyhydroxyverbindung; Polysaccharid; Lyophilisation}
Description
Das Stabilisatorgemisch wird zusammengesetzt aus: 10ml 0,5mol/1 L-Arginin-Hydrochlorid (eingestellt auf pH 7,0), 1,05ml 40% Saccharose, 10,5ml Infukcll-Infusionslösung 6% (Dextran ,,7OkD"). Diese Mischung wird sterilfiltriert und 18ml werden mit 12 ml masernvirushaltigem Zellkulturüberstand vereint. Jeweils 0,5 ml dieser Vakzine werden in Rollrandfläschchen gefüllt (Einerdosis) und anschließend bei -20°C eingefroren. Die Lyophilisation wird 48 Stunden bei 220C ausgeruht. Die Hälfte der so hergestellten lyophilisierten Masernvakzine wird 7 Tage bei 370C inkubie;' und bis zur Virusgehaltsbestimmung durch ein· Plaquezählverfahren bei -20°C aufbowahrt. Virustiter vor der Temperaturbehandlung 10*-'° PBE/ml, Virustiter nach der Temperaturbehandlung 104lM PBE/ml, logarithmische Titerdifferenz: 0,81.
10ml 0,5mol/l L-Arginin-Hydrochlorid (pH 7,0); 6,3ml Infukoll 40 (Dextran ,,4OkD"); 1.05ml 44,2%Trehalose · 2 H2O; 4ml5,25mol/l Phosphat-Puffer (pH 7,0). Die Fertigung der Impfstoffdosis erfolgte nach Beispiel 1. Die logarithmische Titerdifferenznach der Temperaturbehandlung betrug 0,85 Einheiten.
Boisplel 3
10ml 0,5mol/l L-Arginin-Hydrochlorid (pH7,0); 6,3ml Infukoll 40 (Dextran ,,4OkD"); 1,05ml 40%Sorbit; 4ml 5,25ml/l Phosphat-Puffer (pH 7,0). Die Fertigung der Impfstoffbasis erfolgte nach Beispiel 1. Die logarithmische Titerdifferenz nach der Temperaturbehandlung betrug 0,92 Einheiten.
Claims (4)
1. Verfahren zur Stabilisierung eines Lebendvirusimpfstoffes gegenüber Temperatureinwirkung unter Verwendung eines Stabilisatorgemisches auf Basis von Aminosäuren, Polyhydroxyverbindungen und Polysacchariden, gekennzeichnet dadurch, daß der virushaltige Zellkuiturüberstand nach der Virusernte mit einem Gemisch aus L-Arginin, Saccharose, Sorbit oder Trehalose und Dextran eines Molekulargewichtes von 40 bis 7OkD im Masseverhältnis 5:2:3 versetzt wird und nach der Lyophilisation höchstens eine Restfeuchte von 0,4Ma.-% aufweist.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß die Masse des Stabilisators pro Einerimpfdosis zwischen 20 und 40 mg liegt.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß virushaltiges Zellkulturmedium und Stabilisatorgemisch im Volumenverhältnis 2:3 gemischt werden.
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Stabilisierung eines Lebendvirusir.lpfstoffes gegenüber Temperatureinwirkung. Das Verfahren ist in der Impfstoffproduktion auch zur Herstellung von Masernlebendvirusimpfstoff anwendbar.
Charakteristik des bekannten Standes der Technik
Wäßrige Lösungen von Lebendvirusvakzinen sind als unstabil bekannt. Die übliche Technologie, um die Instabilität zu vermindern, ist das Entfernen des Wassers durch Lyophilisation. Aber auch in getrocknetem Zustand verliert diese Vakzine beim Lagern einen Teil ihrer Infektiosität. Die Geschwindigkeit dieses Infektiositätsverlustes ist um so höher, je höher die Lager- und Handhabungstemperatur ist. Es ist deshalb wichtig, ein Maximum an Stabilität für die Vakzine durch die Wahl eines optimalen Milieus für das Virus zu erroichen. Als chemische Komponenten dieses Milieus sind eine Vielzahl von chemischen Verbindungen bekannt. Keine dieser Verbindungen allein oder deren bisher verwendete Mischungen führte zur Herstellung einer Masernvakzine, deren Virusgehalt nach thermischer Belastung 7 Tage bei 370C weniger als eine logarithmische Titerstufe abfällt, wie es die WHO für diesen Impfstoff fordert.
In Ullmann
4. Auflage, Bd. 21, S. 303 ist die Verwendbarkeit von Aminosäuren als Stabilisatorsubstanz für Virus-Impfstoffe erwähnt. Außerdem ist in Mayr/Bachmann/Bibrack/Wittmann: „Virologische Arbeitsmethoden", Bd. 2, Jena, 1977, S. 138 dia Verwendung von oligomeren und monomeren Polyhydroxyverbindungen sowie Aminosäuren als Stabilisatoren von Viruspräparaten beschrieben. Diese Verfahren werden jedoch nicht den Anforderungen der WHO bezüglich der Thermostabilität des Lebendvirusimpfstoffes" gerecht.
Ziel der Erfindung
Ziel der Erfindung ist es daher, ein Verfahren zur Stabilisierung zu entwickeln, um z. B. der WHO-Fordorung für den Masernimpfstoff zu genügen.
Darlegung des Weses der Erfindung '
Es wurde überraschenderweise gefunden, daß die Thermostabilität von Virusimpfstoffen in Lösungen von Aminosäuren, Polyhydroxyverbindungen und Polysacchariden beträchtlich zunimmt.
Als Impfvirus wurde z. B. der Masernvirusstamm L16/SSW verwendet. Das virushaltige Zellkulturmedium, eingestellt auf 103 bis 10° plaquebildende Einheiten/ml, wird mit einem sterilfiltrierten Stabilisatorgemisch im Verhältnis 2:3 Volumenteilen gemischt. Das Stabilisatorgemisch enthält die Aminosäure L-Arginin (z. B. als Hydrochlorid), die Polyhydroxyverbindung Saccharose, Sorbit oder Trehalose und das Polysaccharid Dextran mit einem mittleren Molekulargewicht von 8 kD bis 14OkD, vorzugsweise 40~70kD, im Masseverhältnis 5:2:3. Die Masse des Stabilisatorgemisches pro Einerimpfdosis ist zu 20 bis 40mg festgelegt. Die Mischung von Virus und StabiÜsator wird unter sterilen Bedingungen wahlweise zu Einer- (0,5ml) oder Zehnerimpfstoffdosen (5 ml) abgefüllt und anschließend eingefroren. In der letzten Stufe der Impfstoffherstellung wird das Wasser in der Vakzine durch Lyophilisation entfernt. Die Bedingungen der Lyophilisation müssen so gewählt werden, daß der gefriergetrocknete Impfstoff eine Restfeuchte, gemessen mit der Methode der WHO, von nicht mehr als 0,4% aufweist. Das erfindungsgemäße Verfahren führt durch Zugabe von 50% der Aminosäurekomponente und in reiner Form überraschend zum Erfolg. Der Lebendvirusimpfstoff weist durch das erfindungsgemäße Verfahren nach einer Temperaturbehandlung von 7 Tagen bei 37"C nur einen Abfall des Virustiters von weniger als eine logarithmische Titerstufe auf, was den WhO-Anforderungen entspricht. Der Masernimpfstoff kann einzeln verabreicht werden oder in Kombination mit anderen Virusimpfstoffen (z.B. Mumps- und/oder Rötelnimpfstoff) Anwendung finden. Durch die höhere Thermostabilität bedingt, ist eine Anwendung des Impfstoffs nicht nur in der gemäßigten, sondern auch in der subtiopiachen und tropischen Klimazone möglich.
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