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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein
Verfahren zum Stabilisieren einer wässerigen
Zusammensetzüng, welche einen oder mehrere Antikörper enthält.
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Antikörper werden heutzutage oft in der Human-
und Veterinärmedizin für prophylaktische, diagnostische
oder therapeutische Zwecke verwendet; antivirale oder
antibakterielle Antikörper werden in der
(prophylaktischen) Behandlung von Infektionskrankheiten verwendet,
Antigonadotrophine werden oft verwendet, um Hormonspiegel
zu regulieren, und Antikörper gegen Tumor-Antigene, um
Tumoren zu lokalisieren und zu bekämpfen.
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Es besteht daher ein grosser Bedarf für stabile
wässerige Präparate, welche Antikörper enthalten und
welche direkt in Menschen oder Tiere injiziert werden können
ohne weitere Verarbeitungen oder Behandlungen.
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Die grundlegende Schwierigkeit besteht jedoch
darin, dass wässerige Zusammensetzungen von Antikörpern
in der Praxis als besonders unstabil befunden werden und
sogar nach sehr kurzer Zeit keine oder praktisch keine
Antikörperaktivität mehr aufweisen.
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Ein naheliegender Versuch, diese Schwierigkeit
zu lösen, könnte darin bestehen, die betreffende
Zusammensetzung gefrierzutrocknen.
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Beispielsweisee offenbart WO 84/00890 ein
lyophilisiertes Gamma-Globulin-Konzentrat, in welches vor
der Lyophilisierung ein Macromolekül eingeschlossen wurde.
Während der trockenen Lagerung sind die resultierenden
trockenen Zusammensetzungen stabil und weisen eine
niedere Antikomplement-Aktivität auf, wiederum ohne
Verwendung von grossen Mengen an irgendeinem Stabilisator. Vor
dem Gebrauch wird das lyophilisierte Konzentrat in
sterilem Wasser wieder aufbereitet, um eine
Proteinkonzentration für intravenöse Injektion an einem Patienten zu
ergeben. Diese Veröffentlichung offenbart jedoch nicht,
dass Dextran wirkt, um monoclonale Antikörper in
wässerigen Zusammensetzungen zu stabilisieren.
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EP-A-173648 offenbar pharmazeutische Präparate,
welche monoclonale Antikörper für parenterale
Verabreichung enthalten, wie isotonische wässerige Lösungen,
welche gewisse nicht-identifizierte Adjuvantien, wie
Stabilisatoren und Verbindungen, welche die Viskosität
des Präparates regulieren, wie Dextran, wie auch gut
bekannte rheologische Modifiziermittel enthalten. Wie
WO 84/00890 erwähnt dieses Gesuch jedoch nicht, dass
Dextran das Instabilitätsproblem monoclonalrer Antikörper
in wässerigen Zusammensetzungen lösen kann, noch schlägt
es dies vor.
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Es wurde jedoch gefunden, dass selbst die
Gefriertrocknung der Zusammensetzung das so sehr
erwünschte Resultat nicht zu erreichen vermag. Eine
irreversible Dimerisierung der betreffenden Antikörper
während des Gefriertrocknungsverfahrens wurde als häufig
auftretende Nebenreaktion festgestellt, so dass selbst
gefriergetrocknete Zusammensetzungen einen beträchtlichen
Verlust der Aktivität erleiden. Ausserdem bewirken Dimere
oder höhere Oligomere anaphylaktische Reaktionen beim
Menschen, welche selbstverständlich unerwünscht sind.
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Es wurde daher nach Substanzen geforscht,
welche, wenn sie der wässerigen Zusammensetzung der
Antikörper zugesetzt werden, sicherstellen, dass die biologische
Aktivität und die physikalische Qualität der Antikörper
praktisch konstant bleiben über eine lange Zeit.
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Während diesen Untersuchungen wurde eine grosse
Anzahl Substanzen untersucht, doch keine der Substanzen
erbrachte die gewünschte Stabilität der betreffenden
Antikörper in genügendem Mass.
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Es wurde nun gefunden, dass eine wässerige
Zusammensetzung von einem oder mehreren Antikörpern über
eine lang Zeitdauer stabil bleibt, wenn Dextran zu der
wässerigen Zusammensetzung zugesetzt wird.
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Der Ausdruck Dextran umfasst eine Gruppe von
wasserlöslichen Polysacchariden, welche ein mittleres
Molekulargewicht zwischen etwa 20'000 und etwa 150'000
aufweisen, wie z.B. im Merck Index, 10. Auflage, No. 2911,
beschrieben. Sehr geeignete Vertreter innerhalb des
Geltungsbereiches der vorliegenden Erfindung sind Dextrane
mit dem verhältnismässig niederen Molekulargewicht von
etwa 20'000 bis 75'000, wie Dextran 40, welches ein
mittleres Molekulargewicht von 40'000 aufweist, und Dextran
70 (Molekulargewicht 70'000).
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Die Antikörper, welche gemäss der vorliegenden
Erfindung stabilisiert werden, können z.B. als Antiserum
(polyclonale Antikörper) erhalten werden oder können durch
immortalisierte B-Lyphocyten erzeugt werden, z.B. nach der
von Köhler und Milstein, Nature 256, 495 (1975)
beschriebenen Methode, welche zu monoclonalen Antikörpern führt,
oder sie können aus Triomas oder Quadromas erhalten werden,
wobei bivalente monoclonale Antikörper entstehen.
Monoclonale Antikörper , welche mittels rekombinanter DNA-
Techniken erhalten werden, sind ebenfalls ausdrücklich
eingeschlossen.
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Die betreffenden Antikörper und bevorzugterweise
die monoclonalen Antikörper können gegen jedes Antigen
oder Hapten gerichtet sein. Bevorzugte Antikörper zur
Verwendung in der vorliegenden Erfindung sind gegen
Hormone und insbesondere gegen Gonadotropine gerichtet,
wie Anti-menschliches chorionisches Gonadotropin (Anti-
hCG), Anti-follikel stimulierende Hormone (Anti-FSH),
Anti-luteninisierende Hormone (Anti-LH), Anti-trächtiges
Stutenserum-Gonadotropin (Anti-PMSG), Anti-menschliches
menopausales Gonadotropin (Anti-HMG).
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Die üblichen Konzentrationen, in welchen die
Antikörper verwendet werden, können zwischen 0,1 und
etwa 1,5 mg pro ml wässeriger Zusammensetzung und
insbesondere zwischen 0,5 und 2,5 mg/ml variieren. Die üblichste
Konzentration liegt jedoch zwischen 1 und 1,5 mg pro ml
(der gesamten Zusammensetzung).
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Im allgemeinen wird eine Menge an Dextran
verwendet, welche von 0,3 bis etwa 5 Gewichtsteilen Dextran
pro Gewichtsteil Antikörper variieren kann, wobei 1 bis 2
Gewichtsteile Dextran pro 1 Gewichtsteil Antikörper als
das Idealste betrachtet wird.
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In einem absoluten Sinn kann die Menge an
Dextran, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet wird,
zwischen etwa 0,05 und 20 mg/ml wässerige Zusammensetzung
und insbesondere zwischen 0,5 und 5 mg pro ml wässerige
Zusammensetzung variieren. Eine Menge an Dextran von etwa
1 bis 2 mg/ml wird als äusserst geeignet zur
Stabilisierung einer wässerigen Zusammensetzung von 1 bis 1,5 mg
Antikörper betrachtet. Im allgemeinen wird Dextran nicht
in solcher Menge verwendet, welche notwendig ist, um die
Viskosität der wässerigen Zusammensetzung merklich zu
verändern.
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Die wässerige Antikörperzusammensetzung, welche
für Injektionszwecke geeignet ist, kann zusätzlich zu den
Bestandteilen (Antikörper und Dextran), welche bereits
erwähnt wurden,auch andere Bestandteile enthalten, wie:
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- Mittel, um die Zusammensetzung isotonisch zu
gestalten, z.B. NaCl, Sorbit, Mannit, in einer geeigneten
Konzentration;
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- Mittel zur Einstellung des pH der
Zusammensetzung auf ein pH zwischen 5,0 und 9,0 und insbesondere
zwischen 7,0 und 8,5;
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- Konservierungsmittel, wie Benzylalkohol;
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- bakterizide Substanzen, wie die Parabene;
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- biologisch aktive Substanzen, wie
entzündungshemmende Substanzen und/oder Anästhetika.
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Die stabilisierte wässerige Zusammensetzung von
z.B. monoclonalen Antigonadotrophinen wird auf übliche
Weise hergestellt durch Einführung der betreffenden
Antigonadotrophine, Dextran und aller anderen Bestandteile in
sterilisiertes Wasser.
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Die Erfindung wird in mehr Einzelheiten auf der
Basis des folgenden Versuches erklärt.
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Eine Lösung von 1 mg pro ml monoclonalem
AntihCG (Maus) in Wasser wurde hergestellt, und eine gewisse
Menge der auf ihre stabilisierenden Eigenschaften zu
prüfenden Substanz wurde zugesetzt. Jede Lösung wurde während
einem Monat bei 4ºC, bzw. 20ºC und 40ºC gehalten und
anschliessend auf die drei folgenden Faktoren untersucht:
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(1) die Gegenwart von Oligomeren und
insbesondere von Dimeren,
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(2) Zersetzung des Anti-hCG und
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(3) physikalische Instabilität, insbesondere
das Auftreten von Opaleszenz und Partikelbildung.
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Im Fall einer positiven Einschätzung (nach
Lagerung während dieses Monates) aller drei Faktoren, wurde
die Lösung als (+) eingestuft, wenn alle drei Faktoren
negativ eingeschätzt wurden, wurde die Stufe als (-)
spezifiziert und wenn einer oder zwei der oben erwähnten
Faktoren negativ beurteilt wurden, erfolgte die Einstufung
("0").
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Die nach Lagerung während eines Monates
erhaltenen Resultate sind in Tabelle I dargestellt.
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Die Substanzen, welche nach einem Monat als immer
noch positiv beurteilt wurden, wurden weiter untersucht
nach 3 bzw. 6 und 9 Monaten (siehe Tabelle II).
TABELLE I
Untersuchte Substanz
Menge
Einstufung (1 Monat)
Phosphatpuffer
Mannit
Glukose
Lactose
Glycin
Arginin
Dithioerythrit
Natriumedetat
Benzylalkohol
Gemisch von Methyl- und Propylparaben
Benzylkoniumchlorid
Dextran 40
Ammoniumchlorid
Albumin
Natriumcarboxymethylcellulose
TABELLE II
Untersuchte Substanz
Menge
Einstufung 3 Monate
Glycin
Natriumedetat
Albumin
Dextran 40
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Selbst nach 6- und 9-monatiger Lagerung blieb
die Einstufung von Dextran 40 positiv.
Beispiel 1
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Die folgende Zusammensetzung wurde für die
Injektion zubereitet :
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Monoclonales Anti-hCG 1 mg
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Dextran 40 1 mg
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NaCl 3,5 mg
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Phosphatpuffer pH = 8
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Na&sub2;HPO&sub4; 7,5 mg
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NaH&sub2;PO&sub4; 0,33 mg
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Wasser für Injektionen auf 1 ml
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Diese Zusammensetzung ist während mindestens
9 Monaten stabil.
Beispiel 2
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Zusammensetzung für Injektionen bestehend aus:
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Monoclonales Anti-hCG (Maus) 1 mg
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Dextran 40 2 mg
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Glukose 20 mg
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Phosphatpuffer pH = 8
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Na&sub2;HPO&sub4;/NaH&sub2;PO&sub4; 7,5 mg/0,33 mg
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Wasser für Injektionen auf 1 ml
Beispiel 3
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Zusammensetzung für Inektionen bestehend aus:
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Monoclonales Anti-PMSG (Maus) 1,5 mg
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Dextran 40 1 mg
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Benzylalkohol 1 mg
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Glycin-Puffer pH 8,5
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Wasser auf 1 ml