DD299440A5 - Verfahren zur vollstaendigen restriktion von dna-molekuelen - Google Patents

Abstract

Die Erfindung stellt ein Verfahren zur vollstaendigen Restriktion von DNA-Molekuelen dar. Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik, wo eine spezifische Fragmentierung von DNA-Molekuelen mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen zu den Basismethoden gehoert. Das Ziel der Erfindung besteht darin, DNA-Molekuele, die unter Verwendung der bisher bekannten Methode durch bestimmte Restriktionsendonukleasen nur inkomplett spaltbar waren vollstaendig und schnell in die spezifischen Restriktionsfragmente zu zerlegen. Die Aufgabe wurde dadurch geloest, dasz solche DNA-Molekuele in Gegenwart einer zweiten DNA-Species (insbesondere Oligonukleotid-Duplexe, die den Erkennungsort fuer die entsprechende Restriktionsendonuklease enthalten) mit der Restriktionsendonuklease inkubiert werden. Als sehr vorteilhaft erwies sich das Verfahren zur Komplettierung und Beschleunigung der spezifischen Spaltung von DNA des Phagen lambda durch die Restriktionsendonukleasen Eco57I und Cfr9I, von DNA des Phagen-Vektors mp18 durch EcoRII und des Plasmids pBR322 durch NarI.{Gentechnik; Restriktionsendonukleasen; DNA; DNA-Spaltung; Oligonukleotide; Phagen; Vektoren; Plasmide; Cfr9I}

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Gentechnik. Sie hat zum Ziel, die spezifische Fragmentierung von DNA-Molekülen durch Restriktionsendonukleasen effektiver zu gestalten. Die Aufgabe besteht darin, DNA-Moleküle, die durch bestimmte Restriktionsendonukleasnn unter den üblichen Reaktionsbedingungen nur partiell geschnitten werden bzw. ungewöhnlich lange Inkubationszeiten zur Erhöhung der Spaltungseffektivität benötigen, durch diese Restriktionsendonukleasen vollständig und schnell zu spalten. Sie betrifft damit eine Basismethode der Gentechnik und ist auf diesem Gebiet anwendbar.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Die ortsspezifische Spaltung von DNA-Molehülen mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen ist eine Basismethode zur Herstellung definierter Fragmente des genetischen Materials (DNA), die dann weiter analysiert oder gentechnisch neu verkoppelt werden können. Das übliche Vorgehen besteht in der In-vito-Inkubation der gereinigten DNA mit der entsprechenden Restriktionsendonuklease .inter definierten Temparaturbedingungen (meist 37⁰C) in Gegenwart einer für jede Restriktionsendonuklease charakteristischen Salz· und Kofaktorkonzentration bei entsprechendem pH-Wert (MANIATIS et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Press, New York, 1982).

Resistenz von gereinigten DNA-N!olekül9n gegenüber bestimmten Restriktionsendonukleasen trotz des Vorliegens entsprechender Erkennungsorte in der DNA kann durch die Präsenz modifizierter oder unüblicher Basen in der DNA-Erkennungssequenz odor in deren Nähe bedingt sein und durch das Ersetzen dieser Basen durch die vier üblichen Basen Adenin, Guanin, Cytosin oder Thymin überwunden werden (KRUGiR und BICKLE, Microbiol, Reviews 47 (1983) 345-360). Kürzlich wurde gefunden, daß die Resistenz von DNA-Molekülen auch darauf beruhen kann, daß bestimmte Restriktionsendonukleasen besondere Anforderung9n an die Substrat-DNA stellen (z. B. koordiniertes Vorliegen mehrerer Erkennungsorte in der Substrat-DNA) und die resistente DNA diese Anforderungen nicht erfüllte. In diesem Falle besteht ein Weg zur Überwindung der Resistenz in dir Koinkubation der resistenten DNA mit empfindlichen DNA-Species bzw. Oligonukleotid-Duplexen, die den Erkennungsort für die entsprechende Restriktionsendonuklease besitzen (BARCAK et al., Wirtschaftspatent DD 264231; KRÜGER et al., Nucleic Acids Res. 16 [1988] 3997-4008; PEIN et al., FEBS Letters 245 [1989] 141-144). Unabhängig vom Auftreten solcher resistenter DNA-Spedes ist aus der Literatur (z. B. BOLTON et al., Gene 1 β [1988] 31-43) und aus der praktischen Erfahrung in der Gentechnik bekannt, daß sich verschiedene Erkennungsorte in demselben DNA-Molekül durch bestimmte Restriktionsendonukleasen mit unterschiedlicher Effizienz schneiden lassen. Daraus resultiert, daß die Spaltung solcher DNA-Species durch bestimmte Restriktionsendonukleasen unter den üblichen Reaktionsbedingungen nur inkomplett ist und auch durch längere Inkubationszeiten und mehrmalige Zugabe der Restriktionsendonuklease zum Inkubationsansatz meist nicht komplettiert werden kann. Die molekularen Ursachen des unvollständigen Schneidens von DNA-Species sowie Methoden zur Vervollständigung und Beschleunigung der DNA-Restriktion waren bisher nicht bekannt. Die vorliegende Erfindung schafft eine solche praktikable Möglichkeit.

Ziel der Erfindung

Das Ziel der Erfindung besteht darin, DNA-Moleküle, die unter Verwendung der bisher bekannten Methoden durch bestimmte Restriktionsendonukleasen nur inkomplett spaltbar sind, vollständig und schnell in die spezifischen Restriktionsfragmente zu zerlegen.

-2- 299 440 Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu entwickeln, das sich zur schnellen und vollständigen Spaltung von DNA-Molekülen eignet. Die Aufgabe wurde dadurch gelöst, daß DNA-Moleküle, die mit den bisher bekannten Methoden nur unvollständig spaltbar sind, in Gegenwart einer zweiten, empfindlichen DNA-Species (insbesondere Oligonukleotid-Duplexen, die den Erkennungsort für die entsprechende Restriktlonsendonuklease besitzen) mit der Restriktionsendonukl6ase inkubiert werden.

Die verwendeten Oligonukleotid-Duplexe sind vorzugsweise 12 bis 20 Basenpaare lang und enthalten etwa in ihrer Mitte die Erkennungssequenz für das entsprechende Restriktionsenzym. Das mengenmäßige Verhältnis der komplett zu schneidendun DNA zur Aktivator-DNA (Oligonukleotid-Duplexe oder biologisch replizierte, empfindliche DNA-Species) ist so zu gestalten, daß die Zahl von Erkennungsorten für das entsprechende Restriktionsenzym in der Aktivator-DNA mindestens so groß oder größer ist als in der eigentlichen Substrat-DNA. Nach Beendigung der Koinkubation mit der Restriktionsendonuklease werden die entstandenen DNA-Fragmente wie üblich durch Gelelektrophorese aufgetrennt und sichtbar gemacht (MANIATIS et al., s. oben). Überraschenderweise gelingt es mit dieser Methode, die DNA-Moleküle schnell und vollständig in die spezifischen Restriktonsfragmente zu zerlegen. Das Verfahren ermöglicht es erstmals, eine komplette Spaltung von DNA-Species durch bestimmte Restriktionsendonukleasen zu bewerkstelligen. Die vollständige Spaltung der DNA-Moleküle ist eine für die Lösung der meisten gentechnischen Fragestellungen notwendige Voraussetzung. Ein weiterer Vorteil des Verfahrens besteht darin, die bisher in den Fällen unvollständiger DNA-Spaltung geübte Praxis einer mehrfachen Zugabe der Restriktionsendonuklease zum Inkubationsansatz sowie einer vielstündigen (über Nacht oder länger) Inkubation zu verbessern und die vollständige Spaltung der DNA durch einmalige Enzymgabe und eine kurze Inkubationszeit zu erreichen. Damit ist das Verfahren, neben der Tatsache, daß so überhaupt erstmalig eine vollständige Fragmentierung von DNA-Molekülen ermöglicht wird, auch zeit- und materialökonomisch.

Als sehr vorteilhaft hat sich das Verfahren zur Komplettierung und Beschleunigung der spezifischen Spaltung von DNA des Phagen lambda durch die Restriktionsendonukleasen Eco57l und Cfr9l, von DNA des Phagen-Vektors mpl8 durch E-pH11 und des Plasmids pBR322 durch Narl erwiesen. Die verwendeten Oligonukleotid-Duplexe können durch die üblichen chemischen und/oder enzymatischen Verfahren synthetisiert oder aus natürlicher DNA erzeugt werden.

Ausführungsbeispiele

Die Erfindung wird nachstehend anhand von Ausführungsbeispielen erläutert.

Beispiel 1

Die Restriktionsendonuklease Cfr91 erkennt die Basensequenz

3'-GGGCCC ^{im DNA}-^Molekül (BUTKUS et al., Nucleic Acids Res. 15 (1987] 7091-7102).

Die DNA des Bakteriophagen lambda, der auch als Vektor in der Gentechnik Verwendung findet, besitzt 3 Erkennungsorte für diese Restriktionsendonuklease. Auch unter optimalen Reaktionsbedingungen kommt es nur zur unvollständigen Verdauung der lambda-DNA. Zugabe des 12 Basenpaare langen Oligonukleotid-Duplexes •ι λ λ A/"*(**f*/"*/¹^f*Τ/"Ό

V CCTGCCCCCAGC ^zum Reaktionsgemisch ermöglicht eine vollständige Cfr91-Spaltung der Substrat-DNA.

In einem Reaktionsansatz werden 2\ig lambda-DNA, 5 χ 10~⁷ Mol des o.g. Dodekadesoxynukleotid-Duplexes und 5 Einheiten Cfr9l in 20μΙ Reaktionspuffer mit den Kofaktorkonzentrationen 1OmM Tris-HCI (pH 7,5), 5mM MgCI₂,20OmM Natriumglutamat, 1 mM DTTsowie lOOpg/ml Rinderserumalbumin für 1 Stunde bei 37°C inkubiert.

Nach Abstoppen der Reaktion (5 min Inkubation bei 65⁰C) erfolgt die Auftrennung der DNA-Fragmente durch Elektrophorese im

Agarosegel mit anschließender Sichtbarmachung der Fragmente im UV-Licht (312nm) nach Äthidiumbromidbehandlung des

Beispiel 2

Wie Beispiel 1, nur da¹} anstelle von 5 Einheiten Cfr9l 10 Einheiten der Restriktionsdonuklease Eco57l sowie anstelle des im Beispiel 1 genannten' )!igonukleotid-Duplexes ein Duplex mit Einzelkettenlängen von 13 bzw. 16 Nukleotiden, der die Eco57l-Erkennungssequenz enthält, in einer Endkonzentration von 2x10"' Mol eingesetzt wurden. Die Inkubationsbedingungen des Restriktionsgemisches waren die für Eco57l optimalen (Katalog des ESP Fermentes „Enzymes for Molecular Biology").

Claims (5)

1. Verfahren zur vollständigen Restriktion von DNA-Molekülen mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen, dadurch gekennzeichnet, daß DNA-Moleküle, die nach den bisher bekannten Methoden durch bestimmte Restriktionsendonukleasen nur unvollständig geschnitten werden können, unter Zusatz einer zweiten DNA-Species vollständig und schnell in spezifische Fragmente zerlegt werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als zweite DNA-Specios synthetisch hergestellte Oligonukleotid-Duplexe, biologisch replizierte DNA-Moleküle oder Teile derselben eingesetzt werden, die Erkennungsorte für die jeweilige Restriktionsendonuklease besitzen und keine spezifische Methylierung tragen.

3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekonnzeichnet, daß vorrangig Oligonukleotid-Duplexe von 12 bis 20 Basenpaaren Länge eingesetzt werden, die die Crkennungssequenzen für die Restriktionsendonukleasen Cfr9l, Eco57l, EcoRII oderNarl enthalten.

4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß eine vollständige Verdauung der DNA des Phagen lambda durch Cfr9l und Eco57l, des Klcnierungsvektors mp 18 durch EcoRII und des Plasmids pBR322 durch Narl erzielt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß Oligonukleotid-Duplexe Verwendung finden, die durch die üblichen chemischen und/oder enzymatischen Verfahren synthetisiert oder aus natürlicher DNA erzeugt werden.