DE3877337T2

DE3877337T2 - Verfahren zur mutagenese mittels oligonukleotid-gerichteter reparatur eines strandbruchs.

Info

Publication number: DE3877337T2
Application number: DE19883877337
Authority: DE
Inventors: Mark Allan Hayden; Wlodzimierz Mandecki
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1987-12-11
Filing date: 1988-11-21
Publication date: 1993-08-19
Anticipated expiration: 2008-11-22
Also published as: JPH022348A; EP0319759A2; EP0319759A3; DE3877337D1; EP0319759B1

Description

Hintergrund

Die vorliegende Erfindung ist eine continuation-in-part Anmeldung der Anmeldung No. 883.242 mit dem Titel METHOD FOR MUTAGENESIS BY OLIGONUCLEOTIDE-DIRECTED REPAIR OF A STRAND BREAK, eingereicht am 8. Juli 1986 von Wlodzimierz Mandecki, jetzt aufgegeben.
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Verfahren zur positionsspezifischen Mutagenese und zur Reparatur von Strangbrüchen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur positionsspezifischen Mutagenese oder DNA-Bruchreparatur, worin ein Oligonukleotid, das die gewünschte Mutation hervorruft, verwendet wird.
Positionsspezifische Mutagenese ist ein Fachausdruck, der für eine große Gruppe von in-vitro-Verfahren verwendet wird [Übersicht bei Botstein et al., Science 229, 1193-1201 (1985)], von welchen beschrieben wird, daß sie zwei Gruppen von Verfahren umfaßt: Mutagenese durch Primer-Extension und Mutagenese durch Genfragmentaustausch. In-vivo-Methoden, die eine homologe Rekombination umfassen, ermöglichen es, gezielt spezifische Positionen für Mutationen auszuwählen
Die Primer-Extension-Mutagenese umfasst die Hybridisierung eines Oligonukleotid-Primers, der die Mutation beinhaltet, mit einzelsträngiger DNA, die das Ziel der Mutagenese ist. Diese in Frage stehende DNA dient als Matrize für die in vitro enzymatische Primer-Extension zu einem kompletten zweiten Strang. Die resultierende heterologe doppelsträngige DNA wird mittels Transformation in E. coli übertragen. Eine Fraktion der Klone, die aus dieser Transformation resultieren, enthält die Mutation.
Die Mutagenese durch Genfragmentaustausch umfaßt die in vitro Verdauung eines doppelsträngigen Vektors durch ein Restriktionsenzym außerhalb der Ziel-Region. Die eine Mutation enthaltende doppelsträngige synthetische DNA wird mit dem Vektor an der Restriktionsstelle verknüpft.
Das Verfahren der Primer-Extension wurde ursprünglich bei der Positionsspezifischen Mutagenese des einzelsträngigen Bakteriophagen 0174 angewendet [Hutchinson, J. Biol. Chem. 253, 6551 (1978); Razin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 75, 4268 (1978)]. Eine Anzahl von Protokollen ermöglicht die Anwendung dieses Verfahrens bei jedem Gen, das auf einem ringförmigen Vektor geklont wurde. Die Voraussetzung für eine einzelsträngige DNA kann durch folgendes erfüllt werden: (i) Verwendung eines M13 einzelsträngigen Vektors [Zoller et al., Nucleic Acids Res. 10, 6487-6500 (1982)]; (ii) Verwendung eines Plasmidvektors mit dem Replikationsursprung von M13, was zur Verpackung von einzelsträngigen Plasmiden nach Superinfektion mit M13 in Viruspartikel führt [Dente et al., Nucleic Acids Res. 11, 1645 (1983); Zagursky et al.,Gene 27, 183 (1984); und Levinson et al., J. Mol. Acpl.Genet. 2, 507 (1984)]; (iii) Enzymatischer Abbau eines Teils von einem Strang eines Duplexplasmids mit einer Exonuklease [Wallace et al., Science 209, 1396 (1980)]; (iv) Schaffung eines einzelsträngigen Gap durch Bildung eines Heteroduplexmoleküls [Kramer et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441 (1984)]: oder (v) direkte Hybridisierung des Oligonukleotids an eine Duplex-DNA, um eine D-Schleife zu bilden [Schold et al., DNA 3, 469 (1984)].
Die Effizienz der Mutagenese bei dem Primer-Extension- Verfahren kann durch Verwendung von zwei Primern gesteigert werden, um die DNA-Synthese an zwei Stellen zu initiieren [Norris et al., Nucleic Acids Res. 11, 5103 (1983); und Zoller et al., DNA 3 479 (1984)], oder durch Verwendung einer DNA-Matrize, die mehrere Uracilreste statt Thymin enthält [Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 488-492 (1985)].
Synthetische DNA zur Verwendung für die Mutagenese mittels Genfragmentaustausch können aus zwei hybridisierten Oligonukleotiden bestehen, deren Enden zu den Enden passen, die durch Restriktionsenzyme in einer Vektor-DNA gebildet wurden. Alternativ können Mutanten durch Konstruktion von längeren Genfragmenten, die aus vier oder mehr Oligonukleotiden bestehen, oder sogar von vollsynthetischen Genen erhalten werden [Caruthers et al., "Promoters: Structure and Function", Edition Rodriguez et al., Praeger Scientific, New York, Seiten 432-451 (1982)]. Spezialisierte Anwendungen dieses Verfahrens umfassen: (i) Linker-Scannermutagenese zur Einführung von Clustern von Punktmutationen an diskreten Stellen [Mc.Knight et al., Science 217, 316-314 (1882)]; (ii) Mutagenese durch Insertion von zwei Codons unter Verwendung eines selektierbaren Markers [Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 82, 4202-4206 (1982)], und (iii) "Bandaid"-Mutagenese, die auf einer Ligation eines einzelenen Oligonukleotids in einen doppelsträngigen Gap beruht, der durch Schneiden mit zwei Restriktionsendonukleasen, die ein einzelsträngiges 3'-Ende und ein einzelsträngiges 5'-Ende, komplementär zu jedem Ende des Oligonukleotids, bilden, geschaffen wurde [Mural et al., DNA 5, 84 (1986)].
Die obigen Verfahren sind universell anwendbar und ermöglichen die Einführung von definierten Punktmutationen, Insertionen und Deletionen an praktisch jede gewünschte Stelle auf einer klonierten DNA. Daher wird die positionsgerichtete Mutagenese in weitem Umfang verwendet, um den Zusammenhang zwischen Struktur und Funktion bei DNA, RNA und Proteinen zu prüfen, die wechselseitige Einwirkung dieser biologischen Makromoleküle zu studieren und um Wege zur genetischen Regulierung zu ermitteln. Die weite Anwendbarkeit der positionsgerichteten Mutagenese rechtfertigt das Interesse an neuen Mutageneseverfahren, besonders an Verfahren, welche die Zeit und die Mühe verringern, die derzeit erforderlich sind, um einen Mutanten zu erhalten.
Obwohl die Phänomene der Primer-Extension und des Genfragmentaustausches gut erklärt sind, ist das Phänomen der Reparatur eines DNA-Doppelstrangbruchs in E. coli nicht gut verständlich. An einer einzigen Restriktionsstelle linearisierte Plasmid-DNA transformiert E. coli, jedoch mit einer viel geringeren Effizienz, als die entsprechende kovalent geschlossene ringförmige DNA [Thompson et al., Mol. Gen. Genet. 169, 49-57 (1979) und Conley et al., Mol. Gen. Genet. 194, 211-218 (1984)]. Obwohl Transformanten, die Plasmide mit Deletionen oder Umlagerungen enthalten, häufig sind, werden auch Transformanten mit den nativen Plasmidmolekülen erhalten. Man nimmt an, daß einfache intrazelluläre Rehybridisierung und Ligation der beiden kohäsiven Termini eines linearen Moleküls nicht der vorherrschende Mechanismus bei der Plasmidbildung ist, da die Transformation mit linearisierter Plasmid-DNA aufgrund des vorhandenen recA, recBC oder recF auf das 10- bis 40-fache verringert wird [Conley et al., Mol. Gen. Genet. 194, 211-218 (1984)].
In einer Variante eines Verfahrens, das homologe Rekombination genannt wird, kann linearisierte chimäre Plasmid-DNA Zellen mit einem internen Plasmid, welches mit einem Teil der chimären Plasmid-DNA homolog ist, in dem Verfahren, das "Marker-rescue Transformation" genannt wird, transformieren. Marker-rescue Transformation ist recE abhängig, verlangt, daß die chimären und die internen Plasmide homologe Sequenzen aufweisen und daß homologe Sequenzen etwaige nicht homologe Segmente zur "Rettung" flankieren, variiert in seiner Effizienz mit der Position des linearisierenden Schnitts in der chimären Plasmid-DNA, und ist eine Reaktion erster Ordnung hinsichtlich der DNA-Konzentration [Contente et al., Plasmid 2, 555-571 (1979)].
In Hefe steigert die Restriktionsenzymverdauung innerhalb einer Region eines ringförmigen Hybridplasmids, wobei die Region homolog zu chromosomaler DNA ist, stark die Effizienz der Integration der Plasmid-DNA in die chromosomale DNA gegenüber der Effizienz, die mit ringförmiger Plasmid-DNA erhalten werden kann [Orr-Weaver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 78, 6354-6358 (1981)]. Wenn die Schnittstelle in die Region der Plasmid-DNA gelegt wird, die homolog zu einer Stelle auf dem Chromosom ist, kann die Integration gezielt an der chromosomalen Stelle erfolgen [Orr-Weaver et al., Ref. wie oben]. Die Effizienz der Transformation ist stark von der Plasmidkonzentration abhängig [Orr-Weaver et al., Ref. wie oben]. Die Integration von linearen Molekülen mit einer Deletion innerhalb der Region der Homologie wird von der Reparatur der fehlenden Information, wobei die homologe Region des Chromosoms als Matrize verwendet wird, begleitet, und für das Integrationsverfahren kann das gleiche RAD52-Genprodukt erforderlich sein, das für die Reparatur des Doppelstrangbruchs und für die Genumwandlung erforderlich ist [Orr-Weaver et al., Ref. wie oben]. Die Insertion einer gewünschten Sequenz führt jedoch zur Bildung einer direkten Wiederholung der homologen Sequenz in dem Chromosom und zu der unerwünschten Insertion von Vektorsequenzen in das Chromosom [Orr-Weaver et al., Methods Enzymol. 101, 228-245 (1983)]. Außerdem, obwohl die nachfolgende Rekombination der verdoppelten Sequenzen das unerwünschte Duplikat und Vektorsequenzen eliminieren kann, erfolgt diese Eliminierung in einem sehr geringen Maße [Scherer at al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76, 4951-4955 (1979) und Scherer et al., Science 209, 1380-1384 (1980)]. Beispielsweise wurde die Excision von unerwünschten Vektorsequenzen nach 10 Generationen nur in sieben von 900 Isolaten beobachtet und nur in drei Isolaten wurden Wildtypgene deletiert und erfolgreich durch eine einzige Kopie eines insertierten Mutantengens vollständig ersetzt [Scherer, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Ref. wie oben].
Das homologe Rekombinationsverfahren von Orr-Weaver et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), Ref. wie oben, kann für eine gezielte Geninsertion in Säugetierchromosome, beispielsweise für die gezielte Insertion eines Plasmids, das ein Betaglobin-Deletionsanalog an dem Betaglobinlocus aufweist, verwendet werden [Smithies at al.,Nature 317, 230-234 (1986)]. Die Insertion einer gewünschten Sequenz führt jedoch wie bei der Hefe zu einer direkten Wiederholung der homologen Sequenz in dem Chromosom und zu der unerwünschten Insertion von Vektorsequenzen darin [Smithies et al., Ref. wie oben]. Die niedrige Frequenz der homologen Rekombination und die niedrige Frequenz, mit der die Excisionsvorgänge vonstatten gehen, begrenzt die mögliche Verwendung des Verfahrens bei der Gentherapie [Maniatis, Nature 317, 205-206 (1986)].
In B. subtilis kann die homologe Rekombination verwendet werden, um nicht homologe Sequenzen, die mit flankierenden Sequenzen verknüpft sind, in das Chromosom zu insertieren (und so ein Gen zu klonieren, wenn die nicht homologe Sequenz ein Gen ist) oder um chromosomale Sequenzen zu deletieren, wenn die flankierenden Sequenzen nicht angrenzend sind (nach dem Auftreten eines doppelten Crossover-Rekombinationsvorgangs) [Niaudet et al.. Gene 19, 277-284 (1982) und Niaudet et al., J Bacteriol. 163, 111-120 (1985)]. Die Einführung von Sequenzen, die von einem Plasmid stammen und homolog zu Sequenzen in einer Zelle sind, kann aber für Änderungen (wie einige Typen von Deletionen, Additionen oder Inversionen) zur kompletten Homologie nach der Transformation in die Zelle geheilt werden [Iglesias et al., Mol. Gen. Genet. 184, 405-409 (1981)]. Dennoch ist die Brauchbarkeit dieser Verfahren Beschränkungen unterworfen, die denjenigen der homologen Rekombination in Hefe ähnlich sind.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 7177-81 (1986), und EP-A- 25 31 193, die eine kollidierende Europäische Anmeldung für die benannten Vertragsstaaten DE und F gemäß Artikel 54(3) und (4) EPÜ ist, beschreiben ein Verfahren zur oligonukleotid-gerichteten Reparatur von Brüchen doppelsträngiger DNA zur Gewinnung von Deletionsmutanten.
US-A-4.293.652 beschreibt ein Verfahren zum sequentiellen Genzusammenbau unter Verwendung eines doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotids und einer Ligationsstufe in vitro.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine Methode zur Insertion oder Substitution von Nukleotiden mittels eines Verfahrens zur Verfügung, welches die Stufe der gemeinsamen Kultivierung der linearen in Frage stehenden DNA, die einen Bruch aufweist, und eines Oligonukleotids, das eine Nukleotidsequenz enthält, die komplementär zu einem Strang der DNA auf beiden Seiten des Bruchs ist und den Bruch überspannt, in einer geeigneten Wirtszelle umfaßt. Der hier benutzte Ausdruck "Bruch", wie er für ein Segment einer einzel- oder doppelsträngigen DNA verwendet wird, bezieht sich auf eine Trennung zwischen Enden, sowohl von stumpfen als auch von kohäsiven Enden. So wird der Ausdruck "Bruch" für die Trennung zwischen den Enden einer einzel- oder doppelsträngigen linearen DNA verwendet, aber nicht für einen Nick oder einen Gap in nur einem Strang einer doppelsträngigen DNA.
Gemäß der vorliegenden Erfindung enthält das Oligonukleotid einen ersten Teil (ein "Teil" beträgt der Länge nach ein oder mehrere Nukleotide), der vollständig komplementär zu der Nukleotidsequenz einer ersten Region (eine "Region" beträgt der Länge nach ein oder mehrere Nukleotide) des Strangs ist, einen zweiten Teil, der vollständig komplementär zu der Nukleotidsequenz einer zweiten Region des Strangs ist, und einen dritten Teil, der sich zwischen dem ersten und dem zweiten Teil befindet und zu der Nukleotidsequenz des Strangs zwischen der ersten und zweiten Region nicht komplementär ist. So bedeutet "Überspannen des Bruchs", daß die beiden Enden der DNA in physikalische Nähe gebracht werden.
Das Verfahren umfaßt auch die Stufe, die genannte Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen zu halten, besonders unter Bedingungen, die für die Reparatur des Strangbruchs und für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Inkorporation einer dritten Region, die zu dem dritten Teil zwischen der ersten Region und der zweiten Region komplementär ist, in die DNA zu gestatten, geeignet sind. "Inkorporation" bezieht sich in dem Sinne, der hier verwendet wird, auf jedes Verfahren, mit welchem das gewünschte Ergebnis erreicht wird, insbesondere einschließlich des Auffüllens und Ligierens und einschließlich des Verfahrens der Reparatur, aber nicht begrenzt auf letzteres.
Die Stufe der gemeinsamen Kultivierung des Verfahrens zur positionsgerichteten Mutagenese gemäß der vorliegenden Erfindung enthält vorzugsweise die Stufe des Exponierens der doppelsträngige DNA mit dem Oligonukleotid in vitro und besonders bevorzugt die Stufe der gemeinsamen Einführung des Oligonukleotids und der DNA in die Wirtszelle. Die "Einführung" kann mittels beliebiger geeigneter Maßnahmen erfolgen, einschließlich Injektion, CaCl&sub2;-Transformation, Elektroporation und Zellfusion oder Fusion mit Liposomen, aber nicht begrenzt darauf. Zur Zeit wird eine Stufe der gemeinsamen Kultivierung bevorzugt, welche die Stufe der Denaturierung der DNA einschließt.
In dem Verfahren der positionsgerichteten Mutagenese gemäß der vorliegenden Erfindung kann DNA auf einem Vektor (autonom replizierende DNA oder RNA), vorzugsweise auf einem Plasmid, verwendet werden. Obwohl ein Plasmid bevorzugt wird, kann auch ebenso günstig ein viraler Vektor, wie ein Bakteriophage, verwendet werden.
Die Stufe des Exponierens kann Transformieren der Wirtszelle mit dem Oligonukleotid, Transformieren der Wirtszelle mit der in Frage stehenden DNA, und gemeinsames Transformieren (nämlich Transformieren zu etwa der gleichen Zeit und besonders, wenn das Oligonukleotid und die DNA sich in dem gleichen Transformationsmedium befinden) der Wirtszelle mit der DNA und dem Oligonukleotid umfassen. Die Stufe des Exponierens kann die Stufe des Bereitstellens eines Oligonukleotids, das einen dritten Teil enthält, dessen am meisten in der Mitte liegenden Nukleotide an ein Nukleotid des zweiten Teils anschließt, das nicht weiter als 26 Nukleotide längs der Nukleotidsequenz des Strangs der DNA von dem Bruch entfernt ist, umfassen.
Ein Verfahren, mit dem eine Deletion von Nukleotiden gemäß der vorliegenden Erfindung erhalten wird, umfaßt die Stufe der gemeinsamen Kultivierung der DNA, die einen Bruch aufweist, und eines Oligonukleotids in einer geeigneten Wirtszelle. Die Sequenz des Oligonukleotids ist komplementär zu den Regionen eines Strangs der DNA an beiden Seiten des Bruchs, überspannt den Bruch und enthält: Einen ersten Teil, der zu der Nukleotidsequenz einer ersten Region des Strangs vollständig komplementär ist; einen zweiten Teil, der vollständig komplementär zu einer Nukleotidsequenz einer zweiten Region des Strangs ist und direkt an den ersten Teil anschließt, wobei die in Frage stehende DNA eine dritte Region zwischen der ersten und zweiten Region umfaßt; und Halten der genannten Wirtszelle unter geeigneten Bedingungen und für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Inkorporation einer dritten Region, die dem dritten Teil zwischen der ersten Region und der zweiten Region komplementär ist, in die DNA zu gestatten. Das Verfahren kann auch eine Stufe des gemeinsamen Kultivierens enthalten einschließlich der Stufen des Exponierens des Oligonukleotids mit der doppelsträngigen DNA und der Denaturierung der DNA. Das Verfahren kann auch eine zusätzliche Stufe enthalten, nämlich die Verwendung eines 1000-fachen Überschusses des Oligonukleotids im Vergleich zur in Frage stehenden DNA.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Reparatur eines DNA-Doppelstrangbruchs zur Verfügung. In einer geeigneten Wirtszelle wird die DNA, die einen Doppelstrangbruch enthält, gemeinsam mit einem Oligonukleotid, das eine zu einem Strang der DNA an beiden Seiten des Bruchs komplementäre Nukleotidsequenz aufweist, kultiviert, wobei das Oligonukleotid einen ersten Teil, der vollständig zu der Nukleotidsequenz einer ersten Region des Strangs komplementär ist und sich an einer Seite des Doppelstrangbruchs befindet, und einen zweiten Teil, der vollständig zu der Nukleotidsequenz einer zweiten Region komplementär ist und sich an der anderen Seite des Doppelstrangbruchs befindet, enthält. Die Wirtszelle wird unter geeigneten Bedingungen für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Reparatur des Doppelstrangbruchs zu gestatten, gehalten.
Bei dem Verfahren zur Reparatur des Bruchs einer doppelsträngigen DNA gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Oligonukleotid zur Verfügung gestellt werden, das einen dritten Teil enthält, der sich zwischen dem ersten und zweiten Teil befindet und zu dem Strang zwischen der ersten und zweiten Region nicht komplementär ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ferner ein Verfahren zur Reparatur eines Strangbruchs in einzelsträngiger DNA zur Verfügung, welches die gemeinsame Kultivierung in einer geeigneten Wirtszelle der in Frage stehenden DNA mit einem Einzelstrangbruch und einem Oligonukleotid, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die komplementär zu einem Strang der DNA an beiden Seiten des Bruchs ist, umfaßt. Das Oligonukleotid weist einen ersten Teil auf, der vollständig komplementär zu der Nukleotidsequenz einer ersten Region des Strangs ist und sich an der einen Seite des Einzelstrangbruchs befindet, und einen zweiten Teil, der vollständig komplementär zu der Nukleotidsequenz einer zweiten Region ist und sich an der anderen Seite des Einzelstrangbruchs befindet. Die Wirtszelle wird unter geeigneten Bedingungen für einen Zeitraum, der ausreicht, um die Reparatur des Einzelstrangbruchs zu gestatten, gehalten. Das Verfahren zur Reparatur des Bruchs einer einzelsträngigen DNA kann eine Stufe enthalten, in der ein Oligonukleotid zur Verfügung gestellt wird, das einen dritten Teil enthält, der zwischen dem ersten und zweiten Teil liegt und zu dem Strang zwischen der ersten und zweiten Region nicht komplementär ist. So kann das Verfahren für eine positionsgerichtete Mutagenese verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt ein Verfahren zur Durchführung einer Gentherapie, um die erwünschten genetischen Modifikationen herbeizuführen, die Stufe, Zellen zur Verfügung zu stellen, die einen Bruch in der DNA aufweisen, die dem zu behandelnden Gen entspricht. Es umfaßt auch die Stufe, in die zu behandelnden Zellen ein Oligonukleotid einzuführen, das eine zu einem Strang der DNA an beiden Seiten des Bruchs komplementäre Nukleotidsequenz aufweist und wobei das Oligonukleotid einen ersten Teil, der vollständig komplementär zu der Nukleotidsequenz einer ersten Region des Strangs ist, einen zweiten Teil, der vollständig komplementär zu der Nukleotidsequenz einer zweiten Region des Strangs ist, und einen dritten Teil, der zwischen dem ersten und zweiten Teil liegt und der zu der Nukleotid Sequenz des Strangs zwischen der ersten und zweiten Region nicht komplementär ist, enthält. Die Wirtszelle wird unter geeigneten Bedingungen für einen Zeitraum gehalten, der ausreicht, um die Inkorporation einer dritten Region, die komplementär ist zu dem dritten Teil zwischen der ersten Region und der zweiten Region, zu gestatten. Die Stufe der Aufrechterhaltung der Bedingungen kann eine Stufe der Selektion von Zellen, welche die gewünschte genetische Modifikation aufweisen, umfassen.
Um in der DNA einen Bruch zu erzeugen, können die Zellen einer Strahlung unter Bedingungen, die für die Erzeugung eines Bruchs in der DNA durch Anwendung einer Strahlung geeignet sind, ausgesetzt werden oder die Zellen können mit einem Arzneimittel unter Bedingungen, die zur Erzeugung eines Bruchs in der DNA durch Versetzen mit einem Arzneimittel geeignet sind, versetzt werden. Besonders bevorzugt wird jedoch ein sequenzspezifisch DNA spaltendes Molekül, das spezifisch für den Teil der in Frage stehenden DNA ist, der modifiziert werden soll, in die Zellen eingeführt.
Ein Verfahren zum Klonieren eines Segments der DNA gemäß der vorliegenden Erfindung enthält die Stufe einer gemeinsamen Kultivierung von Vektor-DNA mit einem Bruch und einer linearen DNA, die kloniert werden soll, in einer geeigneten Wirtszelle. Auch ein erstes und ein zweites Oligonukleotid wird gemeinsam kultiviert. Das erste Oligonukleotid enthält einen ersten Teil, welcher zu der Nukleotidsequenz einer ersten Region eines Strangs der Vektor-DNA vollständig komplementär ist, wobei die erste Region auf der einen Seite des Bruchs liegt, und einen zweiten Teil, der zu der Nukleotidsequenz einer ersten Region eines Strangs der in Frage stehenden DNA vollständig komplementär ist, wobei die zweite Region proximal zu einem ersten Ende der DNA und distal zu einem zweiten Ende der DNA liegt. Das zweite Oligonukleotid hat einen ersten Teil, der vollständig komplementär zu der Nukleotidsequenz einer zweiten Region eines Strangs der Vektor-DNA ist, wobei die zweite Region an der anderen Seite des Bruchs liegt, und einen zweiten Teil, der vollständig komplementär zu der Nukleotidsequenz einer zweiten Region eines Strangs der in Frage stehenden DNA ist, wobei diese zweite Region proximal zu dem zweiten Ende der DNA und distal zu dem ersten Ende liegt. Die Wirtszelle wird unter geeigneten Bedingungen für einen Zeitraum gehalten, der ausreicht, um die Reparatur des Bruchs zu gestatten.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Figur 1 Veranschaulicht die Sequenz des Polylinkers eines Vektors vor und nach der Mutagenese gemäß der vorliegenden Erfindung und ebenso die homologe Sequenz eines Plasmids, die sich gemäß der vorliegenden Erfindung aus einer zweiten Mutagenese ergibt.
Figur 2 ist eine schematische Darstellung des durch Mutation veränderten Vektors der Figur 1 und des resultierenden Plasmids, wobei die Stelle der Mutagenese, neben dem mutagenisierenden Oligonukleotid linear dargestellt, gezeigt wird.
Figur 3 veranschaulicht die Sequenzen von Oligonukleotiden verschiedener Länge, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.
Figur 4 ist eine graphische Darstellung der Wechselbeziehung zwischen der Länge des Oligonukleotids, das gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, und der Effizienz der Mutagenese sowie der Zahl der produzierten Mutantenkolonien.
Figur 5 ist eine graphische Darstellung der Wechselbeziehung zwischen der Menge der linearisierten Plasmid-DNA, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wird, und der Effizienz der Mutagenese sowie der Zahl der erhaltenen Mutantenkolonien.
Figur 6 ist eine graphische Darstellung der Wechselbeziehung zwischen der Konzentration des verwendeten Oligonukleotids und der Effizienz der Mutagenese sowie der Zahl der erhaltenen Kolonien.
Figur 7 ist eine schematische Darstellung der Oligonukleotidsequenzen, welche die Schnittstelle überlappen und Mutationen in verschiedenen Distanzen von der Schnittstelle eines in Frage stehenden Plasmids gemäß der vorliegenden Erfindung aufweisen.
Figur 8 ist eine graphische Darstellung der Wechselbeziehung zwischen dem Abstand zwischen den Schnittstellen und Mutationsstellen (wobei die Position der Schnittstelle konstant gehalten wird) und der Effizienz der Mutagenese sowie der Zahl der erhaltenen Mutantenkolonien.
5 Figur 9 zeigt schematisch die Sequenz eines Oligonukleotids, neben einer homologen Sequenz in einem Plasmid, in einer Linie dargestellt, an den Restriktionsstellen wie gezeigt geschnitten;
und Figur 10 ist eine graphische Darstellung der Wechselbeziehung zwischen dem Abstand zwischen den Schnittstellen und Mutationsstellen (wobei die Position der Schnittstellen konstant gehalten wird), und der Effizienz der Mutagenese sowie der Zahl der erhaltenen Mutantenkolonien.
Figur 11 zeigt eine graphische Darstellung der Abhängigkeit zwischen der Länge der Insertion und der Effizienz der Mutagenese sowie der Zahl der erhaltenen Mutantenkolonien.
Figur 12 zeigt die Sequenz des Fragments des p41 Gens von HIV, das mittels Brückenmutagenese konstruiert worden war.
Figur 13 ist eine graphische Darstellung der Deletion einer Gensequenz unter Verwendung der Brückenmutagenese.
Figur 14 ist eine graphische Darstellung der sequentiellen Insertion von Genfragmenten in eine ein Gen verwendende Brückenmutagenese.
Figur 15 ist die Aminosäurensequenz von humanem Anaphylatoxinkomplement C3a mit der Nukleinsäurensequenz hierfür.
Figur 16 zeit die Bsm I Erkennungssequenz und deren Schnittstelle.
Figur 17 ist eine graphische Darstellung der Konstruktion von pMH1.
Figur 18 ist eine graphische Darstellung des X-Gal-Farbscreenings von Zellen der vorliegenden Erfindung.
Figur 19 ist eine graphische Darstellung von drei Oligodesoxyribonukleotiden, von denen jedes einen Teil aufweist, welcher der für einen Teil von C3a kodierenden DNA-Sequenz entspricht.

Detaillierte Beschreibung

Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein "Oligonukleotid", insbesondere ein Oligodesoxyribonukleotid mit einer Sequenz, die von DNA-Sequenzen an den beiden Seiten eines DNA-Doppelstrangbruchs (das heißt den Bruch überspannend) abgeleitet ist, die Reparatur des Bruchs lenken. Als ein Resultat hiervon kann die Effizienz der Transformation von E. coli mit denaturierter linearisierter Plasmid-DNA in Gegenwart des Oligonukleotids um Größenordnungen gesteigert werden. Wenn die Sequenz des Oligonukleotids eine Mutation enthält, kann die Mutation in die reparierte Plasmid-DNA inkorporiert werden.
Das Mutageneseprotokoll gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt eine minimale Anzahl von Stufen. Wärmedenaturierte linearisierte Plasmid-DNA und das Oligonukleotid werden mittels Transformation in E. coli eingeführt, und die Transformanten auf die Mutation gescreent. Ungleich der "Bandaid"-Mutagenese benötigt die vorliegende Erfindung nicht eine in vitro enzymatische Reaktion (wie eine Ligation), und die vorliegende Erfindung ist in ihrer Anwendbarkeit nicht auf DNA mit einem bestimmten Typ von Enden beschränkt (wie die 3'- und 5'- überstehenden Enden, die für die "Bandaid"-Mutagenese erforderlich sind).
Die erhaltenen Transformanten werden darauf gescreent, ob sie die Mutation enthalten, wobei Methoden wie Verdauung durch Restriktionsenzyme, Kolonie-Hybridisierung, oder DNA- Sequenzierung angewandt werden.
Das Verfahren zur Mutagenese gemäß der vorliegenden Erfindung ist in Situationen anwendbar, in denen die Plasmid-DNA in der unmittelbaren Nachbarschaft zu der Position, die mutagenisiert werden soll, linearisiert werden kann. Wo es möglich ist, kann die Linearisierung durch Schneiden der DNA an einer einzigen Restriktionsstelle durchgeführt werden, die wenige Nukleotide von dem Rest, der mutagenisiert werden soll, entfernt ist. Wenn eine einzige Restriktionsstelle nicht zur Verfügung steht, können die folgenden alternativen Verfahren zur Linearisierung angewandt werden: (i) Partielle Verdauung mit Restriktionsenzymen, welche an mehr als einer Stelle schneiden, (ii) Rekonstruktion eines linearen Plasmids durch Ligation von DNA-Fragmenten, die mit anderen Restriktionsenzymen erhalten wurden, oder (iii) randomisiertes Schneiden von DNA unter milden Bedingungen (z.B. mittels DNase oder Beschallung).
Das Verfahren ist besonders gut für solche Anwendungen geeignet wie: Verbinden von nicht zusammenpassenden Enden von Plasmid-DNA (eine Alternative zu den in vitro enzymatischen Manipulationen), Zerstörung und/oder Einführung einer Restriktionsstelle, ungeordnet lokalisierte Mutagenese mit Oligonukleotidproben, die Degenerationen aufweisen, oder Schaffung von definierten Deletionen anschließend an Verdauung mit DNA-Exonunucleasen. Das Verfahren wurde als erfolgreich in rec&supmin;-Wirtszellen beobachtet, aber nicht, wo die DNA keinen Bruch aufwies, der durch das Oligonukleotid überspannt wurde (das heißt, wo die DNA kovalent geschlossene ringförmige DNA war).
Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung wird genauer in den folgenden Beispielen beschrieben. In Beispiel 1 wird das Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, um ein Nukleotid aus dem pUC9-Plasmid zu deletieren. Beispiel 2 erläutert die Verwendung der vorliegenden Erfindung zum Insertieren eines Nukleotids in das Plasmid, das durch die Manipulation des Beispiels 1 erhalten wurde. Die Wechselbeziehung zwischen der Länge des Oligonukleotids und der Effizienz der Mutagenese, hier als das Verhältnis (in Prozenten) der Anzahl der Mutanten zu der gesamten Zahl der erhaltenen Transformanten definiert, wird im Beispiel 3 untersucht. Im Beispiel 4 wird die Wechselbeziehung in der Praxis der vorliegenden Erfindung zwischen den relativen Mengen der Plasmid-DNA und des Oligonukleotids und der Effizienz der Mutagenese untersucht.
Beispiel 5 erläutert die Wichtigkeit der Auswahl eines Oligonukleotids, welches die Schnittstelle überspannt. Im Beispiel 6 wird die Effizienz der Mutagenese für Varianten bei der Position der Mutationsstelle hinsichtlich einer Linearisierungsstelle bei einer konstanten Position untersucht. Im Beispiel 7 wird die relative Position der Linearisierungsstelle hinsichtlich der konstanten Position einer Mutation variiert, um die Wirkung auf die Effizienz der Mutagenese zu bestimmen. Im Beispiel 8 wird die Wechselwirkung des Zustands der linearisierten DNA (nämlich denaturiert gegenüber nicht denaturiert) untersucht.
Im Beispiel 9 wird die universelle Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung durch Verwendung von einer Reihe von Plasmiden, Stämmen von Wirtszellen, Restriktionsenzymen, Genen und Mutationen erläutert. Beispiel 10 erläutert die Anwendbarkeit der vorliegenden Erfindung auf die Mutagenese von chromosomaler DNA in situ. Beispiel 11 beschreibt die Verwendung der vorliegenden Erfindung in der Gentherapie. Im Beispiel 12 wird die vorliegende Erfindung auf die Klonierung von Genen angewendet.

Beispiel 1

Ein Plasmidsystem mit drei Eigenschaften wurde für die quantitative Charakterisierung des Mutageneseverfahrens gesucht. Die Eigenschaften waren: (i) Die Gegenwart eines Clusters von einzigen Restriktionsstellen zum Schneiden der Plasmid-DNA; (ii) die Anwendbarkeit des Plasmids für ein Farbscreening von Mutantenkolonien; und (iii) die Genauigkeit des Mutanten-Screening-Verfahrens. Das pUC9- Plasmid [Vieira et al., Gene 19, 259-268 (1982)] erfüllt die beiden ersten Kriterien, da es einen Polylinker und ein Indikatorgen besitzt (ein Fragment des lacZ-Gens, das für das Enzym beta-Galactosidase kodiert, das Indolyl-beta-D- galactosidase verdaut, die in dem Medium von Zellen vorkommt, die mit dem Vektor zur Erzeugung eines blauen Pigments transformiert wurden). Das dritte Kriterium wurde jedoch von pUC9 nicht erfüllt, da beide Mutationen (wie Nonsense- oder Leseraster-Mutationen) des Polylinkers innerhalb des lacZ-Gens und den Zellen, die umgelagerte Plasmide enthalten, Kolonien des gleichen Typs verursachen (weiße, auf einem Untergrund oder bei Wildtypen blaue Kolonien). Dies macht eine genaue Quantifizierung der Mutantenkolonien schwierig.
Das dritte Erfordernis wurde durch Konstruktion eines Derivats des pUC9-Plasmids erfüllt, das eine Leserastermutation im Polylinker enthält. Das Mutantenplasmid, pWM300, wurde unter Verwendung des Mutageneseverfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung gebildet, wie in Figur 1 gezeigt wird.
In Figur 1 werden Sequenzen des Polylinkers von pUC9 und zwei derivatisierter Plasmide gezeigt. Das Plasmid pWM300, ein Leserastermutant von pUC9, wurde mittels der Reparatur des DNA-Doppelstrangbruchs gemäß der vorliegenden Erfindung konstruiert. Das für die Mutagenese verwendete Oligonukleotid umfaßte die Reste -45 bis 14 von pWM300 (wie in Figur 1 numeriert).
Unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung wurde die DNA des pUC9-Plasmids mit dem PstI Restriktionsenzym linearisiert. Die Beendigung der Reaktion wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese bestätigt. Nicht geschnittene ringförmige Plasmidmoleküle steigern, falls sie in dem Verfahren benutzt wurden, den Untergrund der Wildtyp-Klone. Die Plasmid-DNA und das Oligonukleotid wurden dann in einer Denaturierungsmischung vereinigt. Die Denaturierungsmischung bestand aus 50 ng linearisierter Plasmid- DNA und 20 pMol des Oligonukleotids in einem Puffer, der aus 10 mM KCl, 5 mM Tris-HCl vom pH 8,0, 5 mM MgSO&sub4;, 0,5 mM Dithiothreitol in einem Gesamtvolumen von 30 ul in einem 1,5 ml Eppendorf-Reagenzgefäß bestand.
Die Mischung wurde 3 Minuten bei 100ºC (im einem siedenden Wasserbad) inkubiert, das Reagenzgefäß wurde dann entfernt und 5 Minuten auf Raumtemperatur gehalten, sein Inhalt wurde in 200 ul von kompetenten Zellen, die durch Behandlung mit CaCl&sub2; herge- stellt wurden [gemäß Mandel et al., J. Mol. Biol. 53, 159-162 (1970)], überführt und vorsichtig gemischt. Die Zellen und DNA wurden auf Eis 5 Minuten inkubiert und dann drei Minuten einem Wärmeschock bei 37ºC ausgesetzt. Nach Zugabe von 2 ml 2 x YT-Medium [hergestellt gemäß Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, 17 (1972)] wurden die Zellen bei 37ºC 1 Stunde inkubiert und dann auf LB-Platten [hergestellt gemäß Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, S. 433 (1972)], die 100 ug Ampicillin [GIBCO, Grand Island Biological Company, Grand Island, NY] und 20 ug/ml 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D- galactosid (Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri) enthielten, entsprechend aufgebracht.
Verfahren zur Isolierung von Plasmiden in großem Maßstab, Herstellung von Plasmid-DNA im Minimaßstab und Verdauung mit Restriktionsenzymen wurden so durchgeführt, wie es in [Davis et al., "Advanced Bacterial Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 116-117 (1980)] beschrieben wird. Das Primer-Extension-Verfahren wurde für die DNA-Sequenzierung angewandt, wobei gemäß Chen et al., DNA 4, 165-170 (1985), denaturierte Plasmid-DNA als Matrize verwendet wurde.

Beispiel 2

Das Plasmid pWM300 wurde als Substrat für weitere Mutagenesen verwendet. Wie in der Figur 2 erläutert wird, wurde das Plasmid PWM300 durch Schneiden mit dem Enzym SmaI gleichzeitig linearisiert und mit stumpfen Enden versehen. Nach Mutagenese mit dem Oligonukleotid, das in Figur 2 gezeigt wird, wird mit dem Mutageneseverfahren, das im Beispiel 1 gezeigt wird, das Plasmid pWM301 hergestellt. So wurde die kodierende Sequenz innerhalb des Polylinkers in den Leseraster gebracht, um ein Farbscreening der Transformanten zu ermöglichen. Zusätzlich wurde eine BstNI Position geschaffen, welche die Bestätigung des Vorliegens der Mutation durch Restriktionsanalyse ermöglichte. Die Position der Mutation wird durch einen vergrößerten Buchstaben angezeigt.
Wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird, waren die Mutationen, die in das pWM300-System eingeführt wurden, um das Mutageneseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, in typischer Weise Insertionen eines Restes, welcher den Leseraster des lacZ-Genfragments wiederherstellte. In diesem System bildeten die Mutanten blaue Kolonien, während die Zellen, die nur das ursprüngliche Plasmid (pWM300) und/oder umgelagerte Plasmide enthielten, die Bildung von weißen Kolonien verursachten.
Alle Insertionen, die in das Plasmid pWM300 eingeführt wurden, wurden so konstruiert, daß sie eine einzige Restriktionsstelle innerhalb des Polylinkers zerstören und gleichzeitig eine neue Restriktionsstelle schaffen können. Dieses Merkmal ermöglichte eine zusätzliche Bestätigung des Mutageneseergebnisses durch Restriktionsverdauung von Plasmid-DNA.

Beispiel 3

Eine Reihe von Oligonukleotiden mit einer Länge von 10 bis 60 Resten wurde synthetisiert, um den Effekt der Länge des Oligonukleotids auf die Effizienz der Mutagenese zu bestimmen. Die Oligonukleotide wurden mittel der Phosphoramiditmethode [Caruthers, Science 230, 281-285 (1985)] auf einem Modell 380A Synthesizer, erhältlich bei Applied Biosystems (Foster City, Californien) synthetisiert und mittels Polyacrylamidgel-Elektrophorese unter denaturierenden Bedingungen gereinigt. Die Sequenzen der Oligonukleotide waren homolog zu dem Segment des Plasmids pWM300 (wie in Figur 1 gezeigt wird) und waren symmetrisch zu der SmaI- Position von pWM300, wobei sie diese Position überspannten. Die Fragmente führten eine Insertion eines Adeninrestes in die SmaI-Position ein, wie in der Figur 3 gezeigt wird. Das Plasmid pWM300, linearisiert durch Verdauung mit dem Restriktionsenzym SmaI, wurde für die Mutagenese verwendet.
Die Figuren 3 und 4 erläutern die Rolle, die die Länge des Oligonukleotids bei der Mutagenese spielt. Die Sequenz des längsten verwendeten Oligonukleotids (mit 60 Resten) wird in Figur 3 gezeigt. Die Sequenzen der anderen Oligonukleotide waren Untersequenzen des 60ers , wie durch die horizontalen Linien angezeigt wird. Die Längen der Oligonukleotide sind am rechten Ende jedes Oligomers angegeben. Die eingeführte Mutation wird durch den größten Buchstaben in dem 60er Oligonukleotid angezeigt. In der durchgehenden Linie, die das Plasmid pWM300 darstellt, ist die SmaI- Schnittstelle durch einen Pfeil an der Lücke der Linie dargestellt. Das Plasmid pWM300 (50 ng) wurde ander SmaI- Position linearisiert und 20 pMol jedes der in Figur 3 gezeigten Oligonukleotide wurde für die Mutagenese gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 verwendet.
In der Figur 4 werden die Resultate des Experiments wiedergegeben. Die durchgehende Linie ist ein Graph der Effizienz der Mutagenese; die punktierte Linie ist ein Graph der Anzahl der Mutantenkolonien pro Platte. 20 Klone, die blaue Kolonien bildeten, wurden durch Verdauung mit der Endonuklease BstNI (BstNI war eine neu geschaffene Restriktionsstelle) untersucht, um die Gegenwart der gewünschten Mutation zu bestätigen. Alle 20 Klone zeigten das erwartete Verdauungsmuster, wie durch Agarose-Gelelektrophorese gezeigt wurde. Die DNA-Sequenz des Polylinkers wurde erhalten, wie oben für 2 Klone gezeigt wurde. Die Sequenz war so, wie es für den Mutanten erwartet wurde.
Eine hohe Effizienz der Mutagenese von über 90% wurde beobachtet, wenn Oligonukleotide mit der Länge von 30 und mehr Resten verwendet wurden, wie in der Figur 4 gezeigt wird, und die maximale Effizienz war 98% bei dem Oligonukleotid mit einer Länge von 50 Resten. Das Oligonukleotid mit einer Länge von 20 Resten ergab die Hälfte der Maximaleffizienz, während bei dem 10er oder 15er Oligonukleotid keine Mutanten beobachtet wurden. Obwohl die Effizienz der Mutagenese den höchsten Wert zu erreichen schien, wenn Oligonukleotide mit einer Länge von 40 oder mehr Resten verwendet wurden, wurde die Anzahl der Mutantenkolonien mit der Länge der DNA weiter gesteigert. So wird, um eine gute Effizienz der Mutagenese sicherzustellen, ein Oligonukleotid, das in dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden soll, vorzugsweise 20 bis 30 Reste lang sein, und besonders bevorzugt noch länger.

Beispiel 4

Die Wechselwirkung zwischen der Effizienz der Mutagenese gemäß dem Verfahren des Beispiels1 und der Menge der linearisierten Plasmid-DNA wird in der Figur 5 gezeigt, in der die durchgezogene Linie die Effizienz der Mutagenese erläutert und die punktierte Linie ein Graph der Anzahl der Mutantenkolonien pro Platte ist.
Das pWM300-Plasmid, linearisiert an der SmaI-Position, wurde in der Menge, die in Figur 5 angegeben ist, zusammen mit 20 pM des 60er Oligonukleotids, das in der Figur 3 abgebildet ist, verwendet. Titrationen wurden mit der Plasmid-DNA und dem Oligonukleotid durchgeführt, um die Mengen der DNA, die für die Mutagenese verwendet wird, zu optimieren.
Wie in der Figur 5 gezeigt wird, nahm die Effizienz der Mutagenese ab, wenn über 50 ng der Plasmid-DNA verwendet wurden, wenn die Konzentration des Oligonukleotids konstant gehalten wurde (20 pM des 60er Oligonukleotids pro Reaktion). Die Zahl der gebildeten Mutanten stieg jedoch mit der Menge der Plasmid-DNA in der Reaktion, um einen Höchstwert von etwa 100 ng DNA zu erreichen. Es werden daher bevorzugt etwa 50 ng der linearisierten Plasmid-DNA für die Mutagenese verwendet.
Ein großer molarer Überschuß des Oligonukleotids gegenüber der Plasmid-DNA ist für die Mutagenese wichtig, wie aus der Figur 6 ersichtlich ist. In der Figur 6 wurde die angegebene Menge des 60er Oligonukleotids der Figur 3 und 50 ng (etwa 20 fM, wie mit dem Pfeil angezeigt) des mit SmaI geschnittenen pWM300 in dem Verfahren gemäß Beispiel 1 verwendet. In der Figur 6 ist die durchgezogene Linie ein Graph für die Effizienz der Mutagenese und die punktierte Linie ein Graph für die Mutantenkolonien pro Platte.
Wie in der Figur 6 erläutert wird, wurde die maximale Zahl von Mutanten mit 20 pM des Oligonukleotids erhalten, während die Effizienz der Mutagenese einen Höchstwert bei einer Konzentration von 1 pM des Oligonukleotids erreichte. Diese Menge entsprach einem 1000fachen Übersachuß des Ologonukleoids.

Beispiel 5

Um besser die Stellen von Sequenzänderungen innerhalb des Oligonukleotids, die möglicherweise Mutanten hervorbringen können, und die Position des Oligonukleotids hinsichtlich der Linearisierungsstelle festzustellen, wurden mehrere Experimente unter Verwendung des Mutageneseverfahrens des Beispiels 1 durchgeführt.
Zuerst wurde das Plasmid pWM300 mit den Restriktionsenzym NdeI, das an einer Stelle etwa 240 bp vom Polylinker entfernt schneidet, linearisiert, um festzustellen, ob es wichtig ist, daß das Oligonukleotid die Schnittstelle überspannt. Dann wurde geprüft, ob die in der Figur 3 dargestellte 60er Sequenz, welche die SmaI-Stelle überspannt, Mutationen in dem mit NdeI geschnittenen Plasmid induzieren kann.
Unter 269 Transformanten wurden keine Mutanten beobachtet. Es ist bezeichnend, daß über 95% der Transformanten Mutanten sind, wenn das mit SmaI geschnittene Plasmid pWM300 unter den gleichen Bedingungen verwendet wird. Die Resultate zeigen, daß es wichtig ist, daß das Oligonukleotid die Linearisierungsstelle überspannt, um Mutanten zu erhalten.

Beispiel 6

Eine Reihe von Oligonukleotiden wurde synthetisiert, um die Abhängigkeit der Mutagenese gemäß dem Verfahren des Beispiels 1 von der Entfernung zwisschen einer Mutation und der Linearisierungsstelle zu definieren.
Die Oligonukleotide waren acht asymmetrische 60er mit Insertionen eines Restes an verschiedenen Positionen. Die Sequenzen der 60er, die für die Mutagenese verwendet wurden, werden in der Figur 7 als Modifikationen der Sequenz des Polylinkers des Plasmids pWM300 gezeigt. In der Figur 7 werden die Positionen der insertierten Mutationen auf den waagrechten Strichen gezeigt, die Oligonukleotide darstellen. Die genauen Orte der insertierten Reste werden durch Apostrophe auf der pWM300- Sequenz definiert. Die Insertionen schufen neue Restriktionsstellen, die am linken Ende der Linie angegeben sind. Das Oligonukleotid, welches die MnlI-Stelle einführte, enthielt die Insertion eines mit einer Punktmutation (...GCC AG...-...CC AG...) kombinierten Restes. Die Distanz zwischen der Mutation und der Schnittstelle wird durch die Länge der Spacer-DNA zwischen den beiden definiert. Die Distanzen (in Nukleotiden) werden an der rechten Seite der Figur angegeben.
Die 60er Oligonukleotide wurden auf ihre Fähigkeit untersucht, Mutationen in dem an der SmaI-Stelle linearisierten Plasmids pWM300 zu erzeugen. Die Ergebnisse werden in der Figur 8 erläutert, in der eine durchgezogene Linie graphisch die Effizienz der Mutagenese darstellt, eine gestrichelte Linie, welche die Anzahl der Mutantenkolonien, und eine punktierte Linie, welche die Anzahl der Nichtmutanten-Kolonien, die durch Zellen, welche die ursprünglichen oder umgelagerten Plasmide enthalten, gebildet werden, graphisch darstellen. Die Resultate zeigten, wie die Effizienz der Mutageneseresultate ergab, daß die Effizienz der Mutagenese schnell von 98% auf 13% abnahm, als die Distanz zwischen der Mutation und der Schnittstelle von 0 auf 8 Basenpaare (bp) anstieg. Die Hälfte der Maximal- Effizienz wurde bei einer Distanz von 5 bp erreicht.
Die Effizienz der Mutagenese bei einer Distanz von 17 Nukleotiden (nt) war 1,4% (6 Mutanten pro 422 Transformanten, bestätigt durch DNA-Sequenzierung). Die Distanz von 26 nt zwischen der Mutation und der Schnittstelle war das Maximum, das eine Mutation ermöglichte, und die Effizienz der Mutagenese betrug 0,2% (2 Mutanten pro 820 Transformanten, bestätigt durch DNA-Sequenzierung).
Parallel mit der Abnahme der Anzahl der Mutanten pro Platte stieg die Anzahl der weißen Nichtmutanten-Kolonien. Das deutet zwingend darauf hin, daß die Sequenzen des Wildtyps um die SmaI-Erkennungssequenz auf dem Oligonukleotid die Reparatur und die Herstellung der Plasmid-DNA lenken kann, wenn die Mutation distal zu der Schnittstelle (SmaI) ist.

Beispiel 7

Bei einem alternativen Annäherung an die Untersuchungen des Beispiels 6 wird die Position der Linearisierungsstelle variiert, indem verschiedene Restriktionsenzyme verwendet werden, die innerhalb des Polylinkers schneiden.
Das 60er Oligonukleotid, das eine Mutation an der SmaI- Stelle aufweist (die Sequenz ist in der Figur 3 angegeben), wurde verwendet, um die Reparatur gemäß dem Mutageneseverfahren des Beispiels 1 zu lenken. Das verwendete Oligonukleotid war der 60er der Figur 3 und wird in der Figur 9 mit einer dicken Linie angegeben. Lineare Plasmid-DNA wurde durch Verdauung von pWM300 mit einer von mehreren Restriktionsendonukleasen hergestellt. Ihre Erkennungsstellen werden durch Pfeile wiedergegeben. Ein Plasmidstrang mit einer Polarität, die identisch ist mit der des Oligonukleotids der Figur 1, wurde willkürlich ausgewählt, um die Positionen der Endonukleaseschnittstellen zuzuordnen.
Die Resultate dieses Experiments zeigen, wie in der Figur 10 graphisch dargestellt wird, die Abhängigkeit der Effizienz der Mutagenese (durchgehende Linie) und der Anzahl der Mutantenkolonien (punktierte Linie) von der Distanz zwischen einer Mutation und der Linearisierungsstelle. Die Distanz wird hier als die Länge der Spacer-DNA zwischen der Mutation und der Endonukleaseschnittstelle definiert. Wie in der Figur 10 gezeigt wird, sank die Effizienz der Mutagenese auf 40% bei einer Distanz von 7 bp und auf 2% bei einer Distanz von 13 bp.
Man muß verschiedene geometrisache Faktoren in Betracht ziehen, wenn ein Oligonukleotid für die Mutagenese entworfen wird. Da ein 20er das kürzeste Oligonukleotid war, bei dem eine Mutagenese beobachtet wurde, muß die Überlappung zwischen dem Oligonukleotid und der Plasmid-DNA an jeder Seite der Schnittstelle mindestens 10 nt betragen. Keine Mutanten wurden erhalten, wenn die Mutation weniger als 10 nt von dem Ende des Oligonukleotids entfernt liegt (wie in der Figur 8 und in einem analogen Experiment mit einem 40er, dessen Werte nicht gezeigt werden, dargestellt wird). Offensichtlich sollte die Mutation mindestens 10 nt vom Ende des verwendeten Oligonukleotids entfernt sein, um in die Plasmid-DNA inkorporiert zu werden.

Beispiel 8

Die Wechselwirkung der Beschaffenheit der linearisierten DNA (nämlich denaturiert gegenüber nicht denaturiert) wurde untersucht.
Wenn nicht denaturierte, SmaI verdaute pWM300 Plasmid-DNA zusammen mit dem 60er (die Sequenz wird in der Figur 3 gezeigt) in dem Verfahren des Beispiels 1 für die Mutagenese verwendet wurde, wurden nur 6 Mutanten unter insgsamt 57 Transformanten erhalten. In einem parallelen Experiment ergab die Verwendung von wärmedenaturierter Plasmid-DNA 1330 Mutanten von insgesamt 1360 Transformanten.
Es ist also für eine hohe Effizienz der Mutagenese wichtig, die lineare Plasmid-DNA vor ihrer Verwendung für die Transformantion zu denaturieren. Dies wird durchgeführt, indem eine Mischung der Plasmid-DNA und des Oligonukleotids 3 Minuten bei 100ºC inkubiert wird. Die Verwendung von nicht nicht denaturierter DNA erbringt eine viel niedrigere Effizienz der Mutagenese.

Beispiel 9

Um zu zeigen, daß das Mutageneseverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung nicht auf die Verwendung eines bestimmten Stammes beschränkt ist, wurden insgesamt vier Plasmide, drei E. Coli-Stämme, drei Gene und acht Restriktionsenzyme in dem Verfahren zur Einführung verschiedener Mutationen verwendet, wie es in der Tabelle 1 zusammengefaßt ist, Innerhalb des Bereichs von ±10 bp von der Schnittstelle aus wurden die Mutationen bei allen Versuchen in in ein Plasmid eingeführt, wobei das im obigen Beispiel 1 beschriebene Mutageneseverfahren verwendet wurde.
Vier Gruppen von Mutationen wurden entwickelt, nämlich: Insertion eines Restes, Deletion eines Restes, Punktmutation und Punktmutation kombiniert mit der Insertion eines Restes. Es sollte möglich sein, größere Insertionen, Deletionen oder mehrfache Punktmutationen zu erhalten, wenn man ein einziges Oligonukleotid verwendet. TABELLE I EINGEFÜHRTE MUTATIONEN Plasmid Stamm Typ der Mutation Gen/Mut.stelle Schnittstelle Distanz Mutation-Schnittstelle(nt) Länge des Oligonucleotids(nt) Effizienz (%) Insertion v. 1 Rest Deletion v. 1 Rest Punktmutation Insertion v. 1 Rest, Punktmutation, Kombination beider Polylinker β-Lactamase Gen Details siehe im Text
In der Tabelle 1 ist die Anzahl der Mutanten von der Gesamtzahl der Transformanten, die mittels DNA-Restriktionsanalyse gescreent wurden, in Klammern beigefügt. Die Konstruktionen wurden mittels DNA-Sequenzierung der relevanten Region von mindestens einem Klon jeder Klasse bestätigt. Alle Verfahren wurden, wie im Beispiel 1 geschildert, durchgeführt.
Für die Verwendung von pN01523 [Dean, Gen 15, 99-102 (1981)] in den Wirtsstämmen MC1009 [Casadaban et al., J. Mol. Biol. 138, 179-207 (1980)] oder CSH26 [Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, S. 17, (1972)], war die Nucleotidsequenz des Oligonukleotids die gleiche wie die Nukleotidsequenz vom Rest 371 bis zum Rest 429 des nicht kodierenden Strangs des rpsL-Gens [Post et al., J. Biol. Chem. 255, 4660-4666 (1980)]. Das Oligonukleotid enthielt eine Mutation, die zu der Insertion eines A/T Basenpaars zwischen die Reste 401 und 402 führte, wobei eine BstNI-Stelle geschaffen wurde.
Die Konstruktion des Oligonukleotids, das für pUC9 verwendet wurde [Vieira et al., Gene 19, 259-268 (1982)] im Stamm JM 83 [Vieira et al., Gene 19, 259-268 (1982)] wird im Beispiel 1 beschrieben.
Für die Verwendung vom Plasmid pWM111 [Mandecki et al., Gen (1986), im Druck] im Stamm JM 83 war die Distanz Mutation- Schnittstelle 3 Basen, die Oligonukleotidsequenz war diejenige vom Rest 1 bis Rest 59 des nicht kodierenden Strangs des C5a Genfragments [Mandecki et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, 3543-3547 (1985)]. Die eingeführte Mutation war eine A --> G Transition an der Position 24, welche eine HaeIII-Stelle schuf. Für die Verwendung vom Plasmid pWM111, wobei ein 59er Oligonukleotid verwendet wurde und wobei die Distanz von der Mutation zur Schnittstelle 0 war, wurde das gleiche Oligonukleotid verwendet, mit der Ausnahme, daß die eingeführte Mutation eine C --> G Transversion an der Position 27 war, die eine HpaII-Stelle schuf.
Für die Verwendung vom Plasmid pWM111, wobei ein 60er Oligonukleotid verwendet wurde, entsprach die Oligonukleotidsequenz den Resten 3819-3878 des kodierenden Strangs des β-Lactamasegens von pBR322 [Sutcliffe, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 43, 77-90 (1978)]. Die Mutation, eine G --> A Transition an der Position 3849, zerstörte die ScaI- und RsaI-Stellen.
Die folgenden E. coli-Stämme wurden als Wirtsstämme in diesen Experimenten und in den vorhergehenden Experimenten verwendet: CSH26 [(lac pro) ara thi] [Miller, "Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 17 (1972)], JM832 [ara, (lac proAB), 080, lacZ M15] [Vireira et al., Gene 19, 259-268 (1982)] und MC1009 [(lacIPOZY)X74, rpsL, galK, galU, (ara, leu)7697] [Casadaban et al., J. Mol. Biol. 138, 179-207 (1980)]. Die Plasmide pUC9 [Vireira et al., Gene 19, 259-268 (1982)] und pNO1523 [Dean, Gene 15, 99-102 (1981)] wurden von Pharmacia, Piscataway, New Jersey, erhalten und pWM111 stammte aus der Sammlung der Abbott Laboratories, Abbott Park, Illinois.

Beispiel 10

Das Verfahren des Beispiels 1 kann für den Zweck, definierte Mutationen in Chromosome in situ einzuführen, modifiziert werden.
Zellen können, um Doppelstrangbrüche zu induziern , mittels Bestrahlung [z.B. gemäß dem Verfahren von Hutchinson et al., Proc. Nucl. Acids Res. 32, 115-154 (1985)], mittels Verwendung von Arzneimitteln [z.B. gemäß dem Verfahren von Walker et al., Ann. Rev. Genet. 19, 103-126 (1985)] oder mittels Verwendung von derivatisierten DNA-Proben [z.B. gemäß den Verfahren von Dreyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, 968-972 (1985) und Dervan, Science 232, 464-471 (1986)] behandelt werden. Oligonukleotide, welche die gewünschte Mutation verwirklichen, werden in die Zellen eingeführt, z.B. mittels durch CaCl&sub2; bewirkte Transformation, wie im Beispiel 1 beschrieben, oder mittels Elektroporation, wie von Smithies et al., Ref. wie oben, beschrieben. Die Zellen werden unter Bedingungen gehalten, die ihre Lebensfähigkeit ermöglichen und die DNA-Reparatur innerhalb der Zellen nicht stören. Die Zellen werden dann auf das Vorhandensein der gewünschten Mutation nach einem Zeitraum, der ausreicht, um die DNA-Reparatur zu ermöglichen, gescreent [z.B. mittels der Southern-Blot- Analyse, wie sie von Williams et al., Nature 310, 476-480 (1084) beschrieben wurde].

Beispiel 11

Besonders in dem Fall, daß derivatisierte Oligonukleotidproben verwendet werden, um gezielt einen Doppelstrangbruch in ein Chromosom an ausgewählten Positionen einzuführen, kann das Verfahren gemäß Beispiel 10 für eine Gentherapie verwendet werden (das heißt für eine genetische Modifikation, die zu einer gewünschten Änderung im Phänotyp führt).
Speziell können nach Identifizierung einer Sequenz in einem Teil des Chromosoms, der geändert werden kann, um in einer Zelle oder in einem Organismus den gewünschten Phänotyp zu erzeugen, Oligonukleotidproben konstruiert werden, welche die Mutation konkretisieren, die zur Erzeugung des gewünschten Phänotyps erforderlich sind. Zellen (einschließlich Eizellen, aber nicht beschränkt auf diese) können aus einem Organismus extrahiert werden, oder es können Zellen einer Zellinie verwendet werden. Ein Doppelstrangbruch kann in einem Chromosom innerhalb der Zellen durch Verwendung von derivatisierten DNA-Proben, die spezifisch für die zu mutierende Stelle sind, gemäß dem Verfahren von Dreyer et al., Ref. siehe oben, oder von Dervan, Ref. siehe oben, geschaffen werden. Mehr als ein Strangbruch kann induziert werden, wo beispielsweise ein Segment eines Chromosoms deletiert oder ersetzt werden soll. Oligo nukleotide, welche die gewünschte Mutation enthalten, können dann in die Zellen mittels einer Modifikation des Verfahrens des Beispiels 1 eingeführt werden oder mittels einer Anzahl von Methoden wie Mikroinjektion [siehe z.B. Brinster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 82, 4438-4442 (1985)], Elektroporation [siehe z.B. Smithies et al., Ref. wie oben] oder Fusion mit einem Liposom, das die Oligonukleotide enthält [siehe z.B. Lurquin, Nucleic Acids Res.6, 3773-3784 (1979)]. Die Zellen können dann auf das Vorhandensein der gewünschten Mutation gescreent und in einen Organismus eingeführt [siehe z.B. Williams et al., Ref. wie oben] oder, je nach Bedarf, kultiviert werden.

Beispiel 12

Die vorliegende Erfindung kann zum DNA-Klonieren eines DNA- Segments angewendet werden, indem das DNA-Segment kovalent an einen linearisierten Vektor gekoppelt wird, wobei zwei Oligonukleotide, die jeweils einen Bruch zwischen einem ersten Ende der DNA, die kloniert werden soll, und einem ersten Ende eines linearisierten Vektors, und zwischen einem zweiten Ende der der DNA, die kloniert werden soll, und einem zweiten Ende eines linearisierten Vektors überspannen.

Beispiel 13

Brückenmutagenese ist eine effiziente Methode, um Insertionen benachbart zu einer einzigen Restriktionsstelle zu schaffen. In diesem Beispiel wird die Durchführbarkeit des Klonierens von relativ großen Insertionen (bis zu 100 nt) mittels Brückenmutagenese bewiesen. Eine Reihe von Oligonukleotiden mit Inserten von verschiedener Größe wurde synthetisiert. Die Länge der Inserte betrug 1, 40, 70 und 100 nt. Die Länge der Oligonukleotide einschließlich der beiden Teile, welche die Homologie mit dem Plasmid bewirken, beträgt 31, 70, 100 und 130 nt. Das Plasmid pWM300 wurde als Klonierungsvektor verwendet. Alle Oligonukleotide ergaben Plasmide mit Insertionen (Figur 11). Das Verfahren wird jedoch mit steigender Größe der Insertionen weniger effizient, wie durch die Zahl der Mutantenkolonien pro Platte gezeigt wird (die von 3900 Kolonien mit einer Insertion von 1 nt auf 77 Kolonien mit der Insertion von 70 nt fiel), oder durch den prozentualen Anteil der Mutanten unter allen Kolonien (er fiel von 95% auf 48%).
Die Resultate zeigen, daß die Brückenmutagenese ein brauchbares, schnelles und einfaches Verfahren zum Klonieren großer DNA-Sequenzen ist. Die Methode wurde die Basis für das dargestellte Gensyntheseverfahren.

Beispiel 14

Due Oligonukleotidsequenz, die in der Figur 11 gezeigt wird sie entspricht den Aminosäureresten 1 bis 143 des humanen Immundefekt-Virus (HIV)), wurde in einen Plasmidvektor pWM300 unter Verwendung des Verfahrens der vorliegenden Erfindung kloniert. Das Oligonukleotid der Figur 11 wurde mittels der Phophor amiditmethode synthetisiert. Das Oligonukleotid enthielt zwei "Arme", die sich von beiden Enden der Sequenz der Figur 11 erstreckten, wie in der Figur 12 gezeigt wird.
Jeder der beiden Arme enthält eine Sequenz, die der DNA-Sequenz an einer Seite einer SmaI-Schnittstelle auf dem Plasmid pWM500 entspricht. Das Plasmid pWM500 kann durch viele andere Plasmide ersetzt werden, und die Nukleotidsequenzen der "Arme" können geändert werden, um den Nukleotidsequenzen auf beiden Seiten des Doppelstrangbruchs zu entsprechen. Das Restriktionsenzym, das für die Bildung des genannten Bruchs verwendet wurde, sollte vorzugsweise stumpfe DNA-Enden bilden. Das Plasmid pWM500 wurde mit SmaI-Restriktionsendonuklease geschnitten.
Das Oligonukleotid der Figur 12 (20 pM) und mit SmaI verdautes pWM500 (50 ng) wurden zu einem Denaturierungspuffer (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM KCl, 5 mM MgCl&sub2;) gegeben und 3 Minuten auf 100ºC erhitzt (im siedenden Wasserbad).Die Mischung wurde 5 Minuten auf Raumtemperatur gekühlt. Die Mischung wurde zu kompetenten JM83-Zellen gegeben (200 ul [ara, (lac-proAB), 80, lacZ DM15]), die durch Behandlung mit CaCl&sub2; hergestellt worden waren. Die Zellmischung wurde 5 Minuten auf Eis inkubiert und 3 Minuten bei 37ºC einem Wärmeschock unterworfen. LB-Kulturlösung wurde zugegeben und die Mischung wurde 60 Minuten bei 37ºC inkubiert. Das Zellpellet wurde dann auf ampicillinhaltige (100 u/ml) LB-Platten aufgestrichen. Die Zellen, die das geeignete Plasmid enthielten, wurden mittels bekannter Methoden isoliert und gezüchtet. Die DNA wurde dann aus den Zellen extrahiert, auf einem CsCl-Gradienten gereingt und die Insertionen wurden sequenziert.

Beispiel 15

Das Verfahren der vorliegenden Erfindung kann auch verwendet werden, um DNA-Sequenzen aus Plasmiden in der Nachbarschaft eines Doppelstrangbruchs (z.B. eines SmaI Bruchs) zu deletieren. Das Verfahren der Deletion von DNA-Sequenzen wird in der Figur 13 gezeigt.
Eine Deletion einer DNA-Sequenz in einer Plasmid-DNA kann durchgeführt werden, indem man ein Oligonukleotid mit einer DNA-Sequenz, die der DNA-Sequenz auf beiden Seiten der vorgeschlagenen Deletion entspricht, synthetisiert. Beispielsweise ist die Oligonukleotidsequenz, wie in der Figur 13a gezeigt ist, A'B'G'H', und die DNA-Sequenz auf beiden Seiten des nicht geschnittenen Plasmids ist
A B C D E F G H C D E F
A'B'C'D'E'F'G'H', wobei C'D'E'F' deletiert werden soll. Das Plasmid wird mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten, das innerhalb der Sequenz schneidet, die deletiert werden soll. Die Mischung des Oligonukleotids und der Plasmid-DNA wird denaturiert (wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben) und gekühlt. Das ermöglicht vielleicht die Bildung einer Struktur, wie sie in der Figur 13(b) gezeigt wird, wo das Oligonukleotid überbrückt und an die entsprechenden Sequenzen in der Plasmid-DNA auf beiden Seiten des Bruchs hybridisiert. Kompetente E. coli-Zellen werden dann mit der Mischung transformiert. Es wurde gefunden, daß ein großer Teil der erhaltenen Klone Plasmide mit der erwarteten Deletion erhalten wird, wie in der Figur
A B G H
13(c) gezeigt wird, nämlich A'B'G'H'.

Beispiel 16

Gensynthese mittels "Walking"

Die vorliegenden Erfindung kann auch dazu verwendet werden, mehrere DNA-Sequenzen in Plasmid-DNA zu insertieren, eine Insertion zu einem Zeitpunkt, wo die Insertionen eine kontinuierliche DNA-Region in dem Plasmid bilden.
Wie in der Figur 14 gezeigt wird, wird ein Plasmid ausgewählt oder konstruiert, das eine Restriktionsenzym- Erkennungsstelle für ein Enzym aufweist, welches außerhalb der Erkennungsstelle schneidet, z.B. BsmI oder andere Restriktionsenzyme der Klasse IIS. Die Restriktionsstelle liegt bevorzugt zwischen einem Promotor und einer Indikatorgensequenz, z.B. einem lacP-Promotor und einem lacZ-Indikatorgenfragment. Der Promotor und die Indikatorgensequenz dienen zum Screenen und zur Expression. Die Insertionen sind sequentiell kloniert. Zuerst wird das Plasmid angrenzend an die BsmI-Stelle mit BsmI geschnitten. Eine Oligonukleotidsequenz mit drei Regionen wird hergestellt. Die erste Region ("Arm 1") entspricht der DNA-Sequenz auf einer Seite des Bruchs. Die zweite Region ("Arm 2") entspricht der DNA-Sequenz auf der anderen Seite des Bruchs. Die dritte Region ist die Insertion, sie befindet sich zwischen der ersten und zweiten Region. Das Oligonukleotid wird mit dem geschnittenen Plasmid gemischt und denaturiert (wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben). Die Mischung wird in kompetente E. coli-Zellen mittels Transformation eingeführt. Die Zellen werden auf das Vorhandensein der Insertion gescreent, wobei die Expression des lacZ-Genfragments verwendet wird.
Die Plasmid-DNA wird zu Beginn so selektiert oder konstruiert, daß das lacZ-Genfragment innerhalb des Leserasters ist (Figur 14(a)). Wenn die Insertion richtig konstruiert und kloniert wird, wird lacZ außerhalb des Leserasters sein, so daß das β-Galactosidasefragment nicht exprimiert wird. Die Kolonien mit den richtigen Insertionen werden also weiß sein.
Das Verfahrenn kann mit einer zweiten Insertion wiederholt werden ("insert 2", Figur 14d). Beispiele für Gensythesen mittels Walking werden in den Beispielen 17-24 geliefert, in denen die Synthese von Expressionsvektoren für den dritten Faktor des humanen Anaphylatoxinkomplement-Systems, C3a, beschrieben wird.

Beispiel 17

Synthese des humanen Anaphylatoxinkomplement-Gens

Der dritte Faktor des humanen Anaphylatoxinkomplement- Systems, C3a, wurde als zu synthetisierendes Modellgen verwendet, wobei die Gensynthese mittels "Walking" benutzt wurde, wie es im Beispiel 16 beschrieben wird. Humanes C3a ist ein ziemlich kleines, stark kationisches Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 9.000 Dalton (77 Aminosäuren). Figur 15 zeigt die Aminosäurensequenz. Eine Nukleinsäurensequenz (Figur 15) wurde von den Aminosäuredaten abgeleitet, indem eine Sequenz geschaffen wurde, die zusätzlich zur Verwendung einer E. coli- Codonpräferenz für stark exprimierte Gene (Gouy, M. et al., Nucleic AcidsRes. 10[22], 7055, 1982) so viele einzige Restriktionsstellen als möglich enthielt. Einzige Restriktionsstellen werden für zukünftige Mutagenesen durch Fragmentaustausch benötigt.
Die vollständig abgeleitetet Nukleotidsequenz für das C3a- Gen wird in der Figur 15 gezeigt. Es besteht aus den einzigen BamHI- und HindIII-Enden an den 5'- und 3'-Enden. Diese Stellen wurden zum Klonieren in einen Expressionsvektor (z.B, pWM200) zugegeben, nachdem das Gen synthetisiert worden war. Zwischen der BamHI-Stelle und dem Met-Startcodon liegt eine lac-Ribosomenbindungsstelle. Die gesamte C3a-Sequenz folgt mit einem einzigen TAA Translationsstopcodon, das einen Teil der terminalen HindIII-Stelle bildet.
Das Gen wurde in drei synthetische Oligodesoxyribonukleotide unterteilt (Figur 19), von denen jedes einen Teil der Sequenz des gesamten Gens enthielt. Oligo #1 (125er) bestand aus 18 nt an beiden 5'- und 3'-Enden, die zu der Sequenz an beiden Seiten der BsmI Schnittstelle von pMH1 nach Schneiden mit BsmI komplementär waren. Der 3' "Arm" enthielt die BsmI- Sequenz zur Regenerierung der 3'-Region des Gens. Die Insertion von 89 Basen von Oligo #1 enthielt die BamHI- Sequenz, die Ribosomenbindungsstelle, das Met-Startcodon und die ersten 21 Aminosäurereste, welche die aminoterminale Region von C3a darstellen. Oligo #2 (124er) enthielt 18 nt an dem 5'-Ende, die zu den letzten 18 nt der Gensequenz von Oligo #1 komplementär waren; 18 nt am 3'-Ende, die zu der Vektorsequenz komplementär waren und die BsmI-Stelle enthielten und eine Insertion von 88 Basen mit Codons, die für die Aminosäuren 22-50 von C3a kodieren. Oligo #3 (122er) enthielt 18 nt an dem 5'-Arm, die zu den letzten 18 nt der Gensequenz von Oligo #2 komplementär waren; 18 nt am 3'-Ende, die zu der Vektorsequenz komplementär waren und die BsmI-Stelle enthielten und eine Insertion von 86 Basen mit den Codons, die für die letzten 22 Aminosäuren von C3a kodieren, mit einem einzigen TAA-Stopcodon und einer terminale HindIII-Stelle.
Den endgültigen Plasmidkonstruktionen, die das erste Drittel, das zweite Drittel und das komplette Ca3-Gen enthielten, wurden als pC3H1, pC3H2 und pC3H3 benannt. Die Synthese dieser drei Plasmide wird ind dne Beispielen 20, 21 und 22 beschrieben.
Alle synthetischen Oligodesoxyribonukleotide, die hier beschrieben werden, wurden auf einem Applied Biosystem 380A Sythesizer synthetisiert, wobei Nukleosid-O-(2-cyanoethyl)- N,N-diisopropyl-phophordiamidit verwendet wurde. Die Synthese wurde auf "0,2 uMol 1000 A controlled pore glass"- Säulen (Applied Biosystems) unter Verwendung des Small Scale Cycle, empfohlen von ABI, durchgeführt. Die Oligodesoxyribonukleotide wurden auf 10%igem Polyacrylamidgel (1/20 bis-Acrylamid). 1X TBE (89 mM Tris-borat, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA) unter denaturierenden Bedingungen gereinigt. Die DNA-Banden des Produkts wurden aus dem Gel herausgeschnitten und über Nacht bei 37ºC durch Einweichen in einen Elutionspuffer (0,5 M Ammoniumacetat, 1 mM EDTA) eluiert. Die DNA wurde zweimal mit Ethanol gefällt und in 50 ul dest. H&sub2;O resuspendiert.
Acrylamid, bis-Acrylamid. Tris und Borsäure wurden bei International Biotechnologies, Inc. gekauft. EDTA stammte von Sigma, Ammoniumacetat von Fisher. Alle Chemikalien , die für die DNA-Synthese verwendet wurden, wurden von Applied Biosystems gekauft.

Beispiel 18

Konstruktion von Klonierungsvektoren

Ein Stammklonierungsvektor wurde so konstruiert, daß er eine einzige Restriktionsstelle innerhalb der SmaI-Stelle der Polylinkersequenz einer von pUC abgeleiteten Reihe von Plasmiden enthielt. Das alleinige Erfordernis der einzigen Restriktionsstelle war, einen einzigen Dopelstrangschnitt zu produzieren, wobei zumindest einer der Stränge direkt im Anschluß an die Stelle geschnitten wird. BsmI erfüllt diese Erfordernis. Es hat eine nicht palindromische Erkennungssequenz von 6 Basen und produziert einen Doppelstrangschnitt mit einem mit zwei Basen herausregenden 3'-Ende. Es wird aus dem Bacillus stearothermophilus NUB 36 isoliert und von den New England Biolabs verkauft. Die Figur 16 zeigt die BsmI Erkennungssequenz und das Schnittmuster, wobei N ein beliebiges Nukleotid bedeutet.
Die pUC-Reihe von Plasmiden stellt eine Basis dar, von der aus der Stammklonierungsvektor der vorliegenden Erfindung zu konstruieren ist. Diese Plasmide enthalten das lacZ-Gen mit einem Polylinker in der Region des Aminoterminus der β-Galactosidase zusätzlich zu einem β-Lactamasegen und einem Replikationsursprung vom ColE1-Typ. Es hat eine große Anzahl von Kopien und kann mit Chloramphenicol amplifiziert werden. Ein weiterer Vorteil ist die Abwesenheit von irgendwelchen BsmI-Stellen auf dem Plasmid.
Die Konstruktion von pMH1 aus pWM300 wird in der Figur 17 gezeigt. pWM300 ist ein Derivat von pUC9 (erhältlich bei Pharmacia) mit einer Deletion einer einzigen Base innerhalb der PstI-Stelle des Polylinkers. Diese Deletion verursacht eine Mutatiom durch Leserasterverschiebung im lacZ und ergibt weiße Kolonien auf einer X-Gal Platte.
Eine BsmI-Stelle wurde in die SmaI-Stelle von pWM300 mittels eines synthetischen 37er Oligodesoxyribonukleotids insertiert, wobei das Protokoll für die oligonukleotidgerichtete Doppelstrangbruch-Reparatur der vorliegenden Erfindung verwendet wurde. Die Gesamtlänge der Insertion war ein 7er, der eine Leserasterverschiebung des lacZ zurück in den Leseraster verursachte und blaue rekombinante Kolonien ergab.
50 ng des mit SmaI geschnittenen pWM300 und 20 pM des synthetisachen 37ers wurden in 200 ul gefrorener kompetenter E. coli JM83-Zellen (Vieira J. et al, Gene 19, 259, 1982) transformiert und auf LB-Platten (GIBCO) aufgetragen, die 100 ug Ampicillin und 1,6 mg X-Gal (5-Brom-4-chlor-3- indolyl-β-D-galactosid) enthielten. Die Platten wurde 15 Stunden bei 37ºC inkubiert und die blauen Kolonien gezählt. Von insgesamt 546 Kolonien waren 528 blau, was eine Effizienz der Mutagenese von etwa 97% entspricht. Zwei blaue Kolonien wurden herausgenommen und in 200 ml LB-Kulturlösung (10 g Bacto-Trypton, 5 g Bacto-Hefeextrakt, 10 g NaCl pro Liter) plus 100 ug/ml Ainpicillin gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde mit 20 ug/ml Chloramphenicol amplifiziert (Frenkel L. et al., DNA 5[6], 539, 1986) und unter Verwendung des NaOH/SDS Lyse-Verfahrens (Birnboim H. et al., Nucleic Acids Res. 7, 1513 1979) isoliert.
Um das Vorhandensein der BsmI-Stelle zu überprüfen, wurden 500 ng der Plasmid-DNA mit 4 Einheiten BsmI unter Bedingungen, die von den New England BioLabs empfohlen wurde, geschnitten. Die mit BsmI behandelte DNA wurde auf einem 0,8% Agarose (Sigma), 0,5X TBE (45 mM Tris-borat, 45 mM Borsäure, 1 mM EDTA)-Gel entlang nicht geschnittener DNA laufen gelassen. Beide Plasmidpräparationen zeigten eine einzige Bande mit korrektem MW. Dieses Plasmid wurde pMH1 benannt und wurde für alle folgenden Klonierungen verwendet.
Die Figur 18 zeigt, wie die alternierende X-Gal-Farbselektion funktioniert, wo X und N in der Figur 18 irgendein Nukleotid darstellen. Durch Konstruieren des insertierten Oligodesoxyribonukleotids in der Weise, daß lacZ innerhalb oder außerhalb des Leserasters liegt, kann die Farbe zwischen blau oder weiß abwechseln. Die Figur 18 zeigt auch, wie die drei C3a-Oligodesoxyribonukleotide konstruiert wurden, um dieses Farbauswahlschema zu verwerten. Oligo #1 stellte einen weißen Phänotyp her, indem eine Leserasterverschiebung im lacZ durch eine Insertion eines T, folgend auf Lys-21, verursacht wurde. Dieses insertierte T ist die erste Base des Cys-22-Codons. Oligo #2 verursachte einen Wechsel von weiß nach blau durch Mutagenese der ersten beiden A-Reste des Lys-51 Codons. Oligo 3# verursachte einen Wechsel von blau nach weiß auf Grund eines TAA-Translationssstop-Codons.

Beispiel 19

Schneiden des Klonierungsvektors mit BsmI

In der vorliegenden Erfindung muß vor jede sequentiellen Klonierungsstufe die rekombinante Gensequenz mit BsmI geschnitten werden. Verschiedene Varianten dieser Stufe sind ausgearbeitet worden, um den speziellen Bedürfnissen des Untersuchenden entgegenzukommen.
Gemäß dem üblichen Protokoll werden 500 ng von mit CsCl gereinigter Plasmid-DNA mit 8 Einheiten von BsmI in einem Reaktionsvolumen von insgesamt 50 ul geschnitten, um eine endgülige DNA-Konzentration von 10 ng/ul zu erhalten. Die Verdauung wird 3-4 Stunden bei 37ºC in einer zugeschmolzenen Accupette-Glaspipette von 200 ul durchgeführt. Etwa 50 ng (5 ul) werden direkt für die Mutagenese mit 20 pM des geeigneten Oligodesoxyribonukleotids verwendet.
Wenn eine hohe Gesamtmenge an DNA ein Problem darstellt, kann der mit BsmI geschnittene Vektor von der nicht geschnittenen DNA mittels Polyacrylamid-Gelelektorphorese gereinigt werden. Dieses Protokoll erfordert wegen der Verluste am Gel eine größere Menge der zu schneidenden DNA. Etwa 5 ug der Plasmid-DNA wird mit 12 Einheiten BsmI 5 Stunden bei 65ºC in einem Gesamtvolumen von 50 ml verdaut. Die Probe wird auf 5%iges Polyacrylamid (1/50 bis-Acrylamid), 1X TBE (89 mM Tris-borat, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA)-Gel aufgegeben und für 2 Stunden einer Elektrophorese bei 10 Watt unterworfen. Unter diesen Bedingungen wandert die geschnittene DNA mit einer größeren Geschwindigkeit als die nicht geschnittene überhelikale DNA. Das Gel wird für wenige Minuten mit dest. Wasser, das 0,5 ug/ml Ethidiumbromid enthält, durchtränkt und die DNA wird mittels UV-Beleuchtung sichtbar gemacht. Die Bande wird ausgeschnitten und in ein Eppendorf-Reagenzgefäß gedrückt. Die DNA wird eluiert, indem der zerdrückte Streifen des Acrylamidgels mit 0,5 ml eines Elutionspuffers (0,5 mM Ammoniumacetat, 1 mM EDTA) über Nacht bei 37ºC durchweicht wird.
Das Acrylamid wird von der Pufferlösung mittels Zentrifugation durch ein 0,2 4m Centrex-Mikrofilterröhrchen (Schleicher & Schuell) abgetrennt. Die DNA wird durch Zugabe von 2 Volumteilen Ethanol gefällt und für 2-3 Stunden bei -20ºC aufbewahrt. Die DNA wird in Mikroröhrchen zentrifugiert und in 10 ul sterilen dest. Wasser resuspendiert.
Die DNA-Konzentration kann angenähert bestimmt werden, indem man 1 ul über ein 0,8% Agarose, 0,5X TBE-Gel mit DNA- Vergleichsstandards laufen läßt. Ein typischer Durchlauf erbrint 20% der ursprünglchen 5 ug und ergibt eine Endkomzentration von etwa 50 ng/ul.
Wenn bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung eine große Zahl von Genfragmenten für die Synthese eines Gens verwendet wird und die Zeit ein begrenzender Faktor ist, kann die Isolierung und Reinigung mit CsCl weggelassen werden. DNA in minipräparativem Maßstab kann die CsCL-DNA ersetzen. 500 ng solcher mini-präparativer DNA kann mit 8 Einheiten von BsmI bei 65ºC 3-4 Stunden geschnitten und direkt für die Mutagenese ohne Phenol/Chloroform- Extraktionen oder RNAse-Behandlung verwendet werden. Obwohl dieses spezielle Protokoll schnell ist, kann eine hohe Gesamtmenge an DNA ein Problem sein.

Beispiel 20

Konstruktion von pC3H1 aus pMH1

pMH1 wurde unter Anwendung der im Beispiels 19 beschriebenen Bedingungen mit BsmI geschnitten. Der linearisierte Vektor wurde mit dem C3a Oligonukleotid #1 gemischt und hybridisiert und in gefrorene kompetente J83-Zellen transformiert, wobei das Protokoll der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen oligonukleotid-gerichteten Reparatur eines Doppelstrangbruchs verwendet wurde. Mehrere Transformanten, die einen weißen Phänotyp aufwiesen, wurden auf das Vorhandensein des C3a-Genfragments durch Verdauen des rekombinanten Plasmids mit PvuII untersucht. Mutanten, die das C3a-Fragment enthielten, wurden durch Anzeigen des richtigen PvuII-Restriktionsmusters identifiziert. Plasmid- DNA mehrerer Mutanten wurde mittels eines CsCl-Gradienten gereinigt und sequenziert. Das rekombinante Plasmid, welches das erste Genfragment von humanem C3a enthielt, wurde pC3H1 benannt.

Beispiel 21

Konstruktion von pC3H2 aus pC3H1

pC3H1 wurde mit BsmI unter Anwendung der im Beispiel 19 beschriebenen Bedingungen geschnitten. Der linearisierte Vektor wurde mit dem Ca3 Oligonukleotid #2 gemischt und hybridisiert und in gefrorene kompetente JM83-Zellen transformiert, wobei das Protokoll der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen oligonukleotid-gerichteten Reparatur eines Doppelstrangbruchs verwendet wurde. Mehrere Transformanten, die einen blauen Phänotyp aufwiesen, wurden auf das Vorhandensein der ersten beiden C3a Genfragmente durch Verdauen des rekombinanten Plasmids mit PvuII untersucht. Mutanten, welche die ersten beiden C3a- Fragmente enthielten, wurden durch Anzeigen des richtigen PvuII-Restriktionsmusters identifiziert. Plasmid-DNA der beiden Mutanten wurde mittels eines CsCl-Gradienten gereinigt und sequenziert. Das rekombinante Plasmid, das die ersten beiden Drittel des humanen C3a Gens enthielten, wurde pC3H2 benannt

Beispiel 22

Konstruktion von pC3H3 aus pC3H2

pC3H2 wurde mit BsmI unter Anwendung der im Beispiel 19 beschriebenen Bedingungen geschnitten. Der linearisierte Vektor wurde mit dem C3a Oligonukleotid #3 gemischt und hybridisiert und in gefrorene kompetente JM83-Zellen transformiert, wobei das Protokoll der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen oligonukleotid-gerichteten Reparatur eines Doppelstrangbruchs verwendet wurde. Mehrere Transformanten, die einen weißen Phänotyp aufwiesen, wurden auf das Vorhandensein des kompletten C3a Gens durch Verdauen des rekombinanten Plasmids mit PvuII untersucht. Mutanten, welche das komplette C3a-Gen enthielten, wurden durch Anzeigen des richtigen PvuII-Restriktionsmusters identifiziert. Plasmid-DNA des einzigen Mutanten wurde mittels eines CsCl-Gradienten gereinigt und sequenziert. Das rekombinante Plasmid, welches das komplette humane C3a Gen enthielten, wurde pC3H3 benannt

Beispiel 23

Transformation von E. coli mit pC3H3

Die Transformation war dieselbe wie im Beispiel 1.
Es ist zu erwarten, daß den Fachleuten zahlreiche Modifikationen und Varianten der vorliegenden Erfindung einfallen, wenn sie die vorangegangene Beschreibung überdenken. Beispielsweise wird es für den Fachmann naheliegend sein, beliebige lineare, einzelsträngige DDesoxyribonukleinsäuren in den Verfahren der vorliegenden Erfindung zu verwenden, obwohl hier der Ausdruck Oligonukleotid verwendet wird. Ebenso wird es für den Fachmann ohne weiteres ersichtlich sein, daß die vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, um Gruppen von Nukleotiden, die ein oder mehrere Codons beinhalten, zu insertieren, deletieren oder substituieren (das heißt gleichzeitig zu deletieren und insertieren), um aus einem Gen, das für eine natürlich vorkomende Form kodiert, Gene zu erhalten, die für Analoge von Polypeptiden kodieren.
Es wird daher beabsichtigt, daß die vorliegende Erfindung nur auf den Umfang beschränkt wird, der durch die beigefügten Ansprüche gezeigt wird.

Claims

1. Ein Verfahren zum sequentiellen Genzusammenbau umfassend:

a) Bereitstellen eines DNA-Moleküls mit einer Restriktionsenzym-Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym, welches außerhalb der Erkennungsstelle schneidet,

b) Schneiden des DNA-Moleküls mit dem besagten Enzym,

c) Bereitstellen eines ersten Oligonukleotids, das eine erste Teilsequenz aufweist, die zu einer Nukleotidseqenz des besagten DNA-Moleküls auf einer Seite der Schnittstelle komplementär ist, weiter eine zweite Teilsequenz, die zu einer Nukleotidsequenz des genannten DNA-Moleküls auf der anderen Seite der Schnittstelle komplementär ist, und eine dritte Teilsequenz zwischen der ersten und zweiten Teilsequenz enthält, die eine Nukleotidsequenz aufweist, die einen Anteil der Gensequenz beinhaltet, die in das besagte DNA-Molekül eingefügt werden soll,

d) Exponieren des besagten geschnittenen DNA- Moleküls mit dem ersten ersten Oligonukleotid, und Denaturieren des DNA-Moleküls,

e) Transformieren einer Wirtszelle mit dem besagten ersten Oligonukleotid und dem besagten DNA-Molekül, um das Fragment in das DNA-Molekül einzufügen,

f) Wiederholen der Stufen b - e mit mindestens einem anderen Oligonukleotid, das eine dritte Teilseqenz mit einer Nukleotidsequenz enthält, die zu einem anderen zu insertierenden Fragment komplementär ist.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, worin der größere Teil einer lacZ kodierenden Region sich in 3'-Richtung zu besagter Restriktionsenzym-stelle befindet.

3. Verfahren gemäß Anspruch 2, das zudem ein Screening des besagten DNA-Moleküls für die lacZ-Expression zur richtigen Insertion der genannten Inserts einschließt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die besagte Restriktionsenzym-stelle sich in 3'-Richtung zu einem Promotor befindet.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4, worin der besagte Promotor lacP ist.

6. Verfahren gemäß Anspruch 2, worin die besagten Inserte eine Gensequenz für humanes C3a umfassen.