DE10048009A1 - Verfahren zum Nachweis von Pilzinfektionen - Google Patents

Verfahren zum Nachweis von Pilzinfektionen

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis klinisch relevanter Pilzinfektionen, bei dem, ausgehend von aus Patientenmaterial isolierter DNA, eine Multiplex-Amplifikationsreaktion zum Nachweis von klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattungen Candida und Aspergillus durchgeführt wird, wobei als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird. Dabei werden ausschließlich Sequenzen von klinisch relevanten Spezies amplifiziert.

Description

Die vorliegende Erfindung entstammt dem Gebiet des Nachweises von pathogenen Pilzinfektionen mithilfe von PCR.
Stand der Technik
Pilzinfektionen bei gesunden Menschen oder nicht immunsupprimierten Patienten sind gewöhnlich lokale oberflächliche Haut-, Schleimhaut-, und Nagelinfektionen ohne schwerwiegende gesundheitliche Auswirkungen. Pilzinfektionen, die bei immun­ supprimierten Personen, zum Beispiel nach Transplantationen oder bei HIV Patienten auftreten, sind jedoch immer lebensbedrohlich. Deshalb wird bei diesen immunsupprimierten Patienten meist bei länger bestehendem Fieber ungeklärter Ursache eine Pilzinfektion auch ohne Erregernachweis angenommen und sicherheitshalber therapiert (Lortholary and Dupont, B., Clin. Microbiol. Rev. 10: 477-504, 1997). Zur Vermeidung unnötiger bzw falscher therapeutischer Maßnahmen ist deshalb eine einfache, sichere und sensitive Diagnose einer systemischen Pilzinfektion wünschenswert.
Das Spektrum möglicher Pilzerreger einer disseminierten Pilzinfektion ist breit. Infektionen mit vorwiegend endemisch vorkommenden obligat pathogenen Erregern primärer Systemmykosen wie Histoplasma capsulatum, Coccidoides immitis, Blastomyces dermatitidis oder Paracoccidoides brasiliensis sind jedoch eher die Ausnahme. Weltweit zunehmende Bedeutung bei invasiven bzw disseminierten Pilzinfektionen besitzten dagegen Infektionen durch die Gattungen Candida und Aspergillus, sodaß insbesondere für diese Gattungen ein zuverlässiger Schnellnachweis wünschenswert ist.
Besondere klinischer Relevanz vor allem im Europäischen Raum besitzen in diesem Zusammenhang die Candida Spezies C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata und C. krusei. Als humanpathogene Aspergillus Keime sind insbesondere die Spezies A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavius und A. terreus von Bedeutung.
Sowohl Candida als auch Aspergillus Pilzinfektionen sind beispielsweise durch den Nachweis disseminierter Pilzzellen im Blut als auf Kulturschalen Kolonie bildende Einheiten (KBE = Koloniebildende Einheiten = PFU) nachweisbar. Dabei liegt die Anzahl der nachzuweisenden Pilzzellen in der Regel im Bereich von 1-10 Kolonie-bildenden Einheiten je ml Blut (Kiehn, Eur. J. Clin. Microbiol. 8, 832-837, (1989)). Für einen Pilznachweis ist deshalb eine Anreicherung der Pilzzellen von Vorteil. Eine Analyse von PFUs in aus Vollblut angereicherten Zellen ist jedoch aufwendig und zeitraubend.
Alternativ stellen Verfahren basierend auf der Amplifikation von Nukleinsäuresequenzen infektiöser Keime mithilfe von PCR (U.S. 4,683,195, U.S. 4,683,10) eine sensitive Möglichkeit zum Nachweis von Infektionen dar. Die Identifikation der richtigen Amplifikationsprodukte geschieht dabei entweder mithilfe von Gelelektrophorese oder mithilfe geeigneter Hybridisations-Sonden. Neuerdings haben sich auch Verfahren etabliert, bei denen eine Amplifikaktionsreaktion im Echtzeitmodus detektiert und On-Line verfolgt werden kann (WO 97/46707, WO 97/46712, WO 97/46714).
Für eine Identifizierung von Spezies auf der Basis von Nukleinsäuresquenzen haben sich Verfahren als besonders geeignet erwiesen, bei denen ribosomale RNA Sequenzen analysiert werden (EP 0 131 052). Dies liegt vor allem daran, daß die ribosomalen RNA Gene in hoher Kopienzahl im Genom vorkommen und mit vergleichsweise hoher Sensitivitität detektiert werden können. Darüber hinaus sind RNA Gene für systematische bzw taxonomische Analysen besonders geeignet, weil die entsprechenden Gene, z. B. die 18s RNA Gene, sowohl Regionen aufweisen, die in der Evolution hochkonserviert sind, als auch Regionen besitzen, die beispielsweise innerhalb einer Gattung hypervariabel sind.
Auch für Candida und Aspegillus sind bereits mehrere, auf der Analyse von 18s RNA Sequenzen beruhende Verfahren publiziert worden (Hopfer et al J. Med. Vet. Mycol. 31: 65-75 (1993)), Makimura et al., J. Med. Microbiol. 40: 358-364 (1994), Einsele et al. J. Clin. Microbiol. 35: 1353-1360 (1997)., mit deren Hilfe die Identität eines pathogenen Erregers festgestellt werden kann. Sämtliche Verfahren sind jedoch nur für den Nachweis jeweils einer einzelnen Spezies geeignet, sodaß das gesamte Spektrum von klinisch relevanten Pilzinfektionen nur mithilfe einer Vielzahl unterschiedlicher Reaktionen abgedeckt werden kann.
WO 97/07238 beschreibt ein Verfahren zum Nachweis von Pilzzellen in klinischem Material, bei dem zunächst intakte Pilzzellen aus Vollblut angereichert werden. Der Nachteil des in WO 97/07238 beschriebenen Verfahren liegt jedoch vor allem darin begründet, daß die verwendeten Primer in einem Background humaner genomischer DNA offensichtlich zu unspezifischen Amplifiaktionsprodukten führen und nur dann spezifisch zum Nachweis klinisch relevanter Pilzspezies eingesetzt werden können, wenn der Amplifikationsreaktion eine aufwendige Probenvorbreitung, d. h. eine Isolation intakter Pilzzellen vorzugsweise aus Vollblut vorausgeht.
Zusammengefaßt sind die gegenwärtigen aus dem Stand der Technik bekannten Methoden zur rechtzeitigen Diagnose einer derartigen Infektion hinsichtlich ihres experimentellen Aufwands, ihrer Geschwindigkeit, Spezifität und Sensitivität limitiert. Insbesondere existierte zum Zeitpunkt der Erfindung kein Verfahren, mit dem eine Pilzinfektion mit hoher Spezifität nachgewiesen werden konnte.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war somit die Bereitstellung eines schnellen, einfachen und sensitiven Verfahrens, mit dem sämtliche klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattungen Candida und Aspergillus nachgewiesen werden können.
Kurzbeschreibung der Erfindung
Die Aufgabe wird gelöst durch eine Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von ausschließlich klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattungen Candida und Aspergillus, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird, dadurch gekennzeichnet, daß ausschließlich Sequenzen pathogener Candida und Aspergillus Spezies amplifiziert werden.
Diese Aufgabe wird insbesondere gelöst durch eine Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattungen Candida und Aspergillus, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird, sodaß Sequenzen der Spezies C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanathii, C. glabrata, C. crusei, A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. terreus, A. awamori, A. oryzae, A. parasiticus, A. soenthaltene, A. tamarii, A. sojae, A. wentii, A. restrictus, A. ochraceus, A. clavatus und A. candidus amplifiziert werden.
Für den Fall, daß eine Aspergillose aufgrund anderer klinischer Indikationen unwahrscheinlich ist, besteht das erfindungsgemäße Verfahren aus einer Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattung Candida, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird, wobei Sequenzen der Spezies C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata und C. krusei amplifiziert werden.
Vorteilhafterweise wird bei diesen Verfahren genau ein Upstream Primer verwendet, dessen Sequenz einer bestimmten Sequenz des 18s RNA Gens entspricht, die bei allen nachzuweisenden Spezies identisch ist. Ein derartiger Primer besitzt in der Regel eine Länge von 13-25 Nukleotiden. Die Sequenz des Primers ist bevorzugt eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 1.
Als Downstream Primer haben sich Primer mit einer Länge von 13-25 Nukleotiden als geeignet erwiesen, deren Sequenz eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 2, Seq. ID. No. 3 oder Seq. ID. No. 4 oder Seq. ID. No. 5 darstellt. Gegenstand der Erfindung sind somit insbesondere Verfahren, bei denen ein, zwei, drei oder oder alle Downstream Primer mit Teilsequenzen gem. Seq. Id. No 2-5 verwendet werden.
Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn das Produkt der Amplifikationsreaktion zusätzlich durch Hybridisierung detektiert wird. In einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden dabei Hybridisierungssonden verwendet, deren Sequenzen identisch mit oder komplementär zu einer Teilsequenz aller 18s RNA Sequenzen sind, die während der Amplifikationsreaktion amplifiziert wurden. Gegenstand der Erfindung sind somit auch Hybridisations. Sonden mit einer Länge von 15 bis 100 und besonders bevorzugt mit eine Länge von 18-35 Nukleotiden, welche eine kontinuierliche Sequenz gemäß Seq. ID. No. 6 enthalten sowie Verfahren, in denen derartige Sonden verwendet werden.
In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung werden die Amplifikationsprodukte mithilfe von Fluoreszenzdetektion nachgewiesen, wobei in der Regel die Hybridisations- Sonden mit einem Fluorophor markiert sind. Als besonders vorteilhaft haben sich dabei Ausführungsformen erwiesen, bei denen das Amplifikationsprodukt mithilfe von Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer (FRET) nachgewiesen wird. Dabei werden zwei mit Fluorophoren markierte Hybridisations-Sonden verwendet, die an benachbarte, aber nicht überlappende Sequenzen der Target-Nukleinsäure dergestalt hybridisieren, daß bei Hybridisation der Sonden an das Target-Molekül die beiden Fluorephore in räumliche Nähe zueinander gebracht werden. Eine Sonde ist dabei mit einem Fluoreszenzresanzenergie- Donor wie beispielsweise Fluorescein markiert. Die andere Sonde ist mit einem Fluoreszenzresonanzenergieakzeptor wie besipielsweise LC-RED-640 oder LC-RED-705 (Roche Molecular Biochemicals) markiert. Bevorzugt zum Nachweis von Candida und Aspergillus sind zwei als FRET-Paar zu verwendende Hybridisations-Sonden gemäß Seq. ID. No. 7 und 8.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind schließlich auch Kits zur Durchführung der Erfindungs-gemäßen Verfahren.
Kurzbeschreibung der Abbildungen Abb. 1
Schematische Darstellung eines Candida-18s-RNA-Gens mit Primern für eine erfindungsgemäße Multiplex-Reaktion zur Detektion von Candida. V1-V8 bezeichnen variable Regionen des 18s-RNA Gens. F3 bezeichnet die Position des Forward Primers mit SeQ: Id. No. 1. F16, F19 und F21 bezeichnen die Positionen der drei Reverse Primer mit SEQ. Id. No. 2-4. "Hybridisierungssonde" bezeichnet eine Sonde gem Seq. Id. No. 6.
Abb. 2
Schematische Darstellung eines Aspergillus-18s-RNA-Gens mit Primern zur Detektion von Aspergillus. Erfindungsgemäß wird der Primer F15 (Seq. Id. No. 5 zusammen mit den Candida Primern gem Abb. 1 im Rahmen einer Multiplex-Reaktion eingesetzt. Wiederum gilt: V1-V8 bezeichnen variable Regionen des 18s-RNA Gens. F3 bezeichnet die Position des Forward Primers mit Seq: Id. No. 1. F15 bezeichnet die Position des Reverse Primer mit SEQ. Id. No. 5. "Hybridisierungsssonde" bezeichnet eine Sonde gem Seq. Id. No. 6.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Gegenstand der Erfindung ist zuächst eine Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von ausschließlich klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattungen Candida und Aspergillus, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird.
Dabei werden Sequenzen der Spezies C. albicans, C. guilliermondii; C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata, C. krusei, A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. terreus, A. awamori, A. oryzae, A. parasiticus, A. soenthaltene, A. tamarii, A. sojae, A. wentii, A. restrictus, A. ochraceus, A. clavatus, A. candidus und bevorzugt ausschließlich Sequenzen der genannten Spezies amplifiziert. Somit sind alle klinisch relevanten Spezies der beiden genannten Gattungen umfaßt, die im klinischen Alltag mit einer bestimmten Häufigkeit auftreten und aufgrund ihrer pathogenen Auswirkungen therapiert werden müssen.
Häufig als Kontamination in Laborratorien vorkommende Spezies werden durch das erfindungsgemäße Verfahren dagegen nicht detektiert. Der Nachweis von nicht pathogenen Spezies dieser und anderer Gattungen durch das erfindungsgemäße Verfahren kann dagegen nicht vollständig ausgeschlossen werden.
Unter bestimmten klinischen Voraussetzungen kann eine Aspergillose ausgeschlossen werden, und es ist lediglich erforderlich, den immunsupprimierten Patienten im Hinblick auf eine pathogene Candida Infektion zu testen. In diesem Fall besteht das erfindungsgemäße Verfahren aus einer Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattung Candida, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird, wobei Sequenzen der Spezies C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata und C. krusei und bevorzugt ausschließlich Sequenzen der genannten Spezies amplifiziert werden.
Voraussetzung für eine Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren ist zunächst eine DNA-Isolation aus Patientenmaterial, wobei es sich bei dem Patientenmaterial vorzugsweise um Blut des Patienten handelt. Prinzipiell sind dazu sämtliche aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren einsetzbar. Fakultativ kann in einem ersten Schritt eine Anreicherung der Pilzzelllen erfolgen (WO 97/07238). Alternativ kann in einigen Fällen auch anderes Körpermaterial wie beispilesweise Gewebe, Stuhl, Urin oder Sputum untersucht werden.
Zur Isolierung der Pilz-DNA ist in der Regel eine Lyse der Pilzzellen erforderlich, die ebenfalls durch verschiedene, dem Fachmann bekannte Verfahren oder eine Kombination aus dem Fachmann bekannten Verfahren erfolgen kann. Beispielsweise hat sich hierfür eine Methode als besonders effektiv erwiesen, beider die Pilzzellen nach Verdau durch das Enzyms Lyticase und Lyse durch SDS bei 65°C mithilfe von Glaspartikeln mechanisch zerkleinert werden.
Die Amplifikationsreaktion der jeweiligen 18s rRNA Target Sequenz erfolgt vorzugsweise mithilfe einer konventionellen PCR-Reaktion unter Standardbedingungen mithilfe von Taq- Polymerase oder anderen thermostabilen DNA Polymerasen.
Als Amplifikations-Primer werden in der Regel chemisch synthetisierte deoxy-Ribonukleotide verwendet. Allerdings können im Prinzip auch andere Nukleinsäuremoleküle oder deren Derivate wie beispielsweise PNA (Peptide Nucleic Acids) eingesetzt werden. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Primer auch mit detektierbaren oder immobilisierbaren Molekülen wie beispielsweise Biotin oder Digoxygenin konjugiert sein.
Als Primer für eine PCR Reaktion ist mindestens ein sogenanter Upstream Primer sowie ein sogenanter Downstream Primer erforderlich, wobei die Sequenz des Upstream Primes der codierenden Sequenz der Target-Nukleinsäure in 5'-3' Orientierung entspricht. Die Sequenz des Downstream Primers entspricht einer Antisense Sequenz in 5'-3' Orientierung. Erfindungsgemäß werden jedoch nicht nur 2 Primer, sondern im Sinne einer sognenannten Multiplex-Reaktion mehrere Primer verwendet. Dadurch ist es möglich, in einem Reaktionsansatz nicht nur Sequenzen einer einzelnen Spezies, sondern Sequenzen mehrerer Spezies zu amplifizieren.
Vorteilhafterweise wird bei diesen Verfahren genau ein Upstream Primer verwendet, dessen Sequenz einer bestimmten Sequenz des 18s RNA Gens entspricht, welche bei allen nachzuweisenden Spezies identisch ist. Ein derartiger Primer besitzt in der Regel eine Länge von 13-25 Nukleotiden. Die. Sequenz des Primers ist bevorzugt eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 1.
Unter einer kontinuierliche Teilsequenz wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Teilsequenz einer Sequnez verstanden, die identisch mit der jeweiligen Sequenz ohne irgendwelche Insertionen oder interne Deletionen ist, aber an einem oder beiden Enden verkürzt sein kann. Eine kontinuierliche 'Teilsequenz im Sinne der Erfindung kann jedoch auch der gesamten jeweiligen Sequenz entsprechen.
Als Downstream Primer haben sich Primer mit einer Länge von 13-25 Nukleotiden als geeignet erwiesen, deren Sequenz eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 2, Seq. ID. No. 3 oder Seq. ID. No. 4 oder Seq. ID. No. 5 darstellt. Primer mit Teilsequenzen gem Seq. Id. No. 2-4 dienen dabei zur Amplifikation von Candida-Sequenzen. Ein Primer gem Seq. Id. No. 3 ist essentiell für den Nachweis von C. glabrata; ein Primer gem Seq. Id. No. 4 ist für den Nachweis von C. Krusei erforderlich. Primer mit Teilsequenzen gem Seq. Id. No. 5 dienen der Amplifikation von Aspergillus-Sequenzen. Gegenstand der Erfindung sind somit insbesondere Verfahren, bei denen ein, zwei, drei oder oder alle Downstream Primer mit Teilsequenzen gem. Seq. Id. No 2-5 verwendet werden.
Die Amplifikationsprodukte können durch unterschiedliche Methoden detektiert werden. Eine klassische Detektionsmethode ist die Agarose-Gelelektrophorese, bei der die PCR- Fragmente nach Größe aufgetrennt und und somit identifiziert werden. Eine andere Alternative bietet der sogenannte PCR-ELISA (Roche Molecular Biochemicals Katalog).
Bei diesem Verfahren wird mindesten ein mit einer immobilisierbaren Gruppe wie beispielsweise Biotin markierter Primer verwendet, sodaß im Anschluß an die PCR-Reaktion das Amplifikationsprodukt an einer Festphase wie einer ELISA-Platte, welche beispielsweise mit Streptavidin als Bindepartner für Biotin beschichtet ist, gebunden werden kann.
In allen Fällen hat es sich jedoch als vorteilhaft erwiesen, wenn das Produkt der Amplifikationsreaktion zusätzlich durch Hybridisierung detektiert wird. Dadurch wird eine höhere Sensitivität des Assays erzielt, sodaß Pilzinfektionen auch dann nachgewiesen werden können, wenn der Titer an disseminierten Tumorzellen im Blut oder in einem anderen Patientenmaterial nur sehr niedrig ist.
Die dafür geeigneten Hybridisations-Sonden besitzen vorzugsweise eine Länge von 15 bis 100 und besonders bevorzugt eine Länge von 18-35 Nukleotiden. Sie sind somit ebenfalls Gegenstand der Erfindung., sofern sie eine kontinuierliche Sequenz gemäß Seq. ID. No. 6 enthalten. Darunter werden im Sinne dieser Erfindung sämtliche Sequenzen verstanden, die einen Sequenzabschnit mit der gesamten Sequenz von Seq. Id. No. 6 ohne jegliche Deletion oder Insertion enthalten. Zusätzlich können diese Sonden aber auch noch weitere Sequenzabschnitte enthalten. Bevorzugt hybridisieren derartige Sonden mit allen Amplifikationsprodukten, die mithilfe der erfindungsgemäßen Primer amplifiziert werden können. Gegenstand der Erfindung sind auch Verfahren, in denen die beschriebenen Sonden verwendet werden
In der Regel werden als Sonden ebenfalls chemisch synthetisierte deoxy-Ribonukleotide verwendet, die wahlweise durch andere Nukleinsäuremoleküle oder deren Derivate wie beispielsweise PNA (Peptide Nucleic Acids) ersetzt werden können. Definitionsgemäß sind diese Sonden mit einer detektierbaren Markierung konjugiert. Dabei kann es sich zum Beispiel um einen Fluoreszenzfarbstoff, ein Enzym, ein radioaktives Atom oder um eine massenspektrometrisch nachweisbare Gruppe handeln. Die Markierung kann abhängig vom genauen Detektionsformat an jeder beliebigen Ribose- oder Phosphatgruppe des Oligonukleotids eingeführt werden. Bevorzugt sind Markierungen am 5' und 3' Ende des Nukleinsäuremoleküls.
In einer speziellen Ausführungsform der Erfindung werden die Amplifikationsprodukte deshalb mithilfe von Fluoreszenzdetektion nachgewiesen, wobei die Hybridisations-Sonden mit einem Fluorophor markiert sind.
Besonders bevorzugt können die Amplifikationsprodukte im Real Time PCR Monitoring (WO 97/46707) detektiert werden. Dabei sind verschiedene homogene Testführungen möglich, bei denen entweder mindestens eine Fluoreszenz-markierten Hybridisationssonde oder ein fluoreszierender DNA-Bindefarbstoff sich bereits während der Amplifikation in der zu analysierenden Probe befinden:
(i) DNA-Bindefarbstoff
Das jeweilige Amplifikationsprodukt wird in diesem Fall durch einen DNA-Bindefarbstoff nachgewiesen, welcher bei Interaktion mit doppelsträngiger Nukleinsäure nach Anregung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge ein entsprechendes Fluoreszenzsignal emmitiert. Als besonders geeignet für diese Anwendung haben sich die Farbstoffe SybrGreen und SybrGold (Molecular Probes) erwiesen. Alternativ können auch interkalierende Farbstoffe verwendet werden.
(ii) TaqMan-Hybridisationssonden
Eine einzelsträngige Hybridsidisationssonde wird mit 2 Komponenten markiert. Bei Anregung der ersten Komponente mit Licht einer geeigneten Wellenlänge wird nach dem Prinzip des Fluoreszenz-Resonanzenergietransfers die absorbierte Energie auf die zweite Komponente, den sogenannten Quencher übertragen. Während des Annealing Schrittes der PCR Reaktion bindet die Hybridisationssonde an die Target-DNA und wird während der sich anschließenden Elongationsphase durch die 5'-3' Exonuklease-Aktivität der Taq-Polymerase degradiert. Dadurch werden die angeregte Fluoreszenzkomponente und der Quencher räumlich voneinander getrennt, sodass eine Fluoreszenzemission der ersten Komponente in gemessen werden kann.
(iii) Molecular Beacons
Diese Hybridisationssonden sind ebenfalls mit einem einer ersten Komponente und einem Quencher markiert, wobei sich die Markierungen vorzugsweise an den beiden Enden der Sonde befinden. In Lösung befinden sich beide Komponenten aufgrund der Sekundärstruktur der Sonde in räumlicher Nähe zueinander. Nach Hybridisierung an die Target-Nukleinsäure werden beide Komponenten von einander getrennt, sodass nach Anregung mit Licht einer geeigneten Wellenlänge die Fluoreszenzemission der ersten Komponente gemessen werden kann (Lizardi et al., US 5,118,801).
(iv) FRET-Hybridisationssonden
Für dieses Testformat werden 2 einzelsträngige Hybridisationssonden gleichzeitig verwendet, die komplementär zu benachbarten Stellen desselben Strangs der amplifizierten Target- Nukleinsäure sind. Beide Sonden sind mit unterschiedlichen Fluoreszenzkomponenten markiert. Bei Anregung einer ersten Komponente überträgt diese nach dem Prinzip des Fluoreszenzresonanzenergietransfers die absorbierte Energie auf die zweite Komponente, sodass bei Bindung beider Hybridisationsproben an das Target-Molekül eine Fluoreszenzemission der zweiten Komponente gemessen werden kann (WO 97/46707).
Dabei wird als sogenannte Donor-Komponente beispielsweise Fluorescein, mit Licht einer geeignetten Wellenlänge angeregt. Bei räumlicher Nähe zu einer geeigneten Akzeptorkomponente wie beispielsweise bestimmten Rhodamin-Derivaten erfolgt dann ein Resonanz-Energie-Transfer auf die Akzeptorkomponente, sodaß das Akzeptormolekül Licht einer bestimmten Emissionswellenlänge emittiert.
Die Markierungen der Hybridisations-Sonden können nach Standardmethoden am 5' Ende, am 3' Ende oder auch intern erfolgen. Die zwei Oligonukleotid-Sonden können dabei bevorzugt an den gleichen Strang der Target-Nukleinsäure hybridisieren, wobei der eine Farbstoff sich vorzugsweise am 3'-terminalen Nukleotid der ersten Sonde befindet und der andere Farbstoff sich vorzugsweise am 5' terminalen Nukleotid der zweiten Sonde befindet, sodaß die Distanz zwischen beiden nur eine geringe Anzahl von Nukleotiden beträgt, wobei diese Anzahl zwischen 0 und 30 liegen kann. Bei Verwendung von Fluorescein in Kombination mit einem Rhodamin-Derivat wie beispielsweise LC-RED-640 oder LC-RED- 705 (Roche Molecular Biochemicals) haben sich Abstände von 0-15, insbesondere 1-5 Nukleotiden und in vielen Fällen von einem Nukleotid als vorteilhaft herausgestellt.
Unter Wahrung der Nukleotid-Abstände zwischen den Farbstoffkomponenten können auch Sonden verwendet werden, die nicht terminal, sondern intern mit einem der Farbstoffe konjugiert sind. Bei doppelsträngigen Target-Nukleinsäuren können auch Sonden eingesetzt werden, die an verschiedene Stränge des Targets binden, sofern ein bestimmter Nukleotidabstand von 0 bis 30 Nukleotiden zwischen den beiden Farbstoff-Komponenten eingehalten wird. (Bernard et al., Analytical Biochemistry 235, p. 1001-107 (1998)).
Als besonders vorteilhaft hat sich der Einsatz derartiger FRET-Paare zum Nachweis von Amplifikationsprodukten während oder nach einer Multiplex-Amplifikationsreaktion herausgestellt. Dies ermöglicht ein paralleles "Real-Time Monitoring" von PCR-Reaktionen, wobei Daten zur Generierung des Amplifikationsprodukts in Abhängigkeit von der Zahl der durchlaufenen Reaktionszyklen ermittelt werden können. Das geschieht in der Regel dadurch, daß aufgrund der Reaktions- und Temperaturbedingungen während des notwendigen Annealings der Amplifikationsprimer an die nachzuweisende Nukleinsäure auch die Oligonukleotide des FRET-Paares an die Target-Nukleinsäure hybridisieren und bei geeigneter Anregung ein entsprechend messbares Fluoreszenzsignal emittiert wird. Aufgrund der erhaltenen Daten kann somit die Menge der ursprünglich eingesetzten Target- Nukleinsäure quantitativ bestimmt werden.
In einer anderen, bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Detektion der Multiplex- Amplifikationsprodukte nach Beendigung der Amplifikationsreaktion, wobei nach Hybridisierung des FRET-Paares an die zu detektierende Target-Nukleinsäure die Temperatur im Rahmen einer Schmelzkurvenanalyse kontinuierlich erhöht wird. Gleichzeitig wird die in Abhängigkeit von der Temperatur emittierte Fluoreszenz gemessen und auf diese Weise eine Schmelztemperatur bestimmt, bei dem das eingesetzte FRET-Paar nicht mehr an die nachzuweisende Sequenz hybridisiert. Bei einem Auftreten von Mismatches zwischen dem eingesetzten FRET-Paar und dem Amplifikationsprodukt wird der Schmelzpunkt signifikant erniedrigt. Auf diese Weise können mit einem FRET-Paar verschiedene Target-Nukleinsäuren identifiziert werden, deren Sequenzen sich voneinander geringfügig durch eine oder wenige Punktmutationen unterscheiden, sodaß mit einer Schmelzpunktanalyse auch die Identität eines bestimmten generierten Amplifikationsproduktes bestätigt werden kann.
Für den Nachweis von Candida und Aspergillus haben sich zwei als FRET-Paar zu verwendende Hybridisations-Sonden gemäß Seq. ID. No. 7 und 8 als geeignet erwiesen. Die erste Sonde mit einer Sequenz gem. Seq. Id. No. 7 wird erfindungsgemäß mit einem Fluoreszenzresanzenergie-Donor wie beispielsweise Fluorescein markiert. Die zweite Sonde wird mit einem Fluoreszenzresonanzenergieakzeptor wie besipielsweise LC-RED-640 oder LC-RED-705 (Roche Molecular Biochemicals) markiert und besitzt eine Sequenz gem. Seq. Id. No. 8.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind schließlich auch Kits zur Durchführung der Erfindungs-gemäßen Verfahren. Dies Kits enthalten bevorzugt Primer mit Sequenzen gemäß Seq. ID. No. 1-4 oder Seq. ID No. 1-5 sowie optional weitere generische Reagenzien für die Amplifikation von Nukleinsäuren oder die Detektion von PCR-Amplifikationsprodukten. Besonders bevorzugt enthalten diese Kits auch erfindungsgemäße Hybridisations-Sonden, beispielsweise mit Seqeunzen gemäß Seq. Id. No. 6, 7 und 8. Als generische Reagenzien können diese Kits beispielsweise thermostabile DNA-Polymerasen, Desoxynucleotide und geeignete Puffersubstanzen enthalten.
Wie bereits ausgeführt, ist zum Nachweis von Pilzen auf genomischer Ebene ein DNA-Isolierungsverfahren mit mehreren Schritten notwendig. Es hat sich gezeigt, daß im Laboralltag trotz strikter Anwendung von Maßnahmen zur Kontaminationsvermeidung bei der Probenprozessierung mit allen in Frage kommenden Verfahren immer wieder falsch positive Signale auftreten, weil aufgrund des ubiquitären Vorkommens von Pilzsporen, bzw. -DNA in der Umwelt und in den verwendeten Reagenzien, ein universelles Pilz-Nachweisverfahren für die Routinediagnostik nicht geeignet ist.
Wegen dieser Problematik besteht die Erfindung aus einem im Spektrum reduzierten PCR-Nachweissystem, welches sich auf den Nachweis klinisch bedeutsamer Pilze beschränkt und frei von Kontaminationsproblemen ist. Bei der Suche nach geeigneten Oligonukleotiden im Bereich der 18S rRNA, die möglichst alle humanpathogen Pilze nachweisen, ergeben sich üblicherweise Probleme, sobald Oligonukleotide zur Ampifikation verwendet werden, die mehrere Pilzgenera im Spektum enthalten. Da die humanpathogenen Spezies des Genus Candida zum Teil phylogenetisch nur entfernt verwandt sind (es gibt keine Signatursequenz für den Genus Candida, die nicht auch andere Genera beinhaltet), treten bei der Amplifikation mit Oligonukleotiden, die alle Candida Spezies im Spektrum enthalten, immer Kontaminationen der Negativkontrollen auf. Erst die Reduktion des Spektrums der PCR auf die phylogenetisch mit C. albicans verwandten Spezies ergibt kontaminations-freie Negativkontrollen, beispielsweise bei einer Verwendung von Primern gem Seq. Id. No. 1 und 2. In dem Spektrum fehlen aber die beiden wichtigen Pathogene C. krusei und C. glabrata, die jedoch phylogenetisch nur relativ entfernt mit Candida albicans verwandt sind.
Da innerhalb der 18S rRNA keine anderen Sequenzbereiche zur Ableitung von geeigneten Oligonukleotiden vorliegen, deren Spektrum diese beiden Spezies beinhaltet, müssen C. krusei und C. glabrata jeweils mit einer speziesspezifischen PCR amplifiziert werden. Erfindungsgemäß geschieht dies durch PCR Reaktionen mit Primern gemäß Seq. Id. Nr. 1 und 3 bzw. 1 und 4.
Das System mit dem breitesten Spektrum humanpathogener Pilze zum Nachweis von Candida oder Aspergiillus Infektionen, welches keine falsch positiven Ergebnisse durch Kontaminationen der Reagenzien mehr aufweist, besteht aus vier einzelnen Amplifikationsreaktionen, die als Forward Primer alle denselben universellen Primer gem. Seq. 1 verwenden. Neben den drei Reverse Primern mit Seq. Id. No. 2-4 wird für eine zusätzliche Amplifikationsreaktion ein Primer gem Seq. Id. No. 5 zum Nachweis von pathogenen Aspergillus Species eingesetzt. Diese vier Amplifikationsreaktionen sind wegen der Verwendung eines einzigen Forward Primers gem. Seq. Id. No. 1 leicht in einer Multiplex-PCR in einem Reaktionsgefäß zusammenzuführen.
Da die Sensitivität einer Multiplex-PCR im ELISA-PCR Verfahren häufig mit der Anzahl der verwendeten Oligonukleotide abnimmt, wurde in einer besonderen Ausführungsform die Amplifikation in zwei in separaten Reaktionsgefäßen stattfindende PCR's geteilt:
  • - Eine Multiplex-PCR umfaßt den Genus Candida: mit Primern gem Seq. Id. No. 1-4 Der reverse-Primer gem Seq. Id. No. 2, der für den größten Teil des Genus Candida spezifisch ist (C. albicans, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanathii u. a.) wird mit den speziesspezifischen Primern gem Seq. Id. No. 3 (C. glabrata), und 4 (C. krusei) kombiniert (Abb 1). Mit dieser Multiplex-PCR können die wichtigsten humanpathogenen Candida Spezies amplifiziert werden. Falsch positive Negativkontrollen der DNA Präparationsmethode treten bei der Amplifikation mit diesen Oligonukleotiden nicht auf.
  • - Der Nachweis von Aspergillus Pilzen erfolgt in einer separaten Reaktion mit PCR Primeren gem Seq. Id. No. 1 und 5. Mit dieser PCR können alle bisher sequenzierten (18S rDNA) humanpathogen Aspergillus Spezies amplifiziert werden (A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, und A. terreus u. a.).
Die Identifizierung positiver Proben erfolgt vorzugsweise über eine Hybridisierung beispielsweise im ELISA Format mit einer universellen Sonde gemäß Seq. Id. No. 6 oder im Real Time PCR Modus mit einem Paar Hybridisationssonden gem Seq. Id. No. 7 und 8. Je nach experimenteller Aufgabenstellung können für beide Verfahren erfindungsgemäß auch Aspergillus bzw Candida genusspezifische oder auch Spezies spezifische Oligonukleotide verwendet werden.
Die Sensitivität des Gesamtverfahrens kann mit Verdünnungsreihen von C. albicans ermittelt werden, deren Zellzahl mikroskopisch bestimmt wurde. Die Zellen werden dazu zu 10 ml Blut zugegeben und das gesamte Verfahren bestehend aus einer entsprechenden Probenvorbereitung sowie einer erfindungsgemäßen PCR wird durchgeführt.
Nach der Hybridisierung im PCR-ELISA Format ergibt sich üblicherweise eine Nachweisgrenze von ca. 3 Zellen pro 10 ml Blut. Die Nachweisgrenze im Lightcycler PCR Format mit FRET Hybridisierungssonden liegt üblicherweise bei 20 Zellen pro 10 ml Blut.
Beispiele Beispiel 1 Aufarbeitung von Blutproben
Mit einem kliniküblichen Blutabnahmesystem wurden 5-10 ml peripheres Venenblut in mit dem Antikoagulans EDTA versetzte Röhrchen abgenommen. Blutproben, die als Positivkontrollen zur Untersuchung der Sensitivität des Nachweisverfahrens verwendet wurden, wurden eine mikroskopisch ausgezählte Anzahl von C. albicans Zellen zugegeben. Nach dem Transport in das Untersuchungslabor wurde das Blut in ein Zentrifugationsgefäße mit 50 ml Volumen umgefüllt und nach Zugabe von 30 ml einer 2%igen SDS Lösung 5 Sek. geschüttelt und 10 Min. bei Raumtemperatur stehen gelassen. In diesem Schritt werden alle zellulären Bestandteile des Blutes mit Ausnahme der Pilzzellen lysiert. In einem anschließenden Zentrifugationsschritt (30 Min., 6000 × g, 15°C) wurden die Pilzzellen von den übrigen Bestandteilen des Blutes getrennt. Nach dem Abgießen des Überstandes wurde das Pellet durch Resuspendieren in 1 ml Wasser aufgenommen und in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß mit Schraubverschluß überführt. Nach Zentrifugation für 10 Min. bei 9.000 RPM (7150 × g) wurde der Überstand abgenommen, 1 ml Wasser zugegeben, erneut wie zuvor zentrifugiert und der Überstand abgenommen. Im Pellet der Reaktionsgefäße sind alle Pilzzellen aus dem eingesetzten Blut in reiner Form konzentriert. Humane Nukleinsäure und andere Blutbestandteile, die die fogenden enzymatischen Reaktionen hemmen können, wurden durch die oben beschriebene Aufbereitung vollständig entfernt.
Beispiel 2 Nukleinsäureisolierung aus Pilzen
Auf das Pellet in den 1,5 ml Reaktionsgefäßen wurde 90 µl Wasser, 10 µl 10x Puffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 M EDTA; 10% Triton X-100), 1 µl Lyticaselösung (25.000 Units/ml) zugegeben und 45 Min. bei 37°C inkubiert. Nach der Zugabe von 15 µl 10% SDS Lösung enthaltend Lyticase (Sigma, Endkonzentration (25.000 U/ml) wurden die Proben für 45 Min. bei 65°C inkubiert und nach der Zugabe von 30 µl Glasbeads (100 µm Durchmesser), 2 µg Lachssperma DNA,
330 µl Wasser, 400 µl Phenol/Chloroform/iso-Amylalkohol (Volumenanteile 24/24/1) für 3 Min. in eine Hochfrequenzrüttler (Mickle Laboratory, Gomshall, UK) geschüttelt. Nach Zentrifugation für 10 Min. wurde die obere Phase abgenommen und nach Zugabe von 24 µl 3 M Natriumacetat und 50 µl iso-Propanol
in einem neuen Gefäße innerhalb von 2 Std. bei -20°C präzipitiert. Nach Zentrifugation für 20 Min. bei 15.000 rpm wurde der Überstand abgenommen und das Pellet mit 800 µl 70% Äthanol zweimal gewaschen (Äthanol zugeben, 1 × schwenken, 10 Min. bei 15.000 rpm zentrifugieren und Überstand abnehmen). Anschließend wurde die im Pellet isolierte Nukleinsäure in einer Speedvac Zentrifuge von den restlichen Äthanolspuren befreit und in 75 µl Wasser aufgenommen. Von dieser Nukleinsäurepräparation wurden je 15µ1 in die Aspergillus-spezifische PCR und die Candida-spezifische PCR geben.
Beispiel 3 Multiplex PCR und Detektion im ELISA Format
Für eine erfindungsgemäße Multiplex-PCR imPCR-ELISA-Format wurde folgender Ansatz hergestellt:
Ansatz für Candida-Multiplex PCR
Primer gem. Seq. ID. Nr. 1-biotiniliert: 2,0 µl (12,5 µmol)
Primer gem. Seq. ID. Nr. 2 0,5 µl (12,5 µmol)
Primer gem. Seq. ID. Nr. 3 0,5 µl (12,5 µmol)
Primer gem. Seq. ID. Nr. 4 0,5 µl (12,5 µmol)
Primer gem. Seq. ID. Nr. 5 0,5 µl (12,5 µmol)
dNTP-Mix 12 µl
10 × Puffer 7,5 µl
Taq 0,35 µl
DNA 15 µl
H2O ad 75 µl
Die Amplifikation der DNA erfolgte über 40 Zyklen in einem Ericomp Thermocyder
Denaturierung: 10 Sek. bei 96°C;
Annealing: 120 Sek. bei 54°C;
Extension: 120 Sek. bei 72°C.
Zur Hybridisierung wurde eine Sonde gem Seq. Id. No. 6 verwendet,. Die Hybridisierung mit den oben genannten Oligonukleotiden erfolgte unter Verwendung von Magnetpartikeln, die mit Digoxigenin markiert sind: Diese Dynabeads (Db) wurden entprechend den Angabewn des Herstellers (Dynal) eingesetzt. Die Bindung der amplifizierten DNA an die Beads erfolgte gemäß den Angaben des Herstellers: Nach zweimaligen Waschen von 10 µl Db-Suspension mit "Bindungs und Waschpuffer" (BW-Puffer) wurden die Db in 50 µl BW-Puffer aufgenommen und in Mikrotiterplatten mit 10 µl PCR-Produkt zusammengegeben und 20 Min inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit BW-Puffer wurde 100 µl NaOH (0,1 M) zugeben, 10 Min. inkubiert und mit 100 µl TE-Puffer gewaschen. Die Hybridisierung erfolgte nach Zugabe von 6 pM des entsprechenden digoxigenierten Oligonukleotids in 50 µl Hybridisierungslösung über 50 Min. bei 47°C. Nichtgebundene Hybridisierungssonde wurde in drei Schritten mit 4 × SSC, 0,1% Tween 20 bei 52°C weggewaschen. Anschließend wurde 50 µl AK-Reagenz zugegeben, 30 Min. bei RT inkubiert, zweimal mit PBS, 0.05% Tween gewaschen und 50 µl Substratpuffer zugegeben. Nach 90 Min. wurde die Substratumsetzung anhand der Fluoreszenz in einem UV ELISA Reader bei 355 nm/460 nm (Anregung/Emission) gemessen. Proben die den Mittelwert der mitgeführten Negativkontrollen um mehr als die fünffache Standardabweichung der Negativkontrollen überschritten wurden als positiv gewertet.
Folgende Lösungen wurden für dieses Protokoll eingesetzt:
d-NTP-Mix für PCR
AL=L<2 × 950 µl H2
O
2 × 12,5 µl dATP 100 mM
2 × 12,5 µl dTTP 100 mM
2 × 12,5 µl dCTP 100 mM
2 × 12,5 µl dGTP 100 mM
10 × PBS-Puffer
2 g KCl
2 g KH2
PO4
80 g NaCl
21,6 g Na2
HPO4
.7 H2
O
add 10 l. H2
O.
TE-Puffer
Tris 10 mM, pH 7,5 bzw. 8,0
EDTA 1 mM
BW-Puffer (Binding + Washing-Puffer) nach Dynal Protokoll
5 mM Tris HCL pH 7,5
0,5 mM EDTA
1,0 M NaCL
20 × SSC
3 M NaCl
0,3 M Na-Citrat-(2-hydrat)
Hybridisierungslösung
5 × SSC,
5 × Denhardt's,
0,1% Tween 20,
100 µg/ml tRNA
6 µmol digoxigeniertes Oligonukleotid/50 µl Lösung
Ak-Markierung (AK-antiDIG-Reagenz)
Ak 1 : 5000 (Boehringer 1093274) in 1% BSA in PBS verdünnt
Substrat-Puffer
4-Methyl-Umbelliferylphosphat 40 mg/Liter (Sigma 3368-04-5 M 8883)
100 mM Tris-HCl, pH 9.6, 50 mM MgCl2
100 mM NaCl.
Eine Vielzahl von Pilzspezies wurde auf diese Art und Weise untersucht.
Amplifikationsprodukte konnten jedoch nur bei solchen DNA Präparationen nachgewiesen werden, die DNA von pathogenen Pilzspezies der Gattungen Candida oder Aspergillus enthielt.
Beispiel 4 Real Time Multiplex PCR
Die Nukleinsäuren wurden wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben isoliert. Es wurden jedoch nur 5-10 µl DNA in die PCR eingesetzt. Die Multiplex-PCR zum Nachweis von pathogenen Candida-Pilzen wurde im LightCycler System (Roche Molecular Biochemicals) entsprechend den Angaben des Herstellers durchgeführt. Der Nachweis des Amplifikationsproduktes erfolgte nach zwei unterschiedlichen Protokollen entweder Mithilfe von SybrGreen als doppelsträngige DNA bindendes Agens oder alternativ Mithilfe von FRET- Hybridisierungssonden. Sämtliche verwendeten Primer und Hybridisierungssonden waren HPLC-gereinigt und wurden in Stocklösungen von 100 pM/µl (Primer) bzw. 3 pM/µl (Sonden) aufbewahrt.
Nachweis mit SvbrGreen
2,0 µl FastStart Buffer DNA-Master SYBR Green (Roche MolecularBiochemicals, enthaltend Puffer, hitzeaktivierbare Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2
und SYBR Green I Farbstoff)
10 pM je eingesetztem Primer gemäß Seq Id No 1, 2, 3 und 4
3,2 µl 25 mM MgCl2
(Arbeitskonzentration 5 mM)
5 µl Proben-DNA
20 µl Gesamtansatz
Nachweis mit Hybridisationssonden
Die zur Detektion eingesetzten Hybridisierungssonden wurden nach Standardprotokollen markiert. Zum Nachweis von positiven Proben wurde ein Oligonukleotid gemäß Seq. Id. No. 7 mit Fluorescein am 3' Ende markiert und ein Oligonukleotid gemäß Seq. Id. No. 8 am 5' Ende mit LcRed 640 markiert.
2,0 µl FastStart DNA-Master for Hybridization Probes (Roche Molecular Biochemicals, enthaltend Puffer, hitzeaktivierbare Taq Polymerase, dNTPs. and MgCl2)
5 pM je eingesetztem Primer gemäß Seq Id. No. 1-5
2 pM je eingesetzter Hybridisierungssonde gemäß Seq Id No 7 und 8
3,2 µl 25 mM MgCl2 (Endkonzentration 5 mM)
5 µl Proben-DNA
20 µl Gesamtansatz
Beide Arten von Ansätzen wurden mit dem folgenden PCR-Programm gefahren und mit einer Schmelzkurve abgeschlossen.
Die Temperaturzyklen des PCR Programms waren:
95°C 600 sec vor dem ersten Zyklus
95°C 10 sec
50°C 10 sec
72°C 30 sec jeweils für 55 Zyklen
Die Schmelzkurven wurden nach vorheriger kurzzeitiger Denaturierung bei 95°C in einem Intervall von 65°C bis 95°C in 0,2°C-Schritten mit kontinuierlicher Fluoreszenzmessung auf Kanal 1 (SYBR Green), Kanal 2 (LC-Red 640) oder Kanal 3 (LC-Red 705) mithilfe der LightCycler Software 3.0 erstellt.
Im FRET-Hybridisierungssonden-Format wurde die Sensitivität mit 10 ml Blutproben, denen mikroskopisch ausgezählte C. albicans Zellen zugegeben wurde, überprüft. Als Sensitivitätsgrenze ergaben sich 20 Zellen pro 10 ml Blut. Für diese Amplifikation wurden nur 5 µl der DNA (Gesamtvolumen nach Aufreinigung 75 µl) eingesetzt. Entsprechende Experimente mit 200 und 2000 Zellen pro 10 ml Blut ergaben deutlich höhere Hybridisierungssignale. Die Schmelztemperatur lag im FRET Modus bei 63°C.
DNA aus einer Vielzahl von verschiedenen Pilzuspezies wurde auf diese Art Analysiert. Dabei koonten jedoch sowohl im SybrGreen Modus als auch im FRET/Hybprobe Modus nur Amplifikationen bei Proben nachgewiesen werden, die humanpathogene Pilze der Spezies C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata, C. crusei, A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. terreus, A. awamori, A. oryzae, A. parasiticus, A. soenthaltene, A. tamarii A. sojae, A. wentii, A. restrictus, A. ochraceus, A. clavatus oder A. candidus enthielten.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (19)

1. Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattungen Candida und Aspergillus, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird, dadurch gekennzeichnet, daß ausschließlich Sequenzen pathogener Candida oder Aspergillus Spezies amplifiziert werden.
2. Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattungen Candida und Aspergillus, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird, dadurch gekennzeichnet, daß Sequenzen der Candida und Aspergillus Spezies C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata, C. crusei, A. fumigatus, A. niger, A. nidulans, A. flavus, A. terreus, A. awamori, A. oryzae, A. parasiticus, A. soenthaltene, A. tamarii A. sojae, A. wentii, A. restrictus, A. ochraceus, A. clavatus und A. candidus. amplifiziert werden.
3. Multiplex Amplifikationsreaktion zum Nachweis von klinisch relevanten Pilzinfektionen der Gattung Candida, bei der als Target eine Region des 18s RNA Gens des Erregers amplifiziert wird, dadurch gekennzeichnet, daß Sequenzen der Candida Spezies C. albicans, C. guilliermondii, C. maltosa, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. viswanatii, C. glabrata und C. crusei. amplifiziert werden.
4. Verfahren nach Anspruch 1-3, dadurch gekennzeichnet daß genau ein Upstream Primer verwendet wird, dessen Sequenz identisch zu einer Sequenz des 18s RNA Gens ist, die bei allen nachzuweisenden Spezies identisch ist.
5. Primer mit einer Länge von 13-25 Nukleotiden, deren Sequenz eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 1 darstellt.
6. Primer mit einer Länge von 13-25 Nukleotiden, deren Sequenz eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 2 darstellt.
7. Primer mit einer Länge von 13-25 Nukleotiden, deren Sequenz eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 3 darstellt.
8. Primer mit einer Länge von 13-25 Nukleotiden, deren Sequenz eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 4 darstellt.
9. Primer mit einer Länge von 13-25 Nukleotiden, deren Sequenz eine kontinuierliche Teilsequenz einer Sequenz gemäß Seq. ID. No. 5 darstellt.
10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß ein, mehrere oder alle Primer gemäß Anspruch 4-8 verwendet werden.
11. Verfahren nach Anspruch 1-4 oder 10 dadurch gekennzeichnet, daß das Produkt der Amplifikationsreaktion zusätzlich durch Hybridisierung detektiert wird.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Hybridisierungssonden identisch mit oder komplementär zu einer Teilsequenz aller 18s RNA Sequenzen sind, die während der Amplifikationsreaktion vermehrt wurden.
13. Sonde mit einer Länge von 20 bis 100 und bevorzugt 25-35 Nukleotiden, welche eine kontinuierliche Sequenz gemäß Seq. ID. No. 6 enthält.
14. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine Sonde gemäß Anspruch 13 verwendet wird.
15. Verfahren gemäß Anspruch 1-4, 10-12 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationsprodukt mithilfe von Fluoreszenzdetektion nachgewiesen wird.
16. Verfahren gemäß Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß das Amplifikationsprodukt mithilfe von Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer nachgewiesen wird.
17. Verfahren gemäß Anspruch 16 dadurch gekennzeichnet, daß Hybridisationssonden gemäß Seq. ID. No. 7 und 8 verwendet werden.
18. Kit, enthaltend Primer mit Sequenzen gemäß Seq. ID. No. 1-4 oder Seq. ID No. 1-5.
19. Kit gemäß Anspruch 18, enthaltend Hybridisationssonden.
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