DE69426807T2 - Nukleinsäure-Amplifizierung bei SDA in Zellen - Google Patents
Nukleinsäure-Amplifizierung bei SDA in ZellenInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft die Amplifikation von Nucleinsäuren und besonders die Amplifikation von Nucleinsäuren in morphologisch intakten Zellen.
- Nucleinsäureamplifikationsverfahren stellen wirksame Werkzeuge zum Nachweis und zur Analyse von kleinen Mengen von Nucleinsäuren bereit. Die außergewöhnliche Sensitivität solcher Verfahren hat zu Versuchen geführt, sie zur frühzeitigen Diagnose von Infektions- und genetischen Krankheiten, Isolierung von Genen zur Analyse und Nachweis spezifischer Nucleinsäuren in der forensischen Medizin zu entwickeln. Nucleinsäureamplifikationsverfahren können nach den Temperaturerfordernissen des Verfahrens eingeordnet werden. Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), Ligase-Kettenreaktion (LCR) und transkriptionsbasierte Amplifikation erfordern sich wiederholende Reaktionszyklen zwischen hohen (85ºC-100ºC) und niedrigen (30ºC-40ºC) Temperaturen, um Einzelstrangzielmoleküle zur Amplifikation zu erzeugen. Im Gegensatz dazu sind Verfahren, wie Strangverdrängungsamplifikation (Strand Displacement Amplification - SDA), sich selbsterhaltende Sequenzreplikation (35R) und das Qβ-Replikasesystem, isotherme Reaktionen, welche bei einer konstanten niedrigen Temperatur (gewöhnlich etwa 30-40ºC) durchgeführt werden können.
- Eine der bekanntesten Nucleinsäureamplifikationsverfahren ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Dieses Verfahren ist von R. K. Saiki, et al. ((1985) Science 230, 1350-1354) und in US-A-4 683 195, US-A-4 683 202 und US-A-4 800 159 beschrieben. In Kürze, um eine Zielsequenz unter Verwendung der PCR zu amplifizieren werden zwei Primer, die komplementär zu Sequenzen sind, die die Zielsequenz flankieren, unter Verwendung der Zielsequenz als Matrize durch Hinzufügen von Desoxyribonucleotiden und einer DNS-Polymerase hybridisiert (einer an jeden der entgegengesetzten Komplementärstränge) und verlängert. Nach der Verlängerung wird die Reaktionstemperatur erhöht, um den neusynthetisierten Strang von der Matrize zu trennen, dann erniedrigt, um die Primer erneut anzulagern und das Verlängerungsverfahren zu wiederholen. Wegen des charakteristischen zyklischen Durchlaufens der Reaktionstemperatur erfordert die PCR die Verwendung einer hitzestabilen Polymerase, wie Tag-Polymerase.
- Im Gegensatz dazu ist Strangverdrängungsamplifikation (SDA) ein isothermes Nucleinsäureamplifikationsverfahren, bei welchem die Verlängerung von Primern, die Verdrängung von Einzelstrangverlängerungsprodukten, das Anlagern von Primern an die Verlängerungsprodukte (oder der ursprünglichen Zeilsequenz) und nachfolgende Verlängerung der Primer im Reaktionsgemisch gleichzeitig stattfindet. Dies ist im Gegensatz zur PCR, bei welcher die Reaktionsschritte in diskreten Phasen oder Zyklen als eine Folge der Temperaturzwänge der Reaktion stattfinden. SDA basiert auf 1) der Fähigkeit einer Restriktionsendonuclease, den unmodifizierten Strang einer Hemiphosphorthioatform ihrer Doppelstrangerkennungsstelle zu schneiden, und 2) der Fähigkeit bestimmter Polymerasen, Replikation am Schnitt zu initiieren und den stromabwärtsgelegenen Nichtmatrizenstrang zu verdrängen. Nach einer anfänglichen Inkubation bei erhöhter Temperatur (etwa 95ºC), um Doppelstrangzielsequenzen zum Anlagern der Primer zu denaturieren, findet nachfolgende Polymerisation und Verdrängung von neusynthetisierten Strängen bei einer konstanten Temperatur (gewöhnlich etwa 37ºC) statt. Erzeugung jeder neuen Kopie der Zielsequenz besteht aus fünf Schritten: 1) Binden von Amplifikationsprimern an eine ursprüngliche Zeilsequenz oder an ein vorher polymerisiertes verdrängtes Einzelstrangverlängerungsprodukt, 2) Verlängerung der Primer durch exonucleasedefiziente (exo&supmin;-) Klenow- Polymerase, die ein α-Thio-Desoxynucleosid-Triphosphat einbaut, 3) Schneiden einer Hemiphosphorthioatdoppelstrang- Erkennungsstelle, 4) Dissoziation des Restriktionsenzyms von der Schnittstelle und 5) Verlängerung vom 3'-Ende des Schnitts durch exo&supmin;-Klenow mit Verdrängung des stromabwärtsgelegenen Nichtmatrizenstrangs. Schneiden, Polymerisation und Verdrängung finden gleichzeitig und kontinuierlich bei einer konstanten Temperatur statt, weil Verdrängung vom Schnitt eine andere schneidbare Erkennungsstelle erzeugt. Wenn Primer, welche an beide Stränge einer Doppelstrangzielsequenz hybridisieren, verwendet werden, ist die Amplifikation exponetiell, weil die Sense- und Antisensestränge als Matrizen für den entgegengesetzten Primer in nachfolgenden Amplifikationsrunden dienen. SDA wird von G. T. Walker, et al. ((1992a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 392-396 und (1992b) Nuc. Acids. Res. 20, 1691-1696) beschrieben. Beispiele von Restriktionsenzymen, welche ihre Doppelstrangerkennungsstellen schneiden, wenn α- Thio-dNTP eingebaut wird, sind HincII, HindII, Aval, NciI and Fnu4HI. Alle diese Restriktionsenzyme und andere, welche die erforderliche Schneideaktivität zeigen, sind geeignet für die Verwendung in der SDA. Einzelheiten des SDA-Verfahrens werden in den folgenden Beispielen gefunden.
- Ziele zur Amplifikation durch SDA können durch Fragmentleren längerer Nucleinsäuren durch Restriktion mit der Endonuclease, die in der SDA-Reaktion verwendet wird (z. B. HincII), erzeugt werden. Für die In-situ-Amplifikation ist es jedoch am meisten bevorzugt, daß die Zielnucleinsäuren mit den ausgewählten Restriktionsendonuclease-Erkennungsstellen zum Schneiden in der SDA-Reaktion erzeugt werden, wie von Walker, et al. (1992b, vorstehend) beschrieben. Dieses Zielerzeugungsschema wird auch in US-A-5 270 184 beschrieben. Dieses Verfahren zur Erzeugung von SDA-amplifizierbaren Zielsequenzen umfaßt Hitzedenaturierung von Doppelstrangnucleinsäuren, die die Zielsequenz enthalten, und Hybridisierung von vier Primern an die Zielsequenz. Zwei der Primer (S&sub1; und S&sub2;) sind SDA- Amplifikationsprimer, wie nachstehend definiert, mit Zielbindungssequenzen nahe ihrer 3'-Enden und Restriktionsenzym- Erkennungsstellen 5' zu den Zielbindungssequenzen. Wenn beide Amplifikationsprimer verwendet werden, ist die Amplifikation exponentiell, jedoch hat die Verwendung nur eines Amplifikationsprimers lineare Amplifikation der Zielsequenz zur Folge. Die anderen beiden Primer (B&sub1; und B&sub2;) sind externe Primer, wie nachstehend definiert, und bestehen nur aus Zielbindungssequenzen. S&sub1; und S&sub2; binden an entgegengesetzten Strängen der Doppelstrangnucleinsäuren, die die Zielsequenz flankieren. B&sub1; und B&sub2; binden an die Zielsequenz 5' (d. h. stromaufwärts) zu S&sub1; bzw. S&sub2;. Exonucleasedefiziente Klenow- Polymerase (exo&supmin;-Klenow-Polymerase) wird dann verwendet, um alle vier Primer in Gegenwart von drei Desoxynucleosid-Triphosphaten und einem modifizierten Desoxynucleosid-Triphosphat (z. B. Desoxyadenosin-5'-[α-thio]triphosphat dATP[αS]) gleichzeitig zu verlängern. Verlängerung von S&sub1; und S&sub2; erzeugt zwei Verlängerungsprodukte, S&sub1;-ext und S&sub2;-ext. Verlängerung von B&sub1; und B&sub2; hat Verdrängung der stromabwärtsgelegenen S&sub1;- und S&sub2;- Verlängerungsprodukte von der ursprünglichen Zielsequenzmatrize zur Folge. Das verdrängte einzelsträngige S&sub1;-Verlängerungsprodukt dient als ein Ziel zur Bindung von S&sub2; und B&sub2;. Ähnlich dient das verdrängte einzelsträngige S&sub2;-Verlängerungsprodukt als ein Ziel zur Bindung von S&sub1; und B&sub1;. Alle vier Primer werden dann an den S&sub1;-ext- und S&sub2;-ext-Matrizen verlängert, um ein zweites Paar von Verlängerungsprodukten zu erzeugen, welche durch Verlängerung der externen Primer wie vorher verdrängt werden. Bindung und Verlängerung von Komplementäramplifikationsprimern an diesen verdrängten Verlängerungsprodukten hat Synthese eines Komplementärstrangs zur Folge. Dies erzeugt zwei Doppelstrangnucleinsäurefragmente mit halbmodifizierten Restriktionsenzym-Erkennungsstellen an jedem Ende, welche zur Amplifikation durch SDA geeignet sind. Die verlängerten externen Primer hybridisierten an S&sub1;-ext und S&sub2;- ext von zwei längeren Doppelstrangfragmenten mit halbmodifizierten Restriktionsenzym-Erkennungsstellen an nur einem Ende. Wie in SDA finden die einzelnen Schritte der Zielerzeugungsreaktion gleichzeitig und kontinuierlich, statt, wobei Zielsequenzen mit den erforderlichen Erkennungssequenzen an den Enden zum Schneiden durch das Restriktionsenzym in SDA erzeugt werden. Weil alle Komponenten der SDA-Reaktion schon in der Zielerzeugungsreaktion vorhanden sind, treten die automatisch und kontinuierlich erzeugten Zielsequenzen in den SDA-Zyklus ein und werden amplifiziert.
- In-situ-Verfahren der Nucleinsäureanalyse ermöglicht Nachweis und Lokalisation spezifischer Nucleinsäuresequenzen innerhalb morphologisch intakter Zellen. In-situ-Verfahren der Nucleinsäureanalyse sind herkömmlich durch direkte Hybridisierung von markierten Sonden erreicht worden, zum Beispiel wie in US-A-4 888 278 beschrieben. Während solche direkten Hybridisierungsverfahren spezifisch für die interessierende Nucleinsäure ist, können sie jedoch nicht ausreichend sensitiv sein, um sehr geringe Kopieanzahlen der Nucleinsäure in allen Fällen nachzuweisen. Als ein Mittel zum Nachweis sehr geringer Kopieanzahlen ist die in-situ- Amplifikation der Zielsequenz vor dem in-situ-Nachweis von großem Interesse geworden. In-situ-Nucleinsäureamplifikationsverfahren haben das Potential, sensitiver als die herkömmliche Lösungsamplifikation zu sein, weil die Zelle das Amplifikationsprodukt konzentrieren kann, wodurch Nachweis von weniger Molekülen ermöglicht wird, als es möglich ist, wenn Amplifikationsprodukte uneingeschränkt diffundieren oder durch den Inhalt von Zellen, welche nicht die interessierende Sequenz enthalten, verdünnt werden. Weil die Nucleinsäure vor der Analyse nicht aus der Zelle extrahiert wird, stellen in-situ- Verfahren Information bereit, bezüglich welcher Zellen in einer Population eine bestimmte Nucleinsäure enthalten, und erlauben ferner Analyse der Nucleinsäure im Zusammenhang mit den biochemischen und morphologischen Charakteristiken der Zelle. Vor der vorliegenden Erfindung sind in-situ-Amplifikationsverfahren nur für die PCR entwickelt worden (O. Bagasra und R. Pomerantz (1993) AIDS Research and Human Retroviruses 9(1), 69- 76; G. Nuovo, et al. (1992) Diag. Molec. Pathol. 1(2), 98-102; M. J. Embleton, et al. (1992) Nuc. Acids Res. 20(15), 3831- 3837; J. Embretson, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 357-361; P. Komminoth, et al. (1992) Diag. Molec. Pathol. 1(2), 85-97; K. P. Chile, et al. (1992) J. Histochem. Cytochem. 40(3), 333-341; Haase, et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 4971-4975; 0. Bagasra, et al. (1992) New Engl. J. Med. 326(21), 1385-1391; Patterson, et al. (1993) Science 260, 976- 979). Jedoch werden die Mehrfachzyklen von Heiz- und stringenten Hybridisierungsbedingungen, die bei der PCR erfoderlich sind, um ihre Sensitivität zu erreichen, von Geweben und Zellen nicht gut toleriert. Diffusion der amplifizierten Sequenzen aus den Zellen heraus ist durch wiederholtes Erhitzen erhöht, was erhöhtes diffuses Signal überall in der Probe zur Folge hat. Um zu versuchen, den Verlust an PCR-Produkten von der Zelle zu verringern, hält man lange Fixierzeiten (15 Stunden bis Tage) mit vernetzenden Fixiermitteln für erfolgreiche in-situ-Amplifikation durch die PCR für erforderlich. Als Folge der extensiven Fixierung hält man es auch für kritisch, die fixierten Zellen vor der Amplifikation mit Protease zu behandeln (G. Nuovo, et al. (1992) Diag. Molec. Pathol. 1 (2), 98-102).
- Obwohl die SDA die Fähigkeit hat, Zielsequenzen in geringer Kopieanzahl bei 37ºC zu amplifizieren, machten es die vielen bedeutenden Unterschiede zwischen PCR- und SDA- Amplifikationsreaktionsprotokollen vor der vorliegenden Erfindung höchst ungewiß, ob in-situ-Amplifikation bei einer konstanten, relativ niedrigen Temperatur erfolgreich durchgeführt werden könnte oder nicht, um zerstörerische Wirkungen auf die Zellmorphologie zu minimieren. Sowohl die insitu-PCR als auch die in-situ-SDA verwenden Fixieren der Zellen, um die Zellintegrität aufrechtzuerhalten. Bei den niedrigeren Temperaturen bei SDA sind Nucleinsäuren innerhalb der fixierten Zelle deshalb stabiler mit Proteinen vernetzt, welche die Hybridisierung stören können und den Zugang von Polymerase, Sonden und/oder Restriktionsenzymen zur Zielsequenz verhindern. Zugang von Polymerase und/oder Restriktionsenzymen zu den Sonden oder Amplikons kann auch durch gebundene Proteine inhibiert sein, wobei folglich die Amplifikation verhindert wird. Bei der PCR ist es wahrscheinlich, daß Erhitzen teilweises oder vollständiges Umkehren der Fixierung oder der Wirkungen der Fixierung, Freisetzen der gebundenen Proteine von den Nucleinsäuren oder Verringern ihrer Affinität und ihr Befreien für Amplifikation fördert. Solches Freisetzen störender Proteine würde in isothermen Amplifikationsreaktionen nicht erwartet werden. Außerdem können die Heizschritte für die PCR die Inter- und Intrastranghybridisierung wiederholt denaturieren, wobei den Primern besserer Zugang zum Ziel ermöglicht wird. Solches wiederholtes Erhitzen findet bei SDA nicht statt. Ferner können die in der SDA verwendeten Phosphorthioate Disulfidbindungen mit zelullären Proteinen bilden, wobei Zugang von Reagenzien zum Ziel verhindert wird.
- Die Amplifikationsprodukte der PCR sind allgemein größer als solche, die durch SDA erzeugt werden. Es wäre daher sogar wahrscheinlicher, daß eher SDA-Amplifikationsprodukte als PCR- Amplifikationsprodukte aus der Zelle herausdiffundieren. Es war vorher nicht bekannt, ob die Amplifikationsprodukte der SDA groß genug sein würden oder nicht, um nach in-situ- Amplifikation durch die Zelle zurückgehalten zu werden. Obwohl in-situ-PCR-Amplifikation an durch Formaldehyd fixierte Zellen durchgeführt worden ist, war es ungewiß, welche Wirkung das Fixieren und das Formaldehydfixiermittel selber auf die besonderen enzymatischen Reaktionen, die durch die SDA erforderlich sind, haben würde - z. B. Schneiden einer Hemiphosphorthioat-Erkennungsstelle durch ein Restriktionsenzym und die Verdrängungsaktivität von exo&supmin;-Klenow-Polymerase. Nicht nur die Vernetzung, welche beim Fixierverfahren möglicherweise und unvorhersagbar stattfindet, schließt bestimmte Moleküle vom Innern der Zelle aus, Formaldehyd ist bekannt, mit Nucleinsäuren wechselzuwirken, und kann die Restriktion durch Endonucleasen und andere enzymatische Aktivitäten inhibieren.
- Lohman, et al., "Molecular Biology of the Cell", Vol.4 Supplement, Oktober 1993, US Page 113A ist eine Zusammenfassung eines Vortrags, der beim "Thirty Third Annual Meeting of the American Society for Cell Biology" gehalten wurde, welches am 11-15. Dezember 1993 stattfand (nach dem Einreichungsdatum von USSN 08/165719, von dessen Priorität die vorliegende Erfindung in Anspruch genommen wird). Die Druckschrift bezieht sich auf die Identifizierung von HIV-1 proviralen DNS- und mRNS- Sequenzen in HIV-1 infizierten Zellen und Geweben unter Verwendung von in-situ-Hybridisierungsverfahren, kombiniert mit PCR-Amplifikation, wie vorher beschrieben worden ist, und zeigt an, daß der Vortrag, der beim "Thirty Third Meeting" gehalten wurde, die Verwendung von Strangverdrängungsamplifikation (Strand Displacement Amplification - SDA), einer isothermen Genamplifikationsmethodik, beschreiben würde, um eine Region der HIV-1-gag-mRNS und provirale DNS-Gensequenzen in sowohl HIV-1 infizierten Geweben (J. M. Mathys in Vorbereitung) als auch Zellsuspensionen zu amplifizieren. Die Zusammenfassung zeigte an, daß die SDA-Methodik an den schnellen Nachweis von intrazellulären HIV-Zielsequenzen durch Durchflußzytometrie oder Bild-Zytometrie unter Verwendung von fluoreszierenden Oligonucleotidsonden oder Lichtmikroskopie unter Verwendung bestimmter anderer Oligonucleotide angepaßt wurde, aber keine Einzelheiten gibt, wie die SDA-Methodik durchzuführen war.
- Zum Zwecke der vorliegenden Offenbarung werden die folgenden Begriffe wie folgt definiert:
- Ein Amplifikationsprimer ist ein Primer zur Amplifikation einer Zielsequenz durch Hybridisierung und Verlängerung des Primers. Bei der SDA hybridisiert das 3'-Ende des Amplifikationsprimers (die Zielbindungssequenz) am 3'-Ende der Zielsequenz und umfaßt eine Erkennungsstelle für ein Restriktionsenzym nahe seines 5'-Endes. Die Zielbindungssequenz ist allgemein ungefähr 10-20 Basenpaare lang. Die Restriktionsenzym-Erkennungsstelle ist eine Nucleotidsequenz, die durch ein Restriktionsenzym erkannt wird, welches einen Strang einer DNS- Duplex schneidet, wenn die Erkennungsstelle halbmodifiziert ist, wie von Walker, et al. (1992a), vorstehend, beschrieben. Eine halbmodifizierte Erkennungsstelle ist eine Doppelstrangerkennungsstelle für ein Restriktionsenzym, in welchem ein Strang wenigstens ein derivatisiertes Nucleotid enthält, welches Schneiden dieses Strangs durch das Restriktionsenzym verhindert. Der andere Strang der halbmodifizierten Erkennungsstelle enthält keine derivatisierten Nucleotide und wird durch das Restriktionsenzym geschnitten. Jede halbmodifizierte Restriktionsenzym-Erkennungsstelle, welche durch ein Restriktionsenzym schneidbar ist, ist für die Verwendung in der SDA geeignet. Beispiele der bevorzugten halbmodifizierten Erkennungsstellen sind Hemiphosphorthioat-Erkennungsstellen für die Restriktionsenzyme HincII, HindII, AvaI, NciI und Fnu4HI. Amplifikationsprimer für die SDA sind von Walker, et al. (1992b), vorstehend, mit S&sub1; und S&sub2; bezeichnet.
- Ein "Bumper-" oder externer Primer ist ein Primer, welcher sich stromaufwärts von einem Amplifikationsprimer an eine Zielsequenz anlagert, so daß Verlängerung des externen Primers den stromabwärtsgelegenen Primer und sein Verlängerungsprodukt verdrängt. Die Stoßfänger-Primer bestehen deshalb nur aus Zielbindungssequenzen und sind so gestaltet, daß sie sich dicht genug zu den Amplifikationsprimern an die Zielsequenz anlagern, um sie zu verdrängen, wenn sie verlängert werden. Externe Primer werden von Walker, et al. (1992b), vorstehend mit B&sub1; und B&sub2; bezeichnet. Verlängerung externer Primer ist ein Verfahren zum Verdrängen der Verlängerungsprodukte von Amplifikationsprimern, aber Erhitzen kann in bestimmten Fällen auch geeignet sein.
- Die Begriffe Ziel oder Zielsequenz beziehen sich auf zu amplifizierende Nucleinsäuresequenzen (DNS und/oder RNS). Diese schließen die zu amplifizierende ursprüngliche Nucleinsäuresequenz und ihren komplementären zweiten Strang ebenso wie jeden Strang einer Kopie der ursprünglichen Nucleinsäuresequenz, die durch Amplifikation der Zielsequenz erzeugt wurden, ein.
- Amplifikationsprodukte, Verlängerungsprodukte oder Amplikons sind Kopien der Zielsequenz oder ihres Komplementärstrangs, die durch Amplifikation der Zielsequenz erzeugt wurden.
- Die vorliegende Erfindung stellt in einem ersten Gesichtspunkt davon ein Verfahren zur Strangverdrängungsamplifikation einer Zielsequenz bereit, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Bereitstellen einer Probe von fixierten Zellen, bei der die morphologische Integrität der Zellen gewährleistet ist und Amplifikationsreagenzien die fixierten Zellen penetrieren können;
- b) innerhalb der Zellen Hybridisieren eines Amplifikationsprimers 3' zur Zielsequenz, wobei der Amplifikationsprimer eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle 5' zu einer Zielbindungssequenz umfaßt, und Hybridisieren eines externen Primers 5' zum Amplifikationsprimer;
- c) Verlängern des Amplifikationsprimers und des externen Primers in Anwesenheit einer exonucleasedefizienten Polymerase und eines α-Thio-Desoxynucleosid-Triphosphats, um ein Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukt zu erzeugen, das von der Zielsequenz durch Verlängern des externen Primers verdrängt wird;
- d) doppelsträngiges Gestalten des Amplifikationsprimer- Verlängerungsproduktes durch Synthetisieren eines Komplementärstranges und Schneiden eines Stranges davon an der Restriktionsenzym-Erkennungsstelle mit einer Restriktionsendonuclease;
- e) Verwenden des nicht geschnittenen Stranges als Matrize, die sich von dem Schnitt mit der exonucleasedefizienten Polymerase und dem α-Thio-Desoxynucleosid-Triphosphat erstreckt, so daß der geschnittene Strang von dem Matrizenstrang verdrängt wird; und
- f) Wiederholen der Schneide-, Verlängerungs- und Verdrängungsschritte, so daß die Zielsequenz in situ amplifiziert wird.
- In einem zweiten und alternativen Gesichtspunkt der Erfindung wird ein Verfahren zur Strangverdrängungsamplifikation einer Doppelstrangzielsequenz bereitgestellt, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Bereitstellen einer Probe von fixierten Zellen, bei der die morphologische Integrität der Zellen gewährleistet ist und Amplifikationsreagenzien die fixierten Zellen penetrieren können;
- b) innerhalb der Zellen Hybridisieren von zwei Amplifikationsprimern (S&sub1; und S&sub2;), die HincII-Erkennungsstellen in der Nähe ihrer 5'-Enden aufweisen, an entgegengesetzte Nucleinsäurestränge, die die Zielsequenz flankieren, und Hybridisieren von zwei externen Primern (B&sub1; und B&sub2;) an entgegengesetzte Stränge der Zielsequenz 5' zu den Amplifikationsprimern;
- c) Verlängern der Amplifikationsprimer und der externen Primer in Anwesenheit eines α-Thio-Desoxynucleosid- Triphosphats, um ein erstes Verlängerungsprodukt von S&sub1; (S&sub1;- ext) und ein erstes Verlängerungsprodukt von S&sub2; (S&sub2;-ext) zu erzeugen, wobei S&sub1;-ext und S&sub2;-ext durch Verlängern der externen Primer von der Zielsequenz verdrängt werden;
- d) Hybridisieren der Amplifikationsprimer und der externen Primer an S&sub1;-ext und S&sub2;-ext und Verlängern der Amplifikationsprimer und externen Primer in Anwesenheit des α- Thio-Desoxynucleosid-Triphosphats, so daß die Verlängerung der externen Primer ein zweites Verlängerungsprodukt von jeweils S&sub1; und S&sub2; verdrängt;
- e) doppelsträngiges Gestalten der zweiten Verlängerungsprodukte durch Synthetisieren eines Komplementärstranges und Schneiden eines Stranges von jedem der doppelsträngigen zweiten Verlängerungsprodukte mit HincII;
- f) Verwenden des nicht geschnittenen Stranges als Matrize, die sich von dem Schnitt in Anwesenheit des α-Thio- Desoxynucleosid-Triphosphats mit einer exonucleasedefizienten Polymerase erstreckt, so daß der geschnittene Strang von dem Mattizenstrang verdrängt wird; und
- g) Wiederholen der Schneide-, Verlängerungs- und Verdrängungsschritte, so daß die Zielsequenz in situ amplifiziert wird.
- Die Erfindung stellt gemäß eines dritten alternativen Gesichtspunkts davon ein Verfahren bereit, das eine Strangverdrängungsamplifikation für den Nachweis einer HIV- Zielsequenz in einer Zelle beinhaltet, umfassend die folgenden Schritte:
- a) Bereitstellen einer Probe von fixierten Zellen, bei der die morphologische Integrität der Zellen gewährleistet ist und Amplifikationsreagenzien die fixierten Zellen penetrieren können;
- b) innerhalb der Zellen Hybridisieren eines Amplifikationsprimers 3' zur HIV-Zielsequenz, wobei der Amplifikationsprimer eine Restriktionsenzym-Erkennungsstelle 5' zu einer Zielbindungssequenz umfaßt, und Hybridisieren eines externen Primers 5' zum Amplifikationsprimer;
- c) Verlängern des Amplifikationsprimers und des externen Primers in Anwesenheit einer exonucleasedefizienten Polymerase und eines α-Thio-Desoxynucleosid-Triphosphats, um ein Amplifikationsprimer-Verlängerungsprodukt zu erzeugen, das von der Zielsequenz durch Verlängerung des externen Primers verdrängt wird;
- d) doppelsträngiges Gestalten des Amplifikationsprimer- Verlängerungsproduktes durch Synthetisieren eines Komplementärstranges und Schneiden eines Stranges davon an der Restriktionsenzym-Erkennungsstelle mit einer Restriktionsendonuclease;
- e) Verwenden des nicht geschnittenen Stranges als Matrize, die sich von dem Schnitt mit der exonucleasedefizienten Polymerase und dem α-Thio-Desoxynucleosid-Triphosphat erstreckt, so daß der geschnittene Strang von dem Matrizenstrang verdrängt wird;
- f) Wiederholen der Schneide-, Verlängerungs- und Verdrängungsschritte, so daß die Zielsequenz in situ amplifiziert wird; und
- g) Nachweisen der amplifizierten HIV-Zielsequenz in situ anhand einer Durchflußzytometrieanalyse eines fluoreszierenden Markers.
- Es wird nachstehend aus der ausführlichen Beschreibung gesehen werden, daß wir die Strangverdrängungsamplifikation erfolgreich an die Amplifikation von Nucleinsäurezielsequenzen in situ in Zellen in Suspension, auf Objektträgern oder in Gewebe mit einer Sensitivität und Spezifität angepaßt haben, die mit der in-situ-PCR vergleichbar sind. Die SDA ist für die Zellen und Gewebe schonender als die PCR, und hervorragende Probenmorphologie wird bei unserem Verfahren bewahrt. Wir haben gefunden, daß in-situ-Amplifikation durch SDA mit immunchemischen Verfahren kompatibel ist, so daß sowohl Amplifikation von Zielsequenzen als auch immunologisches Färben an derselben Probe durchgeführt werden kann. Dies steht im Gegensatz zur in-situ-PCR, bei welcher die sich wiederholenden Temperaturzyklen die interessierenden Zellantigene für immunchemische Verfahren nicht nachweisbar machen können.
- Allgemein folgte bei Anwenden unseres Verfahrens für die in-situ-SDA einer kurzen Fixierung der Zellen oder des Gewebes in einem Konservierungsmittel, welches die Morphologie der Zellen bewahrt, Hinzufügen der für die SDA erforderlichen Reagentien. Wenn die Zielsequenz DNS ist, werden die Zellen oder Gewebe vor der Amplifikation kurz erhitzt, um die Zielsequenz zu denaturieren. Erhitzen findet in einem Gemisch von SDA-Reagentien statt, welches die Enzyme nicht einschließt. Bei Kühlen auf etwa 37ºC werden die Enzyme (Restriktionsendonuclease und exo&supmin;-Klenow) hinzugefügt und die Reaktion wird 30 min bis 5 h lang bei 37ºC inkubiert. Wenn kein vorhergehendes Erhitzen erforderlich ist, um die Zielsequenz zu denaturieren, können alle SDA-Reaktionskomponenten (einschließlich der Enzyme) direkt zu den fixierten Zellen oder Geweben hinzugefügt und Amplifikation, wie vorstehend beschrieben, initiiert werden. Nach Waschen, um nichtverwendete Primer und Enzyme zu entfernen, werden die Amplifikationsprodukte durch in-situ-Hybridisierung einer markierten Sonde oder durch andere auf dem Fachgebiet bekannte Mittel nachgewiesen.
- Die Erfindung wird nachstehend beispielsweise nur mit Bezug auf die dazugehörigen Zeichnungen ausführlicher beschrieben, wobei gilt:
- Fig. 1A und 1B veranschaulichen die verbesserte strukturelle Integrität und Morphologie von Zellen nach der insitu-SDA (Fig. 1A), verglichen mit Zellen nach der in-situ-PCR (Fig. 1B), sichtbargemacht durch Lichtmikroskopie;
- Fig. 2 ist ein Histogramm, das die relativen Prozentgehalte von positiven Zellen zeigt, die durch DISCOVERY- Analyse nach in-situ-SDA sowohl von DNS- als auch von RNS- Zielen (DNS), RNS-Zielen ohne vorhergehende Hitzedenaturierung (RNS), RNS-Zielen nach Behandlung mit DNase (DNase-RNS) und DNS-Zielen nach Behandlung mit RNase (RNase-DNS) nachgewiesen wurden;
- Fig. 3A ist eine graphische Darstellung von Zellanzahl gegen Fluoreszenz, die die Peakverschiebung zeigt, die positive in-situ-Amplifikation von Zielsequenzen anzeigt, wobei der schattierte Peak Amplifikation in Gegenwart von Enzymen entspricht und der lichte Peak Amplifikation ohne Enzymen entspricht und Amplifikationsprodukte durch in-situ- Hybridisierung nachgewiesen werden;
- Fig. 3B zeigt verbesserte Peaktrennung, wenn Amplifikationsprodukte durch direkten Einbau eines fluoreszierenden Markers während der Amplifikation nachgewiesen werden (lichter Peak = Amplifikation mit Enzymen, schattierter Peak = Amplifikation ohne Enzymen);
- Fig. 4A ist eine graphische Darstellung von Zellanzahl gegen Fluoreszenz für AC&sub4;-Zellen nach in-situ-Amplifikation; und
- Fig. 4B ist eine ähnliche graphische Darstellung für A301- Zellen.
- Wir haben gefunden, daß die von Walker, et al. (1992a und 1992b) vorstehend, beschriebenen Lösung = SDA-Protokolle in der biochemisch komplexen und unvorhersehbaren Umgebung von morphologisch intakten Zellen in situ durchgeführt werden können. Allgemein wird eine Probe von Zellen (Zellen in Suspension oder Gewebeschnitte), die zu amplifizierende Nucleinsäuren enthalten, zuerst kurz mit einem Fixiermittel fixiert, welches die morphologische Integrität der Zelle aufrechterhält, aber zelluläre Proteine nicht so extensiv vernetzt oder präzipitiert, daß Penetration von Primern und anderen Reagentien verhindert wird. Rauhe Vorbehandlung mit Protease ist daher nach Fixierung nicht erforderlich, um Penetration von Primern und Reagentien in die fixierten Zellen zu erreichen. Es können entweder vernetzende oder präzipitierende Fixiermittel, wie sie auf dem Fachgebiet bekannt sind, verwendet werden. Beispiele schließen Paraformaldehyd, 4% Glutaraldehyd, Ethanol/Essigsäure Fixiermittel, Carnoy's Fixiermittel (Essigsäure, Ethanol, Chloroform), 1% Osmiumtetraoxid, Bouin's Fixiermittel (1,21% Pikrinsäure, 11% Formaldehyd, 5, 6% Essigsäure), Zenker's Fixiermittel (5,0% Quecksilberchlorid, 2,5% Kaliumdichlorat, 5,0% Essigsäure, 1,0% Natriumsulfat) und Essigsäure/Methanol Fixiermittel ein. Das bevorzugte Fixiermittel zur Verwendung in der Erfindung ist 1-4% Paraformaldehyd, welcher vorzugsweise verwendet wird, um die Zellen oder Gewebe etwa 1 min bis 1 h lang zu behandeln. Wir haben gefunden, daß dieses kurze Fixieren mit Paraformaldehyd Penetration von Primern und anderen Reagentien in die Zellen ermöglicht, ohne daß zerstörerische Proteasebehandlung erforderlich ist, von der man annimmt, daß sie für die in-situ-PCR wesentlich ist. Fixierung kann unter bestimmten Umständen fakultativ sein. Das heißt, die SDA kann in situ in unfixierten Zellen durchgeführt werden, insbesondere wenn nur RNS-Ziele zu amplifizieren sind und kein vorhergehender Heizschritt erforderlich ist (siehe nachstehend).
- Wenn ein Gewebeschnitt, der die zu amplifizierenden Nucleinsäuren enthält, in Paraffin eingebettet ist, wird das Paraffin vor der Fixierung durch Behandeln mit Xylol entfernt, wie es auf dem Fachgebiet bekannt ist. Diese Gewebeschnitte können vorher für andere Zwecke (z. B. im Pathologielabor) fixiert worden sein, ohne Rücksicht auf Penetration von Reagentien für die in-situ-Amplifikation, d. h., sie können im wesentlichen länger als 1 h lang fixiert worden sein. Häufig ist die Penetration von Amplifikatlonsreagentien in die Zellen des Gewebeschnitts trotz der extensiven Fixierung möglicherweise wegen der Dünne des Schnitts noch immer zufriedenstellend. Jedoch kann in einigen Fällen die Penetration der Zellen durch Amplifikationsreagentien verhindert werden oder durch vorherige extensive Fixierung merklich verringert werden. Wenn es so ist, ist es bevorzugt, daß der Gewebeschnitt vor der in-situ-Amplifikation mit Protease oder Hitze behandelt wird, um die Penetration von Reagentien in die Zellen des Gewebeprobe zu verbessern. Gefrorene Gewebeschnitte, welche vorher nicht fixiert worden sind, können wie vorstehend beschrieben fixiert werden und erfordern keine vorherige Protease- oder Hitzebehandlung.
- Es können entweder RNS- oder DNS-Zielsequenzen oder beide direkt unter Verwendung der hierin beschriebenen Verfahren amplifiziert werden. Es sind keine zusätzlichen Schritte oder Reagentien erforderlich, um die RNS-Zielsequenzen zu amplifizieren, anders als bei der in-situ-PCR, bei welcher Reverse-Transkriptase zuerst hinzugefügt werden muß, um cDNS zu erzeugen, welche dann nach dem herkömmlichen PCR-Protokoll amplifizierbar sind (G. J. Nuovo, et al. (1992) Diag. Molec. Pathol. 1: 98-102; G. J. Nuovo, et al. (1991) Am. J. Pathol. 58: 518-523; G. J. Nuovo, et al. (1991) Am. J. Pathol. 139: 1239- 1244). Es würde erwartet werden, daß der Reverse-Transkriptase- Versuch auch bei der in-situ-SDA funktioniert, und kann jedoch unter bestimmten Umständen nützlich sein.
- Die in der SDA verwendete excV-Klenow-Polymerase kann DNS- Kopien einer Zielsequenz unter Verwendung von entweder RNS oder DNS als die Matrize polymerisieren. RNS-Zielsequenzen können daher in fixierten Zellen oder Geweben durch Ausschalten des Heizschritts vor der Initiierung der SDA-Reaktion selektiv amplifiziert werden, so daß nur Einzelstrangmatrizen zur Amplifikation verfügbar sind. Die Doppelstrang-DNS in den Zellen bleibt doppelsträngig und als Matrize nicht verfügbar, wohingegen Primer hybridisieren können, um Einzelstrang-RNS verfügbar zu machen und spezifische Amplifikation von RNS- Zielsequenzen zu beginnen. Fixieren hilft bei der Aufrechterhaltung der Integrität der Zellen während des Heizens. Wenn es keinen vorhergehenden Heizschritt gibt, wie bei der RNS-Amplifikation, ist Fixieren deshalb nicht erforderlich. Nichtfixierte Zellen oder Gewebe für die in-situ- SDA-Amplifikation können mit Detergenzien durchlässig gemacht werden, wie auf dem Fachgebiet bekannt, zum Beispiel NP40, TRITON oder Saponin. Spezifische Amplifikation von RNS- Zielsequenzen kann auch vor der Initiierung der SDA durch Behandlung der fixierten Zellen oder Gewebe mit RNase-freier DNase erreicht werden.
- Behandlung der fixierten Zellen oder Gewebe mit RNase vor dem Denaturieren der Doppelstrang-DNS durch Erhitzen baut mögliche RNS-Zielsequenzen ab und ermöglicht spezifische Amplifikation der entsprechenden DNS-Zielsequenzen. NaOH (etwa 0,1 M) kann auch verwendet werden, um RNS selektiv abzubauen und DNS zur DNS-spezifischen Amplifikation zu denaturieren.
- Wenn der Heizschritt vor der Anlagerung der SDA-Primer eingeschlossen ist (ohne RNase-Behandlung) werden sowohl die DNS- als auch die RNS-Zielsequenzen amplifiziert. In-situ- Amplifikation von RNS durch SDA ist weniger wirksam als DNS- Amplifikation, aber RNS-Ziele sind in der Zelle allgemein in größeren Anzahlen vorhanden als das entsprechende DNS-Ziel. Die Folge von RNS- und DNS-Amplifikation ist deshalb eine Mischung aus relativer Kopieanzahl und Effizienz der Amplifikation und durch viele Faktoren beeinflußt. Amplifikation von sowohl RNS- als auch DNS-Zielen wird für die meisten diagnostischen Anwendungen bevorzugt, weil dies die größte Anzahl an amplifizierbaren Zielsequenzen pro Zelle und folglich die größte Sensitivität und größte Anzahl an positiven Zellen pro Probe liefert.
- Wenn Erhitzen vor der Amplifikation erwünscht ist, werden die fixierten Zellen oder Gewebe allgemein im SDA- Reaktionsgemisch ohne die Enzyme (0,2 mM dNTPs, 50 mM K&sub3;PO&sub4;, 6 mM MgCl&sub2;, 1 ug BSA, 6% DMSO, 50 nM externe Primer und 500 nM SDA-Primer) erhitzt. Die HincII- und exo&supmin;-Klenow-Polymerase- Enzyme werden dann, nachdem die Probe von der Heizquelle entfernt und auf eine Temperatur abkühlen gelassen worden ist, welche für die Enzymaktivität vorzugsweise optimal ist, hinzugefügt. Wenn die fixierten Zellen oder Gewebe nicht zu erhitzen sind, kann das vorstehende SDA-Reaktionsgemisch, das vorzugsweise etwa 150 Units HincII und vorzugsweise etwa 5 Units exo&supmin;-Klenow-Polymerase enthält, zu der Zellprobe hinzugefügt und die Amplifikationsreaktion initiiert werden.
- Amplifikation der ausgewählten Zielsequenz ist wesentlich, wie von Walker, et al. (1992a und 1992b), vorstehend, beschrieben wurde. Jedoch kann es in bestimmten Fällen vorteilhaft sein, die Konzentration von Reagentien (insbesondere Primer) für die in-situ-SDA zu erhöhen, um sicherzustellen, daß zur effizienten Amplifikation ausreichende Mengen in die Zellen gelangen. Ausströmen von Amplikons aus den Zellen ist ein Problem bei in-situ-Nucleinsäureamplifikationsverfahren. Solches Ausströmen ist die Folge der komplexen Wechselwirkung verschiedener Parameter, z. B. Größe des Amplikons, Temperatur und der Grad, zu welchem die Zelle durchlässiggemacht worden ist. Aus diesem Grund kann gegebenenfalls ein Desoxyribonucleosid-Triphosphat-(dNTP) - Analogon, das das mit einer Einheit, wie Digoxigenin ("Dig"), Biotin oder Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), verbundene dNTP umfaßt, zusammen mit dem dATPαS in die Amplifikationsprodukte eingebaut werden, um die Retention der Amplikons innerhalb der Zelle zu erleichtern und gegebenenfalls auch als eine Markierung oder ein Marker zu dienen, das/der zum Nachweisen der Amplifikationsprodukte verwendet wird. Einbau von solchen dNTP-Analoga ist besonders vorteilhaft für die in-situ-SDA, weil die amplifizierte Zielsequenz allgemein kleiner ist als ein PCR-Amplikon. Auch wenn die SDA-Amplifikationsprodukte allgemein kleiner sind als PCR-Amplifikationsprodukte, ist jedoch bei der Ausübung der vorliegenden Erfindung unerwartet beobachtet worden, daß es sowohl in Zellen als auch Geweben weniger Ausströmen gibt, das mit SDA- als mit PCR-in-situ- Amplifikation verbunden ist. Einbau von dNTP-Analoga, wie Dig, hat auch den Vorteil des Bereitstellens eines verstärkten Signals, weil jede eingebaute Markereinheit durch Bindung an anti-Dig-Antikörper, die mit AP (AP-α-Dig) verbunden sind, ein Signal erzeugen kann.
- Nach Initiierung der Reaktion ließ man die Amplifikation der Zielsequenz allgemein etwa 5 min bis 2 h lang, vorzugsweise 30 min bis 1 h lang, bei etwa 37ºC ablaufen. Wir haben gefunden, daß die Zeit, die für die in-situ-Amplifikation durch SDA erforderlich ist, merklich kürzer ist als die Zeit, die erforderlich ist, um eine vergleichbare Menge an Zielamplifikation in situ durch die PCR zu erhalten.
- Im Anschluß an die Zielamplifikation können die erzeugten Amplikone durch eines von mehreren auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren zum Nachweis spezifischer Nucleinsäuresequenzen nachgewiesen werden. Zum Beispiel können Amplifikationsprodukte in der Zelle oder im Gewebe durch spezifische Hybridisierung an eine Oligonucleotid-Detektorsonde nachgewiesen werden. Die Oligonucleotid-Sonde ist ein kurzes Oligonucleotid, welches einen nachweisbaren Marker einschließt, z. B. eine Einheit, welche ein nachweisbares Signal erzeugt oder dessen Erzeugung bewirken kann. Der Marker kann durch Nick-Translation, Endmarkierung oder während der chemischen Synthese der Sonde in die Oligonucleotid-Sonde eingebaut werden. Viele direkt und indirekt nachweisbare Marker sind auf dem Fachgebiet zur Verwendung mit Oligonucleotid-Sonden bekannt. Direkt nachweisbare Marker schließen solche Marker ein, welche keine weitere Reaktion erfordern, um nachweisbar gemacht zu werden, z. B. Radioisotope, fluoreszierende Einheiten und Farbstoffe. Fluoreszierende Marker, wie Fluorescein-Isothiocyanat (FITC), oder Radioisotope, wie ³²P, ³³P, ¹²&sup5;I oder ³&sup5;S, werden für die Verwendung in markierenden Sonden zum direkten Nachweisen von in situ amplifizierten Zielsequenzen bevorzugt. Indirekt nachweisbare Marker schließen solche Marker ein, welche mit zusätzlichen Reagentien reagieren müssen, um nachweisbar gemacht zu werden, z. B. Enzyme, die geeignet sind, ein farbiges Reaktionsprodukt zu erzeugen, Biotin, Avidin, Digoxigenin, Antigene, Haptene oder Fluorochrome. Das Signal von Enzymmarkern wird allgemein durch Reaktion des Enzyms mit seinem Substrat und etwaige zusätzliche Reagentien, die zur Erzeugung eines farbigen, unlöslichen, enzymatischen Reaktionsprodukts erforderlich sind, entwickelt. Biotin- (oder Avidin-) Marker können durch Binden an markiertes Avidin (oder markiertes Biotin) oder markierte anti-Biotin- (oder markierte anti-Avidin-) Antikörper nachgewiesen werden. Digoxigenin- oder Hapten-Marker werden gewöhnlich durch spezifische Bindung an einen markierten anti-Digoxigenin- (anti-Dig-) oder anti- Hapten-Antikörper nachgewiesen. Enzyme werden vorzugsweise zur Verwendung als indirekt nachweisbare Marker bevorzugt. Am meisten bevorzugt ist Alkalische Phosphatase (AP), weil sie stabil ist und extensiv zum Markieren in Geweben und Zellen verwendet worden ist. Das Vorhandensein von AP kann durch Reaktion mit einem Substrat nachgewiesen werden. Die bevorzugten Substrate zum Nachweis von AP sind Vector Red/Vector Blue (Marke) (Vector Labs, CA), 5-Brom-4-chlor-3- indolylphosphat (BCIP)/Nitroblautetrazolium (NBT) (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) oder Nuclear Fast Red (Marke) (Sigma Chemical Company). Vector Red hat den zusätzlichen Vorteil der Fluoreszenz, was Sichtbarmachen eines positiven Signals entweder durch herkömmliche Lichtmikroskopie oder durch Fluofeszenz-Mikroskopie ermöglicht. Verfahren zur Entwicklung des farbigen Reaktionsprodukts von AP mit diesen Substraten sind auf dem Fachgebiet bekannt.
- Um eine amplifizierte Zielsequenz durch in-situ- Hybridisierung an eine markierte Sonde nachzuweisen, werden die Zellen oder Gewebe der markierten Sonde unter Reaktionsbedingungen ausgesetzt, die zur spezifischen Hybridisierung der Sonde an die Einzelstrangamplifikationsprodukte geeignet sind. Allgemein wird die markierte Sonde so ausgewählt, daß sie an eine Nucleotidsequenz im Amplikon hybridisiert, welche sich zwischen den Bindungsstellen der beiden Amplifikationsprimer befindet. Jedoch kann eine markierte Sonde auch dieselbe Nucleotidsequenz wie jeder der Amplifikationsprimer haben. Die bevorzugten Verfahren zum Nachweis der in-situ-Amplifikationsprodukte durch Hybridisierung an eine Detektorsonde sind die von J. B. Lawrence, et al. (1989) Cell 57: 493-502), J. B. Lawrence, et al. (1990) Proc. NaLl. Acad. Sci. USA 87: 5420-5424) und in US-A- 4 888 278 beschriebenen in-situ-Hybridisierungsverfahren.
- In einer anderen Ausführungsform können amplifizierte Zielsequenzen in situ durch Primerverlängerung nachgewiesen werden, wie von Walker, et al. (1992b), vorstehend, beschrieben. Beim Primerverlängerungverfahren wird ein Oligonucleotidprimer, der einen nachweisbaren Marker umfaßt, in situ an die amplifizierten Zielsequenzen hybridisiert und bei 37ºC durch Hinzufügen von Polymerase zu einer diagnostischen Länge verlängert. Zum Nachweis kann der Primer 5'-endmarkiert sein, am meisten bevorzugt unter Verwendung von ³²P. In einer anderen Ausführungsform kann die Verlängerung des - hybridisierten Primers ein dNTP-Analogon einbauen, das einen direkt oder indirekt nachweisbaren Marker umfaßt. Zum Beispiel kann die Verlängerung des Primers ein Dig-derivatisiertes dNTP einbauen, welches dann nach Verlängerung durch Reaktion mit AP- α-Dig und einem geeigneten AP-Substrat nachgewiesen werden kann. Der zu verlängernde Primer kann entweder derselbe wie ein Amplifikationsprimer sein oder er kann ein verschiedener Primer sein, welcher an eine Nucleotidsequenz im Amplikon hybridisiert, welche sich zwischen den Bindungsstellen der Amplifikationsprimer befindet.
- Der nachweisbare Marker kann auch während der Zielsequenzamplifikation direkt in die Amplikone eingebaut werden. Zum Beispiel kann eine der dNTPs in der herkömmlichen SDA-Reaktion vollständig oder teilweise durch ein dNTP-Analogon ersetzt werden, welches ein an einem direkt oder indirekt nachweisbaren Marker gebundenes dNTP umfaßt. Zum Beispiel kann dTTP in der SDA-Reaktion durch am gewünschten Marker gebundenes dUTP ersetzt werden. Die Polymerase baut den Marker dann direkt in die durch die Reaktion erzeugten Amplifikationsprodukte ein. Der Marker kann direkt oder indirekt nachweisbar sein. Vorzugsweise ist der mit dem dNTP verbundene Marker ein fluoreszierender Marker, welcher direkt in den Amplikonen durch Fluoreszenz-Mikroskopie oder Durchflußzytometrie nachgewiesen kann. In einer alternativen, bevorzugten Ausführungsform ist der mit dem dNTP verbundene Marker Biotin oder Digoxigenin, welche durch Reaktion mit Streptavidin/FITC und Fluoreszenz- Mikroskopie oder Durchflußzytometrie nachgewiesen werden können.
- Der Marker der hybridisierten Detektorsonde, der Marker des verlängerten Primers oder der in die Amplifikationsprodukte eingebaute Marker wird dann als ein Anzeichen des Vorhandenseins von amplifizierten Zielsequenzen in den Zellen nachgewiesen. Dies kann das Hinzufügen von Reagentien zu den Zellen erfordern, um das Signal eines indirekt nachweisbaren Markers, wie AP, Biotin oder Dig, zu entwickeln. Mikroskopische Analyse der Zellen wird bevorzugt, wenn der nachweisbare Marker ein Enzym ist. Mikroskopische Analyse kann entweder durch visuelle Beobachtung der Zellen oder Gewebe (Fluoreszenz- oder Lichtmikroskopie) oder automatisierte Bild-Analyse unter Verwendung von Instrumenten, wie DISCOVERY (Marke) (Becton Dickinson Image Cytometry, Leiden, Holland), erfolgen, um die Anzahl und Signalintensität positiver Zellen auszuwerten. In einer anderen Ausführungsform können Amplifikationsprodukte aus Zellen freigesetzt und nach Gel-Elektrophorese als Banden von Amplifikationsprodukten, z. B. durch EtBr-Färbung, Hybridisieren einer Detektorsonde oder Primerverlängerung sichtbargemacht werden. Wenn ein Radiomarker für den Primer oder die Detektorsonde verwendet wird, können die Amplifikationsprodukte durch Autoradiographie der Gele sichtbargemacht werden. Die Verwendung eines direkt nachweisbaren fluoreszierenden Markers ermöglicht Fluoreszenz-Analyse von Zellen in Suspension mittels Durchflußzytometrie (z. B. FACSCAN (Marke), Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA). Eine Verschiebung in der Peakfluoreszenz nach rechts in einer graphischen Darstellung von Zellanzahl gegen Fluoreszenzintensität zeigt eine zunehmende Anzahl an Zellen an, die die Zielsequenz enthalten. Umgekehrt zeigt eine Verschiebung in der Peakfluoreszenz nach links in der graphischen Darstellung eine verringerte Anzahl an Zellen an, die die Zielsequenz enthalten.
- Hitze induziert Autofluoreszenz der zu analysierenden Zellen und hat Probleme beim Nachweis der Produkte der in-situ- Amplifikation mittels Durchflußzytometrie dargestellt. Wenigstens etwas der zugenommenen Autofluoreszenz, die in Zellen nach der PCR gesehen wurde, ist wahrscheinlich durch zyklisches Durchlaufen der Temperatur induziert, während gefunden worden ist, daß Autofluoreszenz für die Durchflußzytometrie-Analyse nach in-situ-SDA im Vergleich zur in-situ- PCR verringert war, ferner Abwandlungen am SDA-Protokoll zum Optimieren der Datenanalyse erforderlich waren. Von besonderer Bedeutung war unsere Entdeckung, daß Monozyten Detektorsonden unspezifisch aufnehmen und dadurch unspezifische Fluoreszenz erhöhen. Wir haben gefunden, daß solche unspezifische Fluoreszenz durch Erhöhen des DMSO auf 10 ul von den 6 ul, welche üblich waren, verringert werden konnte. Wir haben auch gefunden, daß direkter Einbau eines Markers durch Primerverlängerung in vielen Fällen bessere Trennung der Fluoreszenzpeaks lieferte als der Nachweis von Amplifikationsprodukten durch in-situ-Hybridisierung an eine Detektorsonde.
- Unsere Verfahren von in-situ-Amplifikation und Nachweis von Zielnucleinsäuresequenzen sind insbesondere zum Nachweis und zur Analyse von HIV-1 infizierten Lymphoidzellen nützlich. Jüngste Veröffentlichungen legen dar, daß die Anzhal von HIV-1 infizierten Zellen in Lymphoidgewebe größer ist als früher angenommen und merklich größer ist als im peripheren Blut (G. Pantaleo, et al. (1991) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88, 9838- 9842; S. Jurriaans, et al. (1992) AIDS 6, 635-641). Diese Entdeckung legt nahe, daß, auch wenn die Virusbeladung gering ist (wie es frühzeitig bei der Infektion ist), die Lymphoidorgane als Reservoir für das Virus dienen können. Die unerwartet hohe Anzahl an HIV-1 positiven Zellen in Lymphoidgeweben legt auch nahe, daß nach Zerstörung von follikularen dendritischen Zellen (FDC) und des Aufbaus des Lymphknotens HIV-infizierte Zellen in den Blutkreislauf freigesetzt werden. Dies kann nur in einem späteren Stadium der Krankheit stattfinden. Begrenzter Nachweis von mononuklearen Zellen des peripheren Bluts (PBMC) kann deshalb nicht die Stelle von höchster Viruskonzentration in vivo widerspiegeln. Auch wenn ferner die Virusbeladung in PBMC gering ist, ist aktive Virusreplikation in Lymphoidgeweben gezeigt worden, was Fragen zum Konzept von klinischer Latenz aufwirft (G. Pantaleo, et al. (1993) Nature 362, 355-358; J. Embretson, et al. (1993) Nature 362, 359-362). Die Sensitivität und Spezifität der in-situ-SDA kann deshalb sehr frühen Nachweis von HIV-1 Lymphoidgewebe vor dem Erscheinen von HIV-1 positiven Zellen im peripheren Blut ermöglichen.
- Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal ein Mittel zur Strangverdrängungsamplifikation von Nucleinsäuren in situ in Zellen auf Objektträgern, in Suspension und in Geweben bereit. Über PCR-Amplifikationsprodukte zur Verwendung in situ ist auch berichtet worden. Die Amplifikationseffizienz für die in-situ-SDA ist ungefähr dieselbe wie die, über die für die insitu-PCR berichtet wurde (d. h. 109). Jedoch stellt die in-situ- SDA bestimmte unerwartete Vorteile gegenüber der in-situ-PCR bereit. Weil es keine mehrfachen Runden des zyklischen Durchlaufens der Temperatur erfordert, um Amplifikation des Ziels zu erreichen, ist die in-situ-SDA milder zu den Zellen und Geweben. Folglich ist dieses Verfahren mehr vereinbar mit Verfahren, bei welchen Einzelzellanalyse wichtig ist. Nach wiederholtem zyklischen Durchlaufen bei 95ºC bei der PCR erscheint die Morphologie und das Aussehen der Zellen und Gewebe geschädigt. Die Zellen neigen dazu, zu aggregieren und ihren Inhalt in das Medium ausströmen zu lassen, was Nachweis und Quantifizierung der Anzahl positiver Zellen schwer macht, wenn sich das enzymatische Substrat mit mehr als einer positiven Zelle überschneidet. Gewebe verlieren die strukturelle Definition ebenso. Außerdem können Doppelfärbeverfahren, die aufeinanderfolgende in-situ-Hybridisierung und Trnrnunozytochemie einschließen, nach der in-situ-PCR praktisch unmöglich werden, weil das zyklische Durchlaufen der Temperatur die interessierende antigene Stelle zerstören kann. SDA ermöglicht im Gegensatz dazu solch eine Doppelfärbung und ermöglicht folglich eine bessere und vollständigere Analyse der Zellen.
- Wenn Zellen in Suspension oder in Geweben sowohl durch in- situ-SDA als auch Immunofärbung zu analysieren sind, wird es bevorzugt, daß Bindung des Antikörpers an das interessierende Epitop oder Antigen vor dem Fixieren gemacht wird und daß der Antikörper mit einem indirekt nachweisbaren Marker, z. B. Biotin, verbunden ist. Das Antikörper-Konjugat wird dann ah den Zellen durch Fixierung stabilisiert. Nach in-situ-SDA wird der gebundene Antikörper durch Reaktion mit geeigneten signalentwickelnden Reagentien, z. B. mit Fluorochrom verbundenes Streptavidin, nachgewiesen.
- Nachweis von RNS durch die PCR erfordert die Verwendung eines zusätzlichen Enzyms (d. h. Reverse-Transkriptase), um die Einzelstrang-RNS-Matrize in eine cDNS-Kopie zu transkribieren, welche als eine Matrize für nachfolgende PCR-Amplifikation dient. Es ist jetzt jedoch gezeigt worden, daß die in der Strangverdrängungsamplifikation verwendete excC-Klenow- Polymerase Einzelstrang-RNS ebenso wie DNS als Matrize verwendet. Dieses einzelne Verfahren ermöglicht deshalb Amplifikation und Nachweis von RNS und/oder DNS einfach durch Auswahl der Voramplifikationsbehandlung des Ziels (d. h. Denaturierung, keine Denaturierung, DNase oder RNase). Die vorliegende Erfindung stellt zum ersten Mal ein Mittel zur Durchführung von Nucleinsäureamplifikation in situ unter physiologischen Bedingungen (d. h. ohne Fixierung), wie vorstehend beschrieben, bereit. Dieses Merkmal verleiht der insitu-SDA einen besonderen Vorteil gegenüber der in-situ-PCR, wenn schneller Nachweis und schnelle Quantifizierung von RNS und DNS innerhalb einer Zelle zum Festsetzen von Arzneimitteltherapie und Überwachen der Virusbeladung in Patienten nützlich ist. Die vorliegenden Verfahren zur in-situ- SDA-Amplifikation und zum -Nachweis machen es auch möglich, HIV-infizierte Zellen, welche aktive Virusreplikation (RNS) unterstützen, von solchen zu unterscheiden, welche im latenten Stadium (nur DNS) sind. Dies ist wichtig für die Diagnose, weil gezeigt worden ist, daß RNS-Spiegel besser dem klinischen Status des Patienten entsprechen als DNS-Spiegel und sie ein verläßlicherer Indikator für Virusbeladung sind (J. Genesca, et al. (1990) J. Infect. Dis. 162, 1025-1030). Es ist auch hoch erwünscht, den infizierten Zelltyp durch morphologische oder zytochemische Verfahren identifizieren zu können, wenn nur die Verwendung von in-situ-SDA-Amplifikations- und -Nachweisverfahren möglich sind.
- Die folgenden experimentellen Beispiele werden bereitgestellt, um bestimmte Ausführungsformen der Erfindung zu veranschaulichen, sind aber nicht zum Beschränken der Erfindung auszulegen.
- Die SDA und die PCR wurden zuerst in Suspension in der herkömmlichen Art und Weise an Nucleinsäuren durchgeführt, die aus Geweben und Zellen extrahiert worden sind. Dies diente vor der Durchführung der in-situ-SDA der Bestätigung, welche Gewebe HIV-1-positiv waren und welche negativ waren, wodurch eine Basis zur Interpretation der Ergebnisse von in-situ-SDA- Amplifikationen bereitgestellt wurde.
- Die SDA und die PCR wurden dann in situ direkt an geschnittenen Lymphknotengewebeproben von Patienten durchgeführt, die durch Serologie HIV-1-positiv oder -negativ bestimmt wurden. Beide Amplifikationsverfahren wurden an derselben Gewebeprobe durchgeführt, um die Variabilität zu minimieren. Die Gewebe wurden unter Verwendung eines sauberen Skalpels von den Objektträgern entfernt und wurden 2 min lang in 1 ml Xylol gewaschen, um das Paraffin zu entfernen. Die Proben wurden dann bei 1200 Upm in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert, das Xylol wurde abpipettiert, und das Gewebe wurde zweimal mit 1 ml 100% Ethanol gewaschen, bevor es bei 55ºC getrocknet wurde. DNS wurde auch aus HIV-positiven Zelllinien (ACH&sub2; und 8E5) und HIV-negativen Zelllinien (CEM und A301) durch Aufbrechen und Phenolextraktion der Zellen unter Verwendung von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren in Lösung gebracht. Die DNS aus den positiven und negativen Zelllinien wurden als Kontrollen verwendet. Oligonucleotid-Primer und -Sonden wurden in einem Applied Biosystems, Inc. 380B DNS- Synthesizer synthetisiert. Die Sonden wurden mit einem modifizierten AMINOLINK (Marke) (Glen Research, Sterling, VA) an ihrem 5'-Ende synthetisiert, um Markierung mit Alkalischer Phosphatase zu ermöglichen. In einer anderen Ausführungsform wurden in einigen Fällen die Primer und Sonden unter Verwendung eines üblichen Kits (Boehringer-Mannheim) mit Digoxigenin endmarkiert. Die Nucleotid-Positionen im HIV-Genom der folgenden Primer und Sonden wurden gemäß der Sequenz des Humanen Immunodefizienz Virus HXB-2 (GENBANK Accession Number K03455) nummeriert.
- Die PCR wurde im wesentlichen, wie vorher von 0. Bagasra (1992) New Engl. J. Med. 326, 1385-1391) beschrieben, durchgeführt. Jede PCR enthielt das erzeugte Gewebe, 500 ng von jedem Amplifikationsprimer, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl&sub2; und 1 Unit Taq-Polymerase (Promega) im vom Hersteller gelieferten Puffer. Die Zielsequenz für die Amplifikation war das HIV-gag- Gen. Die Primersequenzen waren wie folgt: SK38 (Nucleotide 1541-1578 ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAT (SEQ ID NR. 1) und SK39 (Nucleotide 1657-1630) TTTGGTCCTTGTCTTATGTCCAGAATGC (SEQ ID NR. 2). Zyklisches Durchlaufen wurde für 30 Zyklen (45 sec lang 94ºC, 45 sec lang 72ºC) durchgeführt, gefolgt von einer Endverlängerung 5 min lang bei 72ºC. Aliquots (10 ul) der Reaktion wurden dann 2 min lang bei 95ºC denaturiert und 60 min lang mit 2 umol Sonde SK19 (Nucleotide 1595-1635) ATCCTGGGATTAAATAAAATAGTAAGAATGTATAGCCCTAC (SEQ ID NR. 3), endmarkiert mit ³²P, und T4-Kinase inkubiert. Diese Sonde hybridisiert an ein Segment innerhalb der amplifizierten Sequenz. Die so erhaltenen, an die markierte Sonde hybridisierten Amplifikationsprodukte wurden auf einem Gradientengel (10-20% PAGE) analysiert und autoradiographisch aufgenommen. Die Amplifikationsprodukte wurden auch durch Färbung mit Ethidiumbromid (EtBr) direkt auf dem Gel nachgewiesen. Die für die in-situ-PCR-Amplifikation erforderliche Gesamtzeit betrug ungefähr 4 h.
- Die SDA wurde im wesentlichen, wie von Walker, et al. (1992b), vorstehend, beschrieben, durchgeführt. Jede SDA- Reaktion enthielt 150 Units HincII (New England Biolabs, 75 U/ul), 5 Units exo&supmin;-Klenow-Polymerase (United States Biochemicals), 0,2 mM dNTPs (dCTP, dGTP, dTTP und dATPαS - Pharmacia), 50 mM K&sub3;PO&sub4;, 6 mM MgCl&sub2;, 1 ug BSA, 6% DMSO, 50 nM externe Primer (B&sub1; und B&sub2;), 500 nM Amplifikationsprimer (S&sub1; und S&sub2;) und das erzeugte Gewebe. SK38 und SK39 (SEQ ID NR. 1 und SEQ ID NR. 2) wurden als die externen Primer für die SDA verwendet. Die Sequenzen der Amplifikationsprimer waren AATAGTCGCTTACTTGTTGACGGATAATCCTGGG (S&sub1;, SEQ ID NR. 4) und AAGTAACCGACTATTGTTGACGGCTATACATTCT (S&sub2;, SEQ ID NR. 5). Die Amplifikationsprimer entsprachen den Nucleotid-Positionsnummern 1582-1594 bzw. 1623-1611.
- Die SDA-Proben (ohne die Enzyme) wurden 2-3 min lang bei 95ºC inkubiert, gefolgt von einer 2 min langen Inkubation bei 37ºC. Die Enzyme wurden dann hinzugefügt und die Inkubation 2 h lang bei 37ºC fortgesetzt. Ein Aliquot (10 ul) der Reaktion wurde dann mit 1 uM einer internen Sonde (ACTATTTTATTTAAACC, SEQ ID NR. 6), endmarkiert mit ³²P, und T4-Kinase gemischt. Nach 2 min langer Inkubation bei 95ºC, gefolgt von einer 2 min langen Inkubation bei 37ºC, wurde die Sonde durch Hinzufügen von 2 Units Klenow-Polymerase (Promega) 15-30 min lang bei 37ºC verlängert. Die Produkte wurden dann mit Ladepuffer gemischt und durch Gelelektrophorese auf einem 15% Harnstoff- Polyacrylamidgel analysiert. Das Gel wurde getrocknet und autoradiographisch aufgenommen. In einigen Fällen wurde sowohl bei der PCR als auch bei der SDA ein radiomarkiertes dNTP (z. B. dCTP³²) in das Reaktionsgemisch eingebracht, und die markierten Amplifikationsprodukte wurden nach der Elektrophorese und Trocknen des Gels direkt auf Autoradiogrammen nachgewiesen. Die für die in-situ-SDA-Amplifikation erforderliche Gesamtzeit betrug ungefähr 2 h.
- Nach der PCR zeigte die Ethidiumbromid-Färbung des Gels ein klar positives amplifiziertes Produkt in zwei Patienten und drei negative Patienten in der ersten Gruppe. Die sichtbargemachten Banden waren von der vorausgesagten Größe für die Amplifikationsprodukte der HIV-1-Zielsequenz und wanderten an derselben Position wie das amplifizierte Produkt der positiven Zelllinie. Kein Signal wurde gesehen nach Amplifikation der negativen Zelllinie, oder wenn die Primer oder das Enzym (Taq) vom Reaktionsgemisch weggelassen wurden. Hybridisierung der PCR-Amplifikationsprodukte in Lösung an die ³²P-markierte interne Sonde SK19 (SEQ ID NR. 3) bestätigten die beiden positiven und die drei negativen Patienten in dieser Gruppe. In einer zweiten Gruppe von Patienten wurden stark positive Banden einer amplifizierten HIV-1-Zielsequenz in drei von sechs Patienten bei Ethidiumbromid-Färbung gesehen. Eine sehr schwache Bande wurde in einem Patienten in dieser Gruppe gesehen. Hybridisierung der PCR-Amplifikationsprodukte dieses Patienten in Lösung mit der markierten internen Sonde zeigte, daß die schwache Bande tatsächlich eine klar positive Bande war. Keine Amplifikation wurde aus serologisch negativen Patienten nachgewiesen. Serologisch negative Patienten schlossen einige mit Adenokarzinom, Karzinom, Brustkrebs und cervicaler Lymphadenopathie ein.
- Sowohl die Ethidiumbromid-Färbung von 10% Polyacrylamidgelen als auch die Autoradiographie nach SDA-Amplifikation ließen Amplifikation nur in HIV-infizierten Zellen erkennen. Alle sechs serologisch positiven Patientenproben in der ersten getesteten Gruppe hatten klare Banden, die amplifizierte Produkte anzeigten und den Banden entsprachen, die in der Amplifikation der beiden positiven Zelllinien gefunden wurden. Kein Signal wurde in der negativen Zelllinie nachgewiesen. Autoradiogramine nach Hybridisierung und Verlängerung einer ³²P- markierten Sonde bestätigten die sechs positiven Patienten mit Amplifikationsprodukten, die an derselben Position wie die amplifizierten Produkte der positiven Zelllinie wanderten. Diese Ergebnisse wurden durch Analyse der SDA-Amplifikationsprodukte von achtzehn zusätzlichen serologisch positiven Patienten auf Autoradiogrammen bestätigt.
- In Paraffin eingebettete Gewebeschnitte von HIV-1- positiven Patienten wurden nach der in-situ-PCR und in-situ-SDA auch mikroskopisch beobachtet. Vergleiche wurden angestellt zwischen 1) in-situ-Hybridisierung nach in-situ-Amplifikation durch SDA und 2) in-situ-Hybridisierung ohne vorherige Nucleinsäure-Amplifikation. In beiden Fällen gab es ein starkes Signal, aber nach in-situ-SDA wurden mehr Zellen als positiv bestimmt als durch herkömmliche in-situ-Hybridisierung. In jedem Fall war die Morphologie des Gewebes gut erhalten und der Verlät an morphologischen Einzelheiten war minimal. Im Gegensatz dazu hatte die in-situ-PCR einen merklichen Verlust morphologischer Einzelheiten und Verschlechterung der Gewebestruktur zur Folge.
- Die Fig. 1B und 1A sind lichtmikroskopische Analysen, die einen Vergleich zwischen in-situ-PCR und in-situ-SDA anstellen, die an H9-Zellen durchgeführt wurden. Die in-situ- PCR hatte klare Beschädigung der Zellen (Fig. 1B) zur Folge, wohingegen die in-situ-SDA merklich mehr Zellen morphologisch intakt und die positiven Zellen leichter identifizierbar läßt (Fig. 1A). SDA-behandelte Zellen waren von unbehandelten Zellen nicht zu unterscheiden. Insbesondere war die Färbung nach der PCR inhomogen und unregelmäßig, die Zellkerne der Zellen waren nicht sichtbar, Trümmer umgaben die Zellen und die Zellen wurden von den Objektträgern verloren. Die in-situ-SDA, die an einem Gewebeschnitt von einem HIV-negativen Patienten durchgeführt wurde, zeigte kein sichtbares Signal bei mikroskopischer Untersuchung und die Morphologie des Gewebes war gut erhalten, was darlegte, daß die in-situ-SDA nicht nur hoch sensitiv sondern auch hoch spezifisch für HIV-positive Zellen ist.
- Dieses Experiment veranschaulicht 1) in-situ-SDA von Einzelstrangzielen (DNS und RNS) mit anfänglicher Denaturierung und 2) in-situ-SDA ohne anfängliche Denaturierung, um die Amplifikation auf vorher vorhandene Einzelstrangspezies (RNS) zu beschränken. Gewebeschnitte auf Objektträgern (Lymphknoten, Milz und Hirn von HIV-1-positiven Patienten) wurden in Xylol entparaffiniert, durch Ethanol vom Qualitätsgrad (100%-70%) gezogen und in 4% Paraformaldehyd/mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 10 min lang bei Raumtemperatur fixiert. Die Gewebe wurden in PBS/5 mM MgCl&sub2; 5 min lang rehydratisiert. Ein Aliquot des SDA-Reaktionsgemisches (siehe Beispiel 1) wurde hinzugefügt und die Objektträger wurden 3 min lang in einem Heizblock bei 95ºC inkubiert. Die Objektträger für die RNS- Amplifikation wurden nicht erhitzt. Die HincII-Restriktionsendonuclease und die exo&supmin;-Klenow wurden unter einem Deckgläschen hinzugefügt und die Inkubation wurde in einer Feuchtkammer 2 h lang bei 37ºC fortgesetzt. Die Objektträger wurden in 1x SSC gewaschen, 10 min lang in 95% Formamid/0,2x SSC bei 70ºC inkubiert und in eiskaltem 0,1xSSC gespült. Eine interne SDA-Sonde (20-50 ng, SEQ ID NR. 3, markiert mit Alkalischer Phosphatase, wie von H. Kiyama, et al. (1991) J. Histochem. Cytochem. 39: 1371-1384) und M. A. Farquharson, et al. (1992) Am. J. Clin. Pathol. 45: 1999-2002, beschrieben) wurde unter das Deckgläschen hinzugefügt und 60 min lang bei 55ºC inkubiert. Nach Waschen in 1x SSC bei 45ºC, wurde die Alkalische Phosphatase unter Verwendung von entweder Vector-Red- oder Fast-Red-Substrat gemäß den Anleitungen des Herstellers nachgewiesen. Die Objektträger wurden mit Methylgrün gegengefärbt, durch Dauerbefestigung mit einem Deckgläschen bedeckt und durch Lichtmikroskopie und/oder DISCOVERY-Bildanalyse analysiert. In einigen Fällen wurde ein modifiziertes dNTP (z. B. Dig-dUTP von Boehringer-Mannheim) in das Reaktionsgemisch eingebracht und die Amplifikationsprodukte wurden unter Verwendung einer geeigneten Verdünnung eines mit Alkalischer Phosphatase markierten anti-Dig-Antikörpers nachgewiesen. Die Alkalische Phosphatase wurde mit Vector Red oder Fast Red wie vorstehend nachgewiesen.
- SDA-Amplifikationsprodukte innerhalb der Zellen der Gewebe wurden durch Lichtmikroskopie nachgewiesen, was bestätigte, daß DNS nach Denaturierung der Matrizen-DNS in situ amplifiziert werden konnte, wie es für die SDA in Lösung üblich ist. SDA- Amplifikationsprodukte wurden auch innerhalb der Zellen der Gewebe nachgewiesen, in welchen die Matrizen anfänglich nicht denaturiert worden waren, was anzeigte, daß RNS in situ durch SDA auch amplifiziert werden konnte, wenn der Denaturierungsschritt weggelassen wurde. In-situ-SDA wurde auch an Zellen in Suspension unter Verwendung der Zelllinien ACH&sub2; und CEM mit denselben Reaktionsbedingungen, wie für Gewebe beschrieben, durchgeführt. Ähnliche Ergebnisse wurden für die in-situ-SDA von Zielsequenzen in Zellen in Suspension erhalten. Der Nachweis der amplifizierten Produkte in Zellen in Suspension wurde durch in-situ-Hybridisierung unter Verwendung von entweder einer mit Alkalischer Phosphatase markierten Oligonucleotid-Sonde, die mit BCIP/NBT nachgewiesen wurde, oder einer mit FITC markierten Oligonucleotid-Sonde, die durch Fluoreszenz nachgewiesen wurde, erbracht. In einigen Fällen wurde der Einbau eines modifizierten dNTP (z. B. Dig-dUTP) während der SDA-Reaktion mit einem mit Alkalischer Phosphatase markierten anti-Dig-Antikörper durch Inkubation mit dem BCIP/NBT-Substrat nachgewiesen. Nach Gegenfärbung wurden die Objektträger durch Lichtmikroskopie und/oder unter Verwendung eines DISCOVERY-Bildanalysators analysiert.
- Eine Reihe von in-situ-SDA-Reaktionen unter Verwendung von Voramplifikationsprobenbehandlungen wurde auf Objektträgern, die von einem einzigen HIV-1-positiven Patienten erzeugt wurden, durchgeführt - 1) in-situ-Hybridisierung ohne vorherige Amplifikation, 2) in-situ-SDA von DNS und RNS (denaturiert), 3) in-situ-SDA von RNS (nicht denaturiert), 4) in-situ-SDA von DNS (RNase-Behandlung - 1 mg/ml 30 min lang bei 37ºC) und 5) insitu-SDA von RNS (DNase-Behandlung - 150 Units/ml 30 min lang bei 37ºC). Um die Höhe eines Signals zu quantifizieren, wurden die Objektträger mit dem rechnergesteuerten automatisierten DISCOVERY-Bildanalysator analysiert. Der Bildanalysator erfaßt die Daten, teilt den Parametern Werte zu und bewertet und handhabt die Daten. Jedes positive Ereignis wird bei großer Vergrößerung für morphologische Parameter analysiert und die Daten werden mit einem Unterbild des ausgewählten Objekts auf einer 100 · 100 Bildpunkteinteilung gespeichert. Die Daten können in Listen-, Histogramm- oder Streuungsdiagramm-Form angezeigt werden. Das System quantifiziert die Anzahl positiver Zellen pro Feld und mißt auch Höhe eines Signals.
- Die Ergebnisse sind in Histogramm-Form in Fig. 2 gezeigt. In situ-Hybridisierung alleine (ISH) identifizierte 4,6% positive Zellen, SDA von sowohl DNS als auch RNS (DNS) identifizierte 23,9% positive Zellen, SDA von RNS (RNS) identifizierte 16,7% positive Zellen, SDA von DNS (RNase) identifizierte 15,1% positive Zellen und SDA von RNS (DNase) identifizierte 9,5% positive Zellen. Die SDA fand klar unter allen Reaktionsbedingungen statt, aber die größte Höhe an positivem Signal ist etwa sechs Mal höher nach der Amplifikation. Ferner legen diese Ergebnisse dar, daß die insitu-SDA selektiv für DNS oder RNS oder beide einfach durch Handhabung der Reaktionsbedingungen vor der Initiierung der Amplifikationsreaktion gemacht werden kann. Direkter Vergleich mit Amplifikation durch die in-situ-PCR war unmöglich, weil nach dem zyklischen Durchlaufen von 30 Zyklen bei hoher Temperatur, die Morphologie der Gewebe praktisch zerstört war und die Analyse fragwürdig war. Dies legt dar, daß die in-situ- SDA mit ihren milderen Temperaturbedingungen bei Amplifikation von Nucleinsäuren in Geweben und Zellen in Suspension merklich bessere Ergebnisse bereitstellt als die in-situ-PCR.
- 8E5-Zellen wurden geerntet und auf ungefähr 106 Zellen/ml eingestellt. Die Zellen wurden durch Zentrifugation zu Pellets gemacht und mit 10 ml PBS-Puffer gewaschen, 10 min lang bei 1000 Upm zentrifugiert, um die Zellen wiederzugewinnen. Die gewaschenen Zellen wurden dann in 4% Paraformaldehyd in PBS 20 min lang bei Raumtemperatur fixiert, 5 min lang bei 1500 Upm zu Pellets gemacht und wie zuvor mit 10 ml PBS-Puffer gewaschen. Die Zellen wurden gezählt, auf 5 · 105 Zellen pro zu analysierende Probe eingestellt, und in kleine, klare 0,5 ml- Röhrchen, die 10-20 min lang mit 25 mg/ml acetyliertem BSA beschichtet wurden, überführt. Die Zellen wurden dann zu Pellets gemacht und in 92 ul SDA-Gemisch (10 ul 0,5 M K&sub3;PO&sub4;, 1 ul 10 mg/mL BSA, 10 ul 100% DMSO, 2 ul 10 mM gemischte dNTPs, je 1 ul 100 ng/ul Primer B&sub1; und B&sub2;, je 1 ul 10 ng/ul Primer 51 und 52, 24 ul 25 mM MgCl&sub2;, 2 ul 55% Glycerin und 39 ul Wasser) resuspendiert. Wenn die Amplifikationsprodukte durch direkten Einbau eines nachweisbaren Markers markiert wurden, wurde in der SDA-Reaktion dTTP teilweise durch dUTP-FITC ersetzt. Die Amplifikationsprimer waren wie in Beispiel 1.
- Die erzeugten Röhrchen wurden 3 min lang in einen 95ºC heißen Thermoblock gestellt und weitere 3 min lang in ein 37ºC warmes Wasserbad überführt. Während der Inkubation bei 37ºC wurde das Enzymgemisch erzeugt (etwa 150 Units/HincII- und etwa 5 Units/excß-Klenow-Reaktion). Das Enzymgemisch (3 ul) wurde dann zu jedem Röhrchen hinzugefügt und gut gemischt. Keine Enzyme wurden zu Negativkontrollproben hinzugefügt. Die Proben wurden etwa 2-3 h lang bei 37ºC in einem Wasserbad inkubiert. Im Anschuß an die Amplifikation wurden die Zellen in einer EPPENDORF (Marke) Mikrozentrifuge 2 min lang bei 5000 Upm zu Pellets gemacht. 75 ul des Überstands wurden für Agarose- Gelelektrophorese entfernt, um das Ausmaß des Amplikonausstroms aus den Zellen zu analysieren.
- Zum Nachweis von Amplifikationsprodukten durch in-situ- Hybridisierung wurden die Amplifikationsprodukte in den Zellen 5 min lang bei 95ºC, gefolgt von 1 h lang bei 56ºC in 25 ul SDA-Gemisch an 75 ng mit FITC verbundener SEQ ID NR. 3 hybridisiert. Die Zellen wurden dann 30 min lang bei 37ºC einmal mit 2x SSC, 500 ug/ml BSA gewaschen. Die Zellen wurden vor dem Nachweis von Fluoreszenz durch Durchflußzytometrie in PBS resuspendiert. Die Fluoreszenz wurde unter Verwendung eines FACSCAN Durchflußzytometers (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA) nachgewiesen und quantifiziert, wobei Lichtstreuungs- und Fluoreszenzdaten in LYSIS II (Marke) Software (Becton Dickinson Immunocytometry Systems) gewonnen wurden.
- In durch Hybridisierung einer Detektorsonde analysierten Zellen zeigten graphische Darstellungen von Zellanzahl gegen Fluoreszenz eine ungefähr 6fache Verschiebung nach rechts im Peakfluoreszenzsignal in positiven Zellen im Vergleich zur Negativkontrolle (Fig. 3A). Direkter Einbau des fluoreszierenden Markers lieferte verbesserte Trennung zwischen den Peaks für positive und negative Proben (Fig. 3B), ein ungefähr 15facher Unterschied. Diese Daten legen dar, daß Durchflußzytometrie in Verbindung mit in-situ-Nucleinsäureamplifikation zum Nachweis und zur Quantifizierung einer amplifizierten Zielsequenz innerhalb von Zellen verwendet werden kann.
- Ähnliche Experimente wurden unter Verwendung von A301- Zellen (negativ für HIV) und ACH2-Zellen (positiv für HIV) durchgeführt. Man ließ die in-situ-SDA 2 h lang bei 37ºC ablaufen. Ein Biotin-Marker wurde während der Amplifikation über ein dUTP-Biotin-Konjugat in die Amplifikationsprodukte eingebaut und durch Reaktion mit mit FITC verbundenem Streptavidin nachgewiesen. Logarithmisches Diagramme von Zellanzahl gegen Fluoreszenz zeigte eine Zunahme von ungefähr einem Logarithmus in der Fluoreszenz in den HIV-positiven Zellen (Fig. 4A) im Vergleich zu der negativen Zelllinie (Fig. 4B).
- (1) ALLGEMEINE INFORMATION:
- (i) ANMELDER: BECTON DICKINSON & COMPANY ONE BECTON DRIVE FRANKLIN LAKES NEW JERSEY 07417-1880 UNITED STATES OF AMERICA - und - UNIVERSITY OF MASSACHUSETTS MEDICAL CENTER - 55 LAKE AVENUE NORTH WORCESTER MASSACHUSETTS 01655 UNITED STATES OF AMERICA
- (ii) TITEL DER ERFINDUNG: AMPLIFIKATION VON NUCLEINSÄUREN IN ZELLEN
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 6
- (iv) COMPUTERLESBARE FORM:
- (A) MEDIUMTYP: 3,5 Diskette, 1,44 MB Speicherung
- (B) COMPUTER: IBM kompatibler PC
- (C) BETRIEBSSYSTEM: COMPAQ 386 MS DOS
- (D) SOFTWARE: WordPerfect (Version 5.1)
- (v) GEGENWÄRTIGE ANMELDEDATEN:
- (A) ANMELDENUMMER: 94309308.8
- (B) EINREICHUNGSDATUM: 12. Dezember 1994
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 1:
- (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 27 Basenpaare
- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRANGART: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
- (A) ORGANISMUS: Humanes Immunodefizienz Virus Typ 1
- (B) STAMM: HXB-2
- (xi) SEQUENZBESCHRETBUNG: SEQ ID NR. 1:
- ATAATCCACC TATCCCAGTA GGAGAAT 27
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 2:
- (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 28 Basenpaare
- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRANGART: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
- (A) ORGANISMUS: Humanes Immunodefizienz Virus Typ 1
- (B) STAMM: HXB-2
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 2:
- TTTGGTCCTT GTCTTATGTC CAGAATGC 28
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 3:
- (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 41 Basenpaare
- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRANGART: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
- (A) ORGANISMUS: Humanes Immunodefizienz Virus Typ 1
- (B) STAMM: HXB-2
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 3:
- ATCCTGGGAT TAAATAAAAT AGTAAGAATG TATAGCCCTA C 41
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 4:
- (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 34 Basenpaare
- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRANGART: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 4:
- AATAGTCGCT TACTTGTTGA CGGATAATCC TGGG 34
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 5:
- (1) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 34 Basenpaare
- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRANGART: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 5:
- AAGTAACCGA CTATTGTTGA CGGCTATACA TTCT 34
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR. 6:
- (i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
- (A) LÄNGE: 17 Basenpaare
- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRANGART: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: DNS (genomisch)
- (vi) URSPRÜNGLICHE QUELLE:
- (A) ORGANISMUS: Humanes Immunodefizienz Virus Typ 1
- (B) STAMM: HXB-2
- (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR. 6:
- ACTATTTTAT TTAAACC 17
Claims (1)
1. Verfahren zur Strangverdrängungsamplifikation
(Strand Displacement Amplification - SDA) einer
Zielsequenz, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen einer Probe von Festzellen, bei der
die morphologische Integrität der Zellen gewährleistet ist
und Amplifikationsreagenzien die Festzellen penetrieren
können;
b) innerhalb der Zellen Hybridisieren eines
Amplifikationsprimers 3' zur Zielsequenz, wobei der
Amplifikationsprimer eine Restriktionsenzym-
Erkennungsstelle 5' zu einer Zielbindungssequenz umfasst,
und Hybridisieren eines externen Primers 5' zum
Amplifikationsprimer;
c) Verlängern des Amplifikationsprimers und des
externen Primers in Anwesenheit einer
exonucleasedefizienten Polymerase und eines α-Thio-
Deoxynucleosid-Triphosphats, um ein Amplifikationsprimer-
Verlängerungsprodukt zu erzeugen, das von der Zielsequenz
durch Verlängern des externen Primers verdrängt ist;
d) doppelsträngiges Gestalten des
Amplifikationsprimer-Verlängerungsproduktes durch
Synthetisieren eines Komplementärstranges und Schneiden
eines Stranges davon an der Restriktionsenzym-
Erkennungsstelle mit einer Restriktionsendonuclease;
e) Verwenden des nicht geschnittenen Stranges als
Matrize, die sich von dem Schnitt mit der
exonucleasedefizienten Polymerase und dem α-Thio-
Deoxynucleosid-Triphosphat erstreckt, so dass der
geschnittene Strang von dem Matrizenstrang verdrängt ist;
und
f) Wiederholen des Schneide-, Verlängerungs- und
Verdrängungsschrittes, so dass die Zielsequenz in situ
amplifiziert wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem der Strang mit
HincII geschnitten wird.
3. Verfahren zur Strangverdrängungsamplifikation
einer doppelsträngigen Zielsequenz, umfassend die folgenden
Schritte:
a) Bereitstellen einer Probe von Festzellen, bei der
die morphologische Integrität der Zellen gewährleistet ist
und Amplifikationsreagenzien die Festzellen penetrieren
können;
b) innerhalb der Zellen Hybridisieren von zwei
Amplifikationsprimern (S&sub1; und S&sub2;), die HincII-
Erkennungsstellen in der Nähe ihrer 5'-Enden aufweisen, mit
entgegengesetzten Nucleinsäuresträngen, die die Zielsequenz
flankieren, und Hybridisieren von zwei externen Primern (B&sub1;
und B&sub2;) mit entgegengesetzten Strängen der Zielsequenz 5'
zu den Amplifikationsprimern;
c) Verlängern der Amplifikationsprimer und der
externen Primer in Anwesenheit eines α-Thio-Deoxynucleosid-
Triphosphats, um ein erstes Verlängerungsprodukt von S&sub1;
(S&sub1;-ext) und ein erstes Verlängerungsprodukt von S&sub2; (S&sub2;-ext)
zu erzeugen, wobei S&sub1;-ext und S&sub2;-ext durch Verlängern der
externen Primer von der Zielsequenz verdrängt sind;
d) Hybridisieren der Amplifikationsprimer und der
externen Primer mit S&sub1;-ext und S&sub2;-ext und Verlängern der
Amplifikationsprimer und externen Primer in Anwesenheit des
α-Thio-Deoxynucleosid-Triphosphats, so dass durch die
Verlängerung der externen Primer ein zweites
Verlängerungsprodukt von jeweils S&sub1; und S&sub2; verdrängt wird;
e) doppelsträngiges Gestalten des zweiten
Verlängerungsprodukts durch Synthetisieren eines
Komplementärstranges und Schneiden eines Stranges von jedem
doppelsträngigen zweiten Verlängerungsprodukt mit HincII;
f) Verwenden des nicht geschnittenen Stranges als
Matrize, die sich von dem Schnitt in Anwesenheit des α-
Thio-Deoxynucleosid-Triphosphats mit einer
exonucleasedefizienten Polymerase erstreckt, so dass der
geschnittene Strang von dem Matrizenstrang verdrängt ist;
und
g) Wiederholen des Schneide-, Verlängerungs- und
Verdrängungsschrittes, so dass die Zielsequenz in situ
amplifiziert wird.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche,
ferner umfassend das Nachweisen der amplifizierten
Zielsequenz.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die
amplifizierte Zielsequenz durch In-situ-Hybridisierung mit
einer Detektorsonde nachgewiesen wird, die einen
nachweisbaren Marker umfasst.
6. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die
amplifizierte Zielsequenz mit einem fluoreszierenden Marker
nachgewiesen wird.
7. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die
amplifizierte Zielsequenz durch automatisierte Bild-
Zytometrie nachgewiesen wird.
8. Verfahren nach Anspruch 7, bei dem die
amplifizierte Zielsequenz mit einem nachweisbaren Marker
nachgewiesen wird, der alkalische Phosphatase umfasst.
9. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die
amplifizierte Zielsequenz dadurch nachgewiesen wird, dass
ein Primer mit der amplifizierten Zielsequenz hybridisiert
und mit Polymerase verlängert wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, bei dem der Primer
eine ³²P-End-Markierung aufweist.
11. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem ein
nachweisbarer Marker in die amplifizierte Zielsequenz durch
die Polymerase eingebaut ist.
12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem der
nachweisbare Marker ausgewählt ist aus fluoreszierenden
Markern, Digoxigenin und Biotin.
13. Verfahren nach Anspruch 6 oder 12, bei dem die
amplifizierte Zielsequenz anhand Durchflusszytometrie
nachgewiesen wird.
14. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem eine
Amplifikation einer DNA-Zielsequenz nachgewiesen wird.
15. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem eine
Amplifikation einer RNA-Zielsequenz nachgewiesen wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15, bei dem eine
HIV-Zielsequenz nachgewiesen wird.
17. Verfahren, das eine
Strangverdrängungsamplifikation für den Nachweis einer HIV-Zielsequenz in
einer Zelle beinhaltet, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellen einer Probe von Festzellen, bei der
die morphologische Integrität der Zellen gewährleistet ist
und Amplifikationsreagenzien die Festzellen penetrieren
können;
b) innerhalb der Zellen Hybridisieren eines
Amplifikationsprimers 3' zur HIV-Zielsequenz, wobei der
Amplifikationsprimer eine Restriktionsenzym-
Erkennungsstelle 5' zu einer Zielbindungssequenz umfasst,
und Hybridisieren eines externen Primers 5 zum
Amplifikationsprimer;
c) Verlängern des Amplifikationsprimers und des
externen Primers in Anwesenheit einer
exonucleasedefizienten Polymerase und eines α-Thio-
Deoxynucleosid-Triphosphats, um ein Amplifikationsprimer-
Verlängerungsprodukt zu erzeugen, das von der Zielsequenz
durch Verlängerung des externen Primers verdrängt ist;
d) doppelsträngiges Gestalten des
Amplifikationsprimer-Verlängerungsproduktes durch
Synthetisieren eines Komplementärstranges und Schneiden
eines Stranges davon an der Restriktionsenzym-
Erkennungsstelle mit einer Restriktionsendonuclease;
e) Verwenden des nicht geschnittenen Stranges als
Matrize, die sich von dem Schnitt mit der
exonucleasedefizienten Polymerase und dem α-Thio-
Deoxynucleosid-Triphosphat erstreckt, so dass der
geschnittene Strang von dem Matrizenstrang verdrängt ist;
f) Wiederholen des Schneide-, Verlängerungs- und
Verdrängungsschrittes, so dass die Zielsequenz in situ
amplifiziert wird; und
g) Nachweisen der amplifizierten HIV-Zielsequenz in
situ anhand einer Durchflusszytometrieanalyse eines
fluoreszierenden Markers.
3518. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem der
fluoreszierende Marker in die amplifizierte Zielsequenz
durch die Polymerase eingebaut ist.
19. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die
amplifizierte HIV-Zielsequenz durch In-situ-Hybridisierung
mit einer Detektorsonde nachgewiesen wird.
20. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem sich die
amplifizierte Zielsequenz im HIV-gag-Gen befindet.
21. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem das
doppelsträngige Primerverlängerungsprodukt mit HincII
geschnitten wird.
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| US08/165,719 US5523204A (en) | 1993-12-10 | 1993-12-10 | Detection of nucleic acids in cells by strand displacement amplification |
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|---|---|
| DE69426807D1 DE69426807D1 (de) | 2001-04-12 |
| DE69426807T2 true DE69426807T2 (de) | 2001-10-04 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE69426807T Expired - Lifetime DE69426807T2 (de) | 1993-12-10 | 1994-12-12 | Nukleinsäure-Amplifizierung bei SDA in Zellen |
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