DE10104480A1 - Verfahren, Verwendung und Kit zum Auffinden von Wirkstoffen gegen mit spezifischen Proteinen assoziierte Krankheiten - Google Patents

Verfahren, Verwendung und Kit zum Auffinden von Wirkstoffen gegen mit spezifischen Proteinen assoziierte Krankheiten

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Verwendung und einen Kit zum Auffinden von Wirkstoffen gegen mit spezifischen Proteinen (PK) assoziierte Krankheiten, wie Alzheimer, transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE), bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), Kuru, Scrapie, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und dgl., mit folgenden Schritten: DOLLAR A a1) Bereitstellen von PK enthalten in einer Lösung oder immobilisiert an einem Träger, DOLLAR A a2) Inkontaktbringen von PK mit einem potentiell mit PK interagierenden Wirkstoff, DOLLAR A a3) Zugabe einer proteolytisch wirksamen Substanz, welche unter definierten Reaktionsbedingungen PK im wesentlichen unbeeinflußt läßt und ein eine Isoform von PK bildendes Protein P spaltet, DOLLAR A a4) Nachweis von PK, DOLLAR A und Ermittlung der Wirksamkeit der getesteten Wirksubstanz anhand des Ergebnisses im Schritt lit. a4.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren, eine Verwendung und ei­ nen Kit zum Auffinden eines Wirkstoffs gegen mit spezifischen Proteinen assoziierte Krankheiten, wie Alzheimer, transmissi­ ble spongiforme Enzephalopathien (TSE), insbesondere bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), Kuru, Scrapie, Creutz­ feldt-Jakob-Krankheit, und dgl..
Bei den sogenannten spongiformen Enzephalopathien handelt es sich um Krankheiten, die mit dem Auftreten und der Ablagerung spezifischer Proteine (PK) assoziiert sind. Es handelt sich bei den krankheitsspezifischen Proteinen um Isoformen physio­ logisch vorkommender Proteine (P). Dabei können P und PK so­ genannten Prionproteine sein. Die krankheitsspezifischen Prionproteine unterscheiden sich insbesondere in ihrer räum­ lichen Struktur von P. Sie besitzen eine β-Faltblattstruktur. Sie haben ein erhöhte Aggregationsneigung und weisen eine er­ höhte Proteaseresistenz auf. Die krankheitsspezifischen Prionproteine reichern sich im Nervengewebe an. Sie bilden dort sogenannte amyloide Ablagerungen, welche für die Krank­ heitssymptome mitverantwortlich gemacht werden.
Wodurch das Auftreten der krankheitsspezifischen Prionprotei­ ne hervorgerufen wird, ist bisher nicht bekannt. Sicher er­ scheint allerdings zu sein, daß die krankheitsspezifischen Proteine mitverantwortlich für die bei der Krankheit auftre­ tenden Symptome sind.
Insbesondere im Hinblick auf die in Europa auftretende Rin­ derseuche BSE und der damit einhergehenden Gefahr einer Über­ tragung dieser Krankheit auf den Menschen, besteht ein ge­ steigertes Bedürfnis am Auffinden von Wirkstoffen gegen die vorerwähnten krankheitsspezifischen Proteine.
Die US 5,276,056 beschreibt ein Verfahren zur Detektion von mit der Bildung von Amyloid-Ablagerungen assoziierten Krank­ heiten. Dabei wird Kongorot verwendet.
Aus der WO 99/15903 ist ein Verfahren zur Messung der Asso­ ziation von Teilstrukturen pathologischer Amyloid- Ablagerungen bekannt. Dabei wird aus der Amyloid-Struktur zu­ nächst eine Monomere enthaltende Lösung hergestellt. Der Nachweis krankheitsspezifischer Prionproteine wird mittels Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie durchgeführt. Das er­ fordert einen sehr hohen apperativen Aufwand.
Die WO 99/15651 betrifft synthetische Polypeptide zur Diagno­ se Prophylaxe und Therapie von Prionerkrankungen.
Aufgabe der Erfindung ist es, ein möglichst einfaches und ef­ fizientes Verfahren zum Auffinden eines Wirkstoffs gegen mit spezifischen Proteinen assoziierte Krankheiten anzugeben. Ein weiteres Ziel der Erfindung ist es, eine entsprechende Ver­ wendung sowie einen zur Durchführung des Verfahrens geeigne­ ten Kit bereitzustellen.
Diese Aufgabe wird durch die Ansprüche 1, 20 und 25 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 19 und 21 bis 24 und 26 bis 30.
Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht ein einfaches und effizientes Auffinden von Wirkstoffen gegen mit spezifischen Proteinen assoziierte Krankheiten. Es kann als Hoch- Durchsatzverfahren ausgeführt werden.
Bei dem Schritt lit. a1 kann die Lösung eine standardisierte Lösung sein, welche PK enthält. PK kann rekombinant herge­ stellt sein. Bei der Lösung kann es sich auch um einen Gewe­ beextrakt handeln. Anstelle von PK können selbstverständlich auch Fragmente davon verwendet werden, soweit sie ebenso wie PK degradationsgehemmt sind. Die Immobilisierung von PK an einen Träger, beispielsweise einen aus Kunststoff hergestell­ ten Träger, kann nach herkömmlichen Methoden erfolgen.
Beim Schritt lit. a2 kann der mit PK potentiell interagieren­ de Wirkstoff in einer Lösung vorliegen. Es kann zu einer In­ teraktion zwischen PK und dem Wirkstoff kommen. Dadurch kann sich die Struktur von PK ändern, so daß nachfolgend eine pro­ teolytische Spaltung möglich ist. Die proteolytische Spalt­ barkeit des strukturell geänderten PK wird im Schritt lit. a3 nachgewiesen. Dabei sind die Reaktionsbedingungen so einzu­ stellen, daß vom Wirkstoff unbeeinflußtes PK durch die pro­ teolytisch wirksame Substanz nicht gespalten, ein eine Iso­ form von PK bildendes Protein P jedoch gespalten wird. Bei P kann es sich um eine physiologische Isoform vom PK handeln.
Der beim Schritt lit. a4 erfolgende Nachweis von PK kann nach herkömmlichen Methoden erfolgen. Es können direkte Nachweis­ verfahren eingesetzt werden, bei denen ein Farbstoff unmit­ telbar an PK bindet oder bei dem PK radioaktiv oder mit einem Fluorophor markiert ist. Auch indirekte Nachweisverfahren können zum Einsatz kommen, die auf dem Einsatz markierter An­ tikörper beruhen.
Nach einer Ausgestaltungsform wird ein Kontrollversuch mit den Schritten lit. a1. a3 und a4 durchgeführt und die Wirk­ samkeit des Wirkstoffs durch Vergleich der Ergebnisse in Schritt lit. a4 bestimmt. Der Kontrollversuch wird zweckmäßi­ gerweise parallel zum erfindungsgemäßen Verfahren durchge­ führt. Die Wirksamkeit des Wirkstoffs kann durch relativen Vergleich der Nachweisergebnisse erfolgen. Es können z. B. Fluoreszenz- oder Absorbtionsintensitäten verglichen werden.
Des weiteren kann ein weiterer Kontrollversuch mit den Schritten lit. a1 und a4 durchgeführt werden. Der weitere Kontrollversuch wird zweckmäßigerweise dann durchgeführt, wenn unbekannt ist, ob und in welcher Menge PK in der Probe enthalten ist. Diese Information kann aus dem Vergleich der Nachweisergebnisse in beiden Kontrollversuchen abgeleitet werden.
Die Lösung kann zusätzlich P enthalten. Das ist insbesondere bei Lösungen der Fall, welche aus Gewebeextrakten herge­ stellt sind.
Nach einer vorteilhaften Ausgestaltung des Verfahrens wird die proteolytisch wirkende Substanz nach dem Schritt lit. a3 entfernt oder inaktiviert. Die Entfernung der proteolytisch wirkenden Substanz kann z. B. durch Waschen erfolgen, wenn PK an einem Träger immobilisiert ist. Wenn PK in Lösung ist, kann die Inaktivierung der proteolytisch wirksamen Substanz durch chemische oder physikalische Verfahren, z. B. durch Tem­ peraturerhöhung erfolgen.
Der Wirkstoff kann Bestandteil einer Wirkstoffbibliothek sein. Durch die Zugabe von Wirkstoffbibliotheken kann das Verfahren besonders effizient durchgeführt werden. Der Wirk­ stoff kann zweckmäßigerweise nach einem der Schritte lit. a2 oder lit. a3 entfernt werden. Die Entfernung des Wirkstoffs kann z. B. durch Waschen, Dialyse oder dgl. erfolgen.
Nach einer erfindungsgemäßen Ausgestaltung ist PK ein degra­ dationsgehemmtes Protein. P und PK können Prionproteine sein. PK kann insbesondere eine β-Faltblattstruktur aufweisen. Bei PK kann es sich um das Prionprotein PrPSC und bei P um das Prionprotein PrPC handeln. Zweckmäßig ist es ferner, daß PK mit einer Markierung versehen ist. Es kann sich dabei um eine radioaktive oder fluorophore Markierung handeln.
Als proteolytisch wirkende Substanz kann ein Enzym verwendet werden. Als Enzym wird vorteilhafterweise ein extra- oder in­ trazelluläres oder ein membranständiges Enzym verwendet. Dar­ unter sind auch Enzyme zu verstehen, welches Zellmembran­ assoziierte Proteine verdauen können. Als Enzym kann vorteil­ hafterweise eine Metalloproteinase, vorzugsweise eine Matrix­ metalloproteinase, verwendet werden. Als Enzym kann ferner eine endogene Protease, eine Serinprotease, eine Cysteinpro­ tease oder eine Asparaginsäureprotease verwendet werden. Fer­ ner hat es sich als zweckmäßig erwiesen, Proteinase K zu ver­ wenden.
Nach einer weiteren Ausgestaltung kann der Lösung ein mit PK spezifisch interagierendes Nachweisreagenz zugesetzt werden. Als Nachweisreagenz können an P und PK bindende Antikörper, vorzugsweise der Antikörper 6H4 oder 34C9, verwendet werden. Diese Antikörper werden von der Firma Prionics AG, Schweiz, angeboten und sind in einer entsprechenden Produktinformation beschrieben. Vorteilhafterweise kann auch ein selektiv an PK bindender Antikörper, vorzugsweise der für das Prionprotein PrPSc spezifische Antikörper 15B3, verwendet werden. Es wird in diesem Zusammenhang auf die WO 99/15651 verwiesen, deren Offenbarungsgehalt hiermit einbezogen wird. Bei dem Nachweis­ reagenz kann es sich auch um Kongorot oder ein Derivat davon handeln. Insoweit wird ergänzend auf die US 5,276,059 verwie­ sen, deren Offenbarungsgehalt hiermit einbezogen wird.
Der Nachweis kann mittels Durchflußzytometrie oder eines im­ munologischen Verfahrens erfolgen. Es handelt sich dabei um herkömmliche Nachweisverfahren wie ELISA, RIA, CLIA und dgl..
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie der Kontrollversuche nach den Ansprüchen 2 und 3 sind folgen­ de Ergebnisse denkbar:
Bei ausschließlicher Durchführung des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens kann als Ergebnis im Schritt lit. a4 kein PK nachge­ wiesen werden. In diesem Fall liegt ein gesuchter Wirkstoff vor.
Falls bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens im Schritt lit. a4 PK nachgewiesen wird, kann anhand des Kon­ trollversuchs gemäß Anspruch 2 festgestellt werden, ob eine teilweise Wirksamkeit des eingesetzten Wirkstoffs vorliegt.
Der weitere Kontrollversuch nach Anspruch 3 wird mindestens dann durchgeführt, wenn bei den Versuchen nach Anspruch 1 und 2 PK nicht nachgewiesen worden ist. In diesem Fall ermöglicht der weitere Kontrollversuch die Beantwortung der Frage, ob in der Lösung P enthalten gewesen ist.
Bei Vorliegen einer nicht standardisierten Ausgangslösung empfiehlt sich die Durchführung beider Kontrollversuche vor oder parallel zu dem erfindungsgemäßen Verfahren.
Nach weiterer Maßgabe der Erfindung wird die Verwendung einer proteolytisch wirksamen Substanz beansprucht, welche unter definierten Reaktionsbedingungen ein mit Krankheiten assozi­ iertes spezifisches Proteins PK im wesentlichen unbeeinflußt läßt und ein eine Isoform von PK bildendes Protein P spaltet, zur Durchführung eines Screening-Verfahrens zum Auffinden ei­ nes Wirkstoffs gegen mit dem spezifischen Protein (PK) asso­ ziierte Krankheiten, wie Alzheimer, transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE), bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), Kuru, Scrapie, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und dgl.. Wegen der vorteilhaften Ausgestaltungen wird auf die vorange­ gangenen Ausführungen verwiesen.
Schließlich wird erfindungsgemäß ein Kit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens beansprucht, enthaltend eine proteolytisch wirkende Substanz, welche unter definierten Re­ aktionsbedingungen ein Protein P spaltet und ein spezifisches Protein PK, welches eine mit Krankheiten assoziierte Isoform des Proteins P bildet, im wesentlichen unbeeinflußt läßt, und ein zumindest mit PK spezifisch interagierendes Nachweisrea­ genz N.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen des Kits können in den Ansprüchen 26 bis 30 sowie der vorstehenden Beschreibung ent­ nommen werden.
Nachfolgend wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung näher erläutert:
Zunächst wird eine P und PK enthaltende Lösung hergestellt. Zur Präparation der Lösung werden Gewebeextrakt oder Prion- Protein-Aggregate in 10 mM Natrium-Phosphat-Lösung bei pH 7,2, 0,2% SDS 10 Minuten mit Ultraschall behandelt. Anschlie­ ßend wird der Antikörper 6H4 hinzugefügt. Dieser Antikörper ist z. B. in der WO 99/15651 beschrieben, deren Offenbarungs­ gehalt hiermit einbezogen wird. Mittels Durchflußzytometrie wird eine Gesamtkonzentration an P und PK bestimmt.
In einem weiteren Versuch wird die Lösung mit Proteinale K in einer Konzentration von 100 µg/ml bei 37°C für 30 Minuten in­ kubiert. Anschließend wird zur Inaktivierung der Proteinale K die Temperatur auf 65°C für 30 Minuten erhöht. Dann wird wie­ derum der Antikörper 6H4 hinzugegeben und eine erste Konzen­ tration an PK mittels Durchflußzytometrie bestimmt.
In einem weiteren Versuch wird grundsätzlich wie im vorbe­ schriebenen Versuch vorgegangen. Vor der Zugabe der Proteina­ se K wird allerdings eine Wirkstoff-Bibliothek hinzugegeben. Solche Bibliotheken sind allgemein bekannt. Es wird dazu bei­ spielhaft auf Masel J., Jansen V. A. in Biophys. Chem. 2000, 88: 47 bis 59, und Soto C., et al. in Lancet 2000, 353: 192- 7 verwiesen.
Anschließend wird analog zum zweiten Versuch durchflusszyto­ metrisch eine zweite Konzentration PK ermittelt. Sofern die zweite Konzentration kleiner als die erste Konzentration ist, liegt ein mit dem spezifische Protein interagierender Wirk­ stoff, der eine Spaltung von PK durch Proteinase K ermög­ licht, vor. Die Konzentrationen können selbstverständlich auch mittels anderer herkömmlicher Verfahren bestimmt werden. Z. B. kann der Antikörper dazu mit einem fluorophoren Marker versehen werden.
Der Wirkstoff kann nach gängigen Verfahren identifiziert wer­ den. Das vorgeschlagene Screening-Verfahren ist schnell und effizient.

Claims (29)

1. Verfahren zum Auffinden von Wirkstoffen gegen mit spezi­ fischen Proteinen (PK) assoziierte Krankheiten, wie Alzhei­ mer, transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE), bovine spongiforme Enzephalopathie (BSE), Kuru, Scrapie, Creutz­ feldt-Jakob-Krankheit und dgl., mit folgenden Schritten:
  • 1. Bereitstellen von PK enthalten in einer Lösung oder im­ mobilisiert an einem Träger,
  • 2. Inkontaktbringen von PK mit einem potentiell mit PK in­ teragierenden Wirkstoff,
  • 3. Zugabe einer proteolytisch wirksamen Substanz, welche unter definierten Reaktionsbedingungen PK im wesentlichen un­ beeinflußt läßt und ein eine Isoform von PK bildendes Protein P spaltet und
  • 4. Nachweis von PK.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Kontrollversuch mit den Schritten lit. a1, a3 und a4 durchgeführt wird und die Wirksamkeit des Wirkstoffs durch Vergleich der Ergebnisse der Nachweise ermittelt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei ein weiterer Kontrollversuch mit den Schritten lit. a1 und a4 durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Lösung zusätzlich P enthält.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die proteolytisch wirkende Substanz nach dem Schritt lit. a3 entfernt oder inaktiviert wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff Bestandteil einer Wirkstoffbibliothek ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei PK und ggf. P bei der Nachweisreaktion quantitativ erfaßt wird.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Wirkstoff nach einem der Schritte lit. a2 oder lit. a3 entfernt wird.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei P und PK Prionproteine sind.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei PK eine β-Faltblattstruktur aufweist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei PK mit einer Markierung versehen ist.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als proteolytische wirkende Substanz ein Enzym verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei wobei als Enzym eine endogene Protease, Serinprotease, Aspa­ raginsäureprotease, Cysteinprotease, Proteinase K oder eine Metalloproteinase, vorzugsweise eine Matrixmetalloproteinase, verwendet wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Lösung ein mit P und/oder PK interagierendes Nachweisrea­ genz N zugesetzt wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Nachweisreagenz N ein an P und PK bindender Antikörper, vorzugsweise der Antikörper 6H4, verwendet wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Nachweisreagenz N ein selektiv an PK bindender Antikör­ per, vorzugsweise der für das Prionprotein PrPSc spezifische Antikörper 15B3, verwendet wird.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei als Nachweisreagenz N Kongorot oder ein Derivat davon verwen­ det wird.
19. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Bestimmung der Konzentration mittels Durchflußzytometrie oder eines immunologischen Verfahrens erfolgt.
20. Verwendung einer proteolytisch wirksamen Substanz, wel­ che unter definierten Reaktionsbedingungen ein mit Krankhei­ ten assoziiertes spezifisches Proteins PK im wesentlichen un­ beeinflußt läßt und ein eine Isoform von PK bildendes Protein P spaltet, zur Durchführung eines Screening-Verfahrens zum Auffinden eines Wirkstoffs gegen mit dem spezifischen Protein (PK) assoziierte Krankheiten, wie Alzheimer, transmissible spongiforme Enzephalopathien (TSE), bovine spongiforme Enze­ phalopathie (BSE), Kuru, Scrapie, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit und dgl..
21. Verwendung nach Anspruch 20, wobei P und PK Prionprotei­ ne sind.
22. Verwendung nach Anspruch 20 oder 21, wobei PK eine β- Faltblattstruktur aufweist.
23. Verwendung nach einem der Ansprüche 20 bis 22, wobei als proteolytisch wirksame Substanz ein Enzym verwendet wird.
24. Verwendung nach einem der Ansprüche, wobei als Enzym ei­ ne endogene Protease, eine Serinprotease, Asparaginsäurepro­ tease, Cysteinprotease, Proteinase K oder eine Metallopro­ teinase, vorzugsweise eine Matrixmetalloproteinase, verwendet wird.
25. Kit zur Durchführung des Verfahrens nach einem der vor­ hergehenden Ansprüche enthaltend eine protolytisch wirkende Substanz, welche unter definierten Reaktionsbedingungen ein Protein P spaltet und ein spezifisches Protein PK, welches eine mit Krankheiten assoziierte Isoform des Proteins P bil­ det, im wesentlichen unbeeinflußt läßt, und ein zumindest mit PK spezifisch interagierendes Nachweisrea­ genz N.
26. Kit nach Anspruch 25, wobei das Nachweisreagenz N ein an P und PK bindender Antikörper, vorzugsweise der Antikörper 6H4, ist.
27. Kit nach Anspruch 25, wobei das Nachweisreagenz N ein an PK bindender Antikörper, vorzugsweise der für das Prionpro­ teine PrPSc spezifische Antikörper 15B3, ist.
28. Kit nach einem der Ansprüche 25 bis 27, wobei das Nach­ weisreagenz N Kongorot oder ein Derivat davon ist.
29. Kit nach einem der Ansprüche 25 bis 28, mit einem Trä­ ger, vorzugsweise einer Mikrotiterplatte, mit daran immobili­ siertem spezifischem Protein PK.
30. Kit nach Anspruch 29, wobei PK ein Prionprotein, vor­ zugsweise PrPSc, ist.
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