DE10117281A1 - Peptid zur Diagnose und Therapie der Alzheimer-Demenz - Google Patents

Peptid zur Diagnose und Therapie der Alzheimer-Demenz

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Peptid, das mit hoher Bindungsaffinität an das beta-Amyloid-Peptid bindet, ein Verfahren zur Herstellung solcher Peptide sowie die Verwendung dieser Peptide zur Diagnose und Therapie der Alzheimer-Demenz.

Description

Die Erfindung betrifft ein Peptid, das mit hoher Bindungsaffinität an das β-Amyloid-Peptid bindet, ein Verfahren zur Herstellung solcher Peptide sowie die Verwendung dieser Peptide zur Diagnose und Therapie der Alzheimer-Demenz.
Die Alzheimersche Krankheit ist die häufigste Form der Altersdemenz. Sie beginnt mit geringen Gedächtnisstörungen und führt im weiteren Krankheitsverlauf zum Verlust großer Teile des Gedächtnisses, zur Verminderung des Sprachschatzes auf wenige Wörter, zu räumlicher und zeitlicher Desorientierung, zur Unfähigkeit zu stehen und gehen, sowie häufig zu Harn- und Stuhlinkontinenz. Die statistische Auswertung der Epidemiologie der Alzheimer-Demenz zeigt, daß das Alter der größte Risikofaktor ist, und daß jeder, der nur alt genug wird, diese Krankheit bekommen wird. Meist wird die Krankheit erst nach dem 65. Lebensjahr manifest, zuweilen jedoch auch schon früher, beispielsweise um das 50. Lebensjahr. Die Alzheimer-Krankheit ist deshalb insbesondere für westliche Industriestaaten mit einer hohen Lebenserwartung ein immer größer werdendes soziales und finanzielles Problem.
Als zuverlässigste Diagnose der Alzheimer-Demenz gilt die post mortem-Identifizierung von sogenannten "Amyloid-Plaques" im Gehirn der jeweiligen Person. Diese Amyloid-Plaques sind im wesentlichen der einzig bisher bekannte Zusammenhang zwischen pathologischen Befunden und Krankheitssymptomen. Der Hauptbestandteil dieser Plaques sind Aggregate des β-Amyloid-Peptids bzw. Aβ-Peptids bzw. βA4-Peptids, das 39 bis 43 und üblicherweise 40 oder 42 Aminosäurereste umfaßt. Ob die Plaques eine Folge der Krankheit sind oder umgekehrt die Krankheitssymptome auf dem Vorhandensein der Plaques beruhen, ist noch umstritten. Das letztere Modell, die sog. "Amyloid-Hypothese", wurde in den letzten Jahren immer vollständiger und konsistenter, obwohl ein endgültiger Beweis oder Gegenbeweis bis jetzt nicht erbracht werden konnte (D. J. Selkoe, Science 1997, 275, 630-631).
Das Aβ-Peptid entsteht aus dem Aβ-Vorläuferprotein APP. APP ist ein Transmembranprotein, das durch verschiedene Proteasen, die als α-, β- oder γ-Sekretasen bezeichnet werden, gespalten wird. Durch die Aktivität von β- und γ-Sekretasen entsteht das Aβ-Peptid. Die bisherige Forschung ist darauf gerichtet, einen Inhibitor gegen diese Proteasen zu finden. Derartige Inhibitoren weisen jedoch erhebliche Nachteile auf, da die APP-spaltende Aktivität dieser Proteasen nicht deren einzige Funktion ist und somit die Hemmung der Enzyme zu drastischen Nebenwirkungen führen kann.
Es besteht somit ein Bedarf an Verbindungen, die zur Diagnose und gegebenenfalls zur Therapie von Alzheimer eingesetzt werden können und keine bzw. möglichst geringe Nebenwirkungen für den Patienten aufweisen.
Wünschenswert wäre es insbesondere, Verbindungen zu finden, die an das Aβ-Peptid binden und somit die Aggregation von Aβ hemmen. Zum Auffinden derartiger Verbindungen bieten sich Technologien an, die es ermöglichen, eine sehr große Zahl, beispielsweise 106 bis 112, von chemisch unterschiedlichen Molekülen, eine sogenannte Bibliothek, sehr schnell und einfach nach bestimmten Eigenschaften zu durchsuchen bzw. zu "screenen". Dabei werden chemisch-synthetische Bibliotheken und "biologische", d. h. sich selbst replizierende Bibliotheken, unterschieden. Chemisch-synthetische Bibliotheken bieten ein nahezu unbegrenztes Repertoire an Einzelbausteinen, ermöglichen jedoch nur das Screening einer begrenzten Zahl an verschiedenen Molekülen. Dagegen wird durch biologische Bibliotheken ein sehr schnelles Screening von bis zu 1012 verschiedenen Molekülen in einem Arbeitsschritt gewährleistet. Derartige biologische Bibliotheken sind jedoch auf die Kombination von "natürlichen" Bausteinen beschränkt, wie beispielsweise Ribonuklein- und Desoxyribonukleinsäuren und L-Aminosäuren.
Bei der direkten Anwendung in vivo von Substanzen, die durch biologisches Screening erhalten wurden und somit beispielsweise aus L-Aminosäuren bestehen, ergeben sich ferner Nachteile dadurch, daß sie äußerst empfindlich gegenüber Proteasen sind und zudem fast immer auch eine heftige Immunantwort auslösen, wenn sie an tierischen Modellen oder für die Behandlung von Menschen verwendet werden. Das herkömmliche Peptid-Phagendisplay (Smith, Science 1985, 228, 1315-1317) ist somit in dieser Hinsicht keine ausreichende Methode zur Identifizierung von Verbindungen, die an das Aβ-Peptid binden.
Im Stand der Technik sind bereits Verbindungen beschrieben, die die in vitro-Aggregation von Aβ inhibieren bzw. dessen toxische Effekte vermindern. So ist bekannt, daß Kongorot an Aβ-Aggregate bindet und deren toxische Wirkung inhibiert (Lorenzo und Yankner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12243-12247). Ferner wurden von Tjernberg et al. (J. Biol. Chem. 1996, 271, 8545-8548) Peptide offenbart, die kleinen Abschnitten des Aβ-Peptids entsprechen und dessen Aggregation in vitro hemmen können. Salomon et al., Biochemistry 1996, 35, 13568-13578, haben die Bindung von Nikotin an helikales Aβ und die Inhibierung der Aβ-Aggregation gezeigt. Für Hexadecyl-N-methylpiperidiniumbromid und Rifampicin wurde ebenfalls eine die Aβ-Fibrillenbildung inhibierende und anticytotoxische Wirkung mit einer Dissoziationskonstante im µM- bis mM-Bereich berichtet (Tomiyama et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 6839-6844). Solomon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94, 4109-­ 4112 haben ferner Antikörper beschrieben, die gegen den N-terminalen Teil (Positionen 1 bis 28) von Aβ gerichtet sind. Diese Antikörper konnten die Toxizität von Aβ reduzieren und die Aggregation von Aβ verhindern und sogar rückgängig machen.
Ghanta et al., J. Biol. Chem. 1996, 271, 29525-29528, beschreiben die Synthese eines Peptids, welches aus zwei Teilen besteht. Der N-terminale Teil entspricht den Aminosäuren 15 bis 25 von Aβ, der C-terminale Teil besteht aus sechs aufeinander folgenden Lysinen. Der Aβ15-25-Teil soll an Aβ binden, während der Hexalysin-Teil die Fibrillenbildung durch dessen Wasserlöslichkeit stören soll. Dieses Konstrukt ist in der Lage, die Aggregation von Aβ zu verlangsamen und dessen Cytotoxizität zu reduzieren.
Alle vorstehend beschriebenen Substanzen, welche die Aggregation von Aβ inhibieren, weisen jedoch den erheblichen Nachteil auf, daß sie in vivo leicht abgebaut werden, möglicherweise eine Immunreaktion auslösen und/oder zu unspezifisch wirken und dadurch zumindest langfristig schwere Nebenwirkungen auslösen.
Tjernberg et al., J. Biol. Chem. 1997, 272, 12601-12605, haben ferner ein Protease­ resistentes Pentapeptid beschrieben, das durch Screening einer chemisch synthetisierten Bibliothek aus D-Aminosäuren erhalten wurde. Dieses Peptid scheint an Aβ zu binden und die Bildung von Plaques zu inhibieren. Derartig kleine Peptide, wie sie durch Screening von herkömmlicherweise eher kleinen chemisch synthetischen Bibliotheken gefunden werden, sind jedoch nicht in der Lage, die erforderliche Affinität und insbesondere die gewünschte Spezifität für Aβ zu zeigen.
Es besteht somit insbesondere ein Bedarf an Aβ-Inhibitoren, die eine Affinität für Aβ nahe dem physiologisch wichtigen nanomolaren und subnanomolaren Bereich aufweisen. Neben der hohen Affinität ist es ferner von großer Bedeutung, daß ein Wirkstoff für die Alzheimer- Therapie eine hohe Spezifität für das Aβ-Peptid aufweist, da davon auszugehen ist, daß eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die Bildung von Aβ-Plaques hemmen und ggf. revertieren soll, über einen Zeitraum von unter Umständen mehreren Jahrzehnten verabreicht werden muß und deshalb frei von jeder Art von Nebenwirkungen sein sollte.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung von Verbindungen, die zur zuverlässigen Diagnose der Alzheimer-Krankheit auch bei lebenden Patienten geeignet sind und die ferner zur Therapie der Alzheimer-Demenz eingesetzt werden können, ohne daß sie Nebenwirkungen aufweisen, die das Wohlbefinden des Patienten wesentlich einschränken. Insbesondere ist es eine wesentliche Aufgabe der vorliegenden Erfindung, für die Diagnose und/oder Therapie der Alzheimer-Demenz geeignete Verbindungen bereitzustellen, die bei einem potentiellen Einsatz in Tiermodellen bzw. im Menschen keine oder zumindest eine verminderte Protease-Sensitivität und ferner eine deutlich reduzierte Immunogenität aufweisen.
Weitere Aufgaben ergeben sich aus der folgenden Beschreibung.
Oben genannte Aufgaben werden durch die Merkmale der unabhängigen Schutzansprüche gelöst.
Vorteilhafte Ausgestaltungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Es wurde jetzt überraschenderweise ein Peptid gefunden, das mit hoher Bindungsaffinität und hoher Spezifität an Monomere und/oder Oligomere und/oder Fibrillen des β-Amyloid-Peptids (im folgenden auch als Aβ-Peptid oder Aβ bezeichnet) bindet und im wesentlichen aus D- Aminosäuren besteht. Insbesondere bindet das erfindungsgemäße Peptid an Monomere und/oder Oligomere und/oder Fibrillen des β-Amyloid-Peptid mit einem KD-Wert von höchstens 10 µM, vorzugsweise von höchstens 8 µM, mehr bevorzugt von höchstens 6 µM, besonders bevorzugt von höchstens 4 µM und am meisten bevorzugt von höchstens 1 µM. Ganz besonders bevorzugt sind erfindungsgemäße Peptide, die mit einem KD-Wert im nanomolaren bzw. subnanomolaren Bereich an das β-Amyloid-Peptid binden.
Das erfindungsgemäße, im wesentlichen aus D-Aminosäuren bestehende Peptid ist in einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung aufgrund seiner hohen Affinität und Spezifität für Oligomere bzw. Fibrillen von Aβ in der Lage, die bei der Alzheimer-Demenz auftretenden Aβ-Plaques bzw. Aggregate aufzulösen oder zumindest deren weiteres Wachstum zu verhindern. Ferner ermöglicht das erfindungsgemäße Peptid, die Cytotoxizität von Aβ zu inhibieren. Neben diesen therapeutischen Eigenschaften ist das erfindungsgemäße Peptid hervorragend für diagnostische Tests zum Nachweis von Aβ geeignet.
Bei einer alternativen Ausführungsform ist das erfindungsgemäße, im wesentlichen aus D- Aminosäuren bestehende Peptid aufgrund seiner hohen Affinität und Spezifität für Monomere von Aβ in der Lage, die Oligomerisierung von Aβ und damit die Entstehung von Aβ-Plaques zu inhibieren. Damit ist das erfindungsgemäße Peptid zum Einsatz in der Vorbeugung von Alzheimer prädestiniert.
Zudem weist das erfindungsgemäße D-Peptid gegenüber den herkömmlichen Peptiden aus L- Aminosäuren die herausragende Eigenschaft auf, daß es in in vivo-Anwendungen wesentlich weniger immunogen ist und gleichzeitig deutlich resistenter gegenüber Proteasen ist.
Im wesentlichen aus D-Aminosäuren bestehend bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß die an der Bindung an das Aβ-Peptid beteiligten Aminosäuren des erfindungsgemäßen Peptids im wesentlichen D-Aminosäuren sind.
Daneben kann es vorteilhaft sein, daß an die im wesentlichen, vorzugsweise ausschließlich aus D-Aminosäuren bestehende Bindungsregion des erfindungsgemäßen Peptids weitere Gruppen, beispielsweise L-Aminosäuren, Aminosäureanaloga und dergleichen angefügt werden. Insbesondere kann eine Verknüpfung der im wesentlichen aus D-Aminosäuren bestehenden Bindungsregion des erfindungsgemäßen Peptids mit gut, vorzugsweise sehr gut wasserlöslichen Substanzen wie beispielsweise Zuckerresten die Amyloid-Plaque-lösende Wirkung wesentlich erhöhen. Für diese Zwecke geeignete wasserlösliche Gruppen, insbesondere Zuckerreste, Glucuronsäuren, Sulfatreste, Serin, Glycin, Aspartat und dergleichen, sowie die Art und Weise der Verknüpfung dieser Gruppen mit dem erfindungsgemäßen Peptid sind dem Fachmann bekannt.
Ferner können die erfindungsgemäßen Peptide mit herkömmlichen Antikörpern oder Fragmenten davon auf übliche Weise verknüpft werden, um bei einer therapeutischen Anwendung des erfindungsgemäßen Peptids Bestandteile des Immunsystems zu aktivieren und dadurch Aβ oder ganze Aβ-Plaques dem Abbau beispielsweise durch Makrophagen, Mikrogliazellen usw. zuzuführen.
Weitere Gruppen, mit denen die im wesentlichen aus D-Aminosäuren bestehende Bindungsregion des erfindungsgemäßen Peptids verknüpft werden kann, ergeben sich aus der Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide zur Diagnose der Alzheimer-Demenz mittels bildgebenden Verfahren wie PET (Positronen-Emissions-Tomographie), Kernspin- Tomographie, Computertomographie und SPECT (Single-Photon-Computer-Tomographie). Üblicherweise für derartige Imaging-Techniken verwendetet Gruppen sind dem Fachmann ebenso wie die Art und Weise der Verknüpfung dieser Gruppen mit dem erfindungsgemäßen Peptid ohne weiteres geläufig. Beispiele hierfür sind Gadoliniumkomplexe, Iod, Technetium, Thallium, Fluor und dergleichen.
Schließlich können an die erfindungsgemäßen Peptide funktionelle Gruppen synthetisch angefügt werden, die das Wiederausscheiden der erfindungsgemäßen Peptide, frei oder gebunden an Aβ, aus dem Körper beschleunigen können. Beispiele hierfür sind unter anderem Glucuronsäure und Sulfatgruppen.
Ferner ist es bevorzugt, daß das erfindungsgemäße Peptid 4 bis 18, vorzugsweise 6 bis 15 und besonders bevorzugt 7 bis 9 Aminosäuren umfaßt. Peptide in diesem Sequenzlängenbereich sind klein genug, um beispielsweise als Kontrastmittel bei der Detektion von Amyloidplaques in lebenden Individuen eingesetzt werden zu können.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfaßt das Peptid das aus D-Aminosäuren bestehende Aminosäure-Sequenzmotiv SHYRHISP oder Fragmente davon. Peptide, die das vorstehend genannte Sequenzmotiv umfassen, weisen eine sehr hohe Bindungsaffinität an das β-Amyloid-Peptid auf.
Besonders bevorzugt wird das Peptid ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den D- Aminosäure-Sequenzen:
  • a) QSHYRHISPAQV;
  • b) QSHYRHISPDQV;
  • c) QSHYRHISPAR;
  • d) KSHYRHISPAKV;
  • e) Sequenzen, die sich von den Sequenzen a) bis d) um bis zu drei Aminosäuren unterscheiden; und
  • f) Sequenzen, die die Sequenzen a) bis e) umfassen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Identifizierung bzw. Herstellung von Peptiden, die an das Aβ-Peptid binden.
Eine derartige Selektion ist auf direktem Weg nur mit chemischen Bibliotheken möglich. Um die im Vergleich zu chemischen Bibliotheken weit umfangreicheren biologischen Bibliotheken für das Screening verwenden zu können, wurde bei der vorliegenden Erfindung jedoch die Tatsache ausgenützt, daß zwei Moleküle in gleicher Weise wechselwirken und aneinander binden wie ihre jeweiligen Stereoisomere. Dabei verhält sich ein Komplex zum anderen wie Bild und Spiegelbild. Selektiert man nun eine biologische Bibliothek gegen ein Spiegelbild des Targets, d. h. im vorliegenden Fall gegen ein β-Amyloid-Peptid bestehend aus D-Aminosäuren, so wird nach dem Selektionsverfahren ein Peptid erhalten, das aus L- Aminosäuren besteht (im folgenden auch als L-Peptid bezeichnet). Das Spiegelbild dieses L- Peptids, d. h. ein Peptid, das aus D-Aminosäuren mit gleicher Sequenz besteht (im folgenden auch als D-Peptid bezeichnet), bindet nun auf die selbe Weise an das Target wie das L-Peptid an das "Mirror Target".
Erfindungsgemäß wird somit ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden bereitgestellt, die mit hoher Bindungsaffinität und -spezifität an das β-Amyloid-Peptid binden, umfassend die folgenden Schritte:
  • a) Synthese eines β-Amyloid-Peptids, bestehend aus D-Aminosäuren;
  • b) Screening von biologischen Peptid-Bibliotheken mittels Phagendisplay gegen die β-Amyloid-Sequenz aus Schritt a);
  • c) Identifizierung der an die β-Amyloid-Sequenz bindenden Peptide; und
  • d) Synthese der in Schritt c) selektierten Peptide mit der entsprechenden Aminosäuresequenz aus D-Aminosäuren.
Das in Schritt a) hergestellt β-Amyloid Peptid umfaßt die Aminosäuren 1-42 der bekannten β-Amyloid-Sequenz oder Fragmente davon.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das Screening in Schritt b) mittels Phagen-Display. Dieses als Spiegelbild-Phagendisplay (Schumacher et al., Science 1996, 271, 1854-1857) bezeichnete Verfahren bietet somit die Möglichkeit, mit hoher Bindungsaffinität und -spezifität an das Aβ-Peptid bindende Peptide zu identifizieren, die aus D-Aminosäuren bestehen, und eine stark verminderte Proteaseempfindlichkeit sowie ein reduziertes immunogenes Potential aufweisen.
Aufgrund der extremen Aggregationsempfindlichkeit von Aβ war ein erfolgreiches Screening von biologischen Peptid-Bibliotheken gegen die β-Amyloid-Sequenz nicht zu erwarten. Insbesondere sind die experimentellen Parameter bei Schritt b) des vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens in Abhängigkeit davon einzustellen, ob nach dem biologischen Screening ein Peptid erhalten werden soll, das bevorzugt an Monomere oder Oligomere bzw. Fibrillen bindet.
Falls das erfindungsgemäße Peptid für die Diagnose und/oder Therapie von Alzheimer eingesetzt werden soll, ist es insbesondere erwünscht, daß das durch das biologische Screening selektierte Peptid vorzugsweise an Oligomere bzw. Fibrillen von Aβ bindet. Um dies zu gewährleisten, wird das β-Amyloid-Peptid bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zunächst in Lösungsbedingungen überführt, die dessen kontrollierte Aggregation ermöglichen. Eine unkontrollierte Aggregation von Aβ wird durch Verwendung eines geeigneten Lösungsmittels, insbesondere von DMSO (Dimethylsulfoxid) verhindert.
Anschließend wird in Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens die Peptidbibliothek zugegeben und schließlich die gebildeten Peptid/D-Aβ-Komplexe beispielsweise an Streptavidin immobilisiert.
Falls das erfindungsgemäße Peptid zur Vorbeugung der Alzheimer-Demenz eingesetzt werden soll, ist es insbesondere erwünscht, durch das biologische Screening Peptide zu selektieren, die bevorzugt an Aβ-Monomere binden. In diesem Fall wird bei einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens D-Aβ zunächst in vorzugsweise geringer Konzentration beispielsweise an Streptavidin immobilisiert. Dies verhindert die Aggregation von Aβ vollständig, da alle Aβ-Moleküle einzeln immobilisiert sind. Anschließend erfolgt die Zugabe der Peptidbibliothek und Selektion der an D-Aβ- Monomere bindenden Peptide.
Ob das durch das erfindungsgemäße Verfahren selektierte Peptid an Monomere oder Oligomere bzw. Fibrillen bindet, ist somit durch geeignete Wahl der Schritte und Bedingungen im Verlauf des Selektionsverfahrens einstellbar.
Die in Schritt a) des vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens synthetisierten D-Peptide wurden mit spektroskopischen Methoden wie NMR-Spektroskopie und Cirkulardichroismus-Spektroskopie untersucht. So wurden beispielsweise alle Protonen von L-Aβ bzw. D-Aβ mittels NMR-Spektroskopie identifiziert. Aufgrund der im wesentlichen identischen NMR-Spektren von L-Aβ und D-Aβ sowie der Tatsache, daß die entsprechenden CD-Spektren bei umgekehrten Vorzeichen identisch sind, wurde gewährleistet, daß es sich bei dem in Schritt a) hergestellten D-Aβ um das Spiegelbild von L-Aβ handelt.
Das biologische Screening in Schritt b) des vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens kann alternativ auch mit Plasmid-Display (Schatz et al., Meth. Enzymol. 1996, 267, 171), Ribosomen-Display (Hanes und Plückthun, PNAS, 1997, 94, 4937-4942), Polysomen-Display (Mattheakis et al., PNAS, 1994, 91, 9022-9026), Baculoviren-Display (Ernst et al., Nucl. Acids Res. 1998, 26, 1718-1723), Bakterien-Display (Stahl und Uhlen, Trends Biotech. 1997, 15, 185-192) und/oder in vivo-Display erfolgen.
Des weiteren wird durch die vorliegende Erfindung ein Peptid bereitgestellt, das durch das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren erhältlich ist. Ein derartiges D-Peptid bindet optimal, d. h. mit hoher Affinität an β-Amyloid-Peptide. Ferner ist es durch die meisten Proteasen nicht abbaubar und kann deshalb direkt in einem Tiermodell oder am Menschen angewendet werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids zur Diagnose der Alzheimer-Demenz bei lebenden Individuen, insbesondere durch diagnostisches Imaging der Amyloid-Plaques in lebenden Tieren oder Menschen. Somit ist durch die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide für diagnostisches Imaging bei Tieren auch eine wesentliche Verminderung der Anzahl an Tierversuchen möglich. Tierversuche mit potentiellen Wirkstoffen gegen die Alzheimer- Demenz beinhalten nämlich üblicherweise als essentiellen Schritt die Kontrolle des Einflusses der zu testenden Substanz auf die Entwicklung von Plaques im Laufe der Zeit. Dazu ist es bislang erforderlich gewesen, Tierversuche mit einer großen Zahl an Versuchstieren durchzuführen, da zu bestimmten Zeitpunkten immer wieder Tiere getötet werden müssen, um Zahl und Größe der Plaques zu kontrollieren. Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide ist eine Kontrolle am lebenden Tier möglich, so daß die Tierversuche mit potentiellen Wirkstoffen gegen Alzheimer mit einer deutlich verringerten Anzahl an Versuchstieren durchgeführt werden können.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Peptide gebunden an eine geeignete Substanz als Kontrastmittel zur Detektion von Amyloid-Plaques mittels Computertomographie (CT) eingesetzt. Alternativ werden die erfindungsgemäßen Peptide vorzugsweise mit einer radioaktiven Markierung versehen. So können beispielsweise mit Hilfe der sogenannten Positronen-Emissions-Tomographie (PET) mit Positronen­ emittierenden Radionukliden markierte erfindungsgemäße Peptide injiziert werden und die emittierte γ-Strahlung in Tomogrammen erfaßt werden. Nützliche Positronenemitter sind 11C, 22Na, 58Co und dergleichen.
Weitere Alternativen zur Diagnose der Alzheimer-Demenz bei lebenden Individuen mittels der erfindungsgemäßen Peptide sind Kernspintomographie (MRI, magnetic resonance imaging) und/oder SPECT (single photon emission computer tomographie).
Aufgrund der Fähigkeit der erfindungsgemäßen Peptide zur spezifischen Wechselwirkung mit dem Plaque-Aufbau von Aβ beziehungsweise zur Inhibierung der Toxizität von Aβ können die erfindungsgemäßen Peptide ferner zur Vorbeugung und/oder zur Therapie der Alzheimer- Demenz verwendet werden.
Da die erfindungsgemäßen D-Peptide verglichen mit aus L-Aminosäuren bestehenden Peptiden eine stark reduzierte Protease-Empfindlichkeit und ein vermindertes immunogenes Potential aufweisen, sind sie ebenfalls geeignet, um den Zusammenhang zwischen pathologischen Befunden und Krankheitssymptomen bei der Alzheimer-Demenz zu untersuchen, insbesondere um die Hypothese des "Amyloid-Modells" zu verifizieren.
Die vorliegende Erfindung wird in dem nachfolgenden Beispiel veranschaulicht, ohne sie in irgendeiner Weise einzuschränken.
Beispiel
Folgende Peptide wurden als reversed phase-HPLC-gereinigte Produkte von Jerini Biotools, Berlin, Deutschland bezogen:
  • - Biotinyl-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (alle Aminosäuren sind L-Enantiomere, im folgenden auch als L-Aβ bezeichnet);
  • - D-Aβ (dieselbe Sequenz wie L-Aβ, aber alle Aminosäuren sind D-Enantiomere);
  • - QSHYRHISPAQV (alle Aminosäuren sind D-Enantiomere) mit einem über ein L-Lysin am C-Terminus gebundenen Fluoresceinyl-Rest (im folgenden dann auch als D-Pep bezeichnet).
Die Identität von L-Aβ und D-Aβ wurde durch MALDI-TOF-MS (Matrix-assistierte Laser­ desorptions-Ionisierungs-Flugzeitmassen-Spektrometrie) sowie durch NMR und Cirkulardichroismus-Spektroskopie bestätigt.
Die DNA-Sequenzen wurden unter Verwendung des Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit von PE Applied Biosystems (Warrington, Groß Britannien) mit Ampli Taq DNA- Polymerase bestimmt.
Die Fluoreszenz-Messungen wurden bei 298 K auf einem SLM-Aminco-Fourier Transform- Spektrofluorometer 48000 MHF (SLM Instruments Inc., USA) in Standardfluoreszenz-Zellen aus SUPRASIL-Quartzglas (10 × 10 mm, Hellma, Deutschland) durchgeführt. Die Fluoreszenz wurde bei ständigem Rühren in Buffer (PBS mit 1 mM Natriumdodecylsulfat) unter Verwendung von Anregungs- und Emissionswellenlängen von 495 bzw. 520 nm gemessen. Dazu wurden geeignete Mengen von L-Aβ in Hexafluoroisopropanol (HFP) gelöst. Als Kontrolle wurden dieselben Titrationen mit HFP in Abwesenheit von L-Aβ durchgeführt.
In vitro-Selektion von an Oligomere von D-Aβ bindenden Peptiden:
Zur Durchführung eines Phagendisplays wurde eine Vorratslösung aus 250 µM D-Aβ in DMSO hergestellt. 2 × 1011 Phagen (Phagendisplay-12 Phagedisplay Peptide Library Kit, New England Biolabs, Beverly, Madison, USA) in 0,8 ml TBST (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1 Vol.-%, Tween-20 (Sigma, Deisenhofen)) enthaltend 0,1 Gew.-% BSA (Sigma) wurden 1 : 100 mit 250 µM D-Aβ in DMSO gemischt, was zu einer Endkonzentration von 2,5 µM D-Aβ führte.
Nach 10 Min. wurde die Phagen-Peptid-Suspension in ein mit Streptavidin beschichtetes Röhrchen (Boehringer Mannheim) überführt und für 15 Min. bei Raumtemperatur leicht geschüttelt. Die nichtbindenden Phagen wurden durch Abgießen entfernt. Um etwaige Streptavidin-bindende Phagen zu entfernen, wurde 0,1 mM Biotin für 5 Min. bei Raumtemperatur zugegeben. Danach wurde das Röhrchen 10 mal mit 1,5 ml TBST gewaschen.
Die an D-Aβ bindenden Phagen mit einem Peptid-Bibliothek-Insert wurden durch Zugabe von 0,8 ml 0,2 M Glycin-HCl (pH 2,2) für 10 Min. bei Raumtemperatur eluiert und in 0,2 ml 1 M Tris-HCl (pH 9,1) zur Neutralisierung gegeben. Die Phagen-Titer wurden unter Verwendung einer Fraktion des Eluats zur Infektion von E. coli ER2738-Zellen unter Verwendung des Standardprotokolls (New England Biolabs) bestimmt. Zur Amplifizierung wurde das verbleibende Eluat in eine 20 ml Kultur (10 g/l Pepton (Roth, Karlsruhe), 5 g/l Hefeextrakt und 5 g/l NaCl) von E. coli ER2738 am Anfang der logarithmischen Phase (optische Dichte bei 600 nm von 0,1) zugegeben und bei 37°C unter kräftigem Rühren für 4,5 Std. inkubiert. Die Phagen wurden durch Zentrifugation (30 Min. 5000 × g) der Kulturen und anschließendes Ausfällen der Phagen aus dem verbleibenden Überstand durch Zugabe von 7 ml M NaCl mit 20 Gew.-% Polyethylenglycol (PEG 8000) und Zentrifugation (30 Min. 5000 × g) nach 16 Std. Inkubation auf Eis geerntet. Das Pellet wurde wieder in 1 ml TBS (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl) suspendiert, in ein Mikrozentrifugenröhrchen überführt und bei 10000 × g bei 4°C zentrifugiert, um die verbleibenden Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde mit 200 µl 2,5 M NaCl mit 20 Gew.-% Polyethylenglycol (PEG 8000) ausgefällt. Nach der Inkubation auf Eis für 1 Std. und Zentrifugation (20 Min., 13000 × g, 4°C) wurde das Pellet in 100 µl TBS suspendiert. Ein Aliquot der Phagen-Suspension wurde verwendet, um den Phagen-Titer nach der Amplifizierung zu bestimmen, um das Input- Volumen für den nächsten Schritt zu berechnen, das 2 × 1011-Phagen entspricht.
Nach vier Runden der Selektion und Amplifizierung wurden 41 Klone zufällig für die DNA- Sequenzierung des Peptid-Bibliothek-Inserts ausgewählt. Nach der Übersetzung in Aminosäure-Sequenzen zeigten 23 Sequenzen eine sehr starke Sequenz-Ähnlichkeit (siehe Abb. 1). Eine dieser Sequenzen war 21 mal in den 41 sequenzierten Proben enthalten, was darauf hindeutet, daß ein Peptid aus L-Aminosäuren mit dieser Sequenz sehr stark an D-Aβ bindet.
Um zu überprüfen, ob ein aus D-Aminosäuren bestehendes Peptid mit exakt derselben Sequenz an L-Aβ bindet, wurde ein entsprechendes chemisch synthetisiertes Peptid mit einer Fluorescein-Markierung an dessen C-Terminus für Fluoreszenz-Titrations-Untersuchungen verwendet. Die Abb. 2 zeigt die Änderung der D-Pep-abhängigen Fluoreszenz als Funktion der D-Aβ-Konzentration. Unter Annahme einer einfachen bimolekularen Reaktion zwischen D-Aβ und D-Pep führte die Analyse durch nichtlineare Kurvenanpassung (Müller et al., Biochemistry 1991, 30, 3709-3715) zu einem KD-Wert von 4 µM.
Fluorescein-Isothiocyanat (FITC-I, Sigma) als Kontrolle bindet nicht an D-Aβ.
Abbildungen
Abb. 1: Sequenz-Alignment (GCG, Wisconsin, USA) von 23 erhaltenen Peptid- Sequenzen nach der Selektion der Peptid-Bibliothek entsprechend der Bindung an D-Aβ.
Abb. 2: Bindung von L-Aβ an 0,8 µM D-Pep (.) und als Kontrolle an 1,0 µM Fluorescein (o) als Funktion der L-Aβ-Konzentration. Die Werte ergeben sich aus der Differenz der Fluoreszenz mit L-Aβ gelöst in HFP und HFP ohne L-Aβ. Unter Annahme einer einfachen bimolekularen Reaktion zwischen L-Aβ und dem D-Pep-Peptid ergab die Analyse durch nichtlineare Kurvenanpassung (durchgezogene Linie) einen KD-Wert von 4 µM.

Claims (21)

1. Peptid, dadurch gekennzeichnet, daß es im wesentlichen aus D-Aminosäuren besteht und an Monomere und/oder Oligomere und/oder Fibrillen des β-Amyloid-Peptids mit einem KD- Wert von höchstens 10 µM, vorzugsweise von höchstens 6 µM und besonders bevorzugt von höchstens 4 µM bindet.
2. Peptid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die an der Bindung an das β-Amyloid-Peptid beteiligten Aminosäuren ausschließlich D-Aminosäuren sind.
3. Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es 4 bis 18, vorzugsweise 6 bis 15 und besonders bevorzugt 7 bis 9 Aminosäuren umfaßt.
4. Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es das aus D-Aminosäuren bestehende Sequenzmotiv SHYRHISP oder Fragmente davon umfaßt.
5. Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den D- Aminosäure-Sequenzen:
  • a) QSHYRHISPAQV;
  • b) QSHYRHISPDQV;
  • c) QSHYRHISPAR;
  • d) KSHYRHISPAKV;
  • e) Sequenzen, die sich von den Sequenzen a) bis d) um bis zu drei Aminosäuren unterscheiden; und
  • f) Sequenzen, die die Sequenzen a) bis e) umfassen.
6. Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner wasserlösliche Gruppen umfaßt.
7. Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner Antikörper umfaßt.
8. Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner für die Verwendung in bildgebenden Verfahren geeignete Gruppen umfaßt.
9. Peptid nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es ferner Gruppen umfaßt, die das Wiederausscheiden des Peptids, frei oder gebunden an Aβ, aus dem Körper beschleunigen.
10. Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die mit hoher Bindungsaffinität an das β-Amyloid-Peptid binden, umfassend die folgenden Schritte:
  • a) Synthese eines β-Amyloid-Peptids, bestehend aus D-Aminosäuren;
  • b) Screening von biologischen Peptid-Bibliotheken gegen die β-Amyloid-Sequenz aus Schritt a);
  • c) Identifizierung der an die β-Amyloid-Sequenz bindenden Peptide; und
  • d) Synthese der in Schritt c) selektierten Peptide mit der entsprechenden Aminosäuresequenz aus D-Aminosäuren.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Screening mittels Phagen-Display erfolgt.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Screening folgende Schritte umfaßt:
  • a) Überführung des D-β-Amyloid-Peptids in Lösungsbedingungen, die dessen kontrollierte Aggregation ermöglichen;
  • b) Zugabe der Peptid-Bibliothek; und
  • c) Immobilisierung von Peptid/D-β-Amyloid-Komplexen.
13. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Screening mittels Phagen-Display die folgenden Schritte umfaßt:
  • a) Immobilisierung von D-β-Amyloid-Monomeren;
  • b) Zugabe der Peptid-Bibliothek.
14. Peptid, erhältlich durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 13.
15. Verwendung der Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder nach Anspruch 14 zur Diagnose der Alzheimer-Demenz bei lebenden Individuen.
16. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Peptide als Kontrastmittel zur Detektion von Amyloidplaques eingesetzt werden.
17. Verwendung nach Anspruch 15 oder 16, wobei die Peptide radioaktiv markiert werden.
18. Verwendung nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei die Diagnose mittels PET erfolgt.
19. Verwendung nach Anspruch 15, wobei die Detektion mittels Kernspintomographie erfolgt.
20. Verwendung der Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder nach Anspruch 14 zur Vorbeugung und/oder Therapie der Alzheimer-Demenz.
21. Verwendung der Peptide nach einem der Ansprüche 1 bis 9 oder nach Anspruch 14 zur Untersuchung des Zusammenhangs zwischen pathologischen Befunden und Krankheitssymptomen bei der Alzheimer-Demenz.
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