ES2870085T3

ES2870085T3 - Inhibidores peptídicos permeables a células de la ruta de transducción de señales de JNK para el tratamiento de la cistitis

Info

Publication number: ES2870085T3
Application number: ES14734003T
Authority: ES
Inventors: Jean-Marc Combette; Catherine Deloche
Original assignee: Xigen Inflammation Ltd
Current assignee: Xigen Inflammation Ltd
Priority date: 2013-06-26
Filing date: 2014-06-26
Publication date: 2021-10-26
Anticipated expiration: 2034-06-26
Also published as: JP2017520571A; CA2903275A1; WO2014206563A3; PL3013353T3; JP2020055866A; HK1224225A1; MX2016017308A; EA201501080A1; JP2016523274A; US10624948B2; AU2014301631A1; EP3013353B1; US20160199444A1; CN105307670A; WO2014206563A2; EP3013353A2; KR20160023669A; BR112016029413A2

Abstract

Péptido inhibidor de JNK que comprende o consiste en la secuencia de D-aminoácidos de SEQ ID NO: 11, para su uso en el tratamiento de la cistitis, en particular la cistitis intersticial.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores peptídicos permeables a células de la ruta de transducción de señales de JNK para el tratamiento de la cistitis

La presente invención se refiere al uso de un inhibidor de la proteína cinasa cinasa c-Jun amino-terminal, o de un ácido nucleico que codifica para la misma, para el tratamiento de la cistitis.

La cinasa c-Jun amino-terminal (JNK) es un miembro del grupo de proteína cinasas activadas por mitógenos (MAP) activadas por estrés. Estas cinasas se han implicado en el control del crecimiento y la diferenciación celular y, más generalmente, en la respuesta de las células a los estímulos ambientales. La ruta de transducción de señales de JNK se activa en respuesta al estrés ambiental y por la participación de varias clases de receptores de superficie celular. Estos receptores pueden incluir receptores de citocinas, receptores de serpentina y receptores de tirosina cinasas. En células de mamíferos, JNK se ha implicado en procesos biológicos tales como la transformación oncogénica y la mediación de respuestas adaptativas al estrés ambiental. JNK también se ha asociado con la modulación de las respuestas inmunitarias, incluyendo la maduración y diferenciación de células inmunitarias, así como con la muerte celular programada en células identificadas para su destrucción por el sistema inmunitario. Esta propiedad única convierte a la señalización de JNK en una diana prometedora para el desarrollo de intervenciones farmacológicas. Entre varios trastornos neurológicos, la señalización de JNK está particularmente implicada en el accidente cerebrovascular isquémico y la enfermedad de Parkinson, pero también en otras enfermedades, tal como se menciona a continuación. Además, se demostró que la proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK) p38alfa regula negativamente la proliferación celular al antagonizar la ruta de JNK-cJun. Por tanto, la proteína cinasa activada por mitógenos (MAPK) p38alfa parece ser activa en la supresión de la proliferación de células cancerosas y normales y, además, demuestra la participación de JNK en enfermedades cancerosas (véase, por ejemplo, Hui et al., Nature Genetics, vol. 39, n.° 6, junio de 2007). También se demostró que la cinasa c-Jun N-terminal (JNK) está implicada en el dolor neuropático producido por la ligadura de nervios espinales (SNL), en donde SNL indujo una activación lenta y persistente de j Nk , en particular JNK1, mientras que la activación de la proteína cinasa activada por mitógenos p38 se encontró en la microglía espinal después de s Nl , que había caído hasta cerca del nivel basal a los 21 días (Zhuang et al., The Journal of Neuroscience, 29 de marzo de 2006, 26(13):3551-3560)). Por tanto, la inhibición o interrupción de la ruta de señalización de JNK, en particular la provisión de inhibidores de la ruta de señalización de JNK, parece ser un enfoque prometedor para combatir los trastornos fuertemente relacionados con la señalización de JNK. Sin embargo, hasta ahora sólo se conocen unos pocos inhibidores de la ruta de señalización de JNK.

Los inhibidores de la ruta de señalización de JNK, que ya se conocen en la técnica anterior, incluyen particularmente, por ejemplo, inhibidores de cinasas aguas arriba (por ejemplo, CEP-1347), inhibidores de compuestos químicos pequeños de JNK (SP600125 y AS601245), que afectan directamente a la actividad cinasa, por ejemplo, compitiendo con el sitio de unión a ^aT^pde la proteína cinasa, y los inhibidores peptídicos de la interacción entre JNK y sus sustratos (D-JNKI e I-JIP) (véase, por ejemplo, Kuan et al., Current Drug Targets - CNS & Neurological Disorders, febrero de 2005, vol. 4, n.° 1, págs. 63-67(5)).

Se demostró que RDP58, un decapéptido que se notificó anteriormente como útil en diversas enfermedades, inhibe la fosforilación de p38MAPK y JNK (lyer S. et al.; RDP58, a rationally designed peptide, inhibits multiple forms of pathogenic inflammation through the inhibition of p38MAPK and JNK, Biopolymers, John Wilkey & Sons, Inc., EE.UU., vol. 71, n.° 3, O61, enero de 2003, página 298).

El inhibidor de cinasas aguas arriba CEP-1347 (KT7515) es un inhibidor semisintético de la familia de cinasas de linaje mixto. CEP-1347 (KT7515) fomenta la supervivencia neuronal a dosificaciones que inhiben la activación de las cinasas c-Jun amino-terminales (JNK) en cultivos embrionarios primarios y células PC12 diferenciadas después de la abstinencia trófica y en ratones tratados con 1 -metil-4-feniltetrahidropiridina. Además, CEP-1347 (KT7515) puede fomentar la supervivencia a largo plazo de las neuronas simpáticas, ciliares y motoras del ganglio de la raíz posterior embrionaria de pollo cultivadas (véase, por ejemplo, Borasio et al., Neuroreport. 9(7): 1435-1439, 11 de mayo de 1998).

Se descubrió que el inhibidor de compuestos químicos pequeños de JNK SP600125 reduce los niveles de fosforilación de c-Jun, protege a las neuronas dopaminérgicas de la apoptosis y restablece parcialmente el nivel de dopamina en la EP inducida por MPTP en ratones C57BL/6N (Wang et al., Neurosci Res. Febrero de 2004; 48(2); 195-202). Estos resultados indican además que la ruta de JNK es el principal mediador de los efectos neurotóxicos de MPTP in vivo y la inhibición de la actividad JNK puede representar una estrategia nueva y eficaz para tratar la EP.

Un ejemplo adicional de inhibidores de compuestos químicos pequeños es el inhibidor de JNK AS601245 mencionado anteriormente. AS601245 inhibe la ruta de señalización de JNK y fomenta la supervivencia celular después de la isquemia cerebral. In vivo, AS601245 proporcionó una protección significativa contra la pérdida retardada de neuronas CA1 del hipocampo en un modelo de jerbo de isquemia global transitoria. Este efecto está mediado por la inhibición de JNK y, por tanto, por la expresión y fosforilación de c-Jun (véase, por ejemplo, Carboni et al., J Pharmacol Exp Ther. Julio de 2004; 310(1):25-32. Epub del 26 de febrero de 2004).

Una tercera clase de inhibidores de la ruta de señalización de JNK representan inhibidores peptídicos de la interacción entre JNK y sus sustratos, tal como se mencionó anteriormente. Como punto de partida para la constructo de tales péptidos inhibidores de JNK, puede usarse un alineamiento de secuencias de proteínas JNK que se producen de manera natural. Normalmente, estas proteínas comprenden dominios de unión a JNK (JBD) y se producen en diversas proteínas de unión a insulina (IB), tales como ⁱB1 o IB2. Los resultados de tal alineamiento de secuencias a modo de ejemplo son, por ejemplo, un alineamiento de secuencias entre los dominios de unión a JNK de IB1 [SEQ ID NO: 13], IB2 [SEQ ID NO: 14], c-Jun [SEQ ID NO: 15] y ATF2 [SEQ ID NO: 16] (véanse, por ejemplo, las figuras 1A-1C). Un alineamiento de este tipo revela una secuencia de 8 aminoácidos parcialmente conservada (véase, por ejemplo, la figura 1A). Una comparación de los JBD de IB1 e IB2 revela además dos bloques de siete y tres aminoácidos que están muy conservados entre las dos secuencias.

Las secuencias construidas basándose en un alineamiento de este tipo se dan a conocer, por ejemplo, en el documento WO 01/27268 o en el documento WO 2007/031280. Los documentos WO 2007/031280 y WO 01/27268 describen péptidos de fusión permeables a células pequeñas, que comprenden la denominada secuencia de permeación de células TAT derivada de la secuencia de tráfico básica de la proteína TAT del VIH y una secuencia inhibidora de mínimo 20 aminoácidos de IB1. Ambos componentes están unidos covalentemente entre sí. Inhibidores a modo de ejemplo (y en la actualidad los únicos) de la ruta de señalización de MAPK-JNK dados a conocer tanto en el documento W^o2007/031280 como en el documento WO 01/27268, son, por ejemplo, L-JNKI1 (péptido inhibidor de JNK que se compone de L-aminoácidos) o péptidos D-JNKI1 resistentes a proteasas (péptido inhibidor de JNK que se compone D-aminoácidos no nativos). Estos péptidos inhibidores de JNK (JNKI) son específicos de JNK (JNK1, JNK2 y JNK3). A diferencia de los inhibidores de compuestos pequeños tal como se comentó anteriormente, las secuencias inhibidoras de los documentos WO 2007/031280 o WO 01/27268, por ejemplo, JNKI1, más bien inhiben la interacción entre JNK y su sustrato. Mediante su secuencia de tráfico derivada de TAT, el péptido de fusión se transporta eficazmente al interior de las células. Debido a las propiedades novedosas obtenidas por el componente de tráfico, los péptidos de fusión se transportan activamente a las células, donde permanecen eficaces hasta la degradación proteolítica.

Sin embargo, los péptidos según los documentos WO 2007/031280 o WO 01/27268 sólo han demostrado ser activos en un número particularmente limitado de enfermedades, particularmente enfermedades proliferativas de células no malignas o relacionadas con el sistema inmunitario.

El objeto de la presente invención es proporcionar (el uso de) un péptido inhibidor de JNK para el tratamiento de una enfermedad que aún no se conoce o ya se sabe que está fuertemente relacionada con la señalización de JNK. Este objeto se resuelve mediante el uso de una secuencia inhibidora de JNK tal como se define en el presente documento, concretamente, un péptido inhibidor de JNK que comprende o consiste en la secuencia de D-aminoácidos de SEQ ID NO: 11, para el tratamiento de la cistitis, en particular la cistitis intersticial.

El inhibidor de JNK puede usarse para el tratamiento de la cistitis intersticial.

Preferiblemente, una secuencia inhibidora de JNK, tal como se usa en el presente documento, comprende una longitud total de menos de 150 residuos de aminoácidos, preferiblemente un intervalo de 5 a 150 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de 10 a 100 residuos de aminoácidos, incluso más preferiblemente de 10 a 75 residuos de aminoácidos y lo más preferiblemente un intervalo de 10 a 50 residuos de aminoácidos, por ejemplo, de 10 a 30, de 10 a 20 o de 10 a 15 residuos de aminoácidos.

La secuencia inhibidora de JNK, tal como se usa en el presente documento, se compone exclusivamente de D-aminoácidos. La secuencia inhibidora de JNK en el péptido inhibidor de JNK para su uso según la invención comprende o consiste en la secuencia D-retroinversa según la secuencia de aminoácidos NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPR-COOH (D-IB1(s)) [SEQ ID NO: 2].

Las secuencias inhibidoras de JNK se presentan en la tabla 1 (no según la invención excepto para SEQ ID NO: 11 (D-TAT-IB1(s)) que comprende la secuencia inhibidora de JNK de SEQ ID NO: 2 y la secuencia de tráfico de SEQ ID NO: 6). La tabla presenta el nombre de las secuencias inhibidoras de JNK, así como su número de identificación de secuencia, su longitud y secuencia de aminoácidos. Además, la tabla 1 muestra secuencias así como sus fórmulas genéricas, por ejemplo, para las SEQ ID NO: 1, 2, 5, 6, 9 y 11 y las SEQ ID NO: 3, 4, 7, 8, 10 y 12, respectivamente. La tabla 1 da a conocer además las secuencias quiméricas SEQ ID NO: 9-12 y 23-32 (véase a continuación), las secuencias de L-IB1 SEQ ID NO: 33 a 66 y las secuencias de D-IB1 SEQ ID NO: 67 a 100.

TABLA 1

Además, la secuencia inhibidora de JNK en el péptido inhibidor de JNK puede comprender o consistir en al menos un derivado de la secuencia de aminoácidos según SEQ ID NO: 2. En este contexto, un “derivado de una secuencia de aminoácidos (nativos o no nativos) según SEQ ID NO: 2” es una secuencia de aminoácidos derivada de SEQ ID NO: 2, en la que el derivado comprende al menos un D-aminoácido modificado, preferiblemente de 1 a 20, más preferiblemente de 1 a 10 e incluso más preferiblemente de 1 a 5 D-aminoácidos modificados.

“Un aminoácido modificado” a este respecto puede ser cualquier aminoácido que esté alterado, por ejemplo, mediante glicosilación diferente en diversos organismos, mediante fosforilación o mediante marcaje de aminoácidos específicos. Entonces, un marcador de este tipo se selecciona normalmente del grupo de marcadores que comprende:

(i) marcadores radiactivos, es decir, fosforilación radiactiva o un marcador radiactivo con azufre, hidrógeno, carbono, nitrógeno;

(ii) tintes de color (por ejemplo, digoxigenina);

(iii) grupos fluorescentes (por ejemplo, fluoresceína);

(iv) grupos quimioluminiscentes;

(v) grupos para la inmovilización sobre una fase sólida (por ejemplo, His-tag, biotina, Strep-tag, Flag-tag, anticuerpos, antígeno); y

(vi) una combinación de marcadores de dos o más de las marcadores mencionados en (i) a (v).

Las secuencias inhibidoras de JNK, tal como se usan según la presente invención y tal como se definieron anteriormente, pueden obtenerse o producirse mediante métodos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, mediante síntesis química o mediante métodos de ingeniería genética tal como se comenta a continuación. Por ejemplo, un péptido correspondiente a una porción de una secuencia inhibidora de JNK, tal como se usa en el presente documento, que incluye una región deseada de dicha secuencia inhibidora de JNK o que media la actividad deseada in vitro o in vivo, puede sintetizarse mediante el uso de un sintetizador de péptidos.

La secuencia inhibidora de JNK, tal como se usa en el presente documento y tal como se definió anteriormente, se modifica además mediante una secuencia de tráfico, permitiendo que la secuencia inhibidora de JNK, tal como se usa en el presente documento y tal como se definió anteriormente, sea transportada eficazmente a las células. La secuencia inhibidora de JNK modificada se proporciona y usa como secuencia quimérica.

Por tanto, la presente invención proporciona el uso de un péptido inhibidor de JNK que comprende o consiste en la secuencia de D-aminoácidos de SEQ ID NO: 11, que es un péptido quimérico que incluye al menos un primer dominio y al menos un segundo dominio, para el tratamiento de la cistitis, en el que el primer dominio del péptido quimérico comprende la secuencia de tráfico de SEQ ID NO: 6, mientras que el segundo dominio del péptido quimérico comprende la secuencia inhibidora de JNK de SEQ ID NO: 2.

Normalmente, los péptidos quiméricos, tal como se usan según la presente invención, tienen una longitud de al menos 25 residuos de aminoácidos, por ejemplo, de 25 a 250 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de 25 a 200 residuos de aminoácidos, incluso más preferiblemente de 25 a 150 residuos de aminoácidos, de 25 a 100 y lo más preferiblemente de 25 a 50 residuos de aminoácidos.

Como primer dominio, el péptido quimérico, tal como se usa en el presente documento, comprende una secuencia de tráfico, que dirige un péptido (en el que está presente) a un destino celular deseado. Por tanto, la secuencia de tráfico, tal como se usa en el presente documento, dirige normalmente el péptido a través de la membrana plasmática, por ejemplo, desde el exterior de la célula, a través de la membrana plasmática y hacia el citoplasma. Además, la secuencia de tráfico puede dirigir el péptido a una ubicación deseada dentro de la célula, por ejemplo, el núcleo, el ribosoma, el retículo endoplásmico (RE), un lisosoma o peroxisoma, por ejemplo, combinando dos componentes (por ejemplo, un componente para la permeabilidad celular y un componente para la ubicación nuclear). La secuencia de tráfico puede comprender adicionalmente otro componente, que puede unirse a un componente citoplásmico o cualquier otro componente o compartimento de la célula (por ejemplo, retículo endoplásmico, mitocondrias, aparato de oscuridad, vesículas lisosómicas). Por consiguiente, por ejemplo, la secuencia de tráfico del primer dominio y la secuencia inhibidora de JNK del segundo dominio pueden ubicarse en el citoplasma o en cualquier otro compartimento de la célula. Esto permite determinar la ubicación del péptido quimérico en la célula tras la absorción.

Preferiblemente, la secuencia de tráfico (que se incluye en el primer dominio del péptido quimérico, tal como se usa en el presente documento) tiene una longitud de 5 a 150 secuencias de aminoácidos, más preferiblemente una longitud de 5 a 100 y lo más preferiblemente una longitud de 5 a 50, de 5 a 30 o incluso de 5 a 15 aminoácidos. La secuencia de tráfico (contenida en el primer dominio del péptido quimérico, tal como se usa en el presente documento) se produce como un tramo continuo de secuencia de aminoácidos en el primer dominio. La secuencia de tráfico del péptido quimérico, tal como se usa en el presente documento, se compone exclusivamente de D-aminoácidos.

La secuencia de tráfico del primer dominio del péptido quimérico, tal como se usa en el presente documento, puede obtenerse de fuentes naturales o puede producirse usando técnicas de ingeniería genética o síntesis química (véase, por ejemplo, Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A Laboratory manual. 2a edición. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York).

La secuencia de tráfico del primer dominio comprende o consiste en una secuencia derivada de la proteína TAT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) 1.

Para la secuencia de tráfico (que se incluye en el primer dominio del péptido quimérico, tal como se usa en el presente documento), se usa una secuencia parcial de la proteína TAT de longitud completa que forma un fragmento funcionalmente eficaz de una proteína TAT, es decir, un péptido TAT que incluye la región que media la entrada y la absorción en las células. En cuanto a si dicha secuencia es un fragmento funcionalmente eficaz de la proteína TAT, puede determinarse usando técnicas conocidas (véase, por ejemplo, Franked et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 86: 7397-7401 (1989)). Por tanto, la secuencia de tráfico en el primer dominio del péptido quimérico, tal como se usa en el presente documento, se deriva de un fragmento o una porción funcionalmente eficaz de una secuencia de proteína TAT que comprende menos de 86 aminoácidos y que muestra absorción en las células y, opcionalmente, absorción en el núcleo celular. Las secuencias parciales (fragmentos) de TAT, que se usarán como portador para mediar la permeación del péptido quimérico a través de la membrana celular, comprenden la región básica (aminoácidos 48 a 57 o 49 a 57) de TAT de longitud completa.

La secuencia de tráfico, tal como se usa en el presente documento, comprende la secuencia D-retroinversa NH2-RRRQRRKKRG-COOH (D-TAT) [SEQ ID NO: 6]. Como segundo dominio, el péptido quimérico, tal como se usa en el presente documento, comprende la secuencia inhibidora de JNK de SEQ ID NO: 2, tal como se definió anteriormente. Ambos dominios, es decir, el/los dominio(s) primero y segundo del péptido quimérico, tal como se usa en el presente documento, se unen para formar una unidad funcional.

El/los dominio(s) primero y segundo del péptido quimérico, tal como se usa en el presente documento, se unen mediante un enlace covalente. Un enlace covalente, tal como se define en el presente documento, puede ser, por ejemplo, un enlace peptídico, que puede obtenerse expresando el péptido quimérico, tal como se definió anteriormente, como una proteína de fusión. Las proteínas de fusión, tal como se describen en el presente documento, pueden formarse y usarse de formas análogas o fácilmente adaptables a las técnicas de ADN recombinante convencionales, tal como se describe a continuación.

El/los dominio(s) primero y segundo se unen entre sí mediante una secuencia ligadora que comprende 2 aminoácidos. Los aminoácidos que forman la secuencia ligadora son residuos del aminoácido prolina. El/los dominio(s) primero y segundo están separados entre sí por una bisagra de dos residuos de prolina entre el/los dominio(s) primero y segundo.

El péptido quimérico, tal como se definió anteriormente y tal como se usa en el presente documento, que comprende al menos un primer y al menos un segundo dominio, se compone de D-aminoácidos. En este caso, cada dominio (así como los ligadores usados) se compone de D-aminoácidos.

El péptido quimérico, tal como se usa en el presente documento, comprende o consiste en un péptido quimérico de D-aminoácidos según el péptido TAT-IB1 NH2-DQSRPVQPFLNLTTPRKPRPPRRRQRRKKRG-COOH (D-TAT-IB1(s)) [SEQ ID NO: 11].

La presente invención se refiere adicionalmente al uso de secuencias de ácido nucleico que codifican para el péptido inhibidor de JNK que comprenden o consisten en la secuencia de D-aminoácidos SEQ ID NO: 11, para el tratamiento de la cistitis.

Los ácidos nucleicos que codifican para el péptido inhibidor de JNK, tal como se usa en el presente documento, pueden obtenerse mediante cualquier método conocido en la técnica (por ejemplo, mediante amplificación por PCR usando cebadores sintéticos que pueden hibridarse con los extremos 3' y 5' de la secuencia y/o mediante clonación a partir de un ADNc o una biblioteca genómica usando una secuencia de oligonucleótidos específica para la secuencia génica dada).

Las secuencias de ácido nucleico, tal como se definieron anteriormente según la presente invención, pueden usarse para expresar péptidos, es decir, el péptido inhibidor de JNK, tal como se usa en el presente documento, para su uso terapéutico.

Según una realización adicional de la presente invención, los vectores de expresión pueden usarse para los fines anteriores para la expresión recombinante del péptido inhibidor de JNK, tal como se definió anteriormente. El término “vector de expresión” se usa en el presente documento para designar ADN o ARN circular o lineal, que es o bien bicatenario o bien monocatenario. Además, comprende al menos un ácido nucleico, tal como se definió anteriormente, que va a transferirse a una célula huésped o a un organismo huésped unicelular o multicelular. El vector de expresión, tal como se usa en el presente documento, comprende preferiblemente un ácido nucleico, tal como se definió anteriormente, que codifica para el péptido inhibidor de JNK, tal como se usa en el presente documento. Además, un vector de expresión según la presente invención comprende preferiblemente elementos apropiados para respaldar la expresión, incluyendo diversos elementos reguladores, tales como potenciadores/promotores de fuentes víricas, bacterianas, vegetales, de mamíferos y otras fuentes eucariotas que impulsan la expresión del polinucleótido insertado en células huésped, tales como aisladores, elementos de frontera, LCR (por ejemplo, descritos por Blackwood y Kadonaga (1998), Science 281, 61-63) o regiones de unión de matriz/andamiaje (por ejemplo, descritas por Li, Harju y Peterson, (1999), Trends Genet. 15, 403-408). En algunas realizaciones, los elementos reguladores son heterólogos (es decir, no el promotor del gen nativo). Alternativamente, las señales de transcripción y traducción necesarias también pueden ser proporcionadas por el promotor nativo para los genes y/o sus regiones flanqueantes.

El término “promotor”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una región de ADN que actúa para controlar la transcripción de una o más secuencias de ácido nucleico, tal como se definieron anteriormente, y que se identifica estructuralmente por la presencia de un sitio de unión para la ARN polimerasa dependiente de ADN y de otras secuencias de ADN, que interactúan para regular la función del promotor. Un fragmento que fomenta la expresión funcional de un promotor es una secuencia promotora acortada o truncada que conserva la actividad como promotor. La actividad del promotor puede medirse mediante cualquier ensayo conocido en la técnica (véase, por ejemplo, Wood, de Wet, Dewji y DeLuca, (1984), Biochem Biophys. Res. Commun. 124, 592-596; Seliger y McElroy, (1960), Arch. Biochem. Biophys. 88, 136-141) o disponible comercialmente de Promega®.

Una “región potenciadora” que va a usarse en el vector de expresión, tal como se define en el presente documento, normalmente se refiere a una región de ADN que actúa para aumentar la transcripción de uno o más genes. Más específicamente, el término “potenciador”, tal como se usa en el presente documento, es un elemento regulador de a Dn que potencia, aumenta o mejora la expresión de un gen independientemente de su ubicación y orientación con respecto al gen que va a expresarse, y puede potenciar, aumentar o mejorar la expresión de más de un promotor. Las secuencias promotoras/potenciadoras que van a usarse en el vector de expresión, tal como se define en el presente documento, pueden usar secuencias reguladoras de plantas, animales, insectos u hongos. Por ejemplo, pueden usarse elementos promotores/potenciadores de levaduras y otros hongos (por ejemplo, el promotor GAL4, el promotor de alcohol deshidrogenasa, el promotor de fosfoglicerol cinasa, el promotor de fosfatasa alcalina). Alternativamente, o además, pueden incluir regiones de control de la transcripción de animales, por ejemplo, (i) la región de control génico de la insulina activa dentro de las células beta pancreáticas (véase, por ejemplo, Hanahan et al., 1985. Nature 315: 115-122.); (ii) la región de control génico de la inmunoglobulina activa dentro de las células linfoides (véase, por ejemplo, Grosschedl, et al., 1984, Cell 38: 647-658); (iii) la región de control génico de la albúmina activa en el hígado (véase, por ejemplo, Pinckert, et al., 1987. Genes and Dev 1: 268-276; (iv) la región de control génico de la proteína básica de mielina activa dentro de las células oligodendrocíticas del cerebro (véase, por ejemplo, Readhead, et al., 1987, Cell 48: 703-712); y (v) la región de control génico de la hormona liberadora de gonadotropina activa dentro del hipotálamo (véase, por ejemplo, Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378). Además, el vector de expresión, tal como se define en el presente documento, puede comprender un marcador de amplificación. Este marcador de amplificación puede seleccionarse del grupo que consiste en, por ejemplo, adenosina desaminasa (ADA), dihidrofolato reductasa (DHFR), gen de resistencia a múltiples fármacos (MDR), ornitina descarboxilasa (ODC) y resistencia a N-(fosfonacetil)-L-aspartato (CAD).

Los vectores de expresión a modo de ejemplo o sus derivados adecuados para la presente invención incluyen particularmente, por ejemplo, virus humanos o animales (por ejemplo, virus vaccinia o adenovirus); virus de insectos (por ejemplo, baculovirus); vectores de levaduras; vectores de bacteriófagos (por ejemplo, fago lambda); vectores plasmídicos y vectores cósmidos.

La presente invención puede usar adicionalmente una variedad de sistemas huésped-vector, que pueden expresar la(s) secuencia(s) codificante(s) peptídica(s) de ácidos nucleicos, tal como se definieron anteriormente. Estos incluyen: (i) sistemas de células de mamíferos que están infectados con virus vaccinia o adenovirus; (ii) sistemas de células de insectos infectados con baculovirus; (iii) levadura que contiene vectores de levadura o (iv) bacterias transformadas con bacteriófagos, ADN, ADN plasmídico o ADN cósmido. Dependiendo del sistema huésped-vector usado, puede usarse cualquiera de varios elementos de transcripción y traducción adecuados.

Preferiblemente, puede seleccionarse una cepa de células huésped, adecuada para un sistema huésped-vector de este tipo, que modula la expresión de secuencias de interés insertadas, o modifica o procesa péptidos expresados codificados por las secuencias de la manera específica deseada. Además, la expresión de determinados promotores puede potenciarse en presencia de determinados inductores en una cepa huésped seleccionada; facilitando así el control de la expresión de un péptido genéticamente modificado. Además, diferentes células huésped poseen mecanismos característicos y específicos para el procesamiento y la modificación traduccionales y postraduccionales (por ejemplo, glicosilación, fosforilación) de péptidos expresados. Por tanto, pueden elegirse líneas celulares o sistemas huésped apropiados para garantizar que se logre la modificación y el procesamiento deseados del péptido extraño. Por ejemplo, la expresión de péptidos dentro de un sistema bacteriano puede usarse para producir un péptido central no glicosilado; mientras que la expresión dentro de células de mamíferos garantiza la glicosilación “nativa” de un péptido heterólogo.

Los péptidos inhibidores de JNK, ácidos nucleicos, vectores y/o células huésped, tal como se definen según la invención, pueden formularse en una composición farmacéutica, que puede aplicarse en la prevención o el tratamiento de la cistitis. Normalmente, una composición farmacéutica de este tipo usada según la presente invención incluye, como componente activo, por ejemplo: (i) los péptidos inhibidores de JNK, tal como se definieron anteriormente; y/o (ii) ácidos nucleicos que codifican para el péptido inhibidor de JNK, tal como se definió, y/o (iii) células que comprenden los péptidos inhibidores de JNK, tal como se definieron anteriormente, y/o (iv) células transfectadas con un vector y/o ácidos nucleicos que codifican para el péptido inhibidor de JNK, tal como se definió anteriormente.

Según una realización preferida, una composición farmacéutica de este tipo, tal como se usa según la presente invención, comprende normalmente una cantidad segura y eficaz de un componente, tal como se definió anteriormente, preferiblemente de al menos un péptido inhibidor de JNK según SEQ ID NO: 11, o al menos un ácido nucleico que codifica para el mismo, o al menos un vector, o una célula huésped, tal como se definieron anteriormente.

Los inventores de la presente invención encontraron adicionalmente que el péptido inhibidor de JNK, respectivamente, tal como se define en el presente documento, presenta una tasa de absorción de pocillo particular en las células implicadas en las enfermedades de la presente invención. Por tanto, la cantidad del péptido inhibidor de JNK, respectivamente, en la composición farmacéutica que va a administrarse a un sujeto puede tener una dosis muy baja. Por tanto, la dosis puede ser mucho menor que la de los fármacos peptídicos conocidos en la técnica, tales como DTS-108 (Florence Meyer-Losic et al., Clin Cancer Res., 2008, 2145-53). Esto tiene varios aspectos positivos, por ejemplo, una reducción de las posibles reacciones secundarias y una reducción de los costes.

Preferiblemente, la dosis (por kg de peso corporal) está en el intervalo de hasta 10 mmol/kg, preferiblemente hasta 1 mmol/kg, más preferiblemente hasta 100 |imol/kg, incluso más preferiblemente hasta 10 |imol/kg, incluso más preferiblemente hasta 1 |imol/kg, incluso más preferiblemente hasta 100 nmol/kg, lo más preferiblemente hasta 50 nmol/kg.

Por tanto, el intervalo de dosis puede ser preferiblemente de desde aproximadamente 1 pmol/kg hasta aproximadamente 1 mmol/kg, desde aproximadamente 10 pmol/kg hasta aproximadamente 0,1 mmol/kg, desde aproximadamente 10 pmol/kg hasta aproximadamente 0,01 mmol/kg, desde aproximadamente 50 pmol/kg hasta aproximadamente 1 |imol/kg, desde aproximadamente 100 pmol/kg hasta aproximadamente 500 nmol/kg, desde aproximadamente 200 pmol/kg hasta aproximadamente 300 nmol/kg, desde aproximadamente 300 pmol/kg hasta aproximadamente 100 nmol/kg, desde aproximadamente 500 pmol/kg hasta aproximadamente 50 nmol/kg, desde aproximadamente 750 pmol/kg hasta aproximadamente 30 nmol/kg, desde aproximadamente 250 pmol/kg hasta aproximadamente 5 nmol/kg, desde aproximadamente 1 nmol/kg hasta aproximadamente 10 nmol/kg, o una combinación de dos cualesquiera de dichos valores.

En este contexto, la prescripción de un tratamiento, por ejemplo, las decisiones sobre la dosificación cuando se usa la composición farmacéutica anterior, están normalmente bajo la responsabilidad de los médicos generales y otros médicos, y generalmente tienen en cuenta el trastorno que va a tratarse, el estado del paciente individual, el sitio de administración, el método de administración y otros factores conocidos por los médicos. Pueden encontrarse ejemplos de las técnicas y los protocolos mencionados anteriormente en REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCIES, 16a edición, Osol, A. (ed), 1980. Por consiguiente, una “cantidad segura y eficaz”, tal como se definió anteriormente, para los componentes de las composiciones farmacéuticas, tal como se usan según la presente invención, significa una cantidad de todos o cada uno de estos componentes que es suficiente para inducir significativamente una modificación positiva de la cistitis. Sin embargo, al mismo tiempo, una “cantidad segura y eficaz” es lo suficientemente pequeña como para evitar efectos secundarios graves, es decir, para permitir una relación sensata entre ventaja y riesgo. La determinación de estos límites se encuentra normalmente dentro del alcance del juicio médico sensato. Una “cantidad segura y eficaz” de un componente de este tipo variará en relación con el estado particular que va a tratarse y también con la edad y el estado físico del paciente que va a tratarse, la gravedad del estado, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia acompañante, el portador farmacéuticamente aceptable particular usado y factores similares, dentro del conocimiento y la experiencia del médico tratante. Las composiciones farmacéuticas según la invención pueden usarse según la invención con fines médicos humanos y también veterinarios.

La composición farmacéutica, tal como se usa según la presente invención, puede comprender adicionalmente, además de una de estas sustancias, un portador, excipiente, tampón, estabilizante u otros materiales farmacéuticamente aceptables (compatibles) bien conocidos por los expertos en la técnica.

En este contexto, la expresión “portador farmacéuticamente aceptable (compatible)” incluye preferiblemente la base líquida o no líquida de la composición. El término “compatible” significa que los constituyentes de la composición farmacéutica, tal como se usa en el presente documento, pueden mezclarse con el componente farmacéuticamente activo, tal como se definió anteriormente, y con otro componente de tal manera que no se produzca ninguna interacción que reduciría sustancialmente la eficacia farmacéutica de la composición en las condiciones de uso habituales. Por supuesto, los portadores farmacéuticamente aceptables deben tener una pureza suficientemente alta y una toxicidad suficientemente baja para que sean adecuados para la administración a una persona que va a tratarse.

51 la composición farmacéutica, tal como se usa en el presente documento, se proporciona en forma líquida, el portador farmacéuticamente aceptable comprenderá normalmente uno o más portadores líquidos farmacéuticamente aceptables (compatibles). La composición puede comprender, como portadores líquidos farmacéuticamente aceptables (compatibles), por ejemplo, agua libre de pirógenos; solución salina isotónica o disoluciones (acuosas) tamponadas, por ejemplo, fosfato, disoluciones tamponadas con citrato, aceites vegetales tales como, por ejemplo, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de Theobroma; polioles tales como, por ejemplo, polipropilenglicol, glicerol, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico. Particularmente para la inyección de la composición farmacéutica, tal como se usa en el presente documento, puede usarse un tampón, preferiblemente un tampón acuoso.

Si la composición farmacéutica, tal como se usa en el presente documento, se proporciona en forma sólida, el portador farmacéuticamente aceptable comprenderá normalmente uno o más portadores sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles). La composición puede comprender, como portadores sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles), por ejemplo, una o más cargas o diluyentes sólidos o líquidos compatibles, o también pueden usarse compuestos encapsulantes, que son adecuados para la administración a una persona. Algunos ejemplos de tales portadores sólidos farmacéuticamente aceptables (compatibles) son, por ejemplo, azúcares tales como, por ejemplo, lactosa, glucosa y sacarosa; almidones tales como, por ejemplo, almidón de maíz o almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa, acetato de celulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; sebo; deslizantes sólidos tales como, por ejemplo, ácido esteárico, estearato de magnesio; sulfato de calcio.

La naturaleza precisa del portador u otro material farmacéuticamente aceptable (compatible) puede depender de la vía de administración. Por tanto, la elección de un portador farmacéuticamente aceptable (compatible) puede determinarse en principio por el modo en que se administra la composición farmacéutica, tal como se usa según la invención. La composición farmacéutica, tal como se usa según la invención, puede administrarse, por ejemplo, por vía sistémica. Las vías de administración incluyen, por ejemplo, vías parenterales (por ejemplo, mediante inyección), tales como las vías intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica o transdérmica, las vías enterales, tales como las vías oral o rectal, las vías tópicas, tales como las vías nasal o intranasal, u otras vías, tales como las vías epidérmicas o administración en parches.

La cantidad adecuada de la composición farmacéutica que va a usarse puede determinarse mediante experimentos de rutina con modelos animales. Tales modelos incluyen modelos de conejo, oveja, ratón, rata, perro y primates no humanos. Las formas de dosis unitaria preferidas para inyección incluyen disoluciones estériles de agua, solución salina fisiológica o mezclas de las mismas. El pH de tales disoluciones debe ajustarse a aproximadamente 7,4. Los portadores adecuados para inyección incluyen hidrogeles, dispositivos para la liberación controlada o retardada, poli(ácido láctico) y matrices de colágeno. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para aplicación tópica incluyen aquellos que son adecuados para su uso en lociones, cremas, geles. Si el compuesto va a administrarse por vía oral, los comprimidos y las cápsulas son la forma de dosis unitaria preferida. Los portadores farmacéuticamente aceptables para la preparación de formas de dosis unitaria, que pueden usarse para administración oral, se conocen bien en la técnica anterior. La elección de los mismos dependerá de consideraciones secundarias, tales como el sabor, los costes y la capacidad de almacenamiento, que no son críticas para los fines de la presente invención y pueden realizarse sin dificultad por un experto en la técnica.

Las composiciones farmacéuticas para administración oral pueden estar en forma de comprimido, cápsula, polvo o líquido. Un comprimido puede incluir un portador sólido, tal como se definió anteriormente, tal como gelatina y opcionalmente un adyuvante. Las composiciones farmacéuticas líquidas para administración oral generalmente pueden incluir un portador líquido, tal como se definió anteriormente, tal como agua, vaselina, aceites animales o vegetales, aceite mineral o aceite sintético. Pueden incluirse solución salina fisiológica, dextrosa u otra disolución sacárica, o glicoles tales como etilenglicol, propilenglicol o polietilenglicol.

Para inyección intravenosa, cutánea o subcutánea, o inyección en el sitio de la aflicción, el principio activo estará en forma de una disolución acuosa parenteralmente aceptable que esté libre de pirógenos y tenga un pH, una isotonicidad y una estabilidad adecuados. Los expertos en la técnica pueden preparar disoluciones adecuadas usando, por ejemplo, vehículos isotónicos tales como inyección de cloruro de sodio, inyección de Ringer, inyección de lactato de Ringer. Pueden incluirse conservantes, estabilizantes, tampones, antioxidantes y/u otros aditivos, según se requiera. Ya sea un polipéptido, un péptido o una molécula de ácido nucleico, otro compuesto farmacéuticamente útil según la presente invención que va a administrarse a un individuo, la administración es preferiblemente en una “cantidad profilácticamente eficaz o una “cantidad terapéuticamente eficaz” (según sea el caso), siendo esta suficiente para mostrar un beneficio para el individuo. La cantidad real administrada y la velocidad y el transcurso temporal de la administración dependerán de la naturaleza y la gravedad de lo que esté tratándose. La prevención y/o el tratamiento de la cistitis, tal como se define en el presente documento, incluye normalmente la administración de una composición farmacéutica, tal como se definió anteriormente. El término “modular” incluye la supresión de la expresión de JNK cuando se sobreexpresa en la cistitis. También incluye la supresión de la fosforilación de c-jun, ATF2 o NFAT4 en la cistitis, por ejemplo, mediante el uso de al menos un péptido inhibidor de JNK según SEQ ID NO: 11, como inhibidor competitivo del sitio de unión natural a c-jun, ATF2 y NFAT4 en una célula. El término “modular” también incluye la supresión de complejos hetero y homoméricos de factores de transcripción formados por c-jun, ATF2 o NFAT4 y sus parejas relacionadas, tales como, por ejemplo, el complejo AP-1 que está formado por c-jun, AFT2 y c-fos. Cuando la cistitis está asociada con la sobreexpresión de JNK, tales secuencias inhibidoras de JNK supresoras pueden introducirse en una célula. En algunos casos, “modular” puede incluir el aumento de la expresión de JNK, por ejemplo, mediante el uso de un anticuerpo específico del péptido IB que bloquea la unión de un péptido IB a JNK, evitando así la inhibición de JNK por el péptido relacionado con IB. La prevención y/o el tratamiento de un sujeto con la composición farmacéutica, tal como se dio a conocer anteriormente, puede lograrse normalmente administrando (in vivo) una cantidad (“terapéuticamente eficaz”) de dicha composición farmacéutica a un sujeto, en el que el sujeto puede ser, por ejemplo, cualquier mamífero, por ejemplo, un ser humano, un primate, un ratón, una rata, un perro, un gato, una vaca, un caballo o un cerdo. El término “terapéuticamente eficaz” significa que el componente activo de la composición farmacéutica está en una cantidad suficiente como para mejorar la cistitis.

Por consiguiente, el péptido inhibidor de JNK según SEQ ID NO: 11 puede usarse para el tratamiento de la cistitis, por ejemplo, modulando las rutas de señalización de JNK activadas.

Sin embargo, los péptidos definidos anteriormente también pueden estar codificados por ácidos nucleicos, que luego pueden formar parte de las composiciones farmacéuticas de la invención, por ejemplo, para su uso en terapia génica. En este contexto, la terapia génica se refiere a la terapia que se realiza mediante la administración de un ácido nucleico específico, tal como se definió anteriormente, a un sujeto. En esta realización de la presente invención, el ácido nucleico produce su(s) péptido(s) codificado(s), que luego sirve(n) para ejercer un efecto terapéutico modulando la función de la enfermedad o el trastorno. Puede usarse cualquiera de los métodos relacionados con la terapia génica disponibles en la técnica en la práctica de la presente invención (véase, por ejemplo, Goldspiel etal., 1993. Clin Pharm 12: 488-505).

En una realización preferida, el ácido nucleico, tal como se definió anteriormente y tal como se usa para terapia génica, forma parte de un vector de expresión que codifica para y expresa el péptido inhibidor de JNK que comprende o consiste en SEQ ID NO: 11. En una realización específica, un vector de expresión de este tipo posee un promotor que está operativamente unido a la(s) región/regiones codificante(s) de una secuencia inhibidora de JNK. El promotor puede definirse tal como anteriormente, por ejemplo, inducible o constitutivo y, opcionalmente, específico de tejido.

En otra realización específica, una molécula de ácido nucleico, tal como se definió anteriormente, se usa para terapia génica, en la que las secuencias codificantes de la molécula de ácido nucleico (y cualquier otra secuencia deseada de la misma), tal como se definieron anteriormente, están flanqueadas por regiones que fomentan la recombinación homóloga en un sitio deseado dentro del genoma, proporcionando así la expresión intracromosómica de estos ácidos nucleicos (véase, por ejemplo, Koller y Smithies, 1989. Proc Natl Acad Sci USA 86: 8932-8935).

La administración del ácido nucleico, tal como se definió anteriormente según la invención, a un paciente con el propósito de terapia génica, en particular en el contexto de la cistitis, puede ser o bien directa (es decir, el paciente está directamente expuesto al ácido nucleico o al vector que contiene el ácido nucleico) o bien indirecta (es decir, las células se transforman en primer lugar con el ácido nucleico in vitro, luego se trasplantan al paciente). Estos dos enfoques se conocen, respectivamente, como terapia génica in vivo o ex vivo. En una realización específica de la presente invención, se administra directamente un ácido nucleico in vivo, donde se expresa para producir el producto codificado. Esto puede lograrse mediante cualquiera de los numerosos métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, construir el ácido nucleico como parte de un vector de expresión de ácido nucleico apropiado y administrarlo de tal manera que se vuelva intracelular (por ejemplo, mediante infección usando un vector retroviral, u otro vector, defectuoso o atenuado; véase la patente estadounidense n.° 4.980.286); inyectar directamente ADN desnudo; usar bombardeo de micropartículas (por ejemplo, un “cañón de genes”; Biolistic, DuPont); recubrir los ácidos nucleicos con lípidos; usar receptores de superficie celular/agentes de transfección asociados; encapsular en liposomas, micropartículas o microcápsulas; administrarlo ligado a un péptido que se sabe que entra en el núcleo; o administrándolo ligado a un ligando predispuesto a endocitosis mediada por receptor (véase, por ejemplo, Wu y Wu, 1987. J Biol Chem 262: 4429-4432), que pueden usarse para “seleccionar como diana” tipos de células que expresan específicamente los receptores de interés.

Un enfoque adicional para la terapia génica en la práctica de la presente invención implica la transferencia de un gen (que comprende un ácido nucleico, tal como se definió anteriormente) a células en cultivo de tejidos in vitro mediante métodos tales como electroporación, lipofección, transfección mediada por fosfato de calcio o infección viral. Generalmente, el método de transferencia incluye la transferencia concomitante de un marcador seleccionable a las células. A continuación, las células se colocan bajo presión de selección (por ejemplo, resistencia a antibióticos) para facilitar el aislamiento de aquellas células que han absorbido y están expresando el gen transferido. A continuación, esas células se administran a un paciente. En una realización específica, antes de la administración in vivo de la célula recombinante resultante, el ácido nucleico se introduce en una célula mediante cualquier método conocido en la técnica, incluyendo, por ejemplo, transfección, electroporación, microinyección, infección con un vector viral o bacteriófago que contenga las secuencias de ácido nucleico de interés, fusión celular, transferencia de genes mediada por cromosomas, transferencia de genes mediada por microcélulas, fusión de esferoplasto y métodos similares, que garanticen que las funciones fisiológicas y de desarrollo necesarias de las células receptoras no se vean interrumpidas por la transferencia. Véase, por ejemplo, Loeffler y Behr, 1993. Meth Enzymol 217: 599 618. La técnica elegida debe permitir la transferencia estable del ácido nucleico a la célula, de modo que la célula pueda expresar el ácido nucleico. Preferiblemente, el ácido nucleico transferido es heredable y expresable por la progenie celular.

En realizaciones preferidas de la presente invención, las células recombinantes resultantes pueden administrarse a un paciente mediante diversos métodos conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, inyección de células epiteliales (por ejemplo, por vía subcutánea), aplicación de células cutáneas recombinantes como un injerto de piel en el paciente e inyección intravenosa de células sanguíneas recombinantes (por ejemplo, células madre o progenitoras hematopoyéticas). La cantidad total de células que se prevé usar depende del efecto deseado y del estado del paciente, y puede ser determinada por un experto en la técnica. Las células en las que puede introducirse un ácido nucleico con el propósito de terapia génica abarcan cualquier tipo deseado de célula disponible y pueden ser xenógenas, heterógenas, singénicas o autógenas. Los tipos de células incluyen células diferenciadas, tales como células epiteliales, células endoteliales, queratinocitos, fibroblastos, células musculares, hepatocitos y células sanguíneas, o diversas células madre o progenitoras, en particular, células del músculo cardíaco embrionario, células madre del hígado (publicación de patente internacional WO 94/08598), células madre neuronales (Stemple y Anderson, 1992, Cell 71: 973-985), células madre o progenitoras hematopoyéticas, por ejemplo, obtenidas de la médula ósea, sangre del cordón umbilical, sangre periférica o hígado fetal. En una realización preferida, las células usadas para la terapia génica son autólogas del paciente.

Alternativa y/o adicionalmente, para el tratamiento de la cistitis, pueden usarse terapias de direccionamiento para administrar los ácidos nucleicos y/o péptidos inhibidores de JNK, tal como se definieron anteriormente, más específicamente a determinados tipos de células, mediante el uso de sistemas de direccionamiento tales como un anticuerpo (de direccionamiento) o ligandos específicos de células. Los anticuerpos usados para el direccionamiento son normalmente específicos para las proteínas de superficie celular de las células asociadas con cualquiera de las enfermedades que se definen a continuación. A modo de ejemplo, estos anticuerpos pueden dirigirse a anticuerpos de superficie celular tales como, por ejemplo, proteínas de superficie asociadas a células B tales como proteína DR de CMH de clase II, CD18 (cadena beta de LFA-1), CD45Ro , CD40 o Bgp95, o proteínas de superficie celular seleccionadas de, por ejemplo, CD2, CD4, CD5, CD7, CD8, CD9, CD10, CD13, CD16, CD19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD25, CD30, CD33, CD34, CD38, CD39, CD4, CD43, CD45, CD52, CD56, CD68, CD71 y CD138. Los constructos de direccionamiento pueden prepararse normalmente uniendo covalentemente los ácidos nucleicos y péptidos inhibidores de JNK, tal como se definen en el presente documento según la invención, a un anticuerpo específico para una proteína de superficie celular o uniéndose a un ligando específico de la célula. Por ejemplo, las proteínas pueden unirse a un anticuerpo de este tipo o pueden unirse al mismo mediante un enlace peptídico o mediante acoplamiento químico, reticulación. A continuación, la terapia de direccionamiento puede llevarse a cabo administrando el constructo de direccionamiento en una cantidad farmacéuticamente eficaz a un paciente mediante cualquiera de las vías de administración, tal como se definen a continuación, por ejemplo, las vías intraperitoneal, nasal, intravenosa, oral y administración en parche. Preferiblemente, los ácidos nucleicos o péptidos inhibidores de JNK, tal como se definen en el presente documento según la invención, que se unen a los anticuerpos de direccionamiento o ligandos específicos de células, tal como se definieron anteriormente, pueden liberarse in vitro o in vivo, por ejemplo, mediante hidrólisis del enlace covalente, mediante peptidasas o mediante cualquier otro método adecuado. Alternativamente, si los ácidos nucleicos o péptidos inhibidores de JNK, tal como se definen en el presente documento según la invención, están unidos a un ligando específico de células pequeñas, la liberación del ligando no puede llevarse a cabo. Si están presentes en la superficie celular, los péptidos quiméricos pueden entrar en la célula tras la actividad de su secuencia de tráfico. El direccionamiento puede ser deseable por varios motivos; por ejemplo, si los ácidos nucleicos y péptidos inhibidores de JNK, tal como se definen en el presente documento según la invención, son inaceptablemente tóxicos o si de otro modo requerirían una dosificación demasiado alta. En lugar de administrar los péptidos inhibidores de JNK, tal como se definen en el presente documento según la invención, directamente, podrían producirse en las células diana mediante la expresión a partir de un gen codificante introducido en las células, por ejemplo, a partir de un vector viral que va a administrarse. El vector viral normalmente codifica para los péptidos inhibidores de JNK, tal como se definen en el presente documento según la invención. El vector podría dirigirse a las células específicas que van a tratarse. Además, el vector podría contener elementos reguladores que son activados más o menos selectivamente por las células diana tras una regulación definida. Esta técnica representa una variante de la técnica VDEPT (terapia con profármacos enzimáticos dirigida por virus), que usa proteínas maduras en lugar de sus formas precursoras.

Alternativamente, los péptidos inhibidores de JNK, tal como se definen en el presente documento, podrían administrarse en una forma precursora mediante el uso de un anticuerpo o un virus. Estos péptidos inhibidores de JNK pueden convertirse luego en la forma activa mediante un agente activador producido en, o dirigido a, las células que van a tratarse. Este tipo de enfoque a veces se conoce como ADEPT (terapia con profármacos enzimáticos dirigida por anticuerpos) o VDEPT (terapia con profármacos enzimáticos dirigida por virus); el primero implica dirigir el agente activador a las células mediante conjugación con un anticuerpo específico de la célula, mientras que el segundo implica producir el agente activador, es decir, el péptido inhibidor de JNK, en un vector mediante la expresión a partir de ADN codificante en un vector viral (véanse, por ejemplo, los documentos EP-A-415731 y WO 90/07936).

Descripción de las figuras

Las figuras 1A-C son diagramas que muestran alineamientos de regiones de dominio JBD conservadas en los factores de transcripción indicados. Las secuencias inhibidoras de JNK usadas en el presente documento se identificaron llevando a cabo alineamientos de secuencias. Los resultados de este alineamiento se muestran a modo de ejemplo en las figuras 1A-1C. La figura 1A representa la región de mayor homología entre los JBD de IB1, IB2, c-Jun y ATF2. El panel B representa la secuencia de aminoácidos de los JBD de L-IB1 (s) y L-IB1 a modo de comparación. Los residuos completamente conservados se indican con asteriscos, mientras que los residuos que se cambiaron a Ala en el vector GFP-JBD23Mut se indican con círculos abiertos. La figura 1C muestra las secuencias de aminoácidos de proteínas quiméricas que incluyen una secuencia inhibidora de JNK y una secuencia de tráfico. En el ejemplo mostrado, la secuencia de tráfico se deriva del polipéptido TAT del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y la secuencia del inhibidor de JNK se deriva de un polipéptido IB1 (s). Las secuencias de ser humano, ratón y rata son idénticas en los paneles B y C.

La figura 2 es un diagrama que muestra secuencias de péptidos de fusión TAT-IB genéricos de ser humano, ratón y rata.

La figura 3 representa los resultados de la inhibición de la actividad JNK endógena en células HepG2 usando péptidos de fusión según las SEQ ID NO: 9 y 11 en un enfoque de un pocillo. Tal como puede observarse en la figura 3, particularmente el panel d en la figura 3, D-TAT-IB1(s) según SEQ ID NO: 11 (en este caso abreviado como D-JNKI) inhibe eficazmente la actividad JNK, incluso mejor que L-TAT-IB1(s) según SEQ ID NO: 9 (en este caso abreviado como L-JNKI).

Ejemplos

Ejemplo 1: identificación de secuencias inhibidoras de JNK

Las secuencias de aminoácidos importantes para la interacción eficaz con JNK se identificaron mediante alineamientos de secuencias entre los JBD de dominio de unión a JNK conocidos. Una comparación de secuencias entre los JBD de IB1 [SEQ ID NO: 13], IB2 [SEQ ID NO: 14], c-Jun [SEQ ID NO: 15] y ATF2 [SEQ ID NO: 16] definió una secuencia de 8 aminoácidos débilmente conservada (véase la figura 1A). Dado que los JBD de IB1 e IB2 son aproximadamente 100 veces más eficaces que c-Jun o ATF2 en la unión de JNK (Dickens et al. Science 277: 693 (1997), se razonó que los residuos conservados entre IB1 e IB2 deben ser importantes para conferir la máxima unión. La comparación entre los JBD de IB1 e IB2 definió dos bloques de siete y tres aminoácidos que están muy conservados entre las dos secuencias.

Estos dos bloques están contenidos dentro de una secuencia peptídica de 19 aminoácidos en L-IB1 (s) [SEQ ID NO: 1] y también se muestran a modo de comparación en una secuencia peptídica de 23 aa derivada de IB1 [SEQ ID NO: 17]. Estas secuencias se muestran en la figura 1B, los guiones en la secuencia de L-IB1 indican un hueco en la secuencia para alinear los residuos conservados con L-IB1(s).

Ejemplo 2: preparación de proteínas de fusión inhibidoras de JNK

Las proteínas de fusión inhibidoras de JNK según SEQ ID NO: 9 (no según la invención) se sintetizaron uniendo covalentemente el extremo C-terminal de SEQ ID NO: 1 a un péptido portador N-terminal de 10 aminoácidos de longitud derivado de TAT4g57 del VIH (Vives et al., J Biol. Chem. 272: 16010 (1997)) según SEQ ID NO: 5 a través de un ligador que consiste en dos residuos de prolina. Este ligador se usó para permitir la máxima flexibilidad y evitar cambios estructurales secundarios no deseados. Los constructos básicos también se prepararon y se denominaron L-IB1(s) (SEQ ID NO: 1) y L-TAT [SEQ ID NO: 5], respectivamente.

Por consiguiente, se sintetizaron péptidos retroinversos totalmente D según SEQ ID NO: 11 según la presente invención. Los constructos básicos también se prepararon y se denominaron D-IB1(s) [SEQ ID NO: 2] y D-TAT [SEQ ID NO: 6], respectivamente.

Todos los péptidos de fusión D y L según las SEQ ID NO: 9, 10, 11 y 12 se produjeron mediante síntesis clásica de Fmock y se analizaron adicionalmente mediante espectrometría de masas. Finalmente, se purificaron mediante HPLC. Para determinar los efectos del ligador de prolina, se produjeron dos tipos de péptido TAT, uno con y otro sin dos prolinas. La adición de las dos prolinas no pareció modificar la entrada o la ubicación del péptido TAT dentro de las células. Los péptidos genéricos que muestran los residuos de aminoácidos conservados se proporcionan en la figura 2.

Ejemplo 3: inhibición de la muerte celular por JBD19 (no según la invención)

Se estudiaron los efectos de la secuencia de JBD de 19 aa de longitud de IB1 (s) sobre las actividades biológicas de JNK. La secuencia de 19 aa se unió N-terminal a la proteína verde fluorescente (constructo GFP JBD19) y se evaluó el efecto de este constructo sobre la apoptosis de células zibeta pancreáticas inducida por IL1. Este modo de apoptosis se mostró previamente bloqueado por transfección con JBD1-280 mientras que los inhibidores específicos de ERK1/2 o p38, tal como se conocen en la técnica, no protegen.

Los oligonucleótidos correspondientes a JBD19 y que comprenden una secuencia conservada de 19 aminoácidos, así como una secuencia mutada en las regiones completamente conservadas, se sintetizaron y se insertaron direccionalmente en los sitios EcoRI y SalI del vector pEGFP-N1 que codifica para la proteína verde fluorescente (GFP) (de Clontech). Se cultivaron células ziTC-3 productoras de insulina en medio RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal al 10%, estreptomicina 100 |ig/ml, 100 unidades/ml de penicilina y glutamina 2 mM. Se transfectaron células cTC-3 productoras de insulina con los vectores indicados y se añadió IL-1c (10 ng/ml) al medio de cultivo celular. Se contó el número de células apoptóticas a las 48 horas después de la adición de IL-1zi usando un microscopio de fluorescencia invertido. Las células apoptóticas se discriminaron de las células normales por la característica “vesiculación” del citoplasma y se contaron después de dos días.

GFP es un vector de expresión de proteína verde fluorescente usado como control; JBD19 es el vector que expresa una GFP quimérica unida a la secuencia de 19 aa derivada del JBD de IB1; JBD19Mut es el mismo vector que GFP-JBD19, pero con un JBD mutado en cuatro residuos conservados tal como se muestra en la figura 1B; y JBD1-280 es el vector GFP unido a todo el JBD (aa 1-280). El constructo que expresa GFP-JBD19 previno la apoptosis de células pancreáticas^^ inducidas por IL-1cc tan eficazmente como todo el JBD1-280.

Como controles adicionales, las secuencias mutadas en residuos de IB1 totalmente conservados tenían una capacidad muy disminuida para prevenir la apoptosis.

Ejemplo 4: importación celular de péptidos TAT-IB1(s)

Se evaluó la capacidad de las formas enantioméricas L y D de los péptidos TAT y TAT-IB1(s) (“péptidos TAT-IB”) para entrar en las células. Los péptidos L-TAT, D-TAT, L-TAT-IB1(s) (todos no según la invención) y D-TAT-IB1(s) (según la invención) [SEQ ID NO: 5, 6, 9 y 11, respectivamente] se marcaron mediante la adición N-terminal de un residuo de glicina conjugado con fluoresceína. Se añadieron péptidos marcados (1 |iM) a cultivos de células cTC-3, que se mantuvieron tal como se describe en el ejemplo 3. En momentos predeterminados, las células se lavaron con PBS y se fijaron durante cinco minutos en metanol-acetona (1:1) helado antes de examinarse bajo un microscopio de fluorescencia. Se usó BSA marcada con fluoresceína (1 |iM, 12 moles/mol de BSA) como control. Los resultados demostraron que todos los péptidos marcados con fluoresceína anteriores habían entrado de manera eficiente y rápida (menos de cinco minutos) en las células una vez añadidos al medio de cultivo. Por el contrario, la albúmina sérica bovina marcada con fluoresceína (BSA 1 |iM, 12 moles de fluoresceína/mol de BSA) no entró en las células.

Un estudio del transcurso del tiempo indicó que la intensidad de la señal fluorescente para los péptidos L-enantioméricos disminuyó en un 70% después de un periodo de 24 horas. Hubo poca o ninguna señal presente a las 48 horas. Por el contrario, D-TAT y D-TAT-IB1(s) eran extremadamente estables dentro de las células.

Las señales fluorescentes de estos péptidos retroinversos totalmente D eran todavía muy fuertes 1 semana después, y la señal sólo disminuyó ligeramente a las 2 semanas después del tratamiento.

Ejemplo 5: inhibición in vitro de la fosforilación de c-JUN, ATF2 y Elk1

Se investigaron los efectos de los péptidos sobre la fosforilación mediada por JNK de sus factores de transcripción diana in vitro. Se produjeron JNK1, JNK2 y JNK3 recombinantes y no activadas usando un kit de lisado de reticulocitos de conejo TRANSCRIPTION AND TRANSLATION (Promega) y se usaron en ensayos de cinasa en fase sólida con c-Jun, ATF2 y Elk1, o bien solos o bien fusionados con glutatión-S-transferasa (GST), como sustratos. Se realizaron estudios de dosis-respuesta en los que se mezclaron péptidos L-TAT o L-TAT-IB1(s) (0-25 |iM; no según la invención) con las cinasas JNK1, JNK2 o JNK3 recombinantes en tampón de reacción (Tris-acetato 20 mM, EGTA 1 mM, fosfato de p-nitrofenilo (pNPP) 10 mM, pirofosfato de sodio 5 mM, p-glicerofosfato 10 mM, ditiotreitol 1 mM) durante 20 minutos. Las reacciones de la cinasa se iniciaron luego mediante la adición de MgCh 10 mM y 5 pCi de 33P-c-dATP y 1 |ig de GST-Jun (aa 1-89), GST-AFT2 (aa 1-96) o GST-ELK1 (aa 307-428). Las proteínas de fusión con GST se adquirieron de Stratagene (La Jolla, CA).

También se añadieron a la mezcla diez |il de perlas de glutatión-agarosa. A continuación, los productos de reacción se separaron mediante SDS-PAGE en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 10%. Los geles se secaron y posteriormente se expusieron a películas de rayos X (Kodak). Se observó una inhibición casi completa de la fosforilación de c-Jun, ATF2 y Elk1 por JNK a dosis de péptido TAT-IB(s) tan bajas como de 2,5 |iM. Sin embargo, una marcada excepción fue la ausencia de inhibición de TAT-IB(s) de la fosforilación por JNK3 de Elk1. En general, el péptido TAT-IB1(s) mostró efectos superiores en la inhibición de la fosforilación por la familia JNK de sus factores de transcripción diana. La capacidad de los péptidos D-TAT, D-TAT-IB1(s) y L-TAT-IB1(s) (estudio de dosificación de 0-250 |iM) para inhibir la fosforilación de GST-Jun (aa 1-73) por JNK1, JNK2, y JNK3 recombinantes se analizó tal como se describió anteriormente. En general, el péptido D-TAT-IB1(s) disminuyó la fosforilación de c-Jun mediada por JNK, pero a niveles aproximadamente de 10 a 20 veces menos eficientemente que L-TAT-IB1(s).

Ejemplo 6: inhibición de la fosforilación de c-JUN por JNK activadas

Los efectos de los péptidos L-TAT o L-TAT-IB1(s), tal como se definen en el presente documento (no según la invención), sobre las JNK activadas por estímulos estresantes se evaluaron usando GST-Jun para eliminar las JNK de las células HeLa irradiadas con luz UV o células PTC tratadas con IL-1czi. Las células PTC se cultivaron tal como se describió anteriormente. Las células HeLa se cultivaron en medio DMEM complementado con suero bovino fetal al 10%, estreptomicina 100 |ig/ml, 100 unidades/ml de penicilina y glutamina 2 mM. Una hora antes de usarse para la preparación del extracto celular, las células PTC se activaron con IL-1czi tal como se describió anteriormente, mientras que las células HeLa se activaron con luz UV (20 J/m2). Se prepararon extractos celulares a partir de células HeLa de control irradiadas con luz UV y células ziTC-3 tratadas con IL-1zi raspando los cultivos celulares en tampón de lisis (Tris-acetato 20 mM, EGTA 1 mM, Triton X-100 al 1%, fosfato de p-nitrofenilo 10 mM, pirofosfato de sodio 5 mM, glicerofosfato 10 mM, ditiotreitol 1 mM). Los residuos se eliminaron mediante centrifugación durante cinco minutos a 15.000 rpm en un rotor SS-34 Beckman. Se incubaron extractos de cien |ig durante una hora a temperatura ambiente con un |ig de GST-jun (aminoácidos 1-89) y 10 |il de perlas de glutatiónagarosa (Sigma). Después de cuatro lavados con el tampón de raspado, las perlas se resuspendieron en el mismo tampón complementado con péptidos L-TAT o L-TAT-IB1(s) (25 |iM; no según la invención) durante 20 minutos. Las reacciones de cinasa se iniciaron luego mediante la adición de MgCh 10 mM y 5 pCi de 33P-gamma-dATP y se incubó durante 30 minutos a 30°C.

A continuación, los productos de reacción se separaron mediante SDS-PAGE en un gel desnaturalizante de poliacrilamida al 10%. Los geles se secaron y posteriormente se expusieron a películas de rayos X (Kodak). Los péptidos TAT-IB(s) impidieron eficazmente la fosforilación de c-Jun por las JNK activadas en estos experimentos.

Ejemplo 7: inhibición in vivo de la fosforilación de c-JUN por péptidos TAT-IB(s) tal como se definen en el presente documento

Para determinar si los péptidos permeables a las células, tal como se definen en el presente documento, podrían bloquear la señalización de JNK in vivo, se usó un sistema GAL4 heterólogo. Las células HeLa, cultivadas tal como se describió anteriormente, se transfectaron conjuntamente con el vector indicador 5xGAL-LUC junto con el constructo de expresión GAL-Jun (Stratagene) que comprende el dominio de activación de c-Jun (aminoácidos 1-89) unido al dominio de unión a ADN de GAL4. La activación de JNK se logró mediante la transfección conjunta de vectores que expresan las cinasas directamente aguas arriba MKK4 y MKK7 (véase Whitmarsh et al., Science 285: 1573 (1999)). Brevemente, se transfectaron 3x105 células con los plásmidos en placas de 3,5 cm usando DOTAP (Boehringer Mannheim) siguiendo las instrucciones del fabricante. Para los experimentos que implican GAL-Jun, se transfectaron 20 ng del plásmido con 1 |ig del plásmido indicador pFR-Luc (Stratagene) y 0,5 |ig de plásmidos que expresan MKK4 o MKK7. Tres horas después de la transfección, se cambiaron los medios celulares y se añadieron péptidos TAT y TAT-IB1(s) (1 |iM). Las actividades de luciferasa se midieron 16 horas después usando el “sistema indicador dual” de Promega después de la normalización con respecto al contenido de proteína. La adición del péptido TAT-IB1(s) bloqueó la activación de c-Jun después de la activación de JNK mediada por MKK4 y MKK7. Debido a que las células HeLa expresan las isoformas JNK1 y JNK2 pero no JNK3, se transfectaron las células con JNK3. De nuevo, el péptido TAT-IB(s) inhibió la activación de c-Jun mediada por JNK2.

Ejemplo 8: síntesis de péptidos IB(s) retroinversos totalmente D y variantes de los mismos

Los péptidos inhibidores de JNK de la invención son un péptido de aminoácidos totalmente D sintetizado a la inversa para evitar la proteólisis natural (es decir, péptido retroinverso totalmente D). El péptido retroinverso totalmente D de la invención proporcionaría un péptido con propiedades funcionales similares al péptido nativo, en el que los grupos laterales de los aminoácidos componentes corresponderían al alineamiento del péptido nativo, pero conservarían una estructura principal resistente a proteasas.

Los péptidos retroinversos de la invención son análogos sintetizados usando D-aminoácidos uniendo los aminoácidos en una cadena peptídica de manera que la secuencia de aminoácidos en el análogo peptídico retroinverso sea exactamente opuesta a la del péptido seleccionado que sirve como modelo. Para ilustrar, si la proteína TAT que se produce de manera natural (formada por L-aminoácidos) tiene la secuencia GRKKRRQRRR [SEQ ID NO: 5], el análogo peptídico retroinverso de este péptido (formado por D-aminoácidos) tendría la secuencia RRRQRRKKRG [SEQ ID NO: 6]. Los procedimientos para sintetizar una cadena de D-aminoácidos para formar los péptidos retroinversos se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Jameson et al., Nature, 368, 744-746 (1994); Brady et al., Nature, 368, 692-693 (1994); Guichard et al., J. Med. Chem. 39, 2030-2039 (1996)). Específicamente, los retropéptidos según las SEQ ID NO 2, 4, 6, 8, 11-12, 18, 20, 22 y 25-26 se produjeron mediante síntesis clásica de F-mock y se analizaron adicionalmente mediante espectrometría de masas. Finalmente, se purificaron mediante HPLC.

Dado que un problema inherente con los péptidos nativos es la degradación por proteasas naturales y la inmunogenicidad inherente, los compuestos heterobivalentes o heteromultivalentes de esta invención se prepararán para incluir el “isómero retroinverso” del péptido deseado. Por tanto, proteger el péptido de la proteólisis natural debería aumentar la eficacia del compuesto heterobivalente o heteromultivalente específico, tanto prolongando la semivida como disminuyendo el grado de respuesta inmunitaria destinada a destruir activamente los péptidos.

Ejemplo 9: actividad biológica a largo plazo de péptidos IB(s) retroinversos totalmente D

Se predice la actividad biológica a largo plazo para el heteroconjugado peptídico que contiene D-TAT-IB(s) retroinverso (véanse las secuencias quiméricas anteriores) en comparación con el análogo de L-aminoácidos nativo debido a la protección del péptido D-TAT-IB(s) de la degradación por proteasas nativas, tal como se muestra en el ejemplo 5.

Se analizó la inhibición de la muerte de células beta pancreáticas inducida por IL-1c z i por el péptido D-TAT-IB1(s). Las células c TC-3 se incubaron tal como se describió anteriormente durante 30 minutos con una sola adición de los péptidos indicados (1 |iM), luego se añadió IL-1 (10 ng/ml).

A continuación, se contaron las células apoptóticas después de dos días de incubación con IL-1znz mediante el uso de yoduro de propidio y tinción nuclear con Hoechst 33342. Se contaron un mínimo de 1.000 células para cada experimento. Se indica el error estándar de las medias (EEM), n = 5. El péptido D-TAT-IB1 disminuyó la apoptosis inducida por IL-1 en un grado similar al de los péptidos L-TAT-IB.

También se analizó la inhibición a largo plazo de la muerte celular inducida por IL-1P por el péptido D-TAT-IB1. Las células c TC-3 se incubaron tal como antes durante 30 minutos con una sola adición de los péptidos indicados (1 |iM), luego se añadió IL-1znz (10 ng/ml), seguido de la adición de la citocina cada dos días. A continuación, se contaron las células apoptóticas después de 15 días de incubación con IL-1 mediante el uso de yoduro de propidio y tinción nuclear con Hoechst 33342. Obsérvese que una sola adición del péptido TAT-IB1 no confiere protección a largo plazo. Se contaron un mínimo de 1.000 células para cada experimento. Como resultado, D-TAT-IB1(s), pero no L-TAT-IBI(s), pudo conferir protección a largo plazo (15 días).

Ejemplo 10: inhibición de la actividad JNK endógena en células HepG2 usando un enfoque de pocilio todo en uno (véase la figura 3).

Se sembraron células HepG2 a 3.000 células/pocillo el día anterior al experimento. A continuación, se añadieron concentraciones crecientes de interleucina-1zi [IL-1betazv)] o factor de necrosis tumoral z [TNFalfa] (a) para activar JNK durante 30 minutos. Las células se lisaron en Hepes 20 mM, Tween al 0,5%, pH 7,4 y se procesaron para el ensayo de JNK AlphaScreen. (b) Z' para la actividad JNK inducida por IL-1z 10 ng/ml y medida en 384 pocillos/placa (n=96). (c) Inhibición de la actividad JNK inducida por IL-1beta endógena con inhibidores químicos de JNK [estaurosporina y SP600125]. (d) Efecto de los inhibidores peptídicos L-TAT-IB1(s) según SEQ ID NO: 9 (no según la invención; en este caso abreviado como L-JNKi (v)) y D-TAT-IB1(s) según SEQ ID NO: 11 (según la invención; en este caso abreviado como D-JNKi) y JBD (corresponde a L-JNKI sin la secuencia TAT)] sobre la actividad JNK dependiente de IL-1z. Todos los paneles son representativos de tres experimentos independientes (n=3).

Métodos: Ensayo de cinasas AlphaScreen

Principio: AlphaScreen es una tecnología basada en perlas no radiactivas usada para estudiar interacciones biomoleculares en un formato de microplaca. El acrónimo ALPHA significa ensayo homogéneo de proximidad de luminiscencia amplificada. Se trata de una interacción biológica que acerca perlas “donantes” y un “aceptoras” en estrecha proximidad, luego una cascada de reacciones químicas actúa para producir una señal amplificada. Tras la excitación con láser a 680 nm, un fotosensibilizador (ftalocianina) en la perla “donante” convierte el oxígeno ambiental en un estado singlete excitado. Dentro de su semivida de 4 |is, la molécula de oxígeno singlete puede difundirse hasta aproximadamente 200 nm en disolución y, si una perla aceptora está dentro de esa proximidad, el oxígeno singlete reacciona con un derivado de tioxeno en la perla “aceptora”, generando quimioluminiscencia a 370 nm que activa además los fluoróforos contenidos en la misma perla “aceptora”. Los fluoróforos excitados emiten posteriormente luz a 520-620 nm. En ausencia de una perla aceptora, el oxígeno singlete regresa al estado fundamental y no se produce ninguna señal.

Los reactivos de cinasa (B-GST-cJun, anticuerpo anti P-cJun y JNK3 activa) se diluyeron en primer lugar en tampón de cinasa (Tris-HCl 20 mM pH 7,6, MgCh 10 mM, DTT 1 mM, Na3VO4100 |iM, Tween-20 al 0,01%) y se añadieron a los pocillos (15 |il). A continuación, las reacciones se incubaron en presencia de ATP 10 |iM durante 1 h a 23°C. La detección se realizó mediante la adición de 10 |il de mezcla de perlas (aceptor de proteína A 20 |ig/ml y donante de estreptavidina 20 |ig/ml), diluida en tampón de detección (Tris-HCl 20 mM pH 7,4, NaCl 20 mM, EDTA 80 mM, BSA al 0,3%), seguido de otra incubación de una hora a 23°C en la oscuridad. Para la medición de la actividad JNK endógena, se realizaron ensayos de cinasa tal como se describió anteriormente, excepto que la JNK3 activa se reemplazó por lisados de células y se añadieron componentes de cinasa de reacción después de la lisis de las células. Se usaron anticuerpos B-GST-cjun y P-cJun a las mismas concentraciones mientras que se usó ATP a 50 |iM en lugar de 10 |iM. La señal AlphaScreen se analizó directamente en el aparato Fusion o En Vision.

Ejemplo 11: seguridad, tolerabilidad y farmacocinética de una única infusión intravenosa de 10, 40 y 80 iig/kg de XG-102 (SEQ ID NO: 11) administrada a voluntarios varones sanos en un estudio en fase I de aumento de la dosis, aleatorizado, de doble enmascaramiento, controlado con placebo

El objetivo principal del estudio fue evaluar la seguridad y la tolerabilidad de XG-102 después de la infusión intravenosa (i.v.) de dosis únicas crecientes de XG-102 a voluntarios varones sanos. El objetivo secundario del estudio fue evaluar la farmacocinética de XG-102 después de la infusión i.v. de dosis únicas crecientes de XG-102 a voluntarios varones sanos. Las dosis se administraron como una infusión i.v. de 60 minutos. Con fines de control, se administró una infusión i.v. de placebo a los sujetos de control.

Este fue un estudio de grupo secuencial, de dosis única creciente, controlado con placebo, de doble enmascaramiento, aleatorizado, de un solo centro. Se estudiaron tres niveles de dosis de XG-102 (10, 40 y 80 |ig/kg) en orden creciente de dosis, dentro de cada grupo los sujetos fueron aleatorizados de manera que 6 sujetos recibieron XG-102 y 2 sujetos recibieron placebo. El cribado se realizó en el periodo de 3 semanas antes de la dosificación. La dosificación se produjo el día 0 para cada sujeto. El investigador verificó el bienestar de todos los sujetos antes de su alta de la CRU (24 horas después de la administración). Los sujetos regresaron a la CRU 8 ± 2 días y 28 ± 5 días después de la dosificación para las evaluaciones posteriores al estudio.

Un total de 24 sujetos (varones sanos de entre 18 y 45 años), en 3 grupos de 8. 24 sujetos ingresaron y completaron el estudio. Los datos de todos los sujetos se incluyeron en los análisis de seguridad; los datos de todos los sujetos que recibieron XG-102 se incluyeron en los análisis farmacocinéticos.

Los valores observados de t i /2 fueron cortos. Tanto la exposición máxima medida por Cmáx como la exposición acumulada medida por el AUC0-última aumenta con la dosis. El aumento con la dosis de Cmáx parece ser más que linealmente proporcional basándose en exámenes gráficos y en la media geométrica de sus valores normalizados con respecto a la dosis que, después de la dosis más alta de 80 ^g/kg, están por encima de los intervalos de confianza del 90% para las otras dosis. El aumento con la dosis de AUC0-última es claramente más que linealmente proporcional entre 40 y 80 ^g/kg, ya que los intervalos de confianza del 90% para la media geométrica de su valor normalizado con respecto a la dosis no se superponen con los de las otras dosis sometidas a prueba; mientras que al comparar valores después de 10 y 40 ^g/kg, los intervalos de confianza del 90% se superponen, pero la media geométrica de su valor normalizado con respecto a la dosis después de la dosis de 10 ^g/kg es menor que todos los valores en el intervalo de confianza del 90% correspondiente después de la dosis de 40 ^g/kg.

XG-102 fue seguro y bien tolerado cuando se administró como dosis i.v. únicas de 10, 40 u 80 ^g/kg a sujetos varones sanos. La incidencia de acontecimientos adversos en sujetos que recibieron XG-102 fue similar a la incidencia en sujetos que recibieron placebo. No hubo hallazgos clínicamente significativos en los datos de laboratorio clínico, constantes vitales, ECG, exámenes físicos o exámenes oculares (fondo de ojo y PIO).

Una vez finalizada la infusión intravenosa de XG-102, sus concentraciones plasmáticas disminuyeron rápidamente, lo que llevó a valores por debajo del límite inferior de cuantificación en como máximo 2 horas después del inicio de las infusiones i.v. de 10 ^g/kg de XG-102, 3 horas después del inicio de infusiones i.v. de 40 ^g/kg de XG-102 y como máximo 7 horas después del inicio de las infusiones i.v. de 80 ^g/kg de XG-102. Los valores medidos de t 1/2 y MRT son cortos, con valores medios geométricos por nivel de dosis que oscilan entre 0,36 y 0,65 horas y entre 0,76 y 1,02 horas, respectivamente.

La AUC0-última de XG-102 aumenta en una proporción más que lineal con la dosis en el intervalo de dosis sometido a prueba, con intervalos de confianza del 90% no superpuestos para las medias geométricas de sus valores normalizados con respecto a la dosis entre la dosis de 40 ^g/kg y la dosis de 80 ^g/kg y sólo superposición limitada entre los intervalos de confianza del 90% para las medias geométricas de sus valores normalizados con respecto a la dosis entre 10 ^g/kg y 40 ^g/kg.

La Cmáx de XG-102 parece aumentar en una proporción más que lineal con la dosis de desde 40 hasta 80 ^g/kg. La media geométrica de la Cmáx normalizada con respecto a la dosis en el grupo de dosis de 80 ^g/kg es superior y está fuera de los intervalos de confianza del 90% para la media geométrica de la Cmáx normalizada con respecto a la en

Claims

REIVINDICACIONES

1. Péptido inhibidor de JNK que comprende o consiste en la secuencia de D-aminoácidos de SEQ ID NO: 11, para su uso en el tratamiento de la cistitis, en particular la cistitis intersticial.

2. Ácido nucleico aislado que codifica para el péptido inhibidor de JNK según la reivindicación 1, para su uso en el tratamiento de la cistitis, en particular la cistitis intersticial.

3. Vector que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 2, para su uso en el tratamiento de la cistitis, en particular la cistitis intersticial.

4. Célula que comprende el vector según la reivindicación 3, para su uso en el tratamiento de la cistitis, en particular la cistitis intersticial.