ES2289110T3 - Peptido para diagnostico y terapia de la enfermedad de alzheimer. - Google Patents
Peptido para diagnostico y terapia de la enfermedad de alzheimer. Download PDFInfo
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Abstract
Péptido caracterizado porque está compuesto esencialmente por D-aminoácidos y se une a monómeros y/u oligómeros y/o fibrillas del péptido a-amiloide con un valor de KD de cómo máximo 10 µM, preferiblemente como máximo 6 µM y con especial preferencia como máximo 4 µM, y porque comprende un motivo de secuencia compuesto por D-aminoácidos seleccionado del grupo compuesto por: a) SHYRHISP, b) GISWQQSHHLVA, o c) PRTRLHTH.
Description
Péptido para diagnóstico y terapia de la
enfermedad de Alzeimer.
La invención se refiere a un péptido que se une
con alta afinidad de unión al péptido
\beta-amiloide, a un procedimiento para la
preparación de dichos péptidos, así como al uso de estos péptidos
para el diagnóstico y la terapia de demencia de Alzheimer.
La enfermedad de Alzheimer es la forma más
frecuente de demencia debida a la edad. Empieza con pequeñas
alteraciones de memoria y conduce en la evolución patológica
posterior a la pérdida de gran parte de la memoria, a la reducción
del léxico a pocas palabras, a la desorientación espacial y
temporal, a la incapacidad de levantarse y caminar, así como
frecuentemente a incontinencia de vejiga y heces. La valoración
estadística de la epidemiología de la demencia de Alzheimer muestra
que la edad es el mayor factor de riesgo y que cualquiera que llegue
a ser lo suficientemente mayor sufre esta enfermedad. La mayoría de
las veces, la enfermedad se manifiesta sólo después de los 65 años,
pero a veces también ya antes, por ejemplo alrededor de los 50 años.
La enfermedad de Alzheimer es por tanto un problema social y
financiero cada vez mayor particularmente para los países
industrializados occidentales con una alta esperanza de vida.
Como diagnóstico fiable de la demencia de
Alzheimer es válida la identificación post mortem de las
denominadas "placas amiloides" en el cerebro de la persona
respectiva. Estas placas amiloides son esencialmente la única
conexión conocida hasta ahora entre hallazgos patológicos y síntomas
de la enfermedad. El componente principal de estas placas son
agregados del péptido \beta-amiloide o péptido
A\beta o péptido \betaA4 que comprenden 39 a 43 y habitualmente
40 ó 42 restos aminoacídicos. Si las placas son una consecuencia de
la enfermedad o al contrario los síntomas de la enfermedad se basan
en la existencia de las placas es todavía debatible. El último
modelo, la denominada "hipótesis amiloide", se ha vuelto cada
vez más completo y consistente en los últimos años, aunque hasta
ahora no se ha podido suministrar una evidencia o contraevidencia
definitiva (D.J. Selkoe, Science 1997, 275,
630-631).
El péptido A\beta se forma a partir de la
proteína precursora de A\beta APP. La APP es una proteína
transmembrana que se escinde mediante distintas proteasas, que se
designan como secretasas \alpha, \beta ó \gamma. Mediante la
actividad de las secretasas \beta y \gamma, se forma el péptido
A\beta. La investigación previa estaba dirigida a encontrar un
inhibidor contra estas proteasas. Dichos inhibidores presentan sin
embargo desventajas considerables, ya que la actividad de escisión
de APP de estas proteasas no es su única función, y por tanto la
inhibición de la enzima puede conducir a efectos secundarios
drásticos.
Existe por tanto la necesidad de compuestos que
puedan utilizarse para el diagnóstico y/o para la terapia de
Alzheimer y que no presenten efectos secundarios o los menores
posibles para los pacientes.
Sería particularmente deseable encontrar
compuestos que se unan al péptido A\beta y por tanto inhiban la
agregación de A\beta. Para encontrar dichos compuestos, se
proponen tecnologías que posibilitan investigar o "evaluar" un
número muy grande, por ejemplo 10^{6} a 10^{12}, de moléculas
químicamente distintas, una denominada biblioteca, muy rápida y
sencillamente según determinadas propiedades. A este respecto, se
diferencian bibliotecas químico-sintéticas y
"biológicas", es decir, bibliotecas autorreplicativas. Las
bibliotecas químico-sintéticas ofrecen un
repertorio casi ilimitado de elementos individuales, pero
posibilitan la evaluación de sólo un número limitado de moléculas
distintas. Por el contrario, mediante las bibliotecas biológicas se
garantiza una evaluación muy rápida de hasta 10^{12} moléculas
distintas en una etapa de trabajo. Dichas bibliotecas biológicas
están limitadas sin embargo a la combinación de elementos
"naturales" como, por ejemplo, ácidos ribonucleotídicos y
desoxirribonucleotídicos y L-aminoácidos.
En la aplicación directa in vivo de
sustancias que se obtienen mediante evaluación biológica y por
tanto están compuestas, por ejemplo, por
L-aminoácidos, surgen además las desventajas de que
son extremadamente sensibles frente a proteasas y además
desencadenan casi siempre también una intensa respuesta inmune
cuando se usan en modelos animales o para el tratamiento de
personas. La presentación en fagos de péptidos convencional (Smith,
Science 1985, 228, 1315-1317) no es por tanto a este
respecto un procedimiento suficiente para la identificación de
compuestos que se unen al péptido A\beta.
En el estado de la técnica se han descrito ya
compuestos que inhiben la agregación in vitro de A\beta o
reducen sus efectos tóxicos. Así, es conocido que el Kongorot se une
a agregados A\beta e inhibe su efecto tóxico (Lorenzo y Yankner,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91, 12243-12247).
Además, se han dado a conocer por Tjernberg y col. (J. Biol. Chem.
1996, 271, 8545-8548) péptidos que corresponden a
pequeños segmentos del péptido A\beta y que pueden inhibir su
agregación in vitro. Salomon y col., Biochemistry 1996, 35,
13568-13578, han mostrado la unión de nicotina a
A\beta helicoidal y la inhibición de la agregación de A\beta.
Para bromuro de hexadecil-N-metilpiperidinio y rifampicina,
se ha referido igualmente un efecto inhibidor de la formación de
fibrillas A\beta y anticitotóxico con una constante de disociación
en el intervalo de \muM a mM (Tomiyama y col., J. Biol. Chem.
1996, 271, 6839-6844). Solomon y col., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 1997, 94, 4109-4112 han descrito
además anticuerpos que están dirigidos contra la parte
N-terminal (posiciones 1 a 28) de A\beta. Estos
anticuerpos podían reducir la toxicidad de A\beta y prevenir la
agregación de A\beta e incluso revertirla.
Ghanta y col., J. Biol. Chem. 1996, 271,
29525-29528, describen la síntesis de un péptido que
está compuesto por dos partes. La parte N-terminal
corresponde a los aminoácidos 15 a 25 de A\beta, la parte
C-terminal está compuesta por seis lisinas
consecutivas. La parte A\beta_{15-25} debe
unirse a A\beta, mientras que la parte hexalisina debe interferir
la formación de fibrillas mediante su solubilidad en agua. Esta
construcción tiene la capacidad de retardar la agregación de
A\beta y reducir su citotoxicidad.
Todas las sustancias descritas anteriormente que
inhiben la agregación de A\beta muestran sin embargo la
desventaja considerable de que se degradan fácilmente in
vivo, posiblemente desencadenan una reacción inmune y/o actúan
inespecíficamente, desencadenando por tanto efectos secundarios
graves al menos a largo plazo.
Tjernberg y col., J. Biol. Chem. 1997, 272,
12601-12605, han descrito además un pentapéptido
resistente a proteasa que se ha obtenido mediante evaluación de un
biblioteca de D-aminoácidos sintetizada
químicamente. Este péptido parece unirse a A\beta e inhibir la
formación de placas. Dichos péptidos pequeños, como se encuentran
convencionalmente mediante la evaluación de bibliotecas
químico-sintéticas bastante pequeñas, no son
capaces sin embargo de mostrar la afinidad necesaria y
particularmente la especificidad deseada por A\beta.
Existe por tanto particularmente la necesidad de
inhibidores de A\beta que presenten una afinidad por A\beta
cercana al intervalo nanomolar y subnanomolar fisiológicamente
importante. Además de la alta afinidad, es de gran importancia que
un principio activo para la terapia de Alzheimer muestre una alta
especificidad por el péptido A\beta, ya que se supone que una
composición farmacéutica que deba inhibir la formación de placas
A\beta y dado el caso revertirla, debe administrarse durante un
intervalo de varias decenas de años según las circunstancias y, por
tanto, debería estar libre de cualquier tipo de efecto
secundario.
Es por tanto el objetivo de la presente
invención proporcionar compuestos que sean adecuados para el
diagnóstico fiable de la enfermedad de Alzheimer también en
pacientes vivos y/o que puedan utilizarse para la terapia de la
demencia de Alzheimer sin presentar efectos secundarios que limiten
esencialmente el bienestar del paciente. Es particularmente un
objetivo esencial de la presente invención proporcionar para el
diagnóstico y/o la terapia de demencia de Alzheimer compuestos
adecuados que en el uso potencial en modelos animales o personas no
presenten ninguna sensibilidad a proteasa, o al menos una reducida,
y además una inmunogenicidad claramente reducida.
Surgen otros objetivos a partir de la siguiente
descripción.
Los objetivos anteriormente citados se consiguen
mediante las características de las reivindicaciones
independientes.
Las configuraciones ventajosas se dan en las
reivindicaciones subordinadas.
Se han encontrado ahora sorprendentemente
péptidos que se unen con alta afinidad de unión y alta especificidad
a monómeros y/u oligómeros y/o fibrillas del péptido
\beta-amiloide (designado en adelante también como
péptido A\beta o A\beta) y compuestos esencialmente por
D-aminoácidos. Particularmente, un péptido según la
invención se une a monómeros y/u oligómeros y/o fibrillas del
péptido \beta-amiloide con una constante de
disociación (designada en adelante también como valor de K_{D}) de
cómo máximo 10 \muM, preferiblemente como máximo 8 \muM, más
preferiblemente como máximo 6 \muM, con especial preferencia como
máximo 4 \muM y de la forma más preferible como máximo 1 \muM.
Se prefieren con muy especial preferencia péptidos según la
invención que se unen al péptido \beta-amiloide
con un valor de K_{D} en el intervalo nanomolar o
subnanomolar.
La constante de disociación o el valor de
K_{D} se calcula a partir del cociente de la velocidad de
disociación y la velocidad de asociación del péptido
\beta-amiloide, y reproduce el equilibrio entre
la forma libre y unida.
La constante de disociación puede determinarse
por tanto mediante todos los procedimientos de medida con los que
es accesible la relación de forma libre a unida de un sustrato o
monómero, por ejemplo, mediante titulación por fluorescencia,
resonancia de plasmón superficial, ELISA, radioinmunoensayo y
procedimientos espectroscópicos como RMN. Son conocidos por el
experto otros procedimientos para la determinación de la constante
de disociación.
El péptido según la invención compuesto
esencialmente por D-aminoácidos es capaz en una
forma de realización de la presente invención, debido a su alta
afinidad y especificidad por oligómeros o fibrillas de A\beta, de
disolver las placas o agregados de A\beta presentes en la demencia
de Alzheimer, o al menos reducir su crecimiento posterior. Además,
el péptido según la invención posibilita inhibir la citotoxicidad de
A\beta. Además de estas propiedades terapéuticas, el péptido
según la invención es destacadamente adecuado para ensayos de
diagnóstico para la determinación de A\beta.
En una forma de realización alternativa, el
péptido según la invención compuesto esencialmente por
D-aminoácidos es capaz, debido a su alta afinidad y
especificidad por monómeros de A\beta, de inhibir la
oligomerización de A\beta y por tanto la formación de placas de
A\beta. Por tanto, el péptido según la invención está
predestinado para uso en la prevención de Alzheimer.
Además, el D-péptido según la
invención presenta la propiedad destacada frente a los péptidos
convencionales de L-aminoácidos de que en
aplicaciones in vivo es esencialmente menos inmunogénico y al
mismo tiempo claramente más resistente frente a proteasas.
Esencialmente compuesto por
D-aminoácidos significa en el marco de la presente
invención que participa en la unión al péptido A\beta.
Los aminoácidos del péptido según la invención
son esencialmente D-aminoácidos, es decir, al menos
75%, preferiblemente al menos 80%, con especial preferencia al menos
85% y de la forma más preferible 100% de los aminoácidos
participantes en la unión al péptido A\beta son
D-aminoácidos.
Además, puede ser ventajoso en la región de
unión compuesta esencialmente, preferiblemente exclusivamente, por
D-aminoácidos del péptido según la invención, añadir
otros grupos, por ejemplo, L-aminoácidos, análogos
de aminoácidos y similares. Particularmente, una conexión de la
región de unión compuesta esencialmente por
D-aminoácidos del péptido según la invención con
sustancias bien solubles en agua, preferiblemente muy solubles
como, por ejemplo, restos de azúcar, aumenta esencialmente el efecto
disolvente de la placa amiloide. Con este fin, son conocidos por el
experto grupos solubles en agua, particularmente restos de azúcar,
ácidos glucurónicos, restos sulfato, serina, glicina, aspartato y
similares, así como el modo de conexión de estos grupos con el
péptido según la invención.
Además, los péptidos según la invención pueden
conectarse con anticuerpos convencionales o fragmentos de los
mismos de modo habitual, para activar en un uso terapéutico del
péptido según la invención los componentes del sistema inmune y así
llevar a degradación A\beta o placas A\beta enteras, por
ejemplo, mediante macrófagos, células de microglía y demás.
Surgen otros grupos con los que puede conectarse
la región de unión compuesta esencialmente por
D-aminoácidos del péptido según la invención a
partir del uso de los péptidos según la invención para el
diagnóstico de demencia de Alzheimer mediante procedimientos de
formación de imagen u otra señal como PET (tomografía de emisión de
positrones), tomografía de espín nuclear, tomografía computerizada,
SPECT (tomografía computerizada de fotón único) y detección de
infrarrojo cercano. Habitualmente, para dichas técnicas de formación
de imagen, los grupos usados son familiares para el experto en la
técnica sin más, al igual que los modos de conexión de estos grupos
con el péptido según la invención. Son ejemplos de ellos complejos
de gadolinio, yodo, tecnecio, talio, flúor y similares.
Finalmente, pueden añadirse sintéticamente a los
péptidos según la invención grupos funcionales que pueden acelerar
la reeliminación del cuerpo de los péptidos según la invención,
libres o unidos a A\beta. Son ejemplos de ellos entre otros ácido
glucurónico y grupos sulfato.
Además se prefiere que el péptido según la
invención comprenda 4 a 30, preferiblemente 4 a 20, más
preferiblemente 5 a 18, aún más preferiblemente 6 a 15 y con
especial preferencia 7 a 9 aminoácidos. Los péptidos en este
intervalo de longitud de secuencia son suficientemente pequeños para
poder utilizarse, por ejemplo, como agentes de contraste en la
detección de placas amiloides en individuos vivos.
En una forma de realización de la presente
invención, el péptido comprende el motivo de secuencia aminoacídica
compuesto esencialmente por D-aminoácidos SHYRHISP.
En otra forma de realización de la presente invención, el péptido
comprende el motivo de secuencia compuesto esencialmente por
D-aminoácidos GISWQQSHHLVA. En una forma de
realización adicional de la presente invención, el péptido comprende
el motivo de secuencia compuesto esencialmente por
D-aminoácidos PRTRLHTH.
Los péptidos que comprenden los motivos de
secuencia citados anteriormente presentan una afinidad de unión muy
alta por el péptido \beta-amiloide.
Con especial preferencia, se selecciona el
péptido del grupo compuesto por péptidos con las secuencias de
D-aminoácidos:
a) QSHYRHISPAQV;
b) QSHYRHISPDQV;
c) QSHYRHISPAR;
d) KSHYRHISPAKV;
e) RPRTRLHTHRNR;
f) RPRTRLHTHRTE; y
g) KPRTRLHTHRNR.
Se muestran otros ejemplos de péptidos
preferidos según la invención en las figuras 1, 3 y 4, a condición
de que entren dentro de la protección de la reivindicación
independiente 1. A este respecto, los péptidos citados en las
figuras 1 y 3 son particularmente adecuados para el diagnóstico de
demencia de Alzheimer, mientras que los péptidos mostraos en la
figura 4 pueden utilizarse particularmente para la prevención y/o
terapia de la demencia de Alzheimer. Los péptidos según la
invención mostrados en las figuras 1, 3 y 4 están compuestos
esencialmente, preferiblemente exclusivamente, por
D-aminoácidos.
Además, se describe un procedimiento para la
identificación o preparación de péptidos que se unen al péptido
A\beta.
Dicha selección es posible de modo directo sólo
con bibliotecas químicas. Para poder usar para la evaluación las
bibliotecas biológicas mucho más voluminosas en comparación con las
bibliotecas químicas, se ha aprovechado sin embargo en la presente
invención el hecho de que dos moléculas interaccionan y se unen
entre sí de igual modo que sus respectivos estereoisómeros. A este
respecto, un complejo se comporta con el otro como objeto e imagen
especular. Se selecciona ahora una biblioteca biológica frente a una
imagen especular de la diana, es decir, en el presente caso frente
a un péptido \beta-amiloide compuesto por
D-aminoácidos, de modo que se obtiene según el
procedimiento de selección un péptido que está compuesto por
L-aminoácidos (en adelante designado también como
L-péptido). La imagen especular de este
L-péptido, es decir, un péptido que está compuesto
por D-aminoácidos con la misma secuencia (en
adelante designado también como D-péptido), se une
ahora a la diana del mismo modo que el L-péptido a
la "diana especular".
Según la invención, se proporciona por tanto un
procedimiento para la preparación o selección de péptidos que se
unen con alta afinidad y especificidad de unión al péptido
\beta-amiloide, que comprende las siguientes
etapas:
- a)
- Síntesis de un péptido \beta-amiloide compuesto por D-aminoácidos;
- b)
- evaluación de bibliotecas de péptidos biológicos mediante presentación en fagos frente a la secuencia de \beta-amiloide de la etapa a);
- c)
- identificación de los péptidos que se unen a la secuencia de \beta-amiloide; y
- d)
- síntesis de los péptidos seleccionados en la etapa c) con la correspondiente secuencia aminoacídica de D-aminoácidos.
El péptido \beta-amiloide
preparado en la etapa a) comprende los aminoácidos 1 a 42 de la
secuencia \beta-amiloide conocida o fragmentos de
la misma.
Preferiblemente, se preparan o seleccionan en el
procedimiento aquellos péptidos que se unen a monómeros y/u
oligómeros y/o fibrillas del péptido
\beta-amiloide con un valor de K_{D} de cómo
máximo 10 \muM, preferiblemente como máximo 8 \muM, más
preferiblemente como máximo 6 \muM, con especial preferencia como
máximo 4 \muM y de la forma más preferible como máximo 1
\muM.
En una forma de realización preferida del
procedimiento, la evaluación se realiza en la etapa b) mediante
presentación en fagos. Este procedimiento designado como
presentación en fagos de imagen especular (Schumacher y col.,
Science 1996, 271, 1854-1857) ofrece por tanto la
posibilidad de identificar con alta afinidad y especificidad de
unión los péptidos que se unen al péptido A\beta, que están
compuestos por D-aminoácidos, y presentan una
sensibilidad a proteasa fuertemente reducida así como un potencial
inmunogénico reducido.
Debido a la extrema sensibilidad de agregación
de A\beta, no era de esperar una evaluación exitosa de
bibliotecas de péptidos biológicos frente a la secuencia de
\beta-amiloide. Particularmente, los parámetros
experimentales en la etapa b) del procedimiento según la invención
descrito anteriormente se ajustan dependiendo de si después de la
evaluación biológica debe obtenerse un péptido que se una
preferiblemente a monómeros u oligómeros o fibrillas.
En caso de que deba utilizarse el péptido según
la invención para el diagnóstico y/o la terapia de Alzheimer, es
particularmente deseable que el péptido seleccionado mediante
evaluación biológica se una preferiblemente a oligómeros o
fibrillas de A\beta. Para garantizar esto, se transfiere el
péptido \beta-amiloide en el procedimiento según
la invención en primer lugar a condiciones de disolución que
posibiliten su agregación controlada. Se reduce una agregación
incontrolada de A\beta mediante el uso de un disolvente adecuado,
particularmente de DMSO (dimetilsulfóxido). A continuación, se
añade en la etapa b) del procedimiento según la invención la
biblioteca peptídica y finalmente se inmoviliza el complejo
péptido/D-A\beta formado, por ejemplo, en
estreptavidina.
En caso de que deba utilizarse el péptido para
la prevención de la demencia de Alzheimer, es particularmente
deseable seleccionar péptidos mediante evaluación biológica que se
unan preferiblemente a monómeros A\beta. En este caso, se
inmoviliza en primer lugar en una forma de realización preferida del
procedimiento según la invención D-A\beta a
concentración preferiblemente baja, por ejemplo, en estreptavidina.
Esto reduce la agregación de A\beta completamente, ya que todas
las moléculas de A\beta se inmovilizan. Finalmente, se realiza la
adición de la biblioteca peptídica y la selección de los péptidos
que se unen a monómeros D-A\beta.
Que el péptido seleccionado mediante el
procedimiento descrito se una a monómeros u oligómeros o fibrillas,
es por tanto ajustable mediante la elección adecuada de las etapas y
condiciones en el transcurso del procedimiento de selección.
Los D-péptidos sintetizados en
la etapa a) del procedimiento descrito anteriormente se han
examinado con procedimientos espectroscópicos como espectroscopía
RMN y espectroscopía de dicroísmo circular. Así, se han
identificado, por ejemplo, todos los protones de
L-A\beta o D-A\beta mediante
espectroscopía RMN. Debido a los espectros de RMN esencialmente
idénticos de L-A\beta y
D-A\beta, así como al hecho de que los
correspondientes espectros de DC son idénticos con el signo opuesto,
se garantizaba que en el D-A\beta preparado en la
etapa a) se trata de la imagen especular de
L-A\beta.
La evaluación biológica en la etapa b) del
procedimiento descrito anteriormente puede realizarse como
alternativa también con presentación en plásmido (Schatz y col.,
Meth. Enzymol. 1996, 267, 171), presentación en ribosomas (Hanes y
Plückthun, PNAS 1997, 94, 4937-4942), presentación
en polisomas (Mattheakis y col., PNAS, 1994, 91,
9022-9026), presentación en baculovirus (Ernst y
col., Nucl. Acids Res. 1998, 26, 1718-1723),
presentación en bacterias (Stahl y Uhlen, Trends Biotech. 1997, 15,
185-192) y/o presentación in vivo.
Es otro objeto de la presente invención el uso
del péptido según la invención para el diagnóstico de la demencia
de Alzheimer en individuos vivos, particularmente mediante formación
de imágenes de diagnóstico de placas amiloides en animales o
personas vivos. Por tanto, mediante el uso de los péptidos según la
invención para la formación de imágenes de diagnóstico en animales,
es posible también una reducción esencial del número de ensayos
animales. Los ensayos animales con principios activos potenciales
contra la demencia de Alzheimer incluyen, a saber habitualmente
como etapa esencial, el control de la influencia de la sustancia
para ensayar sobre el desarrollo de placas a lo largo del tiempo.
Para ello, ha sido necesario hasta ahora llevar a cabo ensayos
animales con un gran número de animales de ensayo, ya que deben
sacrificarse en determinados momentos cada vez más animales para
controlar el número y tamaño de las placas. Mediante el uso de los
péptidos según la invención, es posible un control en animal vivo,
de modo que pueden llevarse a cabo los ensayos animales con
principios activos potenciales contra Alzheimer con un número
claramente reducido de animales de ensayo.
En una forma de realización preferida de la
presente invención, se utilizan los péptidos unidos a una sustancia
adecuada como agente de contraste para la detección de placas
amiloides mediante tomografía computerizada (TC). Como alternativa,
se proporcionan los péptidos según la invención preferiblemente con
un marcador radiactivo. Así, pueden inyectarse, por ejemplo con la
ayuda de la denominada tomografía de emisión de positrones (PET),
péptidos según la invención marcados con radionucleidos emisores de
positrones, y registrarse la radiación \gamma emitida en
tomogramas. Son emisores de positrones útiles ^{11}C, ^{22}Na,
^{58}Co y similares.
Otras alternativas para el diagnóstico de la
demencia de Alzheimer en individuos vivos mediante los péptidos
según la invención son tomografía de espín nuclear (MRI, formación
de imágenes por resonancia magnética), SPECT (tomografía
computerizada de fotón único) y/o detección de infrarrojo cercano
(NIR).
Debido a la capacidad de los péptidos según la
invención de interacción específica con la formación de placa de
A\beta o de inhibición de la toxicidad de A\beta, los péptidos
según la invención pueden usarse también para la prevención y/o la
terapia de demencia de Alzheimer.
Ya que los D-péptidos según la
invención presentan una sensibilidad a proteasa fuertemente reducida
y un potencial inmunogénico reducido, comparados con péptidos
compuestos por L-aminoácidos, son igualmente
adecuados para examinar la relación entre hallazgos patológicos y
síntomas de enfermedad en la demencia de Alzheimer, particularmente
para verificar la hipótesis del "modelo amiloide".
La presente invención se ilustrará con los
siguientes ejemplos, sin que la limiten en modo alguno.
Se adquirieron los siguientes péptidos en forma
de productos purificados por HPLC en fase inversa en Jerini
Biotools, Berlín, Alemania:
- -
- Biotinil-DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (todos los aminoácidos son enantiómeros L, designados a continuación también como L-A\beta);
- -
- D-A\beta (la misma secuencia que L-A\beta, pero todos los aminoácidos son enantiómeros D);
- -
- QSHYRHISPAQV (todos los aminoácidos son enantiómeros D) con un resto de fluorosceinilo unido por una L-lisina a la terminación C (en adelante designado también como D-pep).
Se confirmó la identidad de
L-A\beta y D-A\beta mediante EM
MALDI-TOF (espectrometría de masas por
ionización/desorción láser asistida por matriz- tiempo de vuelo),
así como mediante RMN y espectroscopia de dicroísmo circular.
Se determinaron las secuencias de ADN usando el
kit Big Dye Terminator Cycle Sequencing de PE Applied Biosystems
(Warrington, Reino Unido) con ADN-polimerasa Ampli
Taq.
Se llevaron a cabo las medidas de fluorescencia
a 298 K en un espectrofluorómetro de transformada de Fourier
SLM-Aminco 48000 MHF (SLM Instruments Inc., EE.UU.)
o un fluorómetro LS502 (Perkin Elmer) en celdas de fluorescencia
estándar de vidrio de cuarzo SUPRASIL (10 x 10 mm, Hellma,
Alemania). Se midió la fluorescencia con agitación continua en
tampón (PBS con dodecilsulfato de sodio 1 mM) usando longitudes de
onda de excitación y emisión de 495 ó 520 nm. Para ello, se
disolvieron cantidades adecuadas de L-A\beta en
hexafluoroisopropanol (HFP). Como controles, se llevaron a cabo las
mismas titulaciones con HFP en presencia de
L-A\beta.
Para la práctica de una presentación en fagos,
se preparó una disolución madre de D-A\beta 250
\muM en DMSO. Se mezclaron 2 x 10^{11} fagos (kit Phagendisplay
- 12 Phagedisplay Peptide Library, New England Biolabs, Beverly,
Madison, EE.UU.) en 0,8 ml de TBST (Tris-HCl 50 mM,
pH 7,5, NaCl 150 mM, 0,1% en vol, Tween-20 (Sigma,
Deisenhofen)) que contenía 0,1% en peso de BSA (Sigma) 1:100 con
D-A\beta 250 \muM en DMSO, lo que condujo a una
concentración final de D-A\beta 2,5 \muM.
Después de 10 min, se transfirió la suspensión
de fagos-péptido a un tubito recubierto con
estreptavidina (Boehringer Mannheim) y se agitó durante 15 min a
temperatura ambiente.
\vskip1.000000\baselineskip
A diferencia del procedimiento de selección A,
en el que se mezclaba en primer lugar el péptido
\beta-amiloide con los fagos y a continuación se
inmovilizaba la mezcla, en el procedimiento de selección B se
inmoviliza en primer lugar el péptido
\beta-amiloide y sólo después se añaden los
fagos.
Para ello, se diluyó una disolución madre de
D-A\beta 250 \muM (hexafluoroisopropanol) 1:100
en 0,8 ml de TBST (con 0,1% en peso de BSA), se transfirió a un
tubito recubierto con estreptavidina y se agitó ligeramente durante
15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se añadieron 2 x
10^{11} fagos y se agitó ligeramente durante 15 min.
\vskip1.000000\baselineskip
En el procedimiento de selección C, se
transfirió el péptido \beta-amiloide a condiciones
de disolución que garantizaran una reducción de la
oligomerización.
Para ello, se diluyó una disolución madre de
D-A\beta 20 \muM en HFP (hexafluoroisopropanol)
1:10.000 en 1,0 ml de TBST (con 0,1% en peso de BSA), se transfirió
a un tubito recubierto con estreptavidina y se agitó ligeramente
durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se lavó
dos veces con 1,0 ml de PBST (1 PBS (NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O y
NaCl) que contenía un 0,05% de Tween-20), se
añadieron 0,8 ml de TBST con 2 x 10^{11} fagos y se agitó
ligeramente durante 15 minutos.
En todos los procedimientos de selección A, B y
C, se procedió después idénticamente como a continuación:
Se separaron los fagos no unidos mediante
decantación. Para separar los posibles fagos unidos a
estreptavidina, se añadió biotina 0,1 mM durante 5 min a
temperatura ambiente. Después, se lavó el tubito 10 veces con 1,5 ml
de TBST.
Se eluyeron los fagos unidos a
D-A\beta con un inserto de biblioteca de péptido
mediante la adición de 0,8 ml de glicina-HCl 0,2 M
(pH 2,2) durante 10 min a temperatura ambiente, y se añadieron a 0,2
ml de Tris-HCl 1 M (pH 9,1) para neutralización. Se
determinaron las titulaciones de fagos usando una fracción del
eluido para la infección de células ER2738 de E. coli usando
el protocolo estándar (New England Biolabs). Para la amplificación,
se añadió el eluido restante a un cultivo de 20 ml (10 g/l de
peptona (Roth., Karlsruhe), 5 g/l de extracto de levadura y 5 g/l
de NaCl) de ER2738 de E. coli al inicio de la fase
logarítmica (densidad óptica a 600 nm de 0,1) y se incubó a 37ºC
con agitación fuerte durante 4,5 horas. Se recogieron los fagos
mediante centrifugación (30 min, 5000 x g) de los cultivos y
posterior precipitación de los fagos a partir del sobrenadante
restante mediante la adición de 7 ml de NaCl M con 20% en peso de
polietilenglicol (PEG 8000) y centrifugación (30 min, 5000 x g)
después de 16 horas de incubación en hielo. Se resuspendió el
sedimento de nuevo en 1 ml de TBS (Tris-HCl 50 mM,
pH 7,5, NaCl 150 mM), se transfirió a un tubito de microcentrífuga
y se centrifugó a 10.000 x g a 4ºC para sedimentar las células
restantes. Se precipitó el sobrenadante con 200 \mul de NaCl 2,5
M con 20% de polietilenglicol (PEG 8000). Después de incubación
sobre hielo durante 1 hora y centrifugación (20 min, 13.000 x g,
4ºC), se suspendió el sedimento en 100 \mul de TBS. Se usó una
alícuota de suspensión de fagos para determinar la titulación de
fagos después de la amplificación, para calcular el volumen de
entrada para la siguiente etapa que corresponde a 2 x 10^{11}
fagos.
Después de cuatro rondas de selección y
amplificación, se seleccionaron aleatoriamente en el procedimiento
de selección A 41 clones para la secuenciación de ADN del inserto de
biblioteca peptídica. Después de la traducción en secuencias
aminoacídicas, 23 secuencias mostraron una alta similitud de
secuencia (véase la figura 1). Una de estas secuencias estaba
contenida 21 veces en las 41 muestras secuenciadas, lo que indica
que un péptido de L-aminoácidos con esta secuencia
se une muy fuertemente a D-A\beta.
Las secuencias de aminoácidos de los péptidos
seleccionados mediante los procedimientos de selección B y C se
representan en las figuras 3 ó 4. Entre los péptidos obtenidos según
el procedimiento de selección B, aparece cuatro veces la secuencia
GISWQQSHHLVA, mientras que de los 23 clones seleccionados en el
procedimiento de selección C, 17 presentan una similitud de
secuencia muy alta. También en estos ejemplos, la aparición
frecuente de las respectivas secuencias indica una unión muy fuerte
del péptido de L-aminoácidos con esta secuencia en
D-A\beta.
Para comprobar si un péptido compuesto por
D-aminoácidos con exactamente la misma secuencia se
une a L-A\beta, se usó un correspondiente péptido
sintetizado químicamente de secuencia QSHYRHISPAQV
(D-pep) con un marcador de fluoresceína en su
terminación C para exámenes de titulación de fluorescencia. La
figura 2 muestra el cambio de la fluorescencia dependiente de
D-pep en función de la concentración de
L-A\beta. Suponiendo una reacción bimolecular
sencilla entre L-A\beta y D-pep,
el análisis mediante ajuste de curva no lineal (Müller y col.,
Biochemistry 1991, 30, 3709-3715) condujo a un valor
de K_{D} de 4 \muM.
El isotiocianato de fluoresceína
(FITC-I, Sigma) como control no se unió a
L-A\beta.
Figura 1: Secuencias aminoacídicas de péptidos
obtenidos mediante el procedimiento de selección A.
Figura 2: Unión de L-A\beta a
D-pep 0,8 \muM (\medbullet) y como control a
fluoresceína 1,0 \muM (\medcirc) en función de la concentración
de L-A\beta. Los valores surgen a partir de la
diferencia de fluorescencia con L-A\beta disuelto
en HFP y HFP sin L-A\beta. Suponiendo una reacción
bimolecular sencilla entre L-A\beta y el péptido
D-pep, el análisis mediante ajuste de curva no
lineal (línea continua) proporcionó un valor de K_{D} de 4
\muM.
Figura 3: Secuencias aminoacídicas de péptidos
obtenidos según el procedimiento de selección B.
Figura 4: Secuencias aminoacídicas de péptidos
obtenidos según el procedimiento de selección C.
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<210> 1
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<223> Péptido
beta-amiloide
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Claims (14)
1. Péptido caracterizado porque está
compuesto esencialmente por D-aminoácidos y se une a
monómeros y/u oligómeros y/o fibrillas del péptido
\beta-amiloide con un valor de K_{D} de cómo
máximo 10 \muM, preferiblemente como máximo 6 \muM y con
especial preferencia como máximo 4 \muM, y porque comprende un
motivo de secuencia compuesto por D-aminoácidos
seleccionado del grupo compuesto por:
a) SHYRHISP,
b) GISWQQSHHLVA, o
c) PRTRLHTH.
2. Péptido según la reivindicación 1,
caracterizado porque los aminoácidos participantes en la
unión al péptido \beta-amiloide son
exclusivamente D-aminoácidos.
3. Péptido según las reivindicaciones 1 ó 2,
caracterizado porque se selecciona del grupo compuesto por
los péptidos con las secuencias de
D-aminoácidos:
a) QSHYRHISPAQV;
b) QSHYRHISPDQV;
c) QSHYRHISPAR;
d) KSHYRHISPAKV;
e) RPRTRLHTHRNR
f) RPRTRLHTHRTE;
g) KPRTRLHTHRNR; y
h) secuencias que comprenden las secuencias a) a
g).
4. Péptido según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende
además grupos solubles en agua.
5. Péptido según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende
además anticuerpos.
6. Péptido según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende
además grupos adecuados para uso en procedimientos de formación de
imagen u otra señal.
7. Péptido según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, caracterizado porque comprende
además grupos que aceleran la reeliminación del cuerpo del péptido
libre o unido a A\beta.
8. Uso de los péptidos según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un agente para el
diagnóstico de la demencia de Alzheimer en individuos vivos.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que los
péptidos se utilizan como agente de contraste para la detección de
placas amiloides.
10. Uso según la reivindicación 8 ó 9, en el que
los péptidos se marcan radiactivamente.
11. Uso según una cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 10, en el que el diagnóstico se realiza
mediante PET.
12. Uso según la reivindicación 8, en el que la
detección se realiza mediante tomografía de espín nuclear o
detección de infrarrojo cercano.
13. Uso de los péptidos según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un medicamento
para la prevención y/o la terapia de la demencia de Alzheimer.
14. Uso de los péptidos según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de una composición
para examinar la relación entre hallazgos patológicos y síntomas de
la enfermedad en la demencia de Alzheimer.
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