DE10347326B4

DE10347326B4 - Anordnung mit einem Mikroskop und einem Modul

Info

Publication number: DE10347326B4
Application number: DE10347326.2A
Authority: DE
Inventors: Dr. Borlinghaus Rolf
Original assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Current assignee: Leica Microsystems CMS GmbH
Priority date: 2003-10-11
Filing date: 2003-10-11
Publication date: 2022-08-04
Anticipated expiration: 2023-10-12
Also published as: US20050078362A1; DE10347326A1

Abstract

Anordnung mit einem Mikroskop (3) und einem Modul (37) zur Ankopplung an das Mikroskop (3), wobei das Modul (37) eine Lichtquelle (39), die Beleuchtungslicht (41) emittiert, und eine Vorrichtung (43) umfasst, die in einem Bildfeld des Mikroskops (3) ein Beleuchtungsmuster erzeugt, das eine Probe (21) photochemisch verändert,wobei das Mikroskop (3) ein Stativ mit einem Port aufweist, durch den das Beleuchtungslicht (41) der Lichtquelle (39) einkoppelbar ist, undwobei das Modul (37) über eine Ankoppelmechanik (51) an das Stativ des Mikroskops ankoppelbar ist,wobei die Vorrichtung (43) eine Strahlablenkeinrichtung beinhaltet, oderdie Vorrichtung (43) ein MMD, Micro Mirror Device, beinhaltet.

Description

Die Erfindung betrifft eine Anordnung mit einem Mikroskop und einem Modul zur Ankopplung an das Mikroskop.
Für viele mikroskopische Experimente ist es unerlässlich, die Probe beispielsweise photochemisch zu manipulieren. In der Zellbiologie werden Proben oft mit Verbindungen präpariert, die Calcium oder Aminosäuren wie Glutamat enthalten. Diese Verbindungen - Caged-Compound - bestehen zum einen aus dem „gefangenen“ Calcium oder Glutamat und zum anderen aus den sogenannten Komplexbildnern - in englischer Sprache: gelators. Diese Verbindungen können durch Einstrahlen von UV-Licht oder durch Zwei-Photonen-Prozesse aufgebrochen werden, wobei man hier von einer Photoaktivierung spricht. Das freiwerdende Calcium oder das freiwerdende Glutamat ist dann in der Lage, weitere Reaktionen auszulösen.
Aus der Offenlegungsschrift DE 100 43 986 A 1 ist ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe und ein konfokales Scanmikroskop bekannt. Das konfokale Scanmikroskop weist eine Lichtquelle, vorzugsweise einen Laser zur Erzeugung eines Beleuchtungslichtstrahls und eine Strahlablenkeinrichtung zur Führung des Beleuchtungslichtstrahls über die Probe auf. Es sind Mittel zum Aufnehmen eines Voransichtsbildes und Mittel zum Markieren mindestens eines interessierenden Bereichs im Voransichtsbild vorgesehen, wobei dem Bereich oder den Bereichen individuelle Beleuchtungslichtstrahlwellenlängen und oder Beleuchtungslichtstrahlleistungen zuordenbar und der Bereich oder die Bereiche der Probe gemäß der Zuordnung beleuchtbar sind und wobei durch das Beleuchten mindestens eine Manipulation in mindestens einem Bereich durchführbar ist.
In der Rastermikroskopie wird eine Probe mit einem Lichtstrahl beleuchtet, um das von der Probe ausgehende Reflexions- oder emittierte Fluoreszenzlicht zu beobachten. Der Fokus eines Beleuchtungslichtstrahles wird mit Hilfe einer steuerbaren Strahlablenkeinrichtung, im Allgemeinen durch Verkippen zweier Spiegel, in einer Objektebene bewegt, wobei die Ablenkachsen meist senkrecht aufeinander stehen, so dass ein Spiegel in x-, der andere in y-Richtung ablenkt. Die Verkippung der Spiegel wird beispielsweise mit Hilfe von Galvanometer-Stellelementen bewerkstelligt. Die Leistung des vom Objekt kommenden Lichts wird in Abhängigkeit von der Position des Abtaststrahls gemessen. Üblicherweise werden die Stellelemente mit Sensoren zur Ermittlung der aktuellen Spiegelstellung ausgerüstet.
Speziell in der konfokalen Rastermikroskopie wird ein Objekt mit dem Fokus eines Lichtstrahles in drei Dimensionen abgetastet. Ein konfokales Rastermikroskop beinhaltet im Allgemeinen eine Lichtquelle, eine Fokussieroptik, mit der das Licht der Quelle auf eine Lochblende - die sog. Anregungsblende - fokussiert wird, einen Strahlteiler, eine Strahlablenkeinrichtung zur Strahlsteuerung, eine Mikroskopoptik, eine Detektionsblende und die Detektoren zum Nachweis des Detektions- bzw. Fluoreszenzlichtes. Das Beleuchtungslicht wird dabei über den Strahlteiler eingekoppelt. Das vom Objekt kommende Fluoreszenz- oder Reflexionslicht gelangt über die Strahlablenkeinrichtung zurück zum Strahlteiler, passiert diesen, um anschließend auf die Detektionsblende fokussiert zu werden, hinter der sich die Detektoren befinden. Detektionslicht, das nicht direkt aus der Fokusregion im Objekt stammt, nimmt einen anderen Lichtweg und passiert die Detektionsblende nicht, so dass man nur Informationen aus der Fokusregion erhält, die durch sequentielles Abtasten des Objekts zu einem dreidimensionalen Bild führen. Meist wird ein dreidimensionales Bild durch schichtweise Bilddatenaufnahme erzielt, wobei die Bahn des Abtastlichtstrahles auf bzw. in dem Objekt idealerweise einen Mäander beschreibt. Um eine schichtweise Bilddatenaufnahme zu ermöglichen, wird der Probentisch oder das Objektiv nach dem Abtasten einer Schicht verschoben und so die nächste abzutastende Schicht in die Fokusebene des Objektivs gebracht.
Aus der Druckschrift US 5 923 466 A ist ein konfokales Mikroskop mit einem Lichtmodulationssystem bekannt, das eine Blendenanordnung aufweist, die aus einer Lichtquelle stammendes Beleuchtungslicht zu einem Beleuchtungsmuster formt. Das Lichtmodulationssystem 12 umfasst ferner ein Detektionssystem zur Erfassung von Detektionslicht, das aus einer mit dem Beleuchtungsmuster beaufschlagten Probte stammt.
Die Druckschrift US 4 561 731 A offenbart ein Mikroskop mit einem Stativ, das einen Port zur Einkopplung von Beleuchtungslicht aufweist.
Aus der Druckschrift DE 197 54 254 A1 ist ein Laser-Scanning-Mikroskop bekannt, bei dem die Ausgangsstrahlung eines Saphir-Ringlasers über einen Strahlaufweiter und einen Strahlabschwächer in den externen Port des Mikroskops eingekoppelt wird. Die eingekoppelte Strahlung wird über eine in dem Mikroskop vorhandene Scanningeinheit über ein photosensitives Speichermedium geführt, um im Wege einer Zweiphotonenanregung das Speichermedium mit Daten zu beschreiben.
Ein ähnliche Anordnung ist in der Druckschrift DE 197 19 344 A1 beschrieben. Diese Anordnung weist zusätzlich ein Mittel zur Umschaltung zwischen einem kontinuierlich arbeitenden Lasermodus und einem gepulsten Lasermodus auf. Dieses Umschaltmittel kann aus einem Flüssigkristallfilter, einem akustooptischen Bauteil oder einem elektrooptischen Bauteil gebildet sein.
Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine universelle und an die jeweiligen Experimentierbedingungen anpassbare Möglichkeit zur photochemischen Veränderung einer Probe zu schaffen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch die Anordnung nach Anspruch 1.
Die Erfindung hat den Vorteil, dass das Modul zur Ankopplung an jedes Mikroskop anpassbar ausgebildet sein kann. Darüber hinaus ist das Modul mit unterschiedlichsten Lichtquellen bzw. Vorrichtungen zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters bestückbar, so dass eine universelle Anpassung an die jeweiligen Experimentierbedingungen ermöglicht ist.
In einer besonderen Ausgestaltungsform beinhaltet die Lichtquelle eine Halogenlampe. In einer anderen Variante ist als Lichtquelle eine Hochdrucklampe, insbesondere eine Quecksilberhochdrucklampe vorgesehen. In einer ganz besonders bevorzugten Ausgestaltungsform beinhaltet die Lichtquelle zumindest einen Laser, der beispielsweise als Multilinienlaser ausgeführt sein kann.
Zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters ist eine Strahlablenkeinrichtung, die beispielsweise auf der Basis von Galvanometerspiegeln ausgeführt ist, vorgesehen. In einer anderen Variante sind zur Führung des Beleuchtungslichts drehbar angeordnete Prismen vorgesehen. Bei den genannten Ausführungsformen wird das Beleuchtungsmuster in der Probe durch gezieltes Führen des Beleuchtungslichts entlang vorgegebener Beleuchtungsbahnen erzeugt.
In einer anderen Variante wird das Beleuchtungsmuster in die Probe projiziert. Hierzu beinhaltet die Vorrichtung, die in einem Bildfeld des Mikroskops ein Beleuchtungsmuster erzeugt, ein MMD (Mikro-Mirror-Device).
Das Beleuchtungslichtmuster kann ein Punktmuster, ein Linienmuster, ein abgegrenztes Flächenstück oder ein Volumen beinhalten.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsform sind Mittel zur Variierung der Lichtleistung des Beleuchtungslichts vorgesehen. Vorzugsweise ist die Lichtleistung des Beleuchtungslichts während des Abfahrens einer Beleuchtungsbahn veränderbar. Das Mittel zur Variierung der Lichtleistung beinhaltet vorzugsweise ein akustooptisches Bauteil, das beispielsweise als AOTF (acousto-optical-tunable-filter) ausgeführt sein kann. In einer anderen Variante beinhaltet das Mittel zur Variierung der Lichtleistung ein elektrooptisches Bauteil.
Das Beleuchtungsmuster kann, wenn es die Randbedingungen des Experiments verlangen, Teilbereiche mit unterschiedlicher Beleuchtungslichtintensität aufweisen.
In einer besonders bevorzugten Ausgestaltungsvariante ist das Mikroskop, an das das Modul ankoppelbar ist, ein Rastermikroskop oder ein konfokales Rastermikroskop.
Das Mikroskop weist ein Stativ mit einem Port auf, durch den das Beleuchtungslicht der Lichtquelle einkoppelbar ist. In einer vorteilhaften Variante ist eine Justiereinrichtung zum Justieren des Strahlengangs des Beleuchtungslichts vorgesehen. Vorzugsweise arbeitet diese Justiervorrichtung automatisch.
In einer bevorzugten Variante beinhaltet das photochemische Verändern der Probe ein Ausbleichen der Probe. In einer anderen Variante beinhaltet das photochemische Verändern ein Aktivieren oder ein Deaktivieren eines Probenfarbstoffes. In einer ganz anderen bevorzugten Variante beinhaltet das photochemische Verändern ein Freisetzen von zuvor gebundenen Stoffen.
Das Beleuchtungsmuster wird vorzugsweise vom Benutzer festgelegt. Hierzu kann zunächst ein Voransichtsbild aufgenommen werden, indem der Benutzer die vom Beleuchtungsmuster abzudeckenden Bereiche beispielsweise mit einem Zeigegerät (Computermaus) festlegen kann. Es kann auch vorgesehen sein, dass die mit dem Beleuchtungsmuster zu beaufschlagenden Bereiche beispielsweise von einer Bildauswertungssoftware automatisch festgelegt werden.
In einer ganz anderen bevorzugten Variante beinhaltet das photochemische Verändern ein Freisetzen von zuvor gebundenen Stoffen.
In der Zeichnung ist der Erfindungsgegenstand schematisch dargestellt und wird anhand der Figuren nachfolgend beschrieben, wobei gleich wirkende Elemente mit denselben Bezugszeichen versehen sind. Dabei zeigt:

1 Ein Mikroskop mit einem angekoppelten erfindungsgemäßen Modul

1 zeigt ein Mikroskop 1, das als Rastermikroskop 3 ausgebildet ist. Das Rastermikroskop 3 beinhaltet einen Laser 5, der einen Abtastlichtstrahl 7 erzeugt. Der Abtastlichtstrahl 7 wird von dem Hauptstrahlteiler 9 zu einer Scaneinrichtung 11 geleitet, die einen kardanisch aufgehängten Scanspiegel 13 beinhaltet. Der kardanisch aufgehängte Scanspiegel 13 führt den Abtastlichtstrahl 7 durch die Scanoptik 15, die Tubusoptik 17 und durch das Mikroskopobjektiv 19 hindurch, über bzw. durch die Probe 21. Das von der Probe 21 ausgehende Detektionslicht 23 gelangt auf dem umgekehrten Lichtweg, nämlich durch das Objektiv 19, die Tubusoptik 17, die Scanoptik 15 und über den kardanisch aufgehängten Scanspiegel 13 zurück zum Hauptstrahlteiler 9, passiert diesen und die nachfolgende Detektionslochblende 25, um anschließend als Photomultiplier 27 zu dem ausgeführten Detektor 29 zu gelangen. Der Detektor 29 erzeugt elektrische zur Lichtleistung des Detektionslichts 23 proportionale Detektionssignale, die an die Verarbeitungseinheit 31 weitergegeben werden. Die Verarbeitungseinheit 31 ordnet die erhaltenen Daten den Positionsdaten der Scaneinrichtung 11 zu und bildet daraus Bilddaten, die an einen PC 33 übergeben werden, auf dessen Monitor 35 ein Abbild der Probe dargestellt wird.
An das Rastermikroskop 3 ist ein Modul 37 mit einer Lichtquelle 39, die Beleuchtungslicht 41 emittiert und mit einer Vorrichtung 43, die in einem Bildfeld des Rastermikroskops 3 ein Beleuchtungsmuster für photochemische Veränderung der Probe erzeugt, angekoppelt. Die Vorrichtung zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters beinhaltet ein LCD-Element 45, das das Muster des Beleuchtungslichts gemäß den Vorgaben des Benutzers verändert. Der Benutzer nimmt seine Einstellungen hierzu über den PC 33 vor. Die Vorrichtung zur Erzeugung des Beleuchtungsmusters beinhaltet zwei Optiken 47 und 49 zur Erzielung einer optimalen Abbildung des Beleuchtungsmusters im Bildfeld der Probe 21, das Modul 37 über die Ankoppelmechanik 51 auf einfache Weise an das Stativ des Rastermikroskops ankoppelbar. Die Einkopplung des Beleuchtungslichts 41 erfolgt im Rastermikroskop über einen Strahlteiler 53, der so ausgelegt ist, dass er das Beleuchtungslicht reflektiert und gleichzeitig Licht der Wellenlänge des Abtastlichtstrahls sowie Licht der Wellenlänge des Detektionslichts passieren lässt.
Die Erfindung wurde in Bezug auf eine besondere Ausführungsform beschrieben. Es ist jedoch selbstverständlich, dass Änderungen und Abwandlungen durchgeführt werden können, ohne dabei den Schutzbereich der nachstehenden Ansprüche zu verlassen.
Bezugszeichenliste

1: Mikroskop
3: Rastermikroskop
5: Laser
7: Abtastlichtstrahl
9: Hauptstrahlteiler
11: Scaneinrichtung
13: Scanspiegel
15: Scanoptik
17: Tubusoptik
19: Mikroskopobjektiv
21: Probe
23: Detektionslicht
25: Detektionslochblende
27: Photomultiplier
29: Detektor
31: Verarbeitungseinheit
33: PC
35: Monitor
37: Modul
39: Lichtquelle
41: Beleuchtungslicht
43: Vorrichtung zur Erzeugung eines Beleuchtungsmusters
45: LCD-Element
47: Optik
49: Optik
51: Ankoppelmechanik
53: Strahlteiler

Claims

Anordnung mit einem Mikroskop (3) und einem Modul (37) zur Ankopplung an das Mikroskop (3), wobei das Modul (37) eine Lichtquelle (39), die Beleuchtungslicht (41) emittiert, und eine Vorrichtung (43) umfasst, die in einem Bildfeld des Mikroskops (3) ein Beleuchtungsmuster erzeugt, das eine Probe (21) photochemisch verändert, wobei das Mikroskop (3) ein Stativ mit einem Port aufweist, durch den das Beleuchtungslicht (41) der Lichtquelle (39) einkoppelbar ist, und wobei das Modul (37) über eine Ankoppelmechanik (51) an das Stativ des Mikroskops ankoppelbar ist, wobei die Vorrichtung (43) eine Strahlablenkeinrichtung beinhaltet, oder die Vorrichtung (43) ein MMD, Micro Mirror Device, beinhaltet.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (39) eine Halogenlampe beinhaltet.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (39) eine Hochdrucklampe, insbesondere eine Quecksilberhochdrucklampe, beinhaltet.
Anordnung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Lichtquelle (39) einen Laser beinhaltet.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlablenkeinrichtung zumindest einen Galvanometerspiegel beinhaltet.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Strahlablenkeinrichtung zumindest ein drehbar angeordnetes Prisma beinhaltet.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungslichtmuster ein Punktmuster beinhaltet.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungslichtmuster ein Linienmuster beinhaltet.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungslichtmuster ein abgegrenztes Flächenstück beinhaltet.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungslichtmuster ein Volumen beinhaltet.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mittel zur Variierung einer Lichtleistung des Beleuchtungslichtes vorgesehen ist.
Anordnung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zur Variierung der Lichtleistung ein akustooptisches Bauteil, insbesondere einen AOTF, oder ein elektrooptisches Bauteil beinhaltet.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass das Beleuchtungslichtmuster unterschiedliche Teilbereiche mit unterschiedlicher Beleuchtungslichtintensität aufweist.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (3) ein Rastermikroskop ist.
Anordnung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Mikroskop (3) ein konfokales Rastermikroskop ist.
Anordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass eine Justiereinrichtung zum Justieren des Strahlenganges des Beleuchtungslichtes vorgesehen ist.
Anordnung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Justiervorrichtung automatisch arbeitet.