DE1126399B

DE1126399B - Verfahren zur Herstellung cytostatisch wirkender Derivate des p-[Bis-(2-chloraethyl)-amino]-phenylalanins

Info

Publication number: DE1126399B
Application number: DEN19067A
Authority: DE
Inventors: Franz Bergel; John Albert Stock
Original assignee: NAT RES DEV; National Research Development Corp UK
Current assignee: NAT RES DEV; National Research Development Corp UK
Priority date: 1959-10-22
Filing date: 1960-10-21
Publication date: 1962-03-29

Description

Verfahren zur Herstellung cytostatisch wirkender Derivate des p-[Bis-(2-chloräthyl)-amino]-phenylalanins Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Chemotherapeutica mit Hemmwirkung gegenüber Tumorwachstum.
In der britischen Patentschrift 750 155 ist das p-[Bis-(2-chloräthyl)-amino]-phenylalanin beschrieben. Die Verbindung hat die Formel Sie besitzt ein asymmetrisches Kohlenstoffatom und existiert daher in der D- als auch L-Form sowie als Racemat. Die L-Form dieser Verbindung ist unter Namen Melphalan bekannt und wirkt ausgeprägt cytostatisch.
Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Herstellung von Derivaten dieser Verbindung, insbesondere der L-Isomeren mit einer cytostatischen Wirkung, die vergleichbar ist mit der Stammverbindung, die jedoch eine geringere Toxizität besitzen und infolgedessen ein günstigeres Verhältnis von Aktivität zu Giftigkeit aufweisen.
Diese Derivate sind Diastereoisomere von Verbindungen der allgemeinen Formel worin R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und X eine Formyl- oder Acetylgruppe bedeutet und der Rest aus einer optisch aktiven a-Aminosäure mit nur einer Aminogruppe herrührt.
Die Verbindungen der obenstehenden allgemeinen Formel sind bisher in der Literatur nicht beschrieben, sie besitzen zwei asymmetrische Kohlenstoffatome, und sie können daher in diastereoisomeren Formen auftreten, d. h. als LL-, DD-, DL- und LD-Formen.
Bei den bevorzugten Verbindungen gemäß der Erfindung besitzt der p-[Bis-(2-chloräthyl)-amino]-phenylalaninesterteil des Moleküls die L-Konfiguration, und die Aminosäure, mit der die Peptidbindung eingegangen ist, ist eine optisch aktive natürliche Aminosäure, z. B. L-Phenylalanin, oder ein substituiertes Derivat einer derartigen Aminosäure, z. B. p-Nitro-L-phenylalanin oder die entsprechenden Enantiomorphen.
Die Verbindungen gemäß der Erfindung können nach jedem der bekannten Verfahren zur Herstellung von Dipeptiden gewonnen werden.
Ein besonders geeignetes Verfahren besteht in der Umsetzung eines Derivates einer Aminosäure der allgemeinen Formel worin X die oben beschriebene Bedeutung besitzt, mit einem Ester der Chlorameisensäure, z. B. dem Äthyl-, n-Butyl- oder Isobutylester, in Gegenwart eines geeigneten Säurereakzeptors bzw. Säure bindenden Mittels, wie Triäthylamin. Anschließend wird das gebildete gemischte Anhydrid mit einem Phenylalaninderivat der allgemeinen Formel zur Reaktion gebracht, worin R die oben beschriebene Bedeutung besitzt. Soll R im Endprodukt ein Wasserstoffatom bedeuten, so wird die Carboxylgruppe des Phenylalaninderivats in ein Salz umgewandelt, z. B. ein Alkalisalz, bevor man die Verbindung mit dem gemischten Anhydrid zur Reaktion bringt. Anschließend wird durch Ansäuern die Säure wieder in Freiheit gesetzt. Die erfindungsgemäß hergestellten Verbindungen können aus dem Reaktionsgemisch z. B. durch Lösungsmittelextraktion gewonnen werden.
In einer bevorzugten Durchführungsform der Erfindung wird Chlorameisensäureisobutylester zu einer Lösung von N-Acetyl-L-phenylalanin und Triäthylamin in Tetrahydrofuran gegeben. Die erhaltene Lösung wird mit p-[Bis-(2-chloräthyl)-amino-L-phenylalaninäthylester versetzt. Zur Vervollständigung der Reaktion läßt man das Reaktionsgemisch einige Zeit stehen und isoliert den N-Acetyl-L-phenylalanyl-p-[bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylester durch Lösungsmittelextraktion. Dieses Verfahren ist in technischer Hinsicht vorteilhaft, doch wurde festgestellt, daß bei der Bildung des gemischten Anhydrids das asymmetrische Kohlenstoffatom des Ausgangsmaterials teilweise racemisiert, wodurch als Endprodukt ein Gemisch von zwei der möglichen Diastereoisomeren anfällt.
Ein anderes Verfahren zur Herstellung der Verbind. ngen der Erfindung besteht in der Umsetzung des p-[Bis-(2-chloräthyl)-amino]-phenylalaninesters mit einem Carbonsäureazid der allgemeinen Formel Dieses Verfahren ist als Curtius-Verfahren bekannt. Die Umsetzung wird im allgemeinen in der Kälte in einem mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel durchgeführt, wie Äthylacetat, Äther oder bestimmten Kohlenwasserstoffen. Bei diesem Verfahren erfolgt keine Veränderung der sterischen Konfiguration am Asymmetriezentrum.
Beispiel 1 1,32 ml (10 mMol) Chlorameisensäureisobutylester werden tropfenweise unter Rühren zu einer eisgekühlten Lösung von 2,07 g (10 rnMol) N-Acetyl-L-phenylalanin und 1,40 ml (10 mMol) trockenem Triäthylamin in 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 15 Minuten bei 0°C stehengelassen und anschließend mit einer frisch hergestellten Lösung von 3,70 g (10 mMol) p-[Bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylester, Hydrochlorid und 1,4 ml Triäthylamin in 20 ml Chloroform versetzt. Die Lösung wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Hierauf wird das Gemisch unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft, der Rückstand mit Äthylacetat extrahiert und die Äthylacetatlösung nacheinander mit 0,1 n-Salzsäure (eine Emulsion wird durch Abzentrifugieren gebrochen), Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen mit Magnesiumsulfat wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand nach Lösen in kaltem Methanol durch vorsichtige Zugabe von Wasser zur Kristallisation gebracht. Man erhält 3,6 g (70 °/o der Theorie) an N-Acetylphenylalanyl-p-[bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylester vom Fp. 156 bis 158°C in Form farbloser Stäbchen; [,x]' = -I-10° (111/0 in Äthanol) oder +31° (2°/o in Chloroform).

C26H33C12N304:

Berechnet ... C59,8, H6,4, Cl 13,6, N8,011/0;

gefunden ... C60,2, H6,4, C113,9, N8,30/0.

Das Produkt ist ein Isomerengemisch, und es enthält einen größeren Anteil des äußerst aktiven N-Acetyl-L-phenylalanylisomers und in geringerer Menge das D-Isomer.
Biologische Tests dieser Verbindung ergaben, daß die zur vollständigen Hemmung des Wachstums von Walker-Tumoren in Ratten benötigte Minimaldosis 12,5 mg/kg und die LDso bei Ratten etwa 300 mg/kg beträgt. Diese Werte liegen sehr günstig im Vergleich zu anderen tumorwachstumshemmenden Verbindungen.
Beispiel 2 Beispiel 1 wurde unter Verwendung von N-Acetyl-D-phenylalanin anstatt des L-Isomers wiederholt. Der erhaltene N-Acetylphenylalanyl-p-[bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylester schmilzt bei 170 bis 172°C; [cx] D = -I-28,3° (2,3 °/(, in Chloroform).

Ce6H33 C12 N3 04:

Berechnet ... C59,8, 1 16,4, Cl 13,6, N8,0'/0;

gefunden ... C59,8, H6,5, Cl 13,7, N8,00/0.

Ebenso wie im Beispiel 1 ist das Reaktionsprodukt ein Gemisch von zwei Diastereoisomeren. Die Walker-Tumoren in Ratten wurden bei einer Dosis von 25 mg/kg mäßig im Wachstum gehemmt, und die LD5o beträgt für Ratten etwa 700 mg/kg.
Beispiel 3 Beispiel 1 wurde unter Verwendung von N-Acetylp-nitro-L-phenylalanin anstatt N-Acetyl-L-phenylalanin wiederholt. Der erhaltene N-Acetyl-p-nitrophenylalanyl-p-[bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylester schmilzt bei 167 bis 170°C; [x]'[)' = -f-39° (20/0 in Chloroform).

C2sH32C12N406:

Berechnet ... C 55,0, H 5,7, Cl 12,5, N 9,9 °/o;

gefunden ... C 55,3, H 5,8, Cl 12,5, N 10,0 °/o.

Wie im Beispiel 1 ist das Produkt ein Gemisch von zwei Diastereoisomeren. Das Wachstum von Walker-Tumoren in Ratten wurde bei einer Dosis von 250 mg/kg vollständig gehemmt; die LD" beträgt bei Ratten etwa 500 mg/kg. Beispiel 4 Beispiel 1 wurde unter Verwendung von N-Acetylp-nitro-D-phenylalanin an Stelle von N-Acetyl-L-phenylalanin wiederholt. Der erhaltene N-Acetyl-pnitrophenylalanyl - p - [bis - (2 - chloräthyl) - amino]-L-phenylalaninäthylester schmilzt bei 125 bis 127°C; [x] -D" _ -,'42° (20/0 in Chloroform).

C26 H32 CI N4 0,:

/p;

Berechnet ... C 55,0, H 5,7, Cl 12,5, N 9,91

gefunden ... C 55,3, H 5,7, Cl 12,2, N 9,7°/o.

Ebenso wie im Beispiel 1 ist das Produkt ein Gemisch von zwei Diastereoisomeren. Das Wachstum der Walker-Tumoren in Ratten wurde bei einer Dosis von 100 mg/kg vollständig gehemmt; die LD50 beträgt bei Ratten etwa 700 mg/kg.
Beispiel 5 Beispiel 1 wurde unter Verwendung von N-Acetyl-L-leucin an Stelle von N-Acetyl-L-phenylalanin wiederholt. Der erhaltene N-Acetylleucyl-p-[bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylester schmilzt bei 130 bis 132°C; [,x]" = +39,1' (2,5 0/0 in Chloroform).

C23 H 35 C12 N3 04

Berechnet ... C 56,6, H 7,2, CI 14,5, N 8,60/0;

gefunden ... C 56,7, H 6,8, Cl 14,7, N 8,2°/o.

Ebenso wie im Beispiel 2 ist das Produkt ein Gemisch von zwei Diastereoisomeren. Das Wachstum der Walker-Tumoren in Ratten wurde bei einer Dosis von 12,5 mg/kg vollständig gehemmt; die LD50 für Ratten beträgt etwa 75 mg/kg.
Beispiel 6 Beispiel 1 wurde unter Verwendung von N-Acetyl-D-leucin an Stelle von N-Acetyl-L-phenylalanin wiederholt. Der erhaltene N-Acetylleucyl-p-[bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylester schmilzt bei 132 bis 133°C; [x]o' = r42,5° (20/0 in Chloroform).

C23 H35 C12 N3 04

Berechnet ... C 56,6, H 7,2, Cl 14,5, N 8,6 0/0;

gefunden ... C 56,8, H 6,9, Cl 14,8, N 8,80/0.

Wie im Beispiel 1 ist das Produkt ein Gemisch von zwei Diastereoisomeren. Das Wachstum von Walker-Tumoren in Ratten wurde bei einer Dosis von 5 mg/kg vollständig gehemmt; LD50 = 80 mg/kg bei Ratten. Beispiel 7 Beispiel 1 wurde unter Verwendung von N-Formyl-L-phenylalanin an Stelle von N-Acetyl-L-phenylalanin wiederholt. Der erhaltene N-Formylphenylalanylp-[bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylester schmilzt bei 154 bis 156'C; [,x] ö = r-29,1 ° (2,3 0/0 in Chloroform).

C25 H31 C12 N3 04

Berechnet .. . C 59,l, H 6, 1, Cl 14,0, N 8,30/0;

gefunden ... C 59,2, H 6,3, Cl 13,7, N 8,00/0.

Wie im Beispiel 1 ist das Produkt ein Gemisch von zwei Diastereomeren. Das Wachstum von Walker-Tumoren in Ratten wurde bei einer Dosis von 12,5mg/kg vollständig gehemmt; LD50 = 200 mg/kg bei Ratten. Beispiel 8 1,06g (5,7 mMol) N-Acetyl-L-leucinhydrazid in 10 ml Eisessig gelöst werden mit 25 ml Wasser versetzt. Die Lösung wird im Eisbad abgekühlt, dann mit 2 ml konzentrierter Salzsäure (d = 1,16) und hierauf mit einer Lösung von 0,44 g (6,4 mMol) Natriumnitrit in 1 ml Wasser versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit eiskaltem Äthylacetat extrahiert, die organische, das Azid enthaltende Phase mit eiskalter gesättigter Natriumbicarbonatlösung und anschließend mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und abfiltriert.
In der Zwischenzeit werden 0,8 ml (5,7 mMol) Triäthylamin zu einer Lösung von 2,1 g (5,7 mMol) p-[Bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylesterhydrochlorid in 15 ml kaltem Äthyacetat unter Rühren gegeben. Diese Lösung wird hierauf zur vorher bereiteten Azidlösung zugegeben und das Gemisch über Nacht stehengelassen. Anschließend wird die Lösung mit 0,1 n-Salzsäure, Natriumbicarbonatlösung mit Wasser gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft; der Rückstand wird in kaltem Äthanol aufgenommen und durch vorsichtige Zugabe von Wasser zur Kristallisation gebracht. Der N-Acetyl-L-leucylp-[bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylester schmilzt bei 134 bis 135°C; [x]" = -r-25,7° (2,5°/o in Chloroform); Ausbeute 1,5 g (53°/o der Theorie). Beispiel 9 Beispiel 8 wurde unter Verwendung von N-Acetyl-L-phenylalaninhydrazid an Stelle von N-Acetyl-L-leucinhydrazid wiederholt. Der erhaltene N-Acetyl-L-phenylalanyl-p-[bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylester schmilzt bei 150 bis 152°C [x] r-38,9° (2,2°/o in Chloroform).
Beispiel 10 Beispiel 1 wurde unter Verwendung von N-Acetyl-L-valin an Stelle von N-Acetyl-L-phenylalanin wiederholt. Der erhaltene N-Acetyl-L-valyl-0-[bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylester schmilzt bei 181 bis 186°C; [x]ö5 = +31° (2,2°/o in Chloroform). Beispiel 11 Beispiel 1 wurde unter Verwendung von N-Acetyl-L-alanin an Stelle von N-Acetyl-L-phenylalanin wiederholt. Der N-Acetyl-L-alanyl-p-[bis-(2-chloräthyl)-amino]-L-phenylalaninäthylester schmilzt bei 95 bis 100°C; [x]'DS = +45,4° (1,9°/o in Chloroform).

Claims

PATENTANSPRÜCHE: 1. Verfahren zur Herstellung cytostatisch wirkender Derivate des p-[Bis-(2-chloräthyl)-amino]-phenylalanins der allgemeinen Formel 1 worin R Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und X eine Formyl- oder Acetylgruppe bedeutet und der Rest Il sich von einer optisch aktiven a-Aminosäure mit nur einer Aminogruppe im Molekül ableitet, da-durch gekennzeichnet, daß man einen Aminosäureester der allgemeinen Formel III worin R die oben angegebene Bedeutung besitzt, mit einer N-Formyl- oder N-Acetylaminosäure der allgemeinen Formel IV worin X und Y die oben angegebene Bedeutung besitzen, oder einem funktionellen Derivat dieser Carbonsäure in an sich bekannter Weise unter Bildung eines Dipeptids (I) kondensiert.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als funktionelles Derivat der Carbonsäure ein gemischtes Anhydrid verwendet, daß sich von der Verbindung der allgemeinen Formel IV und einem niederen Alkylester der Chlorameisensäure ableitet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkylester der Chlorameisensäure Chlorameisensäureisobutylester verwendet.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als funktionelles Derivat der Carbonsäure ein Carbonsäureazid verwendet.
5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als p-[Bis-(2-chloräthyl)-amino]-phenylalaninester das L-Isomere verwendet.