DE1205655B - Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums WG 696 - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums WG 696 Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer bisher unbekannten cytostatischen Verbindung, die im folgenden als WG 696 bezeichnet wird. Diese Verbindung weist, wie sich herausgestellt hat, eine Aktivität gegen Pilze auf.
• Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf ein Verfahren, welches darin besteht, daß der Organismus Trichoderma viride Leo ND 8 in einem wäßrigen Nährmedlum, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen bebrütet wird, bis die Lösung eine wesentliche Aktivität gegen Pilze aufweist, und dann das auf diese Weise gebildete WG 696 isoliert wird.
• Der besondere Stamm, der den erwähnten Stoff WG 696 bildet, ist aus einer aus Neuguinea stammenden Bodenprobe isoliert und unter Eingangsnummer 14910 in der American Type Culture Collection hinterlegt worden, wo er nur zum Zwecke des Beweises der Offenbarung der vorliegenden Erfindun erhältlich ist.
• Dieser Stamm ist eine Variante von Trichoderma viride Pers. ex. Fries, das zur Gruppe der Fungi imperfeeti, der Ordnung Hyphomeytes und der Familie Mucedinaceae gehört.
• Makroskopisch ist Trichoderma viride Leo ND 8 durch ein rasches Wachstum auf Agarplatten der folgenden Zusammensetzung: Glycerin ..................... 7,5 g Maisquellwasser (50"/,ig) ...... 2,5 g Glucose ..................... 10,0 g Peptone ..................... 5,0 g M9S04 ...................... 0,05 g KI-I2P04 ..................... 0,06 g FeS04 ....................... 0,005 g CUS04 ...................... 0,004 g Agar ........................ 20,0 g Leitungswasser ............. auf 1000 ml pH ......................... 6,5 gekennzeichnet, auf , elchen sich nach Animpfen innerhalb von 48 Stu,iizn bei einer Temperatur von 25'C Kolonien von etwa 2 cm im Durchmesser entwickeln. Das Mycel ist ia den beiden ersten Tagen weiß und niedrig, dann ent,#Nickelt sich ein wollartiges seriales Mycel, und nach 96 Stunden beginnt die Bildung von Konidien, wobei --.'ch die ganze Kolonie dunkelgrün färbt.
• Eine mikroskopische Untersuchung zeigt, daß das Mycel hyalin und septiert ist und 11,2 #L breite Hyphen hat. Die Konidienträger sind aufrecht und verzweigt. Die Phialiden treten getrennt oder in Quirlen auf und sind flaschenförmig, 6 bis 10 #t lang und 2,5 bis 3,5 #L breit. Die Konidien sind hyalin, einzellig, glatt und blaßgrün. Sie sind kugelförmig oder schwach eiförmig und von gleichmäßiger Größe, etwa einer Größe von 3,0 bis 3,2 #t im Durchmesser. Die Konidien liegen in Form von Ketten vor, die im vorgeschrittenen Wachstumsstadium kugelförmige, klebrige Klumpen bilden, von welchen jeder etwa zehn bis zwanzig Konidien enthält.
• Wenn der Pilz in einem flüssigen Kulturmedium gezüchtet wird, werden im Verlauf von 48 bis 144 Stunden beträchtliche Mengen von WG 696 gebildet, die durch einen Agarschalentest unter Verwendung von Candida albieans als Testorganismus nachweisbar sind. Die Fähigkeit zur Bildung von WG 696 wurde in einer Reihe von Versuchen nachgewiesen, bei welchen der Pilz in verschiedenen Kulturmedien bebrütet wurde.
• Bei diesen Versuchen wurden 75 ml eines flüssigen Kulturmediums in einen Schüttelkolben mit einem Inhalt von 500 ml eingebracht und nach dem Sterilisieren mit einer vegetativen Kultur des Pilzes angeimpft, und hierauf wurde die Fermentation bei einer Temperatur von 27'C in einer hin- und hergehenden Schüttelvorrichtune, durchgeführt. Die erhaltenen Ergebnisse sind aus der nachstehend angeführten Tabelle ersichtlich, in der in der ersten Spalte das verwendete Substrat und in der zweiten und dritten Spalte die Hemmungszone angegeben ist, die bei dem erwähnten Agarschalentest nach einer Bebrütun-szeit von 2 bzw. 6 Tagen bestimmt wurde.

  1 1 li 1 111

  S-200 ........... 22 mm 23 mm

  S-25 .............. 47 mm 41 mm

  S-45 .............. 33 mm 33 mm

  S-205 ............. 33 mm 30 mm

  Die Zusammensetzung der verwendeten Substrate

  war wie folgt

  S-200:

  Maisquellwasser (5001jg) ...... 20 g

  KH2P04 ...................... 10 g

  M9S04 ...................... 0,5 g

  Saccharose ................... 50 g

  Leitungswasser auf ............ 1000 ml

  pH ......................... 6,7

  S-25:

  Glycerin ..................... 7,5 g

  Maisquellwasser (501)/,ig) ...... 2,5 g

  Glucose ..................... 10,09

  Staleys Nährstoff

  (Sojabohnenmehl) ............. 15,0-

  M9S04 ...................... 0,05 g

  KH1P04 ..................... 0,06 g

  FeS04 ....................... 0,005 g

  CUS04 ...................... 0,004 g

  Leitungswasser ............ auf 1000 ml

  pH ......................... 6,5

  S-45:

  Saccharose ................... 50,0 g

  NH4N0 . .................... 3,0 g

  KH1P04 ..................... 10,0 g

  Glycerin ..................... 5,0 g

  C ...................... 0,5 g

  O'SO4

  KCI ........................ 0,5 g

  FeS04 ....................... 0,01 g

  ZiiS04 ...................... 0,001 g

  Biotin ....................... 0,01 mg

  Tierisches Öl ................. 1 mi

  Leitungswasser ............ auf 1000 ml

  pH ......................... 6,9

  S-205:

  Fleischextrakt ................ log

  Fischmehl ................... 10 g

  Maisquellenwasser (50"/,ig) .... 5,0 g

  Ammonacetat ................ 2,0 g

  Saccharose ................... 36 g

  Glucose ..................... 9 g

  Leitungswasser ............ auf 1000 ml

  pH ......................... 7,0

  Die nach dem Verfahren gemäß der Erfindung

  erhaltene Verbindung WG 696 ist ein neutraler Stoff,

  der in Wasser nur in geringem Umfang löslich ist, aber

  in den meisten organischen Lösungsmitteln, wie Kohlen-

  wasserstoffen, chlorierten Kohlenwasserstoffen, Alko-

  holen, Ketonen, Estern u. dgl., leicht löslich ist.

  Die Verbindung enthält 69,52 0/0 Kohlenstoff und 8,30 0/0 Wasserstoff und daneben nur mehr Sauerstoff, entsprechend der Formel C17H"04, die auch mit den Ergebnissen der Molekulargewichtsbestimmung dieser Verbindung übereinstimmt.
• Der Schmelzpunkt der kristallinen Verbindung liegt bei 46'C, der Siedepunkt bei 110bis112'C/0,05mmHg. Die Verbindung WG 696 ist optisch aktiv und hat eine spezifische Drehung [x]IDI von -11' in Chloroform (10/,). Sie ist ferner durch ihr UV-Spektrum in Äthanol, das ein Absorptionsmaximum bei etwa 205 m#t (s = 2400) zeigt, und durch ihr Spektrum im 1R-Bereich gekennzeichnet, in welchem es, wie aus der Zeichnung hervorgeht, charakteristische Absorptionsbanden bei den in reziproken Zentimetern ausgedrückten Frequenzen y = 960, 970, 1032, 1084, 1224, 1245, 1376 und 1735 cm-' aufweist, wenn diese Bestimmung mit Hilfe einer Lösung der Verbindung in Tetrachlorkohlenstoff (10/,) erfolgt.
• Die spezifischen mykostatischen und bakteriostatischen Aktivitäten der Verbindung WG 696 wurden mit Hilfe von Reihenverdünnungsversuchen bestimmt. Die Ergebnisse dieser mikrobiologischen Untersuchungen sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben, in der die Aktivitäten als die Menge der Verbindung angegeben sind, die eine 500/(,ige Hemmung (IC,0) des in Frage stehenden Organismus verursacht. Bei diesen Versuchen wurde zur Bestimmung der Aktivität gegen Pilze Sabourauds Nährlösung, zur Bestimmung der Aktivität gegen Bakterien Fleischwasser verwendet.

  Organismus IC5,

  #tg#MI

  Candida albicans ATCC 10231 ........... 0,25

  Candida albieans LSI-1 Z248 .............. 0,32

  Candida parakrusei ..................... 0,28

  Candida parakrusei ..................... 0,40

  Candida utilis .......................... 0,25

  Aspergillus fumigatus CBS ............... 16,0

  Trichophyton mentagrophytes CBS ....... 0,32

  Trichophyton mentagrophytes CBS ....... 0,40

  Saccharomyces cerevisiae ................ 0,10

  Gliocladium deliquescens ................ 5,0

  Verticillium sp . ......................... 4,0

  Cephalosporium sp . ..................... 5,0

  Fusarium sp . ........................... 2,5

  Fusarium sp . ........................... 1,0

  Fusarium sp . ........................... 3,2

  Mucorflavus .......................... 3,2

  Cunninghamella elegans ................. 3,2

  Cunninghamella blakesleana ............. 3,2

  Absidia cylindrospora ................... 1,3

  Rhizopus nigricans ...................... 1,3

  Penicillium sp ........................... 1,6

  Penicillium sp ........................... 3,2

  Aspergillus sp ........................... 12,5

  Aspergillus fiavus ....................... 12,5

  Pseudomonas aeruginosa ................ >l00

  Staphylococcus aureus ................... >l00

  Sarcina lutea FDA 1001 ... ............. >l00

  Streptococcus pyogenes NCTC 6175 ....... >l00

  Corynebacterium xerosis NCTC 9755 ...... >l00

  Klebsiella pneumoniae ................... >l00

  Salmonella typhimurium NCTC 5710 ...... >l00

  Baeillus subtilis ......................... >l00

  Vibrio comma BCTC 8367 ............... >l00

  Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, daß die Verbindung WG696 in den angewandten Konzentrationen nur eine geringe aktibakterielle Wirkung hat, wogegen ihre Aktivität sowohl gegen pathogene als auch gegen nichtpathogene Pilze, einschließlich solcher Pilze, die in der Landwirtschaft und Industrie als Schädlinge auftreten, ganz hervorragend ist.
• Es ist jedoch verständlich, daß die bei den oben angeführten Versuchen festgestellte niedrige antibakterielle Aktivität die Möglichkeit einer Verwendung der Verbindung WG 696 zur Bekämpfung von bestimmten Bakterien, wenn diese Verbindung in höheren Konzentrationen verwendet wird, nicht ausschließt und daß ferner auch eine Verwendung dieser Verbindung in Hinblick auf ihre allgemeine cytostatische Aktivität in Betracht gezogen werden muß. So haben beispielsweise Versuche gezeigt, daß die Verbindung WG 696 in niedrigen Konzentrationen das Wachstum von gewissen Tumorzellen, wie im Falle von Epidermis-Karzinomen des Nasen-Rachen-Raumes von Menschen in einer Gewebekultur, hemmt. Die spezifische Aktivität dieser Verbindung gegen Pilze ist jedoch, was ihre Verwendung in der Human- und Veterinärmedizin betrifft, besonders vorteilhaft. In dieser Hinsicht ist auch ihre niedrige Toxizität bemerkenswert. So konnte bei Tierversuchen, wenn die Verbindung Mäusen subkutan in Form einer Lösung in einem pflanzlichen Öl verabreicht wurde, ein LD"-Wert von 500 bis 1000 mg/kg beobachtet werden, und wenn die Verbindung in der gleichen Form oral verabreicht wurde, betrug die LD" über 1000 mg/kg.
• Ferner zeigten sich bei topischer Anwendung auf der Haut keine nachteiligen Wirkungen, und die Verbindung erwies sich bei der topischen Behandlung von Mykosen bei Mensch und Tier als sehr nützlich. So zeigte sie sich z. B. bei der klinischen Behandlung von durch den Pilz Candida albicans verursachten Hautinfektion bei Menschen besonders brauchbar, und es konnten sogar schwere, durch diesen Pilz hervorgerufene Infektionen, die bei Anwendung anderer, bekannter Verbindungen mit einer Aktivität gegen Pilze nicht angegriffen werden, bei einer Behandlung mit der Verbindung WG 696 geheilt werden.
• Das Verfahren gemäß der Erfindung umfaßt die Verfahrensschritte, die darin bestehen, daß der Organismus Trichoderma viride Leo ND 8 in einem wäßrigen Nährmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthält, unter aeroben Bedingungen gezüchtet wird, bis die Lösung eine wesentliche Aktivität gegen Pilze aufweist, und dann das auf diese Weise gebildete WG 696 isoliert wird.
• Bei Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung wird die Bildungsgeschwindigkeit der Verbindung WG 696 während der gesamten Fermentationsdauer durch routinemäßige Bestimmung der Aktivität des Kulturfiltrates festgestellt, wobei für diesen Zweck der Agarschalentest, beispielsweise unter Verwendung von Candida albicans als Testorganismus, angewandt wird.
• Nach den bei der Herstellung der Verbindung WG 696 in einem halbtechnischen Maßstab erhaltenen Ergebnissen wurde die optimale Ausbeute an diesem Stoff in einem Zeitraum von 48 bis 96 Stunden erzielt, wenn das Fermentationsverfahren bei einer Temperatur von 20 bis 30'C, vorzugsweise einer Temperatur von etwa 27'C, durchgeführt wurde. Der Temperaturbereich ist jedoch nicht kritisch, da die zum Erhalt dieser Ausbeuten erforderliche Zeit in einem gewissen Umfang von der mechanischen Beschaffenheit bzw. Art des Fermentationsgefäßes und von dem Typ der verwendeten Rühreinrichtung abhängt.
• Bei Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung hat sich eine große Anzahl der bekannten Kulturmedien, und zwar sowohl der vollständigen als auch der minimalen Medien, als brauchbar erwiesen.
• Als Kohlenstoff- und Energiequelle werden Zucker Fetten vorgezogen, und von den Zuckern werden Glucose, Fructose, Galactose, Sorbose und Xylose vorzugsweise verwendet, wogegen Saecharose und Lactose von dem Pilz nicht assimiliert werden.
• Als besondere Bestandteile, die an der Zusammensetzung eines geeigneten Kulturmediums beteiligt sind, können Hefeextrakt, Glycerin, Caseinhydrolysate oder Aminosäuren und bestimmte wasserlösliche Vitamine erwähnt werden, und der pH-Wert des Substrates wird vorzugsweise auf etwa 4,5 bis 6,5 eingestellt, bevor das Fermentationsverfahren begonnen wird.
• Wenn die Bildung der Verbindung WG 696 beim Fermentationsverfahren aufhört oder wenn eine zufriedenstellende Ausbeute erreicht ist, wird die Verbindung abgetrennt, aber vorzugsweise nicht, bevor das Mycel von dem Kulturmedium, z. B. durch Filtration, getrennt ist, Die Verbindung WG 696 wird von der Kultur am besten durch Extraktion derselben mit einem organischen Lösungsmittel, das mit Wasser nicht mischbar oder nur teilweise mischbar ist, wie Methylisobutylketon, Hexan, Chloroform, Leichtpetroleum od. dgl., isoliert.
• Der nach Eindampfen des Extraktionsmediums erhaltene Rückstand ist die rohe Verbindung WG 696. Wenn dieses Produkt einer fraktionierten Destillation im Vakuum unterworfen oder chromatographiert wird, wird die reine Verbindung in flüssiger Form erhalten. Als geeignete Adsorbentien für die Chromatographie sind beispielsweise neutrale Tonerde oder Kieselsäuregel und als Lösungsmittel für diesen Zweck insbesondere Kohlenwasserstoffe oder Mischungen von Kohlenwasserstoffen und Äther zu nennen.
• Das auf diese Weise erhaltene flüssige Produkt behält, selbst wenn es rein ist, bei einer Temperatur in der Nähe der Raumtemperatur die erwähnte physikalische Form auf Grund einer ausgeprägten Kristallisationsträgheit eine gewisse Zeit lang bei und kann gewünschtenfalls in dieser Form verwendet werden.
• Bei einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens gemäß der Erfindung wird jedoch auf einfache Weise die Verbindung WG 696 in kristalliner Form erhalten, indem der obenerwähnte Rückstand statt einer fraktionierten Destillation einem Kristallisationsverfahren unterworfen wird, was im Falle einer Herstellung in technischem Maßstab ein Vorteil sein kann, da die Verbindung WG 696 bei erhöhten Temperaturen mehr oder minder instabil ist und selbst dann instabil ist, wenn sie längere Zeit auf die Temperaturen, die für eine Vakuumdestillation erforderlich sind, beispielsweise Temperaturen von 110 bis 120'C, erhitzt wird.
• Bei dieser günstigen Ausführungsform wird das die Verbindung WG 696 enthaltende Kulturmedium mit einem aliphatischen Kohlenwasserstoff, wie Leichtpetroleum, extrahiert und die erhaltene organische Phase zur Trockene eingedampft, wonach dann der Rückstand auf eine Temperatur unter -10'C, vorzugsweise auf eine Temperatur zwischen -20 und -70'C, abgekühlt wird, bei der die Verbindung WG 696 in kurzer Zeit kristallisiert. Im allgemeinen ist es aber vorteilhaft, die Kristallisation in Gegenwart eines geeigneten Lösungsmittels, wie eines Kohlenwasserstoffes, vorzugsweise eines aliphatischen Kohlenwasserstoffes, in dem die Verbindung WG 696 bei niedrigen Temperaturen schwer löslich ist, wie Leichtpetroleum mit einem Kp. von 40 bis 50'C, durchzuführen. Nach dem Kristallisieren wird die ausgefallene Verbindung WG 696 abgetrennt und bei Raumtemperatur getrocknet.
• In gewissen Fällen, beispielsweise wenn der obenerwähnte Rückstand nicht genügend rein ist, kann es sich als vorteilhaft erweisen, diesen Rückstand vor Durchführung des erwähnten Kristallisationsprozesses einer mehr oder weniger wirksamen fraktionierten Destillation zu unterwerfen oder zu chromatographieren.
• Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert.
• Beispiel 1 300 ml eines Substrates der Zusammensetzung: Glycerin ..................... 7,5 g Maisquellwasser (500/0ig) ...... 2,5 g Glucose ..................... 10,0-Staleys Nährstoff (Sojabohnenmehl) .......... 15,0-MgS0 . ...................... 0,05 g KH,PO . ..................... 0,06 g FeSO, ....................... 0,005 g CUSO . ...................... 0,004 g pro Liter Leitungswasser wurden in einen Kolben mit einem Fassungsraum von 2 1 eingebracht, auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und 30 Minuten bei einer Temperatur von 120'C sterilisiert. Nach dem Abkühlen ,wmrde der Inhalt des Kolbens mit einer vegetativen Kultur von Trichoderma viride Leo ND 8, die aus dem Sporenbildungsstadium entwickelt worden war, angeimpft und dann in einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung in einem mit einem Thermostaten ausgestatteten Raum auf einer Temperatur von 27'C gehalten. Die Bildung der Verbindung WG 696 wurde durch Bestimmung der Hemmungszone im Agarschalentest auf filtrierten Proben des Kulturmediums, wobei Candida albicans als Testorganismus verwendet wurde, verfolgt. Nach einer Fermentationszeit von 48 Stunden betrug die Gesamtausbeute 300 #tg je Milliliter des Kulturmediums. Beispiel 2 10001 Substrat der obenerwähnten Zusammensetzung, wobei jedoch die Glucosekonzentration auf 5 0/, erhöht war, wurden in einen Tank aus rostfreiem Stahl mit einem Fassungsraum von 15001 eingebracht und bei einer Temperatur von 120'C 30 Minuten lang sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde der Inhalt des Tanks mit 2,5 1 einer vegetativen Kultur von Trichoderma viride Leo ND 8 angeimpft, die durch Bebrüten des Pilzes in einem Medium der gleichen Zusammensetzung, wie sie im Beispiel 1 angegeben ist, während eines Zeitraumes von 48 Stunden in einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung bei einer Temperatur von 27'C erhalten worden war. Das Fermentationsverfahren in dem Gefäß von halbtechnischem Maßstab wurde 72 Stunden lan- bei einer Temperatur von 27'C unter Rühren und Belüftung durchgeführt, wobei Luft in einer Menge von 0,6 m/h zugeführt wurde. Am Ende der Fermentation lag ein Gehalt von 300 #t- der Verbindung WG 696 je Milliliter des Kulturmediums vor.
• 8 1 der geklärten Kulturflüssigkeit wurden auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit Leichtpetroleum (Kp. 40 bis 50'C) extrahiert; die vereinigten Auszüge (3 1) wurden mit 500 ml Wasser gewaschen, getrocknet und bis zur Sirupkonsistenz eingeengt, und der erhaltene Sirup wurde anschließend im Vakuum destilliert. Die Fraktion mit einem Kp. von 110 bis 112'C/0,05 mm Hg lag in einer Menge von 2,1 g vor und stellte die reine Verbindun- WG 696 dar.
• Analyse (C"H"0,): Gefunden ... C 69,52 0/" H 8,30 berechnet ... C 69,83 0/" H 8,27 0/,. [x]'D' # -11' (1 "/, in Chloroform). Das UV-Absorptionsspektrum in Äthanol zeigte ein Absorptionsmaximum bei etwa 205 m#t (e = 2400), und das IR-Spektrum (1 % in Tetrachlorkohlenstoff) zeigte charakteristische Banden bei 960, 970, 1032, 1084, 1224, 1245, 1376, 1735 und 2790 cm-'.
• 5 g der auf die oben angeführte Weise erhaltenen Verbindung WG 696 wurden in 50 ml Pentan gelöst, und die erhaltene Lösunc, wurde unter Rühren langsam auf eine Temperatur von -70'C abgekühlt, wobei die Verbindung in Form von farblosen Kristallen ausfiel. Die Kristalle wurden abfiltriert, mit kaltem Pentan (Temperatur -50 bis -70'C) gewaschen und getrocknet; es wurde die gewünschte kristalline Verbindung in einer Ausbeute von 4,6 - mit einem Fp. von 46'C erhalten.
• Die Elementaranalyse, die optische Drehung und das IR- und UV-Spektrum waren identisch mit den entsprechenden Daten für das vorhin genannte ölige Produkt.
• Beispiel 3 100 1 eines Substrates der Zusammensetzung: Glycerin ..................... 7,5 g Maisquellwasser (500/,ig) ...... 2,5 g Glucose ..................... 50,0 g Staleys Nährstoff (Sojabohnenmehl) .......... 15,0 g MgS0 . ...................... 0,05 g KH,PO . ..................... 0,06 g FeS0 ........................ 0,005 g CUSO . ...................... 0,004 g pro Liter Leitungswasser wurden in einem Fermenter einer Versuchsanlage mit einem Fassungsraum von 2001 auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt und 30 Minuten bei einer Temperatur von 120'C sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde der Inhalt des Fermenters mit 0,5 1 einer vegetativen Kultur von Trichoderma viride Leo ND 8 angeimpft, die durch Bebrüten des Pilzes in einem Kulturgefäß während eines Zeitraumes von 48 Stunden auf einer hin- und hergehenden Schütteleinrichtung bei einer Temperatur von 27'C erhalten worden war, wobei das bei diesem Keimverfahren verwendete Substrat die gleiche Zusammensetzun g' wie oben angegeben, aufwies, die Konzentration an Glucose jedoch nur 10/, betrug.
• In dem Fermenter der Versuchsanlage wurde ein Fermentationsverfahren 72 Stunden lang bei einer Temperatur von 27'C unter Rühren und Belfftung durchgeführt. Am Ende des Fermentationsprozesses wurde im Agarschalentest unter Verwendung von Candida albicans als Testorganismus ein Gehalt von 250 #tg an der Verbindung WG 696 je Milliliter des Kulturmediums nachgewiesen.
• 25 1 der geklärten Brühe wurden auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und zweimal mit Leichtpetroleum (Kp.40 bis50'C) extrahiert.DievereinigtenAuszüge(61) wurden mit Wasser (11) gewaschen, getrocknet und auf eine sirupartige Konsistenz eingedampft; der erhaltene Sirup wurde in 50 ml Pentan gelöst. Diese Lösung wurde langsam unter Rühren auf eine Temperatur von -70'C abgekühlt, wobei sich die Verbindung WG 696 in Form von farblosen Kristallen ausschied, die abfiltriert, mit kaltem Pentan gewaschen und getrocknet wurden. Es wurden 5,2 g der Verbindung mit einem Fp. von 44 bis 46'C erhalten.
• Die auf diese Weise gewonnene Verbindung wurde neuerlich in Pentan (50 ml) gelöst und die Kristallisation unter Kühlen der Lösung auf eine Temperatur von -20'C unter Rühren wiederholt. Die ausgefallenen Kristalle wurden mit kaltem Pentan (-50 bis -70'C) gewaschen und getrocknet, wobei 4,6 g der gewünschten Verbindung mit einem Fp. von 46'C Z, und [x11D1 11' (10/, in Chloroform) erhalten wurden.

Claims (1)

1. Patentanspruch: Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums WG696, dadurch gekennzeichn e t, daß man Trichoderma viride Leo ND 8, Stamm ATCC 14 910, auf üblichem biologischem Wege züchtet und das gebildete Antibiotikum WG 696 aus dem Kulturmedium isoliert. In Betracht gezogene Druckschriften: Korzybski und Kurylowicz, »Antibiotica% 1961, S. 899 bis 903 und 911 bis 913.