DE1443280A1 - Verfahren zur Darstellung von 35S-L-Cysteinhydrochlorid - Google Patents

Description

• Verfahren zur Darstellung von. 35S-L-Cysteinhydrochlorid Bisherige Verfahren zur Synthese von 35S-Cystein basieren auf einer Biosynthese von Cystein, bzw. Cystin aus 35S-Sulfat mit Hilfe von Mikroorganismen.
• Bei diesem Verfahren ist die erreichbare spezifische Aktivität des Endproduktes begrenzt durch die Strahlenschädigung der zur Biosynthese verwandten Mikroorganismen. 35S-L-Cysteinhydrochlorid läßt sich erfindungsgemäß in jeder gewünschten spezifischen Aktivität enzymatisch unter Verwendung eines Fermentextraktes als Katalysator aus Serin und Na z35S darstellen und als Hydrochlorid isolieren. Zu diesem Zweck wird ein Fermentextrakt, z. B. --aus Hefe, mit Serin und Na 235S und ausreichenden Mengen von Pyridoxalphosphat im ph-Bereich von 7 - 9 bis zur Einstellung des enzymatischen Gleichgewichtes in Stickstoffatmosphäre inkubiert. Die geeignete Reaktionstemperatur liegt von 20 - 390C. Die enzymatische Umsetzung wird durch bekannte Eiweißfällungsmittel, z. B. Metaphosphorsäure oder Trichloressigsäure, beendet. Das 35S-L-Cystein aus dem Ansatz kann nach zwei Verfahren isoliert werden.
• 1. Fällung als Quecksilberkomplex mit einem Überschuß von Quecksilberacetat mit anschließender Spaltung des Komplexes durch Dithizon, wobei das Quecksilberdithizonat mit Tetrachlorkohlenstoff extrahiert wird. Das in der sauren-wässrigen Phase verbliebene Rohcystein wird durch Chromatographie an einem Kationenaustauscher mit verdünnter HC1 gereinigt, wobei mehrere radioaktive Verunreinigungen abgetrennt werden.
• 2; Nach weitgehender Beseitigung des Eiweißfällungsmittels, z. H. Extraktion der Trichloressigsäure mit Äther, wird das Reaktionsgemisch an einer Kationenaustauschersäule von nicht umgesetztem Serin, den Puffersubstanzen, radioaktiven Verunreinigungen und sonstigen Produkten durch Chromatographie mit verdünnter HCl gereinigt. Das Cysteinhydrochlorid wird anschließend unter gleichen Bedingungen rechromatographiert. Das 'abgetrennte, radiochemisch:Ieinheitliche 35S-L-Cysten wird im Vakuum eingeengt und liegt als Hydrochlorid vor. Patentanspruch Verfahren zur Darstellung von 35S-L-Cysteinhyfro- -chlord dadurch gekennzeichnet, daß durch ein geeignetes Ferment als Katalysator für die Umsetzung von Serin und Na 23535 -in schwach alkalischer Lö- sung gebildetes -35S-L-Cystein als Hydrochlorid entweder nach vorheriger Abtrennung als üg-Komplex mit nachfolgender Dithizonspaltung des Komplexes durch Chromatographie an einem Kationenaustauscher mit Salzsäure isoliert .wird oder das 35S-L-Cystein aus dem ReaktI®nsansatz direkt durch eine gleiche Chromatographie als Hydrochlorid isoliert wird. B e i s p i e 1 500 uMol 1-Serin, 10 mg. Pyridoxalphosphat, 500 uMol Na 35S und 110 mg Äthylendiamintetraacetat werden zusammen mit einem Enzymextract geeigneter Aktivität in ca. 40 ml Pufferlösung im ph-Bereich 7-9 bei einer Temperatur von 29-39C unter Stickstoffatmosphäre mehrere Stunden inkubiert.
• Das Äthylendiamintetraacetat dient als Komplexbildner, um divarente-Schwermetallspuren zu beseitigen, die die Enzymaktivität beeinträchtigen. Die Dauer der Inkubation ist abhängig von der Enzymaktivität und der gewählten Temperatur.. Die Umsetzung wird durch Zugabe von 15 ml 30 %iger Metaghosphorsäure beendigt, das gefällt Eiweiß abzentrifuglert und danach das Cystein aus der Lösung durch Zusatz von Quecksil'-beracetat im Überschuß (Suspension von 3 g in 10 ml H20) ausgefällt und abgetrennt. Der Niederschlag wird in 10 m1 etwa 092 n Essigsäure suspendiert und das in dem Niederschlag enthaltene Quecksilber wird erschöpfend mit Dithizon in Tetrachlorkohlenstoff extrahiert. Das so gewonnene Rohcystein wird auf eine Kationsaustauschersäule in der H+-Form gegeben und anschließend mit 1.5n HCl. als Elutionsmittel chromatographiert. Aus dem Cystein enthaltenen Frak# tionen wird dieses durch Gefriertrocknung isoliert.