DE1492002C2

DE1492002C2 - Das Antibiotikum Alanosin und Verfahren zu seiner Herstellung

Info

Publication number: DE1492002C2
Application number: DE1965L0051185
Authority: DE
Inventors: Carolina Coronelli; Krishnamurthy Srinivas Murthy; Joseph Appiano Gentile Thiemann
Original assignee: Lepetit SpA
Current assignee: Gruppo Lepetit SpA
Priority date: 1964-07-29
Filing date: 1965-07-21
Publication date: 1971-03-18
Also published as: FR1580106A; ES315944A1; FI43579B; NO119217B; CH436571A; BR6571578D0; DE1492002B1; SE315562B; GB1115041A; US3676490A; IL23931A; DK115387B; NL6509543A; BE667648A; AT261810B

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft das Antibiotikum Alanosin und dessen Alkali- und Erdalkalisalze sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Antibiotikums.

Alanosin ist eine weiße kristalline Substanz, die schwach löslich in Wasser, nicht löslich in den üblichen organischen Lösungsmitteln, löslich in Säuren mit einem pH-Wert unter etwa 3,5 und löslich in Alkalien mit einem pH-Wert über 7,0 ist. Es kann aus Wasser kristallisiert werden.

Die empirische Formel für Alanosin ist

C₃H₇N₃O₄- MG 149,1.
Die Elementaranalyse ergab die folgenden Werte:

Errechnet:

C 24,18, H 4,70, N 28,15, O 42,92;
gefunden:

C 24,07, H 4,86, N 28,15, 0 42,92
(durch Unterschiedsberechnung).

Es hat die folgende für eine antibiotische Substanz einmalige Strukturformel:

L(-)O = N — N — CH₂ — CH — COOH

OH

NH,

L( — )-2-Amino-3-nitrosohydroxylaminopropionsäure.

Alanosin schmilzt bei 190"C. Es ist optisch aktiv und hat die folgende spezifische Drehung: [«]" = -37,8" (c = 0,5, Wasser). Im Ultraviolettspektrum zeigt es ein Maximum bei 250 ΐτίμ, Ej*_m 630, in einem Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7,0. In 0,1 ^(>/_oiger Salzsäure liegt das Maximum bei 228 ΐημ, E!ü*_m 504. Der spektrophotometrisch gemessene pK-Wert der chromophoren Gruppe liegt bei 4,8.

Bei dem in Nujol aufgenommenen Infrarotspcktrum zeigt Alanosin die folgenden in cm"' ausgedrückten Hauptbanden: 3160, 2925 (Nujol), 2850 (Nujol), 2720, 2630, 2500, 2000, 1870, 1650, 1594, 1500, 1465, 1433 (Nujol), 1394, 1380 (Nujol), 1340, 1277, 1237, 1160, 1087, 1070, 980, 967, 915, 860, 814, 734, 663.

Die mit Natriumhydroxyd erhaltene polentiometrische Titrationskurve zeigt Schultern bei den pK-Werten 4,7 und 8,6 und den Äquivalcntgewichtcn 152 bzw. 162. Eine mit NaOH nach Zugabe von Formaldehyd durchgeführte Titration zeigt eine einzelne Schulter bei einem pK-Wcrt von 4,7 und einem Äquivalcntgewicht von 75.

Mit Ninhydrin gibt Alanosin eine violette Färbung. Durch schwaches Erhitzen mit Sulfanilsäure und u-Naphthylamin stellt sich eine intensive rotviolette Färbung ein, die die Gegenwart einer Nitrosogruppe anzeigt.

Alanosin bildet mit Alkalien und Erdalkalien und allgemein mit anorganischen und organischen basischen Substanzen Salze. Da es zwei verschiedene Säuregruppen enthält, kann es neutrale und saure Salze bilden.

Alanosin besitzt eine antimycolische Wirkung gegenüber verschiedenen Testorganismen. Die nachfolgende Tabelle gibt die minimale hemmende Konzentration in j'/cem gegen einige typische Stämme an.

Candida albicans ATCC 10 231 IO

( andida albicans SK F 2270 5

Saccharomyces cerevisiae ATCC 9736... 2

Hiitamoeba hyslolylica 50

Trichomonas vaginalis 50

Penicillium sp > 100

Alanosin besitzt hochgradige antivirale Wirkung sowohl in vitro als auch in vivo. Es ist sowohl bei DNA- als auch bei RNA-Viren wirksam. Dies ist eine einzigartige Eigenschaft, die bei keinem anderen synthetischen oder natürlichen Produkt zu finden ist. In vitro gibt es einen cytopathischen Schutz ίο gegenüber Vaccinia (DNA)-, Polio (RNA)- und Coe (RNA)-Vircn selbst bei nur Mikrogrammengen. In vivo bietet es Schutz gegenüber Vaccinia-Viren sowohl bei topischer als auch bei innertherapeutischer Verabreichung.

Die Wirkung von Alanosin auf Sarcomen, verursacht durch den Virus SV-40, wurde getestet. Zu diesem Zweck wurden zwölf Hamster zur Transplantation des Tumorgewebes verwendet. 24 Stunden nach der Transplantation wurde mit der Alanosinbehandlung durch subkutane Verabreichung von 20 mg/kg Alanosin einmal täglich bei acht Tieren begonnen und 21 Tage lang fortgesetzt, nachdem die ersten Anzeichen des Tumors bei den Kontrolltieren festgestellt worden waren. Die vier als Kontrolltiere dienenden Tiere erhielten 1 ecm physiologische Kochsalzlösung pro Tag subkutan und entwickelten einen palpablen Tumor nach einer Inkubationszeit von 15 Tagen. Bei Ablauf des Versuchs wurde kein Tumorwachstum bei den behandelten Tieren beobachtet, während bei den Kontrolltieren die Tumore sich zu einer Größe von '/j bis '/2 des Gasttieres entwickelt hatten.

Bei einem anderen Versuch wurden Hamster mit gut entwickelten Tumoren zur Prüfung des Analosineintlusses auf die Tumorreduzierbarkeit verwendet. Bei zwölf Tieren wurde die Tumorgröße gemessen, und ein entsprechendes Diagramm wurde für jeden Tumor angelegt. Vier Tiere wurden mit 2 ecm Salzlösung pro Tag subkutan behandelt. Acht anderen Tieren wurden 30 mg/kg Alanosin pro Tag subkutan verabreicht. Die Behandlung dauerte 2 Wochen, in denen die Größe und Form des Tumors regelmäßig untersucht wurde. Es wurde gefunden, daß bei den behandelten Tieren etwa nach dem K). Tag der Behandlung die Verkleinerung zwischen 50% und einer Größe lag, die nicht mehr groß genug war, um gemessen werden zu können. Selbst bei ilen Tieren mit fühlbarem Tumor war die Konsistenz des Tumorgewebes sehr unterschiedlich von der der Kontrolltiere. Die »behandelten Tumoren« waren weich, während die Tumoren der -Kontrollticre sehr hart waren. Eine Wiederholung des vorstehenden Experiments bestätigte die Feststellungen.

Das Antibiotikum zeigt eine sehr geringe Toxizität.

Die 5()"/₍|igc tödliche Dosis beträgl bei Mäusen intraperitoneal 600 ing/kg und intravenös 300 mg/kg.

Alanosin wird durch die Züchtung einer neuen Spezies von Aclinomyceten des Genus Streptomyces erhalten, der ursprünglich als Slrcptomyces sp. V/119

fto und anschließend als Streptomyces alanosinicus 11. sp.

bezeichnet worden war. Der Mikroorganismus wurde

. aus einer Bodenprobe aus Brasilien gewonnen und in die American Type Culture Collection unter der Nummer ATCC 15 710 eingereiht. Die Kigenschaflen

ft5 ilcs Mikroorganismus, der sich von allen bekannten Spezies des Genus Streptomyces unterscheidet, werden nachfolgend beschrieben.

Um die WachslumseigcnsehaflcM von Slrcpto-

myces alanosinicus η. sp. zu bestimmen, wurde die Kultur auf einer großen Zahl von herkömmlichen Medien gezüchtet und bei 28" C 2 Wochen vor der endgültigen Untersuchung inkubiert.

Auf einem Agarnährboden nach Benett bildet der Mikroorganismus Kolonien, die gewöhnlich einen Durchmesser von 3 bis 5 mm haben und scharf umrissenc Konturen aufweisen, kompakt sind und erhabene Mitlelbereiche und sammetartige Oberflächen haben. Sie sind bedeckt mit einem weißlichgrauen Luftmycel, das später bei voller Sporenaus-, bildung hellbraun wird. Eine große Anzahl der Kolonien auf dem Agarnährboden bilden kein Luftmycel, sondern entwickeln nur ein vegetatives Mycel

mit brauner bis dunkelbrauner Farbe. In Tabelle I werden die physiologischen und Züchtungseigenschaften von Streptomyces alanosinicus n. sp. angegeben. Die günstigste Temperatur zur Entwicklung der Kolonien liegt bei 28 bis 37" C. Kein Wachstum findet bei 50" C und nur ein geringes Wachstum bei 22° C statt.

Wenn die Sporenbildung stattfindet, erscheinen die Sporen in Form von monopodialverzweigten Sporoforen mit eng gewundenen Spiralen, die elipsoide Sporen (1 χ 1,3 μ) haben. Nach der Klassifizierung von Pridh am,Hesselt ine und Benedict gehört Streptomyces alanosinicus n. sp. in die »graue Reihe« der Gattung »Spira«.

Tabelle I

Physiologische	und Züchtigungseigenschaften von Streptomyces	Luftmycel	alanosinicus n. sp. ATCC 15 710	Biochemische Eigenschaften	J
Kulturmedien		mäßig, watteartig,	Lösliches Pigment		■ 0
Hafermehl		Weiß bis Bräun	Braun
		lich, Weiß bis
		Bräunlichgrau
		schwach, pulverig,
Emerson		Weißgrau	bernsteinfarben
		mäßig, pulverig	» bis Grau
Sabourand		. Weiß bis Maus	Rötlichbraun bis
		grau	Dunkelbraun
				H₂S-Bildung
		mäßig bis gut, .
Benett		watteartig, Weiß	bernsteinfarben
		bis Grau	bis Braun
		keins
Pepton-Eisen-Agar .			Schwarz
		schwach, Weiß
Czapeck Dox			keins
		Spuren von weißem
Kartoffel-Agar		watteartigem	keins
		Myccl
		keins
Kartoffelstücke		mäßig, watteartig.	Schwarz.
Glucose-Asparagin .		Weiß	Rosabraun
		gut, watteartig.	bis Braun
Glycerin-Asparagin.		Weiß bis Weiß	Rosabraun bis
		grau	Dunkelbraun	•
		keins		gute Hydrolyse
Nähragar			Spuren von heller
		keins	Bernsteinfarbe
Karoltenstücke ....			keins	völlige Hydrolyse
		gut, watteartig
Stärke-Agar		Weiß, das leicht	keins
		Braun wird		Reduktion negativ
				keine Gerinnung,
Gelatineslich			Spuren von	völlige I'epto-
			braunem	nisierung, keine
			Pigment	pH-Wert-Ver-
Nitraibriihe			keins	änderung
l.ackimisiuilch ....




Vegetatives Mycel
gutes Wachstum,
Hellbraun


gutes Wachstum,
bernsteinfarben
gutes Wachstum,
schwach runzelig,
bernsteinfarben'
bis Dunkelbraun
schwaches Wachs
tum, Braun

mäßiges Wachstum,
Braun
gutes Wachstum,
glasklar
schwaches Wachs
tum, glasklar

gutes Wachstum
gutes Wachstum,
glasklar
gules Wachstum,
Dunkelbraun

schwaches Wachs
tum, glasklar
gutes Wachstum,
glasklar
schwaches Wachs
tum, glasklar

Fortsetzung

Kulturmedien	Vegetatives Mycel	Luftmyccl	Lösliches Pigment	Biochemische Eigenschaften
Calciummalatagar... Tyrosin-Agar ....... Hyckey und Tresner- Agar Zcllulosenähragar ... Magermilch	kein Wachstum schwaches Wachs tum, Hellbraun gutes Wachstum, Dunkelbraun gutes Wachstum, Hellbraun gutes Wachstum, Braun	keins gut, watteartig. Weiß bis Grau gut, watteartig. Weiß keins	keins Hellbraun Rötlichbraun	Melanin negativ keine sichtbare Zcllulose- digcslion leichte Hydrolyse von Kasein

Strcpt. alanosinicus η. sp. wurde mit einer Anzahl von bereits beschriebenen Streptomyces mit ähnlichen Eigenschaften verglichen: Streptomyces platensis, Str. parvulus, Str. filipinensis und Str. albogriscolus. Einige bestimmte Unterschiede wurden jedoch hinsichtlich der Züchtungseigcnschaflen sowie der biochemischen Eigenschaften zwischen diesen Species und dem erfindungsgemäßen Str. alanosinicus gefunden. Einige dieser Unterschiede werden nachfolgend angegeben:

Str. platensis

Die Farbe des Luflmyccls auf Glucose-Asparagin-Agar wird als Weiß beschrieben, das allmählich Schwarz, wird. Die Bildung eines grünlichgelben Pigments auf einem Calcium-Maial-Agar findet statt. Die Nitrate werden reduziert. Inulin wird nicht verarbeitet, und Sorbit und Dulcit werden mctabolisierl.

Str. parvulus

. Gelblich lösliches Pigment auf Glucosc-Aspara-

gin-Agar, Nähragar und Gelatine. H₂S negativ.

Bildung von Aetinomycin D.

Str. filipinensis

Diese Species bildete ein gelbes Pigment auf Glyccrin-Asparagin-Agar. Die Gelatine wird sehr langsam hydrolysiert. Die Bildung von Filipin wird beschrieben, das ein polyenes, antifungales Antibiotikum ist.

Str. albogriscolus

Nitrat wird zu Nitrit reduziert. H₂S wird gebildet. Das Wachstum auf Kartoffclnährbodcn ist schmutzig, gräulichweiß bis schwachrosa. Luftmycel und Sporen werden auf dem Nähragar gebildet, jedoch keine Pigmente. Bei dieser Species wird beschrieben, daß sie einen »Ncomycin-Komplex« bildet.

Streptomyces alanosinicus n. sp..
das nach dem Verfahren von T. G. P r i d Ii a in und D. G ο t t I i e b in J. Bacteriology, Bd. 56. S. 107 (1948), unter Verwendung verschiedener Kohlestoffquellen gezüchtet wurde, verarbeitete praktisch alle getesteten Verbindungen mit Ausnahme von Rhamnosc. Sorbit, Dulcit und Sorbose. Dies geht aus der nachfolgenden Tabelle II hervor.

Tabelle II Verarbeitung von Kohlensloffquellen

KohlcnslofTqucllc

Arabinose .

Xylose ....

Glucose...

Galactose .

Fructose ..

Mannose ..

Rhamnose Lactose ...

Mallose...

Saccharose Raflinose .. Glycerin ..

Sorbit

Mannit ...

Dulcit .... _4S Inosit

Dextrin ...

Inulin ....

Stärke

Ribosc ...

Sorbose...

Wachstum

Sporenbildung

+ + Gut. + Mäßig. — Keine.

Zur Herstellung von Alanosin wird Streptomyces alanosinicus n. sp. ATCC 15 710 in einem wäßrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, wie z. B. Kohlehydrate, eine assimilierbare Stickstoffquelle, wie /.. B. Fleischextrakt»:, Pepton, Maisweichwasser usw., und anorganische Salze, wie z. B. Chloride, Nitrate, Carbonate. Sulfate von Alkalimetall oder Erdalkalimetallen. Zink, Mangan, liisen. Magnesium, enthalt, unter aeroben Bedingungen kultiviert, bis die Lösung eine im wesentlichen anlimycolische und antivirale Wirksamkeil besil/l. und das gebildete Antibiotikum wird aus dom Kiilturlillral uewonnen.

Wie oben bereits gesagt wurde, wird die Fermentation unter aeroben Bedingungen, vorzugsweise unter Schütteln oder Rühren bei 20 bis 40" C während 72 Stunden bis 5 Tagen und langer durchgerührt. Eine wesentliche antimycotische und antivirale Wirksamkeit in dem Nährmedium wird im allgemeinen nach 1 bis 3 Tagen festgestellt.

Die Gewinnung des Antibiotikums aus dem Kulturfiltrat nach Abtrennung des Mycels kann auf verschiedenen Wegen vorgenommen werden. Beispielsweise kann das klare Filtrat in ein Lösungsmittel gegossen werden, das mit Wasser mischbar ist, und in dem das Antibiotikum nicht löslich ist. Das ausgefällte Antibiotikum wird dann gewonnen und gereinigt. Chromatograph'ische Verfahren, die gewöhnlich zur Isolierung von antibiotischen Substanzen angewendet werden, können gleichfalls zur Anwendung kommen.

Außerdem kann eine Reinigung durch Zwischenbildung der wasserlöslichen Alkali- und Erdalkalimetallsalze und erneute Fällung durch Einstellen des pH-Wertes auf Werte zwischen 3,5 und 7,0 bewirkt werden.

Alanosin kann praktisch bei der menschlichen Therapie durch topische oder parenterale Verabreichung zur Anwendung kommen. Die Verabreichung kann in Salben mit einem Gehalt von 0,5 bis 10% oder mit Verdünnungsmitteln und Trägern in Tabjettenform in Dosierungseinheiten von 10 mg bis 500 mg erfolgen. Wegen seiner geringen Toxizität ist das Antibiotikum vollständig gefahrlos für die Humantherapie.

Die nachfolgenden Beispiele geben Hinweise für die Herstellung, Gewinnung und Reinigung von Alanosin.

Fleischextrakt 5,0 g/l

Pcpton 5,0 g/i

Hefeextrakt 5,0 g/1

Enzymatisches Kaseinhydrolysat ... 3,0 g/l

Cerclosc ; 2,0 g/I

NaCl 1,5 g/l

Das Medium wird vor der Sterilisation, die 20 Minuten lang bei 121 "C und einem Dampfdruck von 6,8 kg stattfindet, auf einen pH-Wert von 7,2 gebracht. Die Keimkolben werden bei 28"C 48 Stunden lang auf Rotationsschüttlcrn mit einer Schwingweite von 5 cm und 240 U/Min, inkubiert.

Gärbedingungen

Von dem Keimkolben werden 3% in 300-ccmlirlenmeyeigärkolben gegeben, die 100 ecm des Mediums TVF/5 mit der folgenden Zusammensetzung enthalten:

Glucose 50,0 g/l

Getrocknetes Walfleisch (Pascor) .. 10,0 g/l

CaCO₃ 5,0 g/l

(NH₄J₂SO₄ 1,0 g/l

MgSO₄-7H₂O ....' 1,0 g/l

CuS0₄-Lösung, 0,5% 1 ^ccm

FeSO₄-Lösung, 0,1 % 1 ecm

ZnSO₄-Lösung, 0,2% 1 ecm

MnSO₄-Lösung, 0,8% 1 ecm

Das Medium wird vor der Sterilisation, die 20 Minuten lang bei 121° C vorgenommen wird, auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Die Gärkolben werden inkubiert und unter gleichen· Bedingungen wie die Keimkolben geschüttelt. Nach 72 Stunden wurde das Mycel abzentrifugiert, und die nicht behandelte Brühe wurde nach dem Strichverdünnungsverfahren getestet. Die Ergebnisse sind wie folgt:

25	Saccharomyces cerevisae	Biologische Wirkung in Verdünnungseinheiten bei 3lägiger Gärung	Beispiel 2
	Candida albicans	1/40 1/10	Flaschengärung
30

35

Beispiel 1

Schüttelkolbengärung
von Streptomyces alanosinicus n. sp. ATCC 15 710

Herstellung des Inoculums

Hafermchlagar-Schrägnährböden, die mit Streptomyces alanosinicus n. sp. geimpft worden waren, wurden bei 20 C 7 bis 10 Tage lang bebrütet und dann zum Impfen von 100 ecm eines Pepton-Agar-Glucosc-Hefeextrakt-Mediums verwendet, das in einem 500-ccm-Erlenmeyerkolben enthalten war. Die Zusammensetzung dieses Gärmediums war wie folgt:

von Streptomyces alanosinicus n. sp. ATCC 15 710

Die Gärung in 4-1-Glasfermentoren wurde in den nachfolgenden Medien und unter den angegebenen Verfahrensbedingungen vorgenommen:

Herstellung des Inokulums

Erste Stufe— Inokulumquelle: Kultur von Streptomyces alanosinicus n. sp., gezüchtet auf Hafermehl-Agar oder eine Ampulle mit lyophiler Sporensuspension. Medium und Verfahrensbedingungen sind mit den im Beispiel 1 beschriebenen identisch.

Zweite Stufe — Inokulumquelle: 2,5% der ersten Stufe. Medium: wie in der ersten Stufe. Das Medium, 4 1 im Glasfermentor wird vor der Sterilisation, die 30 Minuten lang bei 121" C durchgeführt wird, auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt, danach inokuliert und bei 28"C 2 Stunden lang inkubiert. Während der Inkubation wird die Brühe mit einer Geschwindigkeit von 1 1 Luft/yMin. belüftet und mit 800 U/Min, gerührt.

Gärbedingungen

Inokulumquelle: 2(X) ecm (5%) der zweiten Inokulumstufe. Medium: wie bei dem ersten Beispiel (TVF/5). Das Medium wird vor der Sterilisation, die 30 Minuten lang bei 121"C stattfindet, auf einen 6s pH-Wert von 7,0 gebracht. 4 I dieses Mediums, die das Inokulum enthalten, werden 72 bis % Stunden bei 28 C inkubiert. Während der Inkubation wird die Masse belüftet und gerührt wie in dem ersten Beispiel.

109 612/170

Die Ergebnisse der Gärung werden in der nachfolgenden Tabelle angegeben.

Gärungen Alter/Std.	pH-Wert	Spektrophometrische Titer ;'/ccm
0	7,10	0
10	6,85	ο -
24	6,80	120
34	7,20	535
48	7,20	755
75	7,20	865
82	7,20	765
96	.7,20	810

Die Extraktion und Reinigung des Produktes wird nach dem folgenden Beispiel vorgenommen.

20

B e i s ρ i e 1 3
Extraktion

30 1 der Brühe werden zentrifugiert, und 6% Darco G-60-Holzkohle (Handelsname) werden zu der klaren Lösung zugegeben, die 30 Minuten gerührt wird. Dann wird die Holzkohle abfiltriert, wobei man eine fast farblose Lösung erhält, die im Vakuum bei 45 bis 50°C auf 1,5 1 eingedampft wird. Die konzentrierte Lösung wird unter Rühren in 5 1 Methanol gegossen, der erhaltene Niederschlag wird filtriert, mit viel Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Als Ausbeute werden 230 g eines rohen Produktes mit einer Analyse von etwa 10% erhalten.

Reinigung

Das vorstehende rohe Produkt wird in 400 ecm Wasser suspendiert, und zu der auf 4° C abgekühlten Suspension wird unter Rühren Schwefelsäure bis zur Erreichung eines pH-Werts von 2,0 bis 2,5 zugegeben. Der ungelöste Rückstand wird abfiltriert, die Lösung wird weiter mit 400 ecm Wasser verdünnt, und 1,61 Methanol werden zur Fällung des Antibiotikums zugegeben. Das Gemisch wird auf 4" C während mehrerer Stunden gehalten, um die Fällung zum Abschluß zu bringen, dann wird es filtriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum über P₂O₅ getrocknet. Die Ausbeute beträgt 62 g eines Produktes mit einer Analyse von 27%· Das getrocknete Produkt wird in wasserfreiem Methanol suspendiert und das Gemisch gerührt. Perchlorsäure (75%) wird bei etwa 4°C bis zur Erzielung eines pH-Wertes von 3,0 zugegeben, der nicht gelöste Teil wird abfiltriert und das Antibiotikum durch Einstellen des pH-Wertes auf 5,5 mit Natriummethoxyd ausgefällt. Die Suspension wird einige Stunden bei 4" C dekantiert, dann wird sie filtriert, und der Niederschlag wird mit Diäthyläther gewaschen. Die Ausbeute beträgt 30 g (Titer: 43%)· Eine Menge von 3,2 1 des vorstehenden Antibiotikums wird in 60 ecm H₂O gelöst und der pH-Wert auf 8 eingestellt. Der nicht gelöste Teil wird abfiitriert, und durch Zugabe von Eisessig wird der pH-Wert auf 5 bis 4,5 gebracht. Beim Abkühlen auf 4 C werden 1,2 g des Antibiotikums in kristalliner

10' Form (Titer: 75%) erhalten.

Eine Menge von 2,9 g des kristallinen Antibiotikums wird in 900 ecm Wasser gelöst, die Lösung wird auf 70 bis 80" C erhitzt, dann filtriert, auf 200 ecm konzentriert und 8 bis 10 Stunden bei 4"C abgestellt. Dann wird sie filtriert und mit kaltem Wasser gewaschen. Die Ausbeute beträgt 1,45 g (Titer: 97%). Durch weiteres Konzentrieren der Lösung auf 100 ecm wird eine weitere Menge des Antibiotikums von 1 g (Titer: 80%) erhalten.

Beispiel 4

Eine Menge von 15 g des nicht kristallisierten Antibiotikums mit einem Titer von 34%, das nach Beispiel 3 erhalten wurde, wird in 100 ecm H₂O suspensiert. Die Suspension wird gekühlt, und konzentrierte Schwefelsäure wird bis.zur Erzielung eines pH-Wertes von 2 zugegeben. Die Lösung wird 15 Minuten bei 4°C gerührt, dann wird das ausgefällte Calciumsulfat abfiltriert und die Lösung auf einen pH-Wert von 4,5 durch Zugabe von Natriumhydroxyd gebracht. Die Suspension wird K) bis 12 Stunden bei 4°C abgestellt, dann filtriert und mit Wasser gewaschen. Ausbeute: 6,5 g (Titer: 72%). Eine weitere Reinigung kann durch Kristallisieren aus Wasser wie bei dem vorstehenden Beispiel vorgenommen werden.

Claims

Patentansprüche:
1. Das Antibiotikum Alanosin der Formel

L— (-)ON — N — CH, — CH — COOH

OH

NH₂

und dessen Alkali- und Erdalkalisalze.
2. Verfahren zur Herstellung des Antibiotikums Alanosin, dadurch gekennzeichnet, daß man den Streptomyces alanosinicus n. sp. ATCC 15 710 in einem wäßrigen Nährmedium, das eine assimilierbare Kohlenstoffquelle, eine assimilierbare Stickstoffquelle und Mineralsalze enthält, bei einer Temperatur von 20 bis 40"C 1 bis 5 Tage unter aeroben submersen Bedingungen züchtet und die' Gärlösung aufarbeitet.