DE1959933A1

DE1959933A1 - Verfahren zur Herstellung von Gangliosidsulfate enthaltenden Arzneimitteln mit antibiotischen Wirkungen durch Extrahieren von Material tierischen Ursprungs

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Publication number: DE1959933A1
Application number: DE19691959933
Authority: DE
Inventors: Erkki Leikola
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1968-11-29
Filing date: 1969-11-28
Publication date: 1970-06-25
Also published as: BE742362A; AT295036B; GB1269846A; NL6917905A; FR2024554A1

Description

PATENTANWÄLTE Dr. D. Thomsen

DIpl.-Chem.

Tiedtke

D!pl.-!ng.

G.

Dipl.-Chem.

8000 MÖNCHEN 2 TAL 33

TELEFON 0811/226894

TELEGRAMMADRESSE: THOPATENT

MÖNCHEN

case B

^f: 3 ί>· .ι f"' ■

- ^r: JhC3

Erkki Ensio Leikola Helsinki, Pinnland

Verfahren zur Herstellung von Gangliosidsulfate enthaltenden Arzneimitteln mit antibiotischen Wirkungen durch Extrahieren von Material tierischen Ursprungs...

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Arzneimitteln mit antibiotischen Wirkungen, die der Formel

HO¹C-H

Fettsäure ^H

Ceramid

Sialsäure und Sulfat enthaltendes Kohlenhydrat

H-C-OH H-C-OH

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MQndllehe Abreden, inibetondere durch Telefon, bedürfen schriftlicher Bestätigung Dresdner Bank München Kto. IG0103 · Postscheckkonto München U6'>74f, _% ·-.

BAD ORIGINAL

entspechende Gangliosidsulfate enthalten. Lipide, die eine Sulfatgruppe enthalten, werden als Sulfatide oder Sulfölipide bezeichnet^ und man nimmt allgemein an» daß sie Ceramid-Galactose-Sulfatester-Struktur besitzen. Hie Bindung der Sulfatgruppe an die Sulfatide ist noch nicht geklärt.

Sulfatide sind bisher im Gehirn gefunden worden (Landsteiner, K.L._a und P.A. Levene, 1925» J.Immunol., lO, Seite 731, und Levene, P,Ao₈ undK.L. Landsteiner, 1927, 3, Biol.Chem_v 75:. Seite 607), aber in letzter Zeit sind Sulfatide auch in anderen Geweben nachgewiesen worden, so z.B. in der Leber, Niere und Milz (Goldberg, I»H., 196I, J.Lipid Res._; 2: Seite 103 und Soper, R., 1963; Comp. Bi ο ehem. Physiol.» 10: Seite 325). Nieminen und Leikola (Nieminen, E., und E. Leikola, 1967., Acta derm.venerol., 47: Seite. 327) haben in der menschlichen Epidermis ein sulfathaltiges Lipid wahrgenommen, dessen Struktur vorläufig ungeklärt ist. Als Ganglioside (Carter, H.E., P. Johnson und E.J. Weber, 1965, Ann.Rev.Biochem_v 34: Seite 109 )bezeichnet man Glucolipide, in denen ein oder mehrere Sialsäuremoleküle vorkommen. Solche Ganglioside sind im normalen Gehingewebe (Kuhn, R₀₃ und H. Wiegandt, 1964, Z. Naturforsch. 19b: Seite 256) und insbesondere im Gehirn an einer gewissen Debilität (sog. Tay-Sachs-Idiotie) leidender Patientm(Svennerholm, L., 1962jBiochem.Biophys.Res.Commun,, 9: Seite 346) gefunden worden. Auch aus der Milz (Svennerholm, L., I963, Acta Chem. Scänd., 17: Seite 86Ο) .und

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ORIGINAL

aus den Rotzellen des Bluts (Klenk, E., und G«, Padberg, 1962_t Z.Physiol.Chem., 327: Seite 2>\9) sind Gan&ioside isoliert worden.

Bisher sind im Schrifttum keine Sulfolipide erwähnt, die auch Sialsäure enthalten, d.h. man kennt keine Lipidgrup-.pe, die gleichzeitig sowohl Sulfat als auch eine Sialsäuregruppe enthält. Die jetzt entdeckte neue Lipidgruppe, die zuerst aus cfempferdehuf isoliert wurde und für die der Nachweis erbracht worden ist, daß sie sowohl die für Ganglioside typische Sialsäure als auch die für Sulfatide typische Sulfatgruppe enthält, wird' im nachfolgenden als Gangliosidsulfat bezeichnet.

Dieses Gangliosidsulfat ist auch ans felle aus Hufen aus Haaren, Wolle, Leder, Amnicngpwebe oder sonstigem Bindegewebe von Säugetieren, aus Vogelfedern und Eierschalen, aus Fischflossen oder-haut, aus Krebs- und Molluskenschalen, aus Stützgewebe der Insekten und aus ihren Absonderungen, z.3. Seidenspinnerpuppen, aus Spinnvreben und Wespennestern, aus Stützgewebe von Stachelhäutern, z.B. vom Seestern, aus Stützgewebe von Schwammtieren, z.B. vom Badeschwamm_Λ aus Stütsgewebe von Protozoen und aus bein Behandeln der . angeführten Substanzen anfallenden Neben- und Abfallprodukten isoliert worden.

Zum Isolieren dieser neuen Gruppe, der 009826/201S

4AMiOU

fate,aus tierischem Material sind übliche Verfahren zum Isolieren von Lipiden angewendet worden, wobei vielleicht die Anwendung eines Gemischs von Chloroform und Methanol (Ledaen, R., 1966, J.Am. Oil Craidsts Soc._;^3: Seite 57) am gebräuchlichsten ist. Im Schrifttum sind zahlreiche andere Lösungsmittel bekannt, die mit Erfolg zum Isolieren von Lipiden aus tierischem Material benutzt worden sind. Am erwähnenswertesten ist die Untersuchung von Autilio und Norton (Autilio, L.A.,

~ und W.T. Norton, 1963jJ· Neurochem., 10: Seite 733)* in we-lcher

sie die Fähigkeit.von 31 organischen Lösungsmitteln vergleichen, die Lipide aus dem weißen Bestandteil des Gehirns zu extrahieren. Von den von ihnen angewandten Lösungsmitteln seien außer Chloroform und Methanol ferner Tetrahydrofuran, Pyridin und Eisessig erwähnt.

Beim Verfahren gemäß der Erfindung sind somit die zum Extrahieren der Lipide benutzten Lösungsmittel bekannt, jedoch sind die Produkte neu,, die aus gewissen Ausgangsstof- ψ fen mittels an sich bekannter Lipidisolierverfahren erhalten werden. Das Verfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, daß Tierhufe, Klauen und Nägel mit Fettlösungsmitteln extrahiert werden, und aus den erzielten Extrakten durch Destillieren das Lösungsmittel und aus dem Destillationsrückstand mittels chromatographischer Verfahren die Verunreinigungen entfernt werden. , ·

Die neuen Produkte stellen eine .Gruppe in ihrer ch@^ r'-'bi^.'.l'"^:.·^ 009826/2015 ' «_v ;'; · :ψ±ΜΜ ψ£Γ

BAD ORIOINAL , ^;;

mischen Struktur einander nahestehender chemischer Verbindungen dar, welche die gleiche allgemeine Formel und die gleichen überraschenden und wertvollen Eigenschaften besitzen. Aus der Produktgruppe wurde eine Verbindung in reinem Zustand isoliert und bezüglich ihrer chemischen Struktur identifiziert; und zwar wurde sie aus Pferdehufen isoliert. Diese Substanz ist ihrer Hauptstruktur nach ein Gangliosid, jedoch enthält sie eine Sulfatgruppe und vertritt somit eine völlig neue Stoffgruppe, die sich von sämtlichen bisher bekannten Sulfolipiden darin unterscheidet, daß darin außer den bisher bekannten Bestandteilen der SuIfolipide ferner die für Ganglioside typische Sialsäure vorkommt.

In reinem Zustand ist Ganglioaidsulfat ein weißer, kristalliner Stoff, der äußerst gut in Methanol und etwas auch in Wasser löslich ist. Die Gruppeneigenschaften dieses sboffs sind in Bezug auf die Sulfatgruppe und auf die Sialsäure einheitlich, während dagegen in den Fettsäuren als auch in den einfachen Kohlehydraten Variationen vorkommen können, je nachdem aus was für Material dor Stoff isoliert wurde. Die allgemeine Formel des Stoffs ist d'ie vorstehend angegebene.

Im folgenden wird die Strukturaufklärung der Gangliosid· s.ulfate beschrieben.

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Die Homogenität der Ganglips'idsulfatfraktion wurde flächenchromatographisch mit den folgenden Lösungsmittelsystemen erhärtet: Chloroform: Methanol : Wasser in verschiedenen Verhältnissen "(24:7:1, 65:25:4, 60:35:8), Chloroform: Methanol:2,5 η NH₄OH (60:35:8), Propanol:V/asser (7:3) und Propanol:konz. NH₄QH (7:3). Mit allen diesen Mischungen ergab die Garrgliosidsulfatfraktion nur einen Fleck.

Nach der Elementaran.alyse enthielt die Verbindung 56,7# C, 9,3 Ji.H, 3,8 % K, 2,4 % S und 25,3 % 0. Nach dem osmometrischen Verfahren (mit Methanol als Lösungsmittel) ergab sich ein Molekulargewicht von 1280.

Das Inf rarotspektrifi der Verbindung, in Fig. 1 wiedergegeben, wies eine Absorptionsspitze bei 1240 cm auf, was für die Sulfatgruppe typisch ist. Die Verbindung lieferte mit Resorcinolchlorwasserstoffsäurereagens die für Sialsäure spezi- * fische rötlich-blaue Farbe. Die Struktur der Verbindung wurde durch Zerlegen derselben in ihre Komponenten und getrenntes Identifizieren einer jeden Komponente bestimmt.

10 mg der Verbindung wurden in verschlossener Ampulle mit 3 ml 2 η methanolischer Salzsäure bei 70⁰C im Verlauf von 20 Stunden hydrolysiert. Aus dem erkalteten Hydrolysat wurden die Fettsäuren mit 2 χ 3 ml Petroläther extrahiert. Die yereinicton Petrolätherfraktionen wurden zum Indentifizieren der Fettsäuren und zur quantitativen Bestimmung benutzt;. Das

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methanolische Hydrolysat wurde durch eine geschickt; Eluieren erfolgte mit 50 ml Methanol„ Die Lösung wurde im Vacuum zur Trockne gedampft und der Rückstand wurde in Pyridin mit einer Kischung(2:l) vom Hexanethyldisilazan tri methylsilyliert. Das überschüssige Siiylierre'agens wurde abge dampft und der Rückstand in 2 ml Hexan gelöst. Diese Lösung wurde zur qualitativen und quantitativen Bestimmung der Kohle hydrate sowohl gaschromatographisch als auch massenspektrographisch benutz. Die Gaschromatografie wurden mit einem mit einem Servo-Riter-Integrator versehenen Varian-Aerograph-Chro matographen C-lodell 20*0 mit einer 2,5 S-SE-30-Säule von 2 m Länge aufgenommen. Die Temperatur betrug hierbei l65°C. Zur internen Eichung diente Trimethylsilyläther von Sorbitol. In der Verbindung wurden Spuren von Galactosamin und sialsäure sowie ein Galactoserest und ein Sphingosinrest" nachgev:iesen. Der SphingosinbefUrid wurde noch massenspektrographisch mit dem Gaschromatograph-Massenspektrograph von LKB gesichefc, und es wurde Sphingosin mit 18 Kohlenstoffatomen und 2 Hydroxylgruppen nachgewiesen. Als Bezugsstoff wurde aus Sphingomyelin vom Ochsenhiyn in entsprechender Weise isoliertes Sphingosin verwendet, das von den Mann Research Laboratories, Inc., New Yorkj bezogen wurde=

Zur Bestimmung dss Ai&inosuekergehalts vmrden 5 &E, der Verbindung in 2 η Salzs&Äe-Methancl-V/asser-Gemis.ch (1:1) *oei 100⁰C in Verlauf von ^O Stunden hydrolysiert. Die Aminozucker wurden aus dem Hydrolysat mit ein^r Dowex-50-Ionenaustaschsäule

,BAD.OfUGINAL

nach dem Verfahren von Boas (Boas, N.P., 1953, J.Biol. Chem., 20*1: Seite 553) abgetrennt; Die erhaltenen Aminozucker wurden trirnethylsilyliert und gaschrornatographisch untersucht, mit Sorbitol-Trimethylsilylather als internem Eichstoff. Die Verbindung enthielt einen Galactosaminrest. Zur Bestimmung des Sialsäuregehalts wurden 15 mg der Verbindung mit 5 ml der . Mischung ÄthanoliChloroformikonz. HCl (7,^:6:3) bei 70⁰C im Verlauf von 3 Stunden hydrolysiert. Die erkaltete Mischung P wurde im Vakuum zur Trockne gedampft und die "Nichtlipide" wurden mit Sephadex (G 25 fine) nach Wells und Dittmer (Wolls_; M.A., und J.C. Dittmer, 1963, Biochemistry, 2: 'Seite 1259) abgetrennt. Die Nichtlipidfraktion wurde zur Trockne gedampft und der Rückstand in V/asser gelöst. Aus dieser wässrigen Lösung wurde die Sialsäure nach Svennerholms Resorcinolverfahren bestimmt, welches in der Version von Miettinen und Takki-Luukkainen (Miettinen, T., und I.T. Takki-Luukkainen, 1959, Acta Chem.Sand., 13: Seite 856) angewendet wir de. Aus dieser Lösung wurde noch der Galactose gehalt nach dem Resorcinolverfahren (Radin, U.S., R. Brown und F.B. Lavin, 1956; J.Biol.Chem., 219: Seite 977) bestimmt. Es konnte nachgewiesen werden, daß die . Verbindung einen Sialsäurerest und einen Galactoserest enthielt. Als Bezugsstoffe dienten von Britisch Drug Houses, Ltd., Poole, England, hergestellte d(+)~Galactose und Sialsäurekonzentrat von der Nutritional Biochemical Corp., Cleveland* Ohio, USA.

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Zur Bestimmung des Sulfatgehalts wurden 1,0 mg der Verbindung mit 200 μΐ 1 η HCi in verschlossener Ampulle bei ■ 70⁰C über Nacht hydrolysiert. Das Sulfat wurde nach dem Verfahren von Spencer (Spencer, B., 1960/Biochem.J., 75: Seite ^35) bestimmt. In der Verbindung wurde 1 .Sulfatrest nachgewiesen.

Die Fettsäuren wurden aus dem Petrolätherextrakt als Methylester gaschromatographisch bestimmt (mit Methylbehenat als internem Eichstoff, mit 10 #-DEGS-Säule und 175°C Chromatographiertemperatur). In der Verbindung wurden nachgewiesen: 63,7 % Stearinsäure, 19,752 Palmitinsäure, 12,0 % Arachirlon-säure sowie 4,6 % nichtidentifizierte Fettsäuren. Als Bezugsstoff diente von der Sigma Chemical Company, St. Louis, Mo., U.S.A., hergestellter Methylester von Fettsäuren, d (+)-Galaosaminhydrochlorid«,

Auf Grund mikrobiologischer Untersuchungen wurde festgestellt, daß dieser neue Stoff überraschende und wertvolle Eigenschaften besitzt. Sein Charakter hat sich als deutlich antibiotisch herausgestellt,'und zwar ist er einerseits bakterizid und andererseits bakteriosta.tiseh_s je nach der angewandten Konzentration. Zur Klärung dieser Eigenschaften wurde folgender Versuch angestellt:

Zur Untersuchst wurden Bakterien namens Streptococcus faecalis und Staphylococcus aureus ATC 6538 verwendet. Das Präparat wurde in der Ultra-Turrax-Zentrifuge mit Baktericnnähr- ·

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- ίο -

lösung homogenisiert, und das so erhaltene Substrat wurde mit den bei der Untersuchung, verwendeten Mikroorganismen geimpft. Das Gangliosidsulfat war aus Pferdehufen isoliert worden.

Die Ergebnisse zeigten, daß das Wachstum des Bakteri-. ums Staphylococcus aureus in 0,5 #iger Gangliosidsulfatemul-

sion inhibiert wird und dasjenige von Streptococcus faecalis in & 1,0 #iger. Das ,Studium de.r bakteriostatischen Wirkung eines lipophilen Stoffs fällt verhältnismäßig schwer, da eine Zerteilung des in Frage stehenden Lipids auf molekulare Größe in wässriger Lösung nicht erzielt werden kann und Emulgieren recht variierende Resultate zeitigt. Deshalb kann hier, ebenso wie auch bei anderen lipophilen antibiotischen Stoffen, keine scharfe antibiotische Grenze angegeben werden. Das Ergebnis zeigt jedoch klar, daß die in Frage stehende Stoffgruppe eine recht überraschende antibiotische Wirkung hat. Nach der Untersuchung enthalten Hufe und Nägel diesen Stoff in genügender Menge, um unter normalen Verhältnissen den schädlichen Einfluß von Mikroorganismen abzux\rehren und zugleich als besonderer Schutz gegen das Bestreben von Mikroorganismen zu wirken, in die vom Oberflächenfarbe bedeckten, gegen Mikroorganismenangriff empfindlichen Regionen des Organismus einzudringen .Dies bedeutet, daß der Stoff äußerst wertvoll für den Organismus i§t.

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O CiAS

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Mit Gangliosidsulfat aus Schweinsborsten (Versuch a) und aus Hühnerfedern (Versuch b) wurden gleichartige Versuche angestellt. Hierbei wurden folgende Ergebnisse erzielt:

Konzentration in %

a) 0,0 O₉I 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 1,0

Staphylococcus aureus ++ + . Streptococcus faecalis + - - - --

Staphylococcus aureus + + +- +- ^ ZZ Z Streptococcus faecalis + + + + + ---

Die Ergebnisse zeigen, daß das Wachstuni des Bakteriuns Staphylococcus aureus bereits in 0,3 &iger Ganglicsidsulfatemulsion und dasjenige von Streptococcus faecalis in 0,1 Siger GangliosidlÖsung inhibiert wird, wenn bei der Herstellung des Gangliosidsulfats Schweinsborsten als Rohmaterial verwendet wurden, während bei Anwendung von aus Federn hergestelltem Gangliosidsulfat die entsprechenden Werte 0,4 baw. 0,5 be-. trugen.

Alle für das Verfahren gemäß der Erfindung angegebenen tierischen Gewebe eignen sich zum Isolieren von Gangliosidsulfat. Ihr Gehalt an Gangliosidsulfat variiert nicht sehr

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stark, von 0,1 bis 0,5 %_t was auch ganz natürlich erscheint, wenn man die Aufgabe des betreffenden Stoffs in der Natur berücksichtigt. Er soll, wie bereits gesagt wurde, dasjenige Gewebe,in dem er vorkommt, und indirekt auch all das Gewebe, welches vom erstgenannten Gewebe möglicherweise umgeben wird, vor dem schädlichen Einfluß von Mikroorganismen schützen. Hierdurch werden solche Tatsachen, wie z.B. die gute Haltbarkeit des Wespennests und der Spinrweben unter den verschiedensten Temperatur- und Feuchtigkeitsverhältnissen in der freien Natur, gut verständlich. Ferner ist zu verstehen, weshalb die Puppe des Seidenspinners die Larve so gut während der Metamorphose schützt. Der Wirkungskreis der besagten Stoffgruppe in der Natur ist derart ausgedehnt und vielfältig, .daß er für-Jahrzehnte hinaus für aufklärende Arbeiten Stoff liefert. Die bisherigen Ergebnisse zeigen jedoch schon, daß die Stoffgruppe in ihren Eigenschaften sowohl äußerst überraschend

als auch wertvoll ist. Medizinische Anwendungen werden-in Zukunft zeigen₄ in wie großem Maß diese Stoffgruppe sur ei~ gentlichen Krankheitsheilung verwertet werden kann., doch sind jedenfalls dafür alle Voraussetzungen vorhanden.

Deutliche mikrobiologische Sehutsvrirkung iofc auch unter anderem aus dem folgenden ¥es?sueh ersieht lach. Eine poröse Extraktionshülse (Schleicher &.Sehüll Nr. 603) wurde mit 0_s2 % Gangliosidsulfat getränkt, Durch dioss Hülse hindurch er

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OBlQiHkL

keinerlei Transport von Mikroorganismen aus innerhalb der Hülse befindlicher infizierter Nährlösung in sterile Lösung außerhalb derselben, obwohl der Durchgans von Bakterien durch diese Hülse völlig unbehindert war, wenn die Hülse in entsprechender Weise mit einem anderen Lipid getränkt war. Diese besondere antibiotische Eigenschaft ist umso wertvoller, als sie erstmalig von einem im tierischen Organismus angetroffenen Lipid bekannt wird. · * ;-...;· .

Die dargestellte überraschende und wertvolle Eigenschaft des Gangliosidsulfats kommt indirekt auch zum Vorschein, wenn man alle bisher untersuchten Bauelemente des tierischen Organismus oder solche Absonderungen betrachtet, die ausdrücklieh dem mikrobiologischen Einfluß,der umgebenden Natur standhalten sollen.

Gangliosidsulfate können in der Antibiotik sowie in der Pfleg© solcher Hautkrankheiten eingesetzt werden"₉ füv die ein Mangel dieser Lipide in der Epidermis charakteristisah ist. Zur Verabfolgung der· Verbindungen kann man sich der folgenden Applikationen bedienen: ·-. ·

1) Parenteral, wobei die Verbindung '-zusammen mit sterilem Wasser₉ physiologischer Salzlösung oder zu injizierendem öl in flüssige Form gebracht wird.

- ι¹» -

2) Oral, wobei aus der Verbindung Tabletten, Kapseln, Pulver, Dragees oder flüssige Präparate hergestellt werden*

3) Lokal, wobei die Verbindung einer geeigneten Salbe oder Krem beigemischt wird.

Zur Veranschaulichung der Erfindung werden folgende Beispiele angeführt.

Beispiel 1

50 g fein zermahlene Hufe werden unter Rückfluß 1 Stünde mit 500 ml Chloroform-Methanolmischung (2+1) extrahiert und abfiltrierti der Rückstand wird noch 1 Stunde unter Rückfluß mit 500 ml Chloroform-Methanolmischung (1+2) extrahiert, Die vereinigten Filtrate werden mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne gedampft. Die Ausbeute (etwa 1 g) ist ein hellgelbes Fett, in dem auch reichlich Neutrallipide vorhanden sind. Dieses Lipidgemisch wird in 30 ml Chloroform aufgelöst; die Mischung wird durch eine Aluminiumoxydsäule geschickt, die aus 50 g in Chloroform suspendiertem AIgO, besteht. Die neutralen Lipide werden aus der AIgO,-Säule mit 500 ml Chloroform eluiert, wonach die polaren Lipide aus der Säule mit 500 ml Methanol eluiert werden. Diese Methanolfraktion wird im Vakuum zur Trockne gedampft, wobei man etwa 0,5 g eines schwach hellgelben Lipid£emisches erhält, das nahezu ausschließlich Gangliosiäsulfat enthält. Man löst

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dieses Gemisch in 2 ml warmem Methanol auf und läßt es erkalten, wobei die in Methanol schlechter löslichen Lipide ausfallen, das Gangliosidsulfat aber in der Lösung bleibt, die anschließend filtriert wird. Diese Mothanoübehandlung wird dreimal wiederholt; es ergeben sich ettva 0,25 g weißes, wachsartiges Gangliosidsulfat.

In der im Beispiel dargestellten Methanol-Reinigungsbehandlung ist der Gangliosidsulfatverlust verhältnismäßig hoch. Beträchtlich bessere Ausbeuten werden erzielt, indem man die hinter der AIpO,-Säule erhaltene Methanolfraktion entweder mit einem Sephadexgelfilter oder mittels präparativer Dünnschicht-Chromatographie reinigt. ·

Man kann auch so verfahren, daß von dem Rohmaterial direkt die zur therapeutischen Verwendung vorgesehene Lipidfraktion mit einem solchen Lösungsmittel abgetrennt wird, das in der Hauptsache nur diese Lipidfraktion zu lösen vermag ₃ während die übrigen Lipide ungelöst bleiben. Dazu kann man am zweckmäßigsten Methanol oder ein Gemisch desselben ir.it Wasser verwenden. Anstelle von Kufen oder dergleichen kann man bei

_o der Behandlung derselben entstandene Neben- und Abfallprodukte

go benutzen,

ο Beispiel 2

68 g Bindehaut werden im Kalten getrocknet- (lyophili—

BAP ORIGINAL

siert). Die trockene Haut wird zerkleinert. Die Fette werden zweimal mit 300 ml Methanol unter Rückfluß* im Verlauf von' 1/2 Stunde extrahiert. Die vereinigten Extrakte werden zur Trockne gedampft. Der erhaltene fettartige Rückstand- (1,0844 g), der reichlich Phospholipidc enthält, wird in der Al₂O,-Säule gereinigt. 30 g. Aluminium oxyd weiden in Chloroform suspendiert und der fettartige in 30 ml Chloroform gelöste Rückstand wi£d hindurchgetrieben. Die neutralen Lipide werden aus der Säule mit fe 90 ml Chloroform eluiert (Ausbeute 330 mg, 0,48 %), und dj.e polaren Lipide werden anschließend mit 250 ml Methanol eluiert (Ausbeute 285 mg, 0,42 %). Ein großer Teil der Proteine usw. bleibt noch in der Säule zurück. Die Fraktion der polaren Lipide wird mittels"Dünnplattenchromatographie auf Silicagelplatten und mit einer Mischung von Chloroform,' Methanol und V/asser (24:7:1) als Treibmittel gereinigt. Aus dem Plattenmaterial wird das Gangliosidsulfat mit Methanol extrahiert; das Methanol wird abgedampft und der Rückstand wird einmal aus Methanol umkristallisiert. Ausbeute etwa 50 mg (0,17 JO·

Beispiel 3

94,5 kg Federn werden mit einer C.H,OH/CH₂Cl₂»Mischung • . (2+1) im Evitol-Apparat zweimal 7 Stundenlang extrahiert. Die Ausbeute beträgt 2,2 kg (2,3 %) hellbraunes Fett, das weiter entweder in der Al₃O,-oder in der Sephadex-Säule gereinigt wird.

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a) 500 mg Federfett werden in. 5 ml Chloroform gelöst,

- der nichtgelöste Teil wird filtriert und die Lösung durch eine

Säule mit 10 g AIpO, ggschickt. Die neutralen Lipide werden mit 35 ml Chloroform eluiert (Rückstand 220 mg, 44,0 %), und die polaren Lipide hiernach mit 100 ml Methanol (Rückstand 155,2 mg, 31,0 %). Die Fraktion der polaren Lipide.enthält etwa 50 % Gangie sidsulfat; dieses wird aus der Fraktion durch dreimaliges Umkristallisieren aus Methanol gewonnen. Gangliosidsulfatausbeute 62 mg (12,H %)..

b) 5 g Federfett werden in 20 ml einer Mischung aus CHCl₃ : MeOH : H₂O (60:30:4,5) suspendiert und der unlösliche Teil wird abfiltriert. 10'g Sephadex (g 25 fine) werden in 50 ml der Mischung aus CHCl, : MeOH : H₃O (60:30:4,5) suspendiert und in ein Ionenaustauschrohr geschüttet. Die Federfettlösung wird hindurchgeschickt, wobei die neutralen Lipide mit der Treiblösung laufen. Die polarai Lipide werden aus der Säule mit 100 ml einer Mischung aus CHCl, : MeOH (2+1) eluiert, Die Fraktion der polaren Lipide wird weiter plattenchromatographisch nach Beispiel 1 gereinigt.

Beispiel 4

378kg Federn werden in der Wärme unter Rückfluß im Evitol-Apparat mit CHpCl« 3 Stunden lang extrahiert. Ausbeute 3>8 kg (1,0 %) hellbraunes Fett, das weiter in der Al₃O₃-SaUIe

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BAUIORiGiNAt

gereinigt wird (vgl. Beispiel 2a). Das Fett enhält 60,6 % neutrale Lipide und etwa 11,4 % polare Lipide. Das Fett enthält etwa 3*8 % Gangliosidsulfat, das nach Beispiel 2a separiert

Beispiel 5

30 kg Federn werden mit 180 1 einer Mischung aus CH^OH ι CH₂Cl₂ (1:1) durch Perkolation über Nacht extrahiert. Die Ausbeute (3,1 kg,2,1 %) wird weiter in der Al₃O₅-SaUIe gereinigt, wobei 50,1 % neutrale Lipide, 25₉0 % polare Lipide und 8,3 % Ganglxosidsulfat (auf die Fettmenge bezogen) erhalten

r ■

werden. ^:

Beispiel 6

30,5 kg trockene Schweinsborsten werden im Evitol-Apparat mit 60 1 Methylenchlorid 6 Stunden lang extrahiert. Das , Lösungsmittel wird abdestilliert, Rückstand 481 gfl,58 %). Der Rückstand wird weiter in der AlgO^-Säule gereinigt, wobei 58,5 % Neutrallipide,. 12₉3 % polare Lipide und 2,4 % Gangliosidsulfat erhalten werden.

Beispiel 7

30,5 kg trockene Schweinsborsten werden im Evitol-

Apparat mit 60 1 einer Chloroform-MeOH-Mischung (2:1) 1 Stun-

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de lang extrahiert. Die Ausbeute an Fett beträgt 432 g (l,42fc); es wird weiter in der Al₃O₃-SaUIe gereinigt. Neutrallipide 46,4 %, polare Lipide 16,1 % und Gangliosidsulfat 8,0 %.

Beispiel 8

5 g Schafwolle werden zweimal mit 50 ml einer Mischung aus CHCl, : MeOH (2+1) insgesamt 1 Stunde lang extrahiert. Ausbeute 505 mg (1Q,1 Ji), die weiter in der Al₃O₃-SaUIe gereinigt wird. Neutrallipide 7,4 %» polare Lipide 2,7 # und Gangliosidsulfat 0,3 Ϊ.

Beispiel 9.

Eine Seidenspinnerpuppe, die 245 mg wog, wird 1/2 Stunde lang mit 15 ml einer Mischung aus CHCl, : MeOH (2+1) extrahiert und anschließend 1/2 Stunde lang mit 15 ml einer Mischung aus CHCl₃ : MeOH (1+2). Der Fettrückstand(4,7 mg, 1,93 %) wird plattenchromatographisch auf Kieselgelplatten nach Beispiel 1 gereinigt. Die Ausbeute etwa O₃3 ng (0,12 %) Gangliosidsulfat.

Beispiel 10

3*3 S Spinnweben werden nach Beispiel 8 1/2 Stunde lang mit 75 ml CHCl₃ : MeOH (2+1) und 1/2 Stunde lang mit 75 vj. CHCl,: KeOH (1+2) extrahiert. Die vereinigten Fraktionen werden filtriert und zur Trockne gedampft, Rückstand'768 mg (23,355)

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* ■ ■ ·

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mit reichlichem Gehalt an Proteiren und Kohlehydraten. Der Rückstand wird in 3,8 ml Chloroform, gelöst und in einer Säule mit 20 g ^A12°3 ß^ereiⁿiß^fc* wobei 106,5 mg neutrale Fette (1358 Ji) und 33,5 mg (4,35 %) polare Fette erhalten werden. Die Fraktion der polaren Fette wird weiter,auf der Platte nach Beispiel 1 j gereinigt, wobei 1,6 mg (0,05 %) Gangliosidsulfat erhalten wer- ; den. ' ■■ ■ . ' . ■:■ , ■. ■ ■ ■" ■'■,■■■.■ ■■ ■. ■ ■■■■

j t Beispiel 11 ." ' |

Ein Wespennest mit einem Gewicht von 453 mg wird aer- . i kleinert und nach Beispiel 8 1/2 Stunde lang mit dmr Chloroform-Methanol-Mischung (2:1) und anschließend 1/2 Stunde lang mit einer Chloroform-Methanol-Mischung (1:2) extrahiert« Der Fettrückstand (49,4 mg, 10,9 %) wird weiter in der Al^O.-Säule gereinigt. Die neutralen Fette betragen 25,0 mg (50,5 JO und die polaren Fette 15*0 mg (30,4 %). Die polaren Lipide werden weiter plattenchromatographisch nach Beispiel 1 gereinigt, wobei 3,5 mg (7,1 %) Gangliosidsulfat erhalten werden.

Beispiel 12

% -2,1 g Badeschwamm (Euspongia officinaj.^|i.-.ülfrten nach • ^Beispiel 0 Extrahiert. Rücketand 19,2 mg (0.$Zm%i ^:ÜÖC plattenfthftthih h Biil 1 ii lk' Öl

nach Beispiel 1 gereinigt vlpk't Ölt Ausbeute 4_#'6 rag (0,22 Ϊ) Ganglioeidsulfat.

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Beispiel 13

6,6 is Schlangenhaut werden zerkleinert und mit 50 ml Methanol 1 Stunde lang extrahiert.' Rückstand 996 mg, der weiter in der Al₂O,-Säule gereinigt wird. Das Fett enthält ill mg (1,68 %) neutrale Lipide und 282 mg (4,26 %) polare Lipide. Die Fraktion der polaren Lipide wird weiter plattenchromato-

graphisch gereinigt, wobei etwa 7 mg (o,l %) Gangliosidsulfat erhalten werden. *

Beispiel 14

2,4 g Seestern worden nacji Beispiel 8. extrahiert. Der Rückstand (235 mg, 9,8 %) wird weiter in der Al₂O,-Säule gereinigt, wobei.5 g Al₂O, ^verwendet werden; es v/erden 75,7 mg S) neutrale Lipide mit 75 ml Chloroform eluiert und 5_Λ5 mg (0,23 %) polare Lipide mit 40 ml Methanol eluiert. Die Fraktion der polaren Lipide enthält neben 4,0 g (0,16 %) Gangliosidsulfat etwas Proteine, die durch Filtrieren aus einer kalten CHCl,-MeOH-Mischung (2:1) entfernt werden.

Beispiel 15

22,6'gilühnereihäute werden zweimal mit 1000 ml einer Mischung aus CHCl, : MeOII (1 + 2) extrahiert. Der Fettrückstand (307 mg, 1,35 %) wird in der Al₂O,-Säule gereinigt, wobei die Fraktion neutraler Lipide in einer Menge von 21,5 mg (0,0-9 %)

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und die Fraktion polarer Lipide ein einer Menge von 172 mg (0,7β %) erhalten wird. Die Fraktion" der polaren Lipide wird vielter plattenchromatographisch gereinigt, wobei 2J>₃& mg (0,2 %) Gangliosidsulfat erhalten werden. ·

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Claims

Patentansprüche

1). Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln mit

ta/

antibiotischen Wirkungen aus Materialien tierischen Ursprungs durch Extraktion, dadurch gekennzeichnet, <j_{aß man aus den} 'Materialien, insbesondere aus Hufen, Klauen oder Nägeln, mit Hilfe von Methanol, Chloroform oder deren Mischungen oder Mischungen von Methanol und Wasser Gangliosidsulftte der Formel

HO-C-H

Ceraaid

Sialsäure und Sulfat (SO₁.).' enthaltendes Kohlenhydrat

COOH

H-C-OH H-C-OH

in ihrem Molekül β cw oh 1 Sialsäure als auch Sulfatgruppe enthalten, aus dem erhaltenen Extrakt durch Destillation das Lösungemittel entfernt, den Destillationsrückstand chromatographisch durch Absorption des Rohmaterials

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an Aluminimoxyd oder Kieselgel reinigt und mittels Chloroform und Methanol eluiert.

2. Verfahren nach Anspruch I₁ dadurch gekennzeichnet,

im

daß ir.an als Materialien tierischen Ursprungs Haare, V/olle, Leder, Amniongewebe oder sonstiges Bindegewebe von Säugetieren, Vogelfedern oder Eierschalen, Fischflossen und -haut Reptilienhaut, Schalen von Krebsen und Mollusken, Stützgewebe und Absonderungen von Insekten, z.B. Puppen von Seidenspinnern^ Spinnweben und Wespennester, Stützgewebe von Stachelhäutern, z.B. Seesternen, Stützgewebe von Schwammtieren, z.B. Badeschwämmen, Stützgewebe von Protozoen und bei der Behandlung dieser Materialien entstandene Neben- oder Abfallprodukte verwendet.

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