DE19617851A1 - Nukleinsäurekonstrukte mit Genen kodierend für Transportsignale - Google Patents
Nukleinsäurekonstrukte mit Genen kodierend für TransportsignaleInfo
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Description
Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sind
Nukleinsäurekonstrukte, die in der Gentechnologie und
insbesondere in der Prophylaxe oder Therapie von Erkrankungen
(im nachfolgenden Gentherapie genannt) verwendet werden
können. Bei der Gentherapie werden Gene in den Organismus
eingeführt, die im Organismus exprimiert werden sollen. Die
Regulation der Expression dieser Gene ist bedeutsam für den
prophylaktischen oder therapeutischen Effekt der Gentherapie.
In den Patentanmeldungen PCT/GB95/02000, EP 95.03370,
EP 95.03371, EP 95.03368, EP 95.03339 werden Regulatoren für
die Expression eines Genes beschrieben. Diese Regulatoren
bestehen aus einer Aktivatorsequenz, deren Funktion
beispielsweise die zellspezifische oder virusspezifische
Aktivierung der basalen Transkription ist. Die DNA-Sequenz
dieser Aktivatorsequenz ist mit ihrem 3′-Ende an das 5′-Ende
eines Promotormoduls verknüpft. An das 3′-Ende des
Promotormoduls ist wiederum mit seinem 5′-Ende das
Strukturgen geknüpft.
Das Promotormodul besteht aus Nukleinsäuresequenzen zur
Bindung der Transkriptionsfaktoren der Familien CDF und CHF
oder E2F und CHF. Diese Bindung führt in der G0- und G1-Phase
des Zellzyklus zu einer Hemmung der stromaufwärts gelegenen
Aktivatorsequenz und damit zu einer Inhibition oder
Transkription des stromabwärts (d. h. in Richtung der
Transkription) gelegenen Strukturgenes.
In der G0- und G1-Phase der Zellteilung liegt der DNA-Gehalt
der Zelle im diploiden Zustand vor. In der G0-Phase ist die
Zelle in Ruhe, in der G1-Phase ist sie in ihrer
Zellzyklusprogression inhibiert. An die G1-Phase schließt
sich die S-Phase an, in der die DNA-Synthese stattfindet und
in der das Genom repliziert wird. Nachfolgend schließt sich
die G2-Phase an, in der die Zelle im tetraploiden Zustand
ist. Auf die G2-Phase folgt die Zellteilung (Mitose = M-
Phase). Die Tochterzellen kommen in den G0- oder G1-Zustand.
Die Kombination einer zellspezifischen oder virusspezifischen
Aktivatorsequenz mit einem diese Aktivatorsequenz in der G0-
und G1-Phase hemmenden Promotormodul ermöglicht somit die
zellspezifische oder virusspezifische als auch
zellzyklusspezifische (d. h. auf die S- und G2-Phase
beschränkte) Regulation der Expression eines Strukturgenes.
Die Kombination einer Aktivatorsequenz mit einem
Promotormodul wird chimärer Promotor genannt. Es gibt
zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten für chimäre Promotoren in
der Gentherapie, jedoch auch eine Reihe von durch
Unzulänglichkeiten bedingte Einschränkungen.
Beispiele für diese Einschränkungen sind
- - eine schwache Aktivatorsequenz, die eine zu geringe Trans kription des Strukturgenes bewirkt,
- - die Verwendung einer Aktivatorsequenz, die durch das ge wählte Promotormodul nicht ausreichend zellzyklusabhängig gehemmt werden kann,
- - die Beschränkung auf zwei (zum Beispiel zell- oder virusspezifische und zellzyklusspezifische) Regulatoren der Transkription des Strukturgenes und
- - ein mangelhafter Verbleib des Transkriptionsproduktes im Zellkern
- - oder der mangelhafte intrazelluläre Transport des Trans kriptionsproduktes des in die Zelle eingeführten Struktur genes.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung,
Nukleinsäurekonstrukte zur Verfügung zu stellen, die eine
präzise Regulierung der Expression von fremden Genen
(Transgene) in den Wirtszellen ermöglichen. Gegenstand der
vorliegenden Erfindung sind daher Nukleinsäurekonstrukte, die
ein nukleäres Retentions-Signal aufweisen, daß in
Leserichtung stromabwärts mit einem Transgen verknüpft ist.
Bevorzugt umfassen die Nukleinsäurekonstrukte wenigstens
folgende Komponenten, und zwar in Leserichtung vom 5′-Ende
zum 3′-Ende:
- a) eine erste unspezifische, zellspezifische, virusspezifi sche, metabolisch und/oder zellzyklusspezifisch aktivier bare Promotor- oder Enhancersequenz (I), die die basale Transkription eines Transgenes aktiviert,
- b) ein Transgen, das als Strukturgen für einem Wirkstoff ko diert,
- c) ein nukleäres Retentions-Signal, dessen cDNA am 5′-Ende mit dem 3′-Ende des Strukturgenes (b) mittelbar oder un mittelbar verknüpft ist.
Bevorzugterweise hat das Transkriptionsprodukt des nukleären
Retentions-Signals eine Bindestruktur für einen nukleären
Export-Faktor.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte können
zusätzlich zu den Komponenten a) bis c) folgende Komponenten
aufweisen:
- d) eine weitere Promotor- oder Enhancersequenz (II), welche die basale Transkription eines nukleären Export-Faktores aktiviert und
- e) eine Nukleinsäure kodierend für einen nukleären Export- Faktor, der an das Transkriptionsprodukt des nukleären Retentions-Signals (c) bindet und hierdurch den Transport des Transkriptionsproduktes des Transgens aus dem Zell kern vermittelt.
Die erste (I) Promotor- oder Enhancersequenz (a) und die
zweite (II) Promotor- oder Enhancersequenz (d) können gleich
oder unterschiedlich sein und, mindestens eine der
Komponenten a) und d) kann unspezifisch, zellspezifisch,
virusspezifisch, metabolisch, insbesondere durch Hypoxie oder
zellzyklusspezifisch aktivierbar sein.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung kann wenigstens eine der
Promotor- oder Enhancersequenzen (a) und (d) ein chimärer
Promotor sein, bei welchem das Promotormodul CDE-CHR oder
E2FBS-CHR mit einer stromaufwärts benachbarten
zellspezifisch, virusspezifisch oder metabolisch
aktivierbaren Aktivatorsequenz interagieren und dadurch die
Expression eines stromabwärts gelegenen Gens beeinflussen,
insbesondere inhibieren kann.
Bei den Komponenten a) und d) kann es sich um eine Aktivator
responsive Promotoreinheit handeln. Derartige Konstrukte
weisen weiterhin folgende Komponenten auf:
- f) wenigstens eine Promotor- oder Enhancersequenz, die un spezifisch, virusspezifisch, metabolisch oder zellspezi fisch und/oder zellzyklusspezifisch aktivierbar ist und
- g) wenigstens eine Aktivatorsubeinheit, die stromabwärts von der Promotor- oder Enhancersequenz (f) gelegen ist und durch die Promotor- oder Enhancersequenz (f) in ihrer ba salen Transkription aktiviert wird,
- h) einen Aktivator-responsiven Promotor, welcher durch die Expressionsprodukte einer oder mehrerer Aktivatorsubeinheit(en) (g) aktiviert wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um
Nukleinsäurekonstrukte, bei welchen die Promotor- oder
Enhancersequenz (a) und/oder (d) und/oder der Aktivator
responsive Promotor ein chimärer Promotor ist und die
Aktivatorsubeinheit (g) ein Gen für wenigstens einen
Transkriptionsfaktor darstellt, der den chimären Promotor des
Aktivator-responsiven Promotors (h) aktiviert.
Ein Beispiel für einen Aktivator-responsiven Promotor
aktiviert durch zwei Aktivatorsubeinheiten (g, g′) (h) stellt
der LexA-Operator in Verbindung mit dem SV40-Promotor dar.
Die Aktivatorsubeinheit (g) umfaßt die cDNA für das LexA-DNA-
Bindeprotein kodierend für die Aminosäuren 1-81 oder 1-202,
deren 3′-Ende verknüpft ist mit dem 5′-Ende der cDNA für das
Gal80-Protein (Aminosäuren 1-435). Die zweite
Aktivatorsubeinheit (g′) umfaßt die cDNA der Gal80-
Bindungsdomäne des Gal4-Proteins kodierend für die
Aminosäuren 851-881, deren 3′-Ende verknüpft ist mit dem 5′-
Ende der cDNA des SV40 large T-Antigens kodierend für die
Aminosäuren 126-132, deren 3′-Ende verknüpft ist mit dem 5′-
Ende der cDNA für die Transaktivierungsdomäne des VP16 von
HSV-1 kodierend für die Aminosäuren 406-488.
Bevorzugt wird das Gen kodierend für das nukleäre Retentions
signal ausgewählt aus der Gruppe umfassend das Rev-responsive
Element (RRE) von HIV-1 oder HIV-2, das RRE-äquivalente
Retentions-Signal von Retroviren oder das RRE-äquivalente
Retentions-Signal des HBV.
Der nukleäre Export-Faktor (e) ist bevorzugterweise ein Gen
ausgewählt aus der Gruppe umfassend das Rev-Gen der Viren
HIV-1, HIV-2, Visna-Maidi Virus, Caprine arthritis
encephalitis Virus, das Virus der infektiösen Anämie des
Pferdes, das Immundefizienzvirus der Katze, von Retroviren,
von HTLV oder das Gen des hnRNP-A1-Proteins oder das Gen des
Transkriptionsfaktors TFIII-A. In der Regel handelt es sich
bei der Nukleinsäure um DNS. Die erfindungsgemäßen
Nukleinsäurekonstrukte werden üblicherweise als Vektoren,
insbesondere Plasmidvektoren oder virale Vektoren eingesetzt.
Bei dem Transgen handelt es sich in der Regel um
Strukturgene, die für einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff
kodieren, der ausgewählt ist aus der Gruppe umfassend
Cytokine, Wachstumsfaktoren, Fusionsproteine zwischen
Liganden wie z. B. Antikörper oder Antikörperfragmente und
Cytokinen oder Wachstumsfaktoren, Rezeptoren für Cytokine
oder Wachstumsfaktoren, antiproliferativ oder zytostatisch
wirkende Proteine, Angiogeneseinhibitoren, Thrombose
induzierende Substanzen und Gerinnungshemmer, Komplement
aktivierende Proteine, Virushüllproteine, bakterielle
Antigene und parasitäre Antigene und Ribozyme.
Bevorzugterweise handelt es sich bei dem Transgen um ein
Strukturgen, das für ein Ribozym kodiert, welches die mRNA
inaktiviert, welche kodiert für ein Protein ausgewählt aus
der Gruppe umfassend Zellzykluskontrollproteine, insbesondere
Cyclin A, Cyclin B, Cyclin D1, Cyclin E, E2F1-5, cdc2, cdc25C
oder DP1, oder Virusproteine oder Cytokine oder
Wachstumsfaktoren oder deren Rezeptoren.
In einer anderen Ausführungsform kann es sich bei dem
Transgen (b) um ein Strukturgen handeln, daß für ein Enzym
kodiert, welches eine Vorstufe eines Pharmakons in ein
Pharmakon spaltet. In einer weiteren Ausführungsform kann das
Strukturgen für ein Ligand-Enzymfusionsprotein kodieren,
wobei das Enzym eine Vorstufe eines Pharmakons in ein
Pharmakon spaltet und der Ligand an eine Zelloberfläche
bindet, bevorzugt an Endothelzellen oder Tumorzellen.
Die Promotor-, Enhancer- oder Aktivatorsequenz kann
ausgewählt sein aus der Gruppe von genregulatorischen
Nukleotidsequenzen aktiviert in Endothelzellen, glatten
Muskelzellen, quergestreiften Muskelzellen, Makrophagen,
Lymphozyten, Tumorzellen, Leberzellen, Leukämiezellen und
Gliazellen oder von Promotorsequenzen der Viren HBV, HCV,
HSV, HPV, EBV, HTLV oder HIV.
Die Erfindung betrifft auch isolierte Zellen oder Zellinien,
die ein erfindungsgemäßes Nukleinsäurekonstrukt enthalten.
Derartige Zellen können zur Bereitstellung eines Heilmittels
zur Behandlung einer Erkrankung verwendet werden, wobei die
Bereitstellung des Heilmittels die Einführung des
Nukleinsäurekonstrukts in eine Zielzelle umfaßt. Derartige
Erkrankungen gehen häufig mit übermäßiger Zellvermehrung
einher.
Zur Bereitstellung des Heilmittels muß zunächst ein
Nukleinsäurekonstrukt in die Zielzelle eingeführt werden.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte erlauben es,
beliebige Promotoren, Enhancer oder Aktivatorsequenzen zu
verwenden und insbesondere den Verbleib des
Transkriptionsproduktes des in die Zelle eingeführten
Strukturgenes im Zellkern zu verstärken oder
den intrazellulären Transport des Transkriptionsproduktes des
in die Zelle eingeführten Strukturgenes zu erhöhen.
Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt für einen
verstärkten Verbleib des Transkriptionsproduktes im Zellkern
umfaßt folgende Komponenten:
- a) eine Promotor- oder Enhancersequenz I, welche die basale Transkription des Strukturgenes aktiviert,
- b) ein Transgen (Strukturgen), das bevorzugt in Form einer cDNA vorliegt, welches für den gewünschten Wirkstoff ko diert, und
- c) ein nukleäres Retentions-Signal (NRS), dessen cDNA am 5′- Ende bevorzugt unmittelbar mit dem 3′-Ende des Struktur genes verknüpft ist. Die Anordnung der einzelnen Kompo nenten ist beispielsweise im folgenden Schema wiedergege ben:
Das erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt für den
verstärkten intrazellulären Transport des
Transkriptionsproduktes weist neben einer Promotor- oder
Enhancersequenz I, welche die basale Transkription des
Strukturgenes aktiviert, und einem Transgen, welches für den
gewünschten Wirkstoff kodiert, ein nukleäres Retentions
signal (NRS) auf, dessen cDNA am 5′-Ende mit dem 3′-Ende des
Strukturgenes verknüpft ist und dessen messenger RNA
Bindestruktur für einen nukleären Export-Faktor (NEF) ist.
Darüber hinaus besitzen derartige Nukleinsäurekonstrukte eine
weitere Promotor- oder Enhancersequenz (II), welche die
basale Transkription der cDNA des nukleären Export-Faktors
(NEF) aktiviert und die cDNA kodierend für einen nukleären
Export-Faktor (NEF), dessen Expressionsprodukt an das
nukleäre Retentions-Signal (NRS) bindet und hierdurch den
Transport des Transkriptionsproduktes des Strukturgenes aus
dem Zellkern vermittelt.
Die Anordnung der einzelnen Komponenten ist beispielsweise im
folgenden Schema wiedergegeben:
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten können die
Promotor- oder Enhancersequenzen der Komponenten a) oder d)
gleich oder unterschiedlich sein, des weiteren können die
Komponenten d) und e) stromaufwärts oder stromabwärts der
Komponenten a), b) und c) gelegen sein.
Als Promotor- oder Enhancersequenz wird bevorzugt wenigstens
eine starke Promotor- oder Enhancersequenz, wie
beispielsweise vom CMV (EP-A-0173177) oder SV40 oder jede
andere, dem Fachmann bekannte Promotor- oder Enhancersequenz,
verwendet.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist bei den
erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten mindestens eine
Promotor- oder Enhancersequenz zellspezifisch, metabolisch
(z. B. durch Hypoxie), virusspezifisch oder
zellzyklusspezifisch aktivierbar.
Besonders bevorzugt werden
- - diejenigen Promotor- oder Enhancersequenzen, die die Trans kription zellspezifisch in Endothelzellen, glatte Muskel zellen, quergestreifte Muskelzellen, blutbildende Zellen, Lymphozyten, Makrophagen, Gliazellen oder Tumorzellen akti vieren und/oder
- - Promotorsequenzen bzw. Enhancersequenzen der Viren HBV, HCV, HSV, HPV, CMV, EBV, HTLV oder HIV und/oder
- - Promotor- oder Enhancersequenzen, welche metabolisch akti vierbar sind wie beispielsweise der durch Hypoxie induzier bare Enhancer (Semenza et al., PNAS 88, 5680 (1991)) oder Promotor (Mc Burney et al., Nucleic Acids Res. 19, 5755 (1991); WO 95/21927) und/oder
- - Promotoren, welche zellzyklusspezifisch aktivierbar sind wie beispielsweise der Promotor des cdc25C Genes, des Cyclin A Genes, des cdc2 Genes (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995), Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995), Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 2833 (1995)), des B- myb Genes (Lam et al., EMBO J. 12, 2705 (1993)), des DHFR- Genes (Means et al., Mol. Cell Biol. 12, 1054 (1992) und des E2F-1 Genes (Johnson et al., Genes Dev. 8, 1514 (1994), Hsiao et al., Genes Dev. 8, 15256 (1994)).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist bei den
erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten mindestens eine
Promotor- oder Enhancersequenz ein chimärer Promotor. Im
Sinne dieser Erfindung stellt ein chimärer Promotor die
Kombination einer stromaufwärts gelegenen zellspezifisch,
metabolisch oder virusspezifisch aktivierbaren
Aktivatorsequenz mit einem stromabwärts gelegenen
Promotormodul dar. Das Promotormodul ist gekennzeichnet durch
eine Nukleotidsequenz, welche die Transkriptionsfaktoren der
Familien CDF und CHF oder E2F und CHF binden und hierdurch
die Aktivierung der stromaufwärts gelegenen Aktivatorsequenz
in der G0- und G1-Phase des Zellzyklus hemmen kann (Lucibello
et al., EMBO J. 14, 132 (1994), PCT/GB95/02000).
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist bei den
erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten mindestens eine
Promotor- oder Enhancersequenz (Komponente a) oder d)) eine
Aktivator-responsive Promotoreinheit.
Eine Aktivator-responsive Promotoreinheit besteht ihrerseits
aus folgenden Komponenten:
- f) eine oder mehrere gleiche oder unterschiedliche Promotor- oder Enhancersequenz(en), die beispielsweise zellzyklus spezifisch, metabolisch, zellspezifisch oder virusspezi fisch oder sowohl zellzyklusspezifisch als auch metabo lisch, zellspezifisch oder virusspezifisch (sogenannte chimäre Promotoren) aktivierbar ist bzw. sind,
- g) eine oder mehrere gleiche oder unterschiedliche Aktivatorsubeinheit(en), welche jeweils stromabwärts von den Promotor- oder Enhancersequenzen gelegen und durch diese in ihrer basalen Transkription aktiviert wird bzw. werden,
- h) einen Aktivator-responsiven Promotor, welcher durch die Expressionsprodukte von einer oder mehreren Aktivatorsubeinheit(en) aktiviert wird.
Die Anordnung der einzelnen Komponenten einer bevorzugten
Aktivator-responsiven Promotoreinheit ist durch folgendes
Schema wiedergegeben:
Die Einfügung einer bevorzugten Aktivator-responsiven
Promotoreinheit in ein erfindungsgemäßes
Nukleinsäurekonstrukt ist beispielsweise durch folgendes
Schema wiedergegeben:
In der einfachsten Form können Aktivator-responsive
Promotoreinheiten beispielsweise chimäre Promotorkonstrukte
nach folgendem Schema darstellen:
In einer weiteren Ausführungsform können erfindungsgemäße
Aktivator-responsive Promotoreinheiten Bindesequenzen für
chimäre Transkriptionsfaktoren aus DNA-Bindungsdomänen,
Protein-Proteininteraktionsdomänen und Transaktivierungsdomä
nen darstellen.
Bevorzugte Strukturgene für einen pharmakologisch aktiven
Wirkstoff sind Gene für Ribozyme, Ribozyme mit kombinierter
Antisense RNA, Proteine und Glykoproteine, ausgewählt aus der
Gruppe umfassend Cytokine, Wachstumsfaktoren, Rezeptoren für
Cytokine oder Wachstumsfaktoren, Fusionsproteine aus Liganden
(z. B. Antikörper oder Antikörperfragmenten) und Cytokinen
oder Wachstumsfaktoren, antiproliferativ oder zytostatisch
wirkende Proteine, Angiogeneseinhibitoren, Thrombose
induzierende Proteine, Gerinnungshemmer, Komplement
aktivierende Proteine, Hüllsubstanzen von Viren und
Hüllsubstanzen von Bakterien.
Besonders bevorzugt sind Gene für Ribozyme, die spezifisch
die mRNA von solchen Genen spalten, welche für Proteine
kodieren, die an der Kontrolle des Zellzyklus im besonderen
Maße beteiligt sind.
Zu diesen Proteinen gehören im besonderen Cyclin A, Cyclin
D1, Cyclin E, Cyclin B, cdc2, E2F1-5, DP1, cdc25C (La
Thangue, Current Opin. Cell Biol. 6, 443 (1994); Müller,
Trends Genet. 11, 173 (1995); Zwicker et al., EMBO J. 14,
4514 (1995)).
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das nukleare
Retentions-Signal (NRS) eine Nukleotidsequenz, die den
Transport einer mit ihr verknüpften premessenger RNA durch
die Kernmembran behindert, die jedoch andererseits eine
Bindestruktur darstellt für ein Exportprotein. Dieses
Exportprotein vermittelt den Transport der ein NRS
enthaltende premessenger oder messenger RNA aus dem Zellkern
in das Zytoplasma. Eine, das NRS enthaltende premessenger
oder messenger RNA wird somit durch Bindung an das
Exportprotein aus dem Zellkern ausgeschleust (Fischer et al.,
Cell 82, 475 (1995)).
Bei den NRS handelt es sich bevorzugterweise um die Rev-
Responsive Element (RRE)-Sequenz von Retroviren. Bei HIV-1
ist diese RRE eine 243 Nukleotide (Nukleotide 7362-7595;
Muesing et al., Nature 313, 450 (1985)) umfassende Sequenz im
env-Gen (Malim et al., Nature 338, 254 (1989); Kjems et al.,
PNAS 88, 683 (1991)). Das nukleare Retentions-Signal (NRS) im
Sinne der Erfindung kann jedoch auch eine homologe und/oder
funktionell ähnliche (analoge) Nukleotidsequenz sein, so
beispielsweise das RRE-equivalente Element des HBV-Virus
(Huang et al., Mol Cell Biol. 13, 7476 (1993)).
Bei den erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukten ist der
nukleare Export-Faktor (NEF) eine Nukleotidsequenz, die für
ein Protein kodiert, welches an die mRNA des NRS bindet und
den Transport der ein NRS enthaltende premessenger RNA oder
messenger RNA aus dem Zellkern in das Zytoplasma (oder aus
dem Zytoplasma in den Zellkern) vermittelt. Im besonderen
wird im Sinne der Erfindung das rev-Gen von Retroviren,
speziell vom HIV-1 oder HIV-2 Virus (Daly et al., Nature 342,
816 (1989); Emerman et al., Cell 57, 1155 (1989); Felber et
al., PNAS 86, 1495 (1989); Fischer et al., EMBO J. 13, 4105
(1994)) verwendet.
Das rev-Protein des rev-Genes von Retroviren bindet mit
seiner N-terminalen Domäne (Zapp et al., Nature 342, 714
(1989); Malim et al., Cell 65, 241 (1991)) an das RRE in der
pre-mRNA (Iwai et al., Nucl. Acids Res. 20, 6465 (1992)).
Durch die Bindung zwischen dem RRE und dem rev-Protein wird
der Transport von "nonspliced" premessenger RNA, aber auch
jeder weiteren RNA, die ein RRE enthält, vom Zellkern in das
Zytoplasma ermöglicht (Fischer et al., EMBO J. 13, 4105
(1994); Fischer et al., Cell 82, 475 (1995)) und damit die
Translation erheblich verstärkt.
Im Sinne der Erfindung können als NEF auch Nukleotidsequenzen
verwendet werden, die Proteine kodieren, die homolog und
funktionell ähnlich dem rev-Protein von HIV-1 sind (Bogerd et
al., Cell 82, 485 (1995)), wie beispielsweise das rev-Gen des
Visna-Maedi Virus (VMV; Tiley et al., J. Virol. 65, 3877
(1991)) oder das rev-Gen des Caprine arthritis encephalitis
Virus (CAEV; Tiley et al., J. Virol. 65, 3877 (1991)).
Im Sinne der Erfindung können auch solche Gene eingesetzt
werden, die Proteine kodieren, die zwar nur eine geringe oder
keine Homologie zum rev-Protein besitzen, jedoch funktionell
ähnlich dem rev-Protein von HIV-1 sind.
Hierzu zählen z. B. das rex-Gen des HTLV-1 (Cullen, Microbiol.
Rev. 56, 375 (1992)), das rev-Gen des Virus der infektiösen
Anämie des Pferdes (EIAV) und des Immundefizienzvirus der
Katze (FIV) (Manusco et al., J. Virol. 68, 1988 (1994)).
In einer alternativen Ausführungsform kann es sich bei den
NEF auch um Nukleotidsequenzen für Proteine handeln, welche
eine Ausschleusung von RNA aus dem Kern bewirken, auch ohne
daß diese durch ein NRS im Kern zurückgehalten wird. Hierzu
zählen beispielsweise der Transkriptionsfaktor TFIIIA (Gaddat
et al., Cell 60, 619 (1990)) oder das heterogene nukleäre
Ribonukleoprotein A1 (hnRNPA1-Protein; Pinol-Roma et al.,
Nature 355, 730 (1992)).
Des weiteren gehören zu den nukleären Transportproteinen im
erweiterten Sinne das "heat shock protein 70" (hsc70; Mandell
et al., J. Cell Biol. 111, 1775 (1990)) oder der Pro
teinkinaseinhibitor CPKI (Fantozzi et al., J. Biol. Chem.
269, 2676 (1994), Wen et al., J. Biol. Chem. 269, 32214
(1994).
Gemeinsam ist dem NEF und seinen homologen und analogen
Proteinen eine mehr aminoterminal gelegene Domäne für die
Bindung des monomeren Proteins an die RNA des NRS (J. Virol
64, 881 (1990); Kjems et al., EMBO J. 11, 1119 (1992)) und
eine meist Leucin-reiche Domäne (Ausnahme hiervon hnRNPA1),
welche für die Transportfunktion des NEF notwendig ist (Wen
et al., Cell 82, 463 (1995); Fischer et al., Cell 82, 475
(1995); Malim et al., J. Virol. 65, 4248 (1991); Venkatesh et
al., Virol. 178, 327 (1990)).
Die Nukleinsäurekonstrukte bestehen bevorzugterweise aus DNS.
Unter dem Begriff Nukleinsäurekonstrukte werden künstliche
Gebilde aus Nukleinsäure verstanden, die in den Zielzellen
transkribiert werden können. Sie sind bevorzugt in einen
Vektor eingefügt, wobei Plasmidvektoren oder virale Vektoren
besonders bevorzugt sind.
Durch die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kann ein
Transgen (Komponente b) sowohl zellspezifisch oder
virusspezifisch oder unter bestimmten metabolischen
Bedingungen als auch zellzyklusspezifisch exprimiert werden,
wobei es sich bei dem Strukturgen bevorzugt um ein Gen
handelt, das für einen pharmakologisch aktiven Wirkstoff oder
aber für ein Enzym kodiert, welches eine inaktive Vorstufe
eines Pharmakons in ein aktives Pharmakon spaltet. Das
Strukturgen kann so gewählt sein, daß dieses Enzym als
Fusionsprotein mit einem Liganden exprimiert wird und dieser
Ligand an die Oberfläche von Zellen, z. B. proliferierende
Endothelzellen oder Tumorzellen bindet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Zellen von
Hefen oder Säugern, die ein erfindungsgemäßes
Nukleinsäurekonstrukt enthalten. In besonders bevorzugter
Ausführungsform werden die Nukleinäurekonstrukte in Zellinien
eingebracht, die dann nach Transfektion zur Expression des
Transgens verwendet werden können. Diese Zellen können somit
zur Bereitstellung eines Heilmittels für Patienten wie auch
im Patienten und somit zur Behandlung einer Erkrankung
verwendet werden. Eine bevorzugte Verwendung des
erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstruktes besteht in der
Behandlung einer Erkrankung, wobei die Bereitstellung des
Heilmittels die Einführung eines Nukleinsäurekonstrukts in
eine Zielzelle und dessen virus- oder zielzellspezifische und
zellzyklusspezifische Expression umfaßt. Bei der Erkrankung
handelt es sich häufig um eine solche, die mit übermäßiger
Zellvermehrung einhergeht, wobei die Herstellung des
Heilmittels die Einführung eines Nukleinsäurekonstruktes in
eine Zielzelle und seine virus- oder zielzellspezifische
Expression in dem Stadium der Zellproliferation umfaßt.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukte kommen in dieser
Form nicht in der Natur vor, d. h. das Transgen oder
Strukturgen für den Wirkstoff oder für ein Enzym oder für ein
Ligand-Enzym-Fusionsprotein ist nicht natürlicherweise
kombiniert mit dem nuklearen Retentions-Signal (NRS) und
beide sind nicht natürlicherweise mit dem Promotor I
verbunden und diese Kombination ist wiederum nicht
natürlicherweise kombiniert mit der Nukleotidsequenz
bestehend aus dem Promotor II und dem nuklearen Export-Faktor
(NEF).
Die Promotoren I und II und das Strukturgen für den Wirkstoff
(oder für das Enzym) der erfindungsgemäßen
Nukleinsäurekonstrukte werden je nach Verwendungszweck
ausgewählt.
Nachfolgend werden einige bevorzugte Anwendungsmöglichkeiten
dargestellt:
In Abhängigkeit von dem geplanten Einsatz der Nukleinsäure-
Konstrukte können folgende Ausführungsformen ausgewählt
werden:
Im Sinne dieser Erfindung zählen zu den bevorzugten
Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder
Enhancern solche genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente
für Gene, die für besonders in Endothelzellen (oder aber in
Zellen in unmittelbarer Nachbarschaft mit proliferierenden
Endothelzellen) nachweisbare Proteine kodieren.
Einige dieser Proteine sind von Borrows et al. (Pharmac.
Ther. 64, 155 (1994)) und Plate et al. (Brain Pathol. 4, 207
(1994)) beschrieben worden. Im besonderen zählen zu diesen
Endothelzell-spezifischen Proteinen beispielsweise:
- - Hirn-spezifischer, endothelialer Glucose-1-Transporter
Die Promotorsequenz wurde von Murakami et al. (J. Biol. Chem. 267, 9300 (1992)) beschrieben. - - Endoglin
Die Promotorsequenz wurde von Bellon et al. (Eur. J., Immunol. 23, 2340 (1993)) und Ge et al. (Gene 138, 201 (1994)) beschrieben. - - VEGF-Rezeptoren
Zwei Rezeptoren werden unterschieden (Plate et al., Int. J. Cancer 59, 520 (1994)): - - VEGF-Rezeptor-1 (flt-1) (de Vries et al., Science 255, 989 (1992)) und der
- - VEGF-Rezeptor-2 (flk-1, KDR) (Terman et al., BBRC 187, 1579 (1992)).
Beide Rezeptoren sind fast ausschließlich auf endothelialen
Zellen (Senger et al., Cancer Metast. Rev. 12, 303 (1993))
anzutreffen.
- - andere Endothelzell-spezifische Rezeptortyrosinkinasen
- - til-1 oder til-2
(Partanen et al., Mol. Cell. Biol. 12, 1698 (1992), Schnürch und Risau, Development 119, 957 (1993), Dumont et al., Oncogene 7, 1471 (1992)) - - B61-Rezeptor (Eck-Rezeptor)
(Bartley et al., Nature 368, 558 (1994), Pandey et al., Science 268, 567 (1995), van der Geer et al., Ann. Rev. Cell. Biol. 10, 251 (1994)) - - B61
Das B61-Molekül stellt den Liganden dar für den B61- Rezeptor. (Holzman et al., J. Am. Soc. Nephrol. 4, 466 (1993), Bartley et al., Nature 368, 558 (1994)) - - Endothelin, im speziellen
- - Endothelin B
Die Promotorsequenz wurde von Benatti et al., J. Clin. Invest. 91, 1149 (1993) beschrieben. - - Endothelin-1
Die Promotorsequenz wurde von Wilson et al., Mol. Cell. Biol. 10, 4654 (1990) beschrieben. - - Endothelin-Rezeptoren, insbesondere der Endothelin B- Rezeptor (Webb et al., Mol. Pharmacol. 47, 730 (1995), Haendler et al. J. Cardiovasc. Pharm. 20, 1 (1992)).
- - Mannose-6-Phosphat-Rezeptoren
Die Promotorsequenzen sind von Ludwig et al. (Gene 142, 311 (19949), Oshima et al., (J. Biol. Chem. 263, 2553 (1988)) und Pohlmann et al. (PNAS USA 84, 5575 (1987)) beschrieben worden. - - Von Willebrand Faktor
Die Promotorsequenz wurde von Jahroudi und Lynch (Mol. Cell. Biol. 14, 999 (1994)), Ferreira et al. (Biochem. J. 293, 641 (1993)) und Aird et al. (PNAS USA 92, 4567 (1995)) beschrieben. - - IL-1α, IL-1β
Die Promotorsequenzen wurden von Hangen et al., Mol. Carcinog. 2, 68 (1986), Turner et al., J. Immunol. 143, 3556 (1989), Fenton et al., J. Immunol. 138, 3972 (1987), Bensi et al., Cell Growth Diff. 1, 491 (1990), Hiscott et al., Mol. Cell. Biol. 13, 6231 (1993) und Mori et al., Blood 84, 1688 (1994) beschrieben. - - IL-1-Rezeptor
Die Promotorsequenz wurde von Ye et al., PNAS USA 90, 2295 (1993) beschrieben. - - Vascular Cell Adhesion Molecule (VCAM-1)
Die Promotorsequenz des VCAM-1 wurde beschrieben von Neish et al., Mol. Cell. Biol. 15, 2558 (1995), Ahmad et al., J. Biol. Chem. 270, 8976 (1995), Neish et al., J. Exp. Med. 176, 1583 (1992), Iademarco et al., J. Biol. Chem. 267, 16323 (1992), und Cybulsky et al., PNAS USA 88, 7859 (1991) - - Synthetische Aktivatorsequenz
Als Alternative zu natürlichen endothelspezifischen Promo toren lassen sich auch synthetische Aktivatorsequenzen ver wenden, die aus oligomerisierten Bindestellen für Trans kriptionsfaktoren, die preferentiell oder selektiv in Endo thelzellen aktiv sind, bestehen. Ein Beispiel hierfür ist der Transkriptionsfaktor GATA-2, dessen Bindestelle im Endothelin-1 Gen 5′-TTATCT-3′ ist (Lee et al., Biol. Chem. 266, 16188 (1991), Dorfmann et al., J. Biol. Chem. 267, 1279 (1992) und Wilson et al., Mol. Cell Biol. 10, 4854 (1990)).
Bei proliferierenden Endothelien werden durch geöffnete
"tight junctions" Nachbarzellen für Makromoleküle vom Blut
aus zugänglich. Durch die funktionellen und anatomischen
Wechselbeziehungen sind die Nachbarzellen von aktivierten
Endothelzellen Zielzellen im Sinne dieser Erfindung.
- - VEGF
Die genregulatorischen Sequenzen für das VEGF-Gen sind - - die Promotorsequenz des VEGF-Gens (5′ flankierende Re gion) (Michenko et al., Cell. Mol. Biol. Res. 40, 35 (1994), Tischer et al., J. Biol. Chem. 266, 11947 (1991)) oder
- - die Enhancersequenz des VEGF-Gens (3′ flankierende Re gion) (Michenko et al., Cell Mol. Biol. Res. 40, 35 (1994)) oder
- - das c-Src-Gen (Mukhopadhyay et al., Nature 375, 577 (1995), Bonham et al., Oncogene 8, 1973 (1993), Parker et al., Mol. Cell. Biol. 5, 831 (1985), Anderson et al., Mol. Cell. Biol. 5, 112 (1985)) oder
- - das V-Scr-Gen (Mukhodpadhyay et al., Nature 375, 577 (1995), Anderson et al., Mol. Cell. Biol. 5, 112 (1985), Gibbs et al., J. Virol. 53, 19 (1985))
- - Steroid-Hormonrezeptoren und deren Promotorelemente (Truss und Beato, Endocr. Rev. 14, 459 (1993)), insbesondere der
- - Maus-Mammatumor-Virus-Promotor
Die cDNA-Sequenz der Promotorregion der long terminal repeat region des MMTV wurde von Chalepakis et al., Cell 53, 371 (1988) und Truss und Beato (Endocr. Rev. 14, 459 (1993) beschrieben.
Als antitumorale oder antientzündliche Substanz im Sinne
dieser Erfindung ist die DNA-Sequenz eines Proteins zu
verstehen, welches die Proliferation von Endothelzellen
inhibiert. Hierzu gehören beispielsweise die DNA-Sequenzen
für:
- - das Retinoblastomprotein (pRb/p110) oder für seine Analoga p107 und 120
- - das p53 Protein
- - das p21 (WAF-1) Protein
- - das p16 Protein
- - weitere CdK-Inhibitoren
- - das GADD45 Protein
- - das bak Protein.
Um eine schnelle intrazelluläre Inaktivierung dieser
Zellzyklusinhibitoren zu verhindern, sind bevorzugt solche
Gene zu verwenden, welche Mutationen für die
Inaktivierungsstellen der exprimierten Proteine aufweisen,
ohne daß diese hierdurch in ihrer Funktion beeinträchtigt
werden.
Das Retinoblastomprotein (pRb) und die Verwandten p107 und
p130 Proteine werden durch Phosphorylierung inaktiviert.
Bevorzugt wird somit eine pRb/p110-, p107- oder p130 cDNA-
Sequenz verwendet, die derartig punktmutiert ist, daß die
Phosphorylierungsstellen des kodierten Proteins gegen nicht
phosphorylierbare Aminosäuren ausgetauscht sind.
Als antitumorale bzw. antientzündliche Substanz ist des
weiteren die DNA-Sequenz für ein Protein zu verstehen,
welches die Gerinnung induziert und/oder die Angiogenese
inhibiert. Zu diesen Proteinen zählt beispielsweise:
- - Tissue factor (TF) und gerinnungsaktive Fragmente von ihm (Morrissey et al., Cell 50, 129 (1987), Scarpati et al., Biochem. 26, 5234 (1987), Spicer et al., PNAS USA 84, 5148 (1987), Rehemtulla et al., Thromb. Heamost. 65, 521 (1991))
- - Plasminogenaktivatorinhibitor-1 (PAI-1)
- - PAI-2
- - PAI-3
- - Angiostatin
- - Interferone
- - IFNα
- - IFNβ
- - IFNγ
- - Platelet factor 4
- - IL-12
- - TIMP-1
- - TIMP-2
- - TIMP-3
- - Leukemia Inhibitory Factor (LIF).
Als antitumorale bzw. antientzündliche Substanz ist jedoch
auch eine DNA-Sequenz für ein Protein zu verstehen, welches
direkt oder indirekt eine zytostatische Wirkung auf Tumoren
aufweist. Hierzu zählen im besonderen:
- - Perforin
- - Granzym
- - IL-2
- - IL-4
- - IL-12
- - Interferone, wie beispielsweise
- - IFNα
- - IFNβ
- - IFNγ
- - TNF
- - TNFα
- - TNFβ
- - Oncostatin M
Als antitumorale Substanz ist des weiteren die DNA-Sequenz
für ein Protein zu verstehen, welches ggf. zusätzlich zur
antitumoralen Wirkung Entzündungen stimuliert und hierdurch
zur Elimination von Tumorzellen beiträgt. Hierzu zählen im
besonderen beispielsweise:
- - RANTES (MCP-2)
- - monocyte chemotactic and activating factor (MCAF)
- - IL-8
- - macrophage inflammatory protein-1 (MIP-1α, -β)
- - neutrophil activating protein-2 (NAP-2)
- - IL-3
- - IL-5
- - human leukemia inhibitory factor (LIF)
- - IL-7
- - IL-11
- - IL-13
- - GM-CSF
- - G-CSF
- - M-CSF
- - Cobra venum factor (CVF) oder Teilsequenzen vom CVF, welche dem menschlichen Komplementfaktor C3b funktionell entspre chen, d. h. welche an den Komplementfaktor B binden können und nach Spaltung durch den Faktor D eine C3 Konvertase darstellen. Die DNA-Sequenz für CVF und seiner Teilsequen zen wurden von Fritzinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12775 (1994) veröffentlicht.
- - der menschliche Komplementfaktor C3 oder seine Teilsequenz C3b. Die DNA-Sequenz für C3 und seiner Teilsequenzen wurde von De Bruÿn et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 708 (1985) publiziert.
- - Spaltprodukte des menschlichen Komplementfaktors C3, welche funktionell und strukturell dem CVF ähneln. Derartige Spaltprodukte wurden von O′Keefe et al., J. Biol. Chem. 263, 12690 (1988) beschrieben.
- - Bakterielle Proteine, welche Komplement aktivieren oder Entzündungen auslösen, wie beispielsweise Porine von Salmonella typhi murium (Galdiero et al., Infection and Immunity 46, 559 (1984)), "clumping" Faktoren von Staphylococcus aureus (Espersen Acta Path. Microb. et Imm. Scandin. Sect C 93, 59 (1985)), Moduline besonders von gram-negativen Bakterien (Henderson et al., Inflam. Res. 44, 187 (1995)), "Major outer membrane protein" von Legionellen (Bellinger-Kawahara et al., J.Exp.Med. 172, 1201 (1990)) oder von Haemophilus influenza Typ B (Hetherington et al. Infection and Immunity 60, 19 (1992)) oder von Klebsiellen (Alberti et al., Infection and Immunity 61, 852 (1993)) oder M-Moleküle von Streptokokken Gruppe G (Campo et al., J.Infec.Dis. 171, 601 (1995)).
Als Wirksubstanz im Sinne der Erfindung können auch DNA-
Sequenzen von Fusionsproteinen zwischen den aufgeführten
Cytokinen oder Wachstumsfaktoren zum einen und Liganden für
Rezeptoren auf der Zellmembran (wie beispielsweise einem
Antikörper spezifisch für Endothelzellen oder Tumorzellen
oder dem Fc-Teil des menschlichen Immunglobulins) zum anderen
Verwendung finden. Derartige DNA-Sequenzen und ihre
Herstellung wurden beispielsweise in der EPA 0464 633 A1
beschrieben.
Als antitumorale bzw. antientzündliche Substanz ist jedoch
auch die DNA-Sequenz für ein Enzym zu verstehen, welches in
der Lage ist, Vorstufen eines antitumoralen Wirkstoffes in
einen antitumoralen Wirkstoff zu überführen.
Derartige Enzyme, welche inaktive Vorsubstanzen (Prodrugs) in
aktive Zytostatika (Drugs) spalten und die jeweils
zugehörigen Prodrugs und Drugs sind bereits von Deonarain et
al. (Br. J. Cancer 70, 786 (1994)), von Mullen, Pharmac.
Ther. 63, 199 (1994)) und Harris et al. (Gene Ther. 1, 170
(1994)) übersichtlich beschrieben worden.
Beispielsweise ist die DNA-Sequenz eines der folgenden Enzyme
zu verwenden:
- - Herpes Simplex Virus thymidinkinase (Garapin et al., PNAS USA 76, 3755 (1979), Vile et al., Cancer Res. 53, 3860 (1993), Wagner et al., PNAS USA 78, 1441 (1981), Moelten et al., Cancer Res. 46, 5276 (1986), J. Natl. Cancer Inst. 82, 297 (1990))
- - Varizella Zoster Virus Thymidinkinase (Huber et al., PNAS USA 88, 8039 (1991), Snoeck, Int. J. Antimicrob. Agents 4, 211 (1994))
- - bakterielle Nitroreduktase (Michael et al., FEMS Microbiol. Letters 125, 195 (1994), Bryant et al., J. Biol. Chem. 266, 4126 (1991), Watanabe et al., Nucleic Acids Res. 18, 1059 (1990))
- - bakterielle β-Glucuronidase (Jefferson et al., PNAS USA 83, 8447 (1986))
- - pflanzliche β-Glucuronidase aus Secale cereale (Schulz et al., Phytochemistry 26, 933 (1987))
- - humane β-Glucuronidase (Bosslet et al., Br. J. Cancer 65, 234 (1992), Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1987))
- - humane Carboxy peptidase (CB) z. B.
- - CB-A der Mastzelle (Reynolds et al., J. Clin. Invest. 89, 273 (1992))
- - CB-B des Pankreas (Yamamoto et al., J. Biol. Chem. 267, 2575 (1992), Catasus et al., J. Biol. Chem. 270, 6651 (1995))
- - bakterielle Carboxy peptidase (Hamilton et al., J. Bacteriol. 174, 1626 (1992), Osterman et al., J. Protein Chem. 11, 561 (1992))
- - bakterielle β-Laktamase (Rodrigues et al., Cancer Res. 55, 63 (1995), Hussain et al., J. Bacteriol. 164, 223 (1985), Coque et al., EMBO J. 12, 631 (1993))
- - bakterielle Cytosine deaminase (Mullen et al., PNAS USA 89, 33 (1992), Austin et al., Mol. Pharmac. 43, 380 (1993), Danielson et al., Mol. Microbiol. 6, 1335 (1992))
- - humane Catalase bzw. Peroxidase (Ezurum et al., Nucl. Acids Res. 21, 1607 (1993))
- - Phosphatase, im besonderen
- - humane alkalische Phosphatase (Gum et al., Cancer Res. 50, 1085 (1990))
- - humane saure Prostataphosphatase (Sharieff et al., Am. J. Hum. Gen. 49, 412 (1991), Song et al., Gene 129, 291 (1993), Tailor et al., Nucl. Acids Res. 18, 4928 (1990))
- - Typ 5 saure Phosphatase (Gene 130, 201 (1993))
- - Oxidase, im besonderen
- - humane Lysyloxidase (Kimi et al., J. Biol. Chem. 270, 7176 (1995))
- - humane saure D-aminooxidase (Fukui et al., J. Biol. Chem. 267, 18631 (1992))
- - Peroxidase, im besonderen
- - humane Gluthation Peroxidase (Chada et al., Genomics 6, 268 (1990), Ishida et al., Nucl. Acids Res. 15, 10051 (1987))
- - humane Eosinophilen Peroxidase (Ten et al., J. Exp. Med. 169, 1757 (1989), Sahamaki et al., J. Biol. Chem. 264, 16828 (1989))
- - humane Schilddrüsen Peroxidase (Kimura, PNAS USA 84, 5555 (1987)).
Zur Erleichterung der Sekretion der aufgeführten Enzyme kann
die jeweils in der DNA-Sequenz enthaltende homologe
Signalsequenz ersetzt werden durch eine heterologe, die
extrazelluläre Ausschleusung verbessernde Signalsequenz.
So kann beispielsweise die Signalsequenz der β-Glucuronidase
(DNA Position 27 bis 93; Oshima et al., PNAS 84, 685
(1987)) ersetzt werden durch die Signalsequenz für das
Immunglobulin (DNA Position 63 bis 107; Riechmann et al.,
Nature 332, 323 (1988)) oder durch die Signalsequenz für das
CEA (DNA-Position 33 bis 134; Schrewe et al., Mol. Cell.
Biol. 10, 2738 (1990), Berling et al., Cancer Res. 50, 6534
(1990)) oder durch die Signalsequenz des humanen respiratory
syncytial virus glycoproteins (cDNA der Aminosäuren 38 bis
50 oder 48 bis 65; Lichtenstein et al., J. General Virol.
77, 109 (1996)).
Des weiteren sind bevorzugt DNAs solcher Enzyme zu wählen,
welche durch Punktmutation in einem geringeren Maße in
Lysosomen gespeichert und vermehrt sekretiert werden.
Derartige Punktmutationen wurden beispielsweise für die β-
Glucuronidase beschrieben (Shiplex et al., J.Biol.Chem. 268,
12193 (1993).
Zur Verankerung des Enzyms in die Zellmembran der das Enzym
bildenden Zelle kann alternativ oder zusätzlich zur
Signalsequenz eine Sequenz für eine Transmembrandomäne
eingeführt werden.
So kann beispielsweise die Transmembransequenz des
menschlichen Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (DNA-
Position 1485 bis 1554; Cosman et al., Behring Inst.
Mitt. 83, 15 (1988)) oder die DNA-Sequenz für die Signal- und
Transmembranregion des menschlichen Respirator Syncytial
Virus (RSV)-Glykoproteins G (Aminosäuren 1 bis 63 oder deren
Teilsequenzen, Aminosäuren 38 bis 63; Vÿaya et al., Mol.
Cell Biol. 8, 1709 (1988), Lichtenstein et al., J. General
Virol. 77, 109 (1996)) oder die DNA-Sequenz für die Signal-
und Transmembranregion der Influenzavirus-Neuraminidase
(Aminosäuren 7 bis 35 oder die Teilsequenz Aminosäuren 7 bis
27; Brown et al., J. Virol. 62, 3824 (1988)) zwischen der
DNA-Sequenz für den Promotor und der DNA-Sequenz für das
Enzym (z. B. die β-Glucuronidase) eingefügt werden.
Zur Verstärkung der Translation kann am 3′-Ende des Promotors
und unmittelbar vom 5′-Ende des Startsignals (ATG) der
Signal- bzw. Transmembransequenz die Nukleotidsequenz
GCCACC Seq.-ID.-Nr. 1
oder
GCCGCC Seq.-ID.-Nr. 2
eingefügt (Kozak, J. Cell. Biol. 108, 299 (1989) werden.
Zur Verankerung des Enzyms in die Zellmembran der das Enzym
bildenden Zellen kann jedoch auch die Nukleotidsequenz für
einen Glykophospholipid-Anker eingefügt werden.
Die Einfügung eines Glykophospholipid-Ankers erfolgt am 3′-
Ende der Nukleotidsequenz für das Enzym und kann zusätzlich
zur Einfügung einer Signalsequenz erfolgen.
Glykophospholipid-Anker sind beispielsweise für das CEA (DNA-
Position 893 bis 1079; Berling et al., Cancer Res. 50,
6534 (1990)), für das N-CAM (Cunningham et al., Science 236,
799 (1987) und für weitere Membranproteine, wie
beispielsweise Thy-1 (Clissold, Biochem. J. 281, 129 (1992))
oder CD16 (Selvaray et al., Nature 333, 565 (1988))
beschrieben worden.
Eine Übersicht über Glycophospholipid verankerte
Membranproteine wurde von Ferguson et al. (Ann. Rev. Biochem.
57, 285 (1988)) publiziert.
Eine weitere Möglichkeit der Veränderung von Enzymen an die
Zellmembran entsprechend der vorliegenden Erfindung ist die
Verwendung einer DNA-Sequenz für ein Ligand-Enzym-
Fusionsprotein. Die Spezifität des Liganden dieses
Fusionsproteins ist gerichtet gegen ein auf der Zellmembran
von proliferierenden Endothelzellen oder von Tumorzellen
befindliche Membranstruktur.
Zu den Liganden, welche an die Oberfläche von
proliferierenden Endothelzellen binden, gehören
beispielsweise Antikörper oder Antikörperfragmente, gerichtet
gegen Membranstrukturen von Endothelzellen, wie sie
beispielsweise von Burrows et al. (Pharmac.Ther. 64, 155
(1994)), Hughes et al. (Cancer Res. 49, 6214 (1989)) und
Maruyama et al. (PNAS-USA 87, 5744 (1990)) beschrieben
wurden. Insbesondere zählen hierzu Antikörper gegen die VEGF-
Rezeptoren.
Die murinen monoklonalen Antikörper sind bevorzugt in
humanisierter Form einzusetzen. Die Humanisierung erfolgt in
der von Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)) und
Hoogenbooms et al. (Rev.Tr.Transfus.Hemobiol. 36, 19 (1993))
dargestellten Weise. Antikörperfragmente werden entsprechend
dem Stand der Technik hergestellt, beispielsweise in der von
Winter et al. (Nature 349, 293 (1991)), Hoogenboom et al.
(Ref.Tr.Transfus.Hemobiol. 36, 19 (1993); Girol.Mol.Immunol.
28, 1379 (1991) oder Huston et al. (Intern.Rev.Immunol. 10,
195 (1993)) beschriebenen Weise.
Zu den Liganden gehören des weiteren alle Wirkstoffe, welche
an Membranstrukturen oder Membranrezeptoren auf
Endothelzellen binden. Beispielsweise gehören hierzu
Substanzen, die endständig Mannose enthalten, des weiteren
IL-1 oder Wachstumsfaktoren oder deren Fragmente bzw.
Teilsequenzen von ihnen, die an Rezeptoren exprimiert durch
Endothelzellen binden, wie beispielsweise PDGF, bFGF, VEGF,
TGFβ (Pusztain et al., J.Pathol. 169, 191 (1993)). Des
weiteren gehören hierzu Adhäsionsmoleküle, welche an
aktivierte und/oder proliferierende Endothelzellen binden.
Derartige Adhäsionsmoleküle, wie beispielsweise SLex, LFA-1,
MAC-1, LECAM-1 oder VLA-4, wurden bereits beschrieben
(Übersichten bei Augustin-Voss et al., J.Cell.Biol. 119, 483
(1992), Pauli et al., Cancer Metast. Rev. 9, 175 (1990), Honn
et al., Cancer Metast. Rev. 11, 353 (1992)).
Zu den Liganden gehören jedoch auch Antikörper oder deren
Fragmente, welche gerichtet sind gegen tumorspezifische oder
tumorassoziierte Antigene auf der Tumorzellmembran.
Beispiele für derartige Antigene und die zugehörigen
Antikörper sind bei Sedlacek et al., Contrib.Oncol. 32 (1988)
und Contrib.Oncol. 43 (1992) beschrieben. Antikörper-Enzym-
Fusionsproteine wurden beispielsweise von Bosslet et al., Br.
J. Cancer 65, 234 (1992) beschrieben. Zur Erleichterung der
Sekretion der aufgeführten Ligand-Enzym-Fusionsproteine kann
die jeweils in der DNA-Sequenz des Enzyms enthaltene homologe
Signalsequenz, wie bereits beschrieben, ersetzt werden durch
eine heterologe, die extrazelluläre Ausschleusung
verbessernde Signalsequenz.
Als antitumorale bzw. antientzündliche Substanz ist jedoch
auch die DNA-Sequenz für ein Ribozym zu verstehen, welches in
der Lage ist, das Transkriptionsprodukt (messenger RNA) eines
Genes für ein Zellzykluskontrollprotein zu spalten und
hierdurch zu inaktivieren.
Bevorzugte Substrate für derartige Ribozyme ist die messenger
RNA der Gene des Cyclin A, Cyclin B, Cyclin D1, Cyclin E,
cdc2, cdc25C und DP1.
Die DNA-Oligonukleotidsequenz für ein Ribozym, welches Cyclin
D1 mRNA (Xiong et al., Cell 665, 691 (1991) in der Nukleotid-
Position
spaltet, ist beispielsweise
Die DNA-Oligonukleotidsequenz für ein weiteres Ribozym zur
Spaltung der Cyclin D1 mRNA in der Nukleotidposition
ist beispielsweise
Die DNA-Oligonukleotidsequenz für ein Ribozym, welches die
mRNA von Cyclin E (Koff et al., Cell 66, 1217 (1991)) in der
Nukleotid-Position
spaltet, ist beispielsweise
die DNA Oligonukleotidsequenz für ein weiteres Ribozym zur
Spaltung der mRNA von Cyclin E in der Nukleotid-Position
spaltet, ist beispielsweise
Gegenstand der Erfindung sind des weiteren
Nukleinsäurekonstrukte, in welchen eine Kombination der DNA-
Sequenzen von mehreren gleichen antitumoralen oder
antientzündlichen Substanzen (A, A) oder von unterschiedlichen
antitumoralen Substanzen (A, B) vorliegt. Zur Expression von
zwei DNA-Sequenzen wird vorzugsweise die cDNA einer "internal
ribosome entry site" (IRES) als regulatorisches Element
zwischengeschaltet.
Derartige IRES wurden beispielsweise von Mountford und Smith
(TIG 11, 179 (1995), Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19,
4485 (1991), Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293 (1992),
Dirks et al., Gene 128, 247 (1993), Pelletier und Sonenberg,
Nature 334, 320 (1988) und Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694
(1994) beschrieben.
So kann die cDNA der IRES-Sequenz des Poliovirus (Position
140 bis 630 des 5′ UTR; Pelletier und Sonenberg, Nature
334, 320 (1988)) zur Verknüpfung der DNA der
antientzündlichen Substanz A (am 3′ Ende) und der DNA der
antientzündlichen Substanz B (am 5′ Terminus) verwendet
werden.
Ein derartiger Wirkstoff weist je nach Kombination additive
(A+A, A+B1) oder synergistische Wirkung im Sinne der
Erfindung auf.
Im Sinn der vorliegenden Erfindung wird als Promotor oder
Aktivatorsequenz aus Promotoren oder Enhancern bevorzugt eine
genregulatorische Sequenz bzw. ein Element aus einem Gen
verwendet, welches ein Protein kodiert, welches besonders
stark oder selektiv in Zellen der Blutbildung exprimiert ist.
Zu solchen genregulatorischen Sequenzen gehören
Promotorsequenzen für Gene eines Cytokins oder seines
Rezeptors, dessen Expression in den unreifen blutbildenden
Zellen (oder in benachbarten Zellen, wie beispielsweise dem
Stroma), dem nachfolgenden, auf die blutbildenden Zellen
einwirkenden und als Wirksubstanz gewünschten Cytokin
vorgeschaltet ist. Beispielsweise sind derartige auf unreife
blutbildende Zellen einwirkende Cytokine wie:
- - Stem Cell Factor
- - IL-1
- - IL-3
- - IL-6
- - GM-CSF.
Als Wirksubstanz im Sinne der Erfindung ist eine DNA-Sequenz
zu verstehen, deren exprimiertes Protein die Proliferation
und/oder Differenzierung von Blutzellen bewirkt.
Als Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder
Enhancern sind genregulatorische Sequenzen der Gene für
solche Proteine zu verwenden, welche bei der Immunreaktion in
Makrophagen und/oder in Lymphozyten verstärkt gebildet
werden. Derartige Proteine sind beispielsweise:
- - IL-1
- - IL-1β
- - IL-1-Rezeptor
- - IL-2
- - IL-2-Rezeptor
- - IL-3
- - IL-3-Rezeptor
- - IFNγ
- - IL-4
- - IL-4-Rezeptor
- - IL-5
- - IL-6
- - LIF
- - IL-7
- - IL-10
- - IL-11
- - IL-12
- - IL-13
- - GM-CSF
- - GM-CSF-Rezeptor
- - Integrin beta 2 proteins.
Die Wirksubstanz im Sinne der Erfindung ist die DNA-Sequenz
für ein Cytokin, ein Chemokin, einen Wachstumsfaktor oder
einer ihrer Inhibitoren, für ein Ribozym katalytisch für das
Transkriptionsprodukt eines dieser DNA-Sequenzen oder für das
Transkriptionsprodukt eines Genes welches für ein
Zellzykluskontrollprotein oder eine DNA-Sequenz für einen
Antikörper oder für ein Enzym. Die Auswahl der Wirksubstanz
richtet sich nach der zu behandelnden Grunderkrankung und der
gewählten Promotorsequenz.
Im Sinne der Erfindung werden bevorzugt Promotoren
Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder Enhancern oder
genregulatorische Sequenzen solcher Gene zu verstehen, mit
der Transkriptionsfaktoren gebildet oder aktiv in
Synovialzellen und Entzündungszellen interagieren. Im Sinne
dieser Erfindung zählen zu den bevorzugten Promotorsequenzen
genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente aus Genen, die für
besonders in Synovialzellen und Entzündungszellen exprimierte
Proteine kodieren.
Als Wirksubstanz im Sinne der Erfindung ist eine DNA-Sequenz
zu verstehen, deren exprimiertes Protein die Entzündung
beispielsweise im Gelenk direkt oder indirekt hemmt und/oder
die Rekonstitution von extrazellulärer Matrix (Knorpel,
Bindegewebe) im Gelenk fördert.
Der Wirkstoff kann in zwei grundsätzlich unterschiedlichen
Formen hergestellt werden:
- - für die Therapie von Virusinfektionen und Parasiteninvasio nen oder aber
- - für die Prophylaxe von Infektionserkrankungen durch Viren, Bakterien oder Parasiten.
Zur Prophylaxe von Infektionserkrankungen dienen Impfstoffe.
Die Möglichkeiten, auf konventionellem Wege wirkungsvolle
Impfstoffe herzustellen, sind jedoch beschränkt (Brown, Int.
J. Technol. Assessm. Health Care 10, 161 (1994)), Ellis, Adv.
Exp. Med. Biol. 327, 263 (1992)), Arnon et al., FASEB J. 6,
3265 (1992)).
Demzufolge wurde die Technologie der DNA-Vakzine entwickelt.
Diese DNA-Vakzinen werfen jedoch Fragen zur
Wirksamkeitsstärke, Sicherheit und zu Nebenwirkungen auf
(Fynan et al., Int. J. Immunopharm. 17, 79 (1995), Donnelly
et al., Immunol. 2, 20 (1994)).
Wirkstoffe zur Prophylaxe von Infektionserkrankungen im Sinne
dieser Erfindung zeichnen sich wegen ihrer Zellspezifität und
Zellzyklusregulation durch ein hohes Maß an Sicherheit aus.
Als Aktivatorsequenz sind Promotorsequenzen von Zellgenen
auszuwählen, deren Aktivität besonders durch Infektionen mit
Bakterien oder Parasiten verändert werden oder es sind
Promotorsequenzen solcher Viren auszuwählen, die die von
ihnen infizierten Zellen transformieren und zur Proliferation
anregen.
Zu diesen Viren gehören beispielsweise HBV, HCV, HSV, HPV,
HIV, EBV und HTLV.
Als Wirksubstanz ist die DNA eines Proteins auszuwählen,
welches zytostatische, zytotoxische oder antivirale Wirkungen
aufweist. Beispiele für zytotoxische oder zytostatische
Proteine wurden schon oben aufgeführt. Bei der Wahl eines
Enzyms ist nachfolgend die durch dieses Enzym spaltbare
Vorstufe einer antiviralen zytotoxischen oder antiparasitären
Substanz zu verabreichen.
Wirksubstanzen für antivirale Proteine im Sinne dieser
Erfindung sind des weiteren antiviral wirksame Cytokine und
Wachstumsfaktoren. Hierzu zählen beispielsweise die DNA-
Sequenzen für folgende Wirksubstanzen:
- - IFNα
- - IFNβ
- - IFNγ
- - TNFβ
- - TNFα
- - IL-1
- - TGFβ.
Als Wirksubstanz im Sinne der Erfindung können jedoch auch
DNA-Sequenzen für Fusionsproteine zwischen den aufgeführten
Cytokinen, Wachstumsfaktoren oder dem extrazellulären Teil
der Rezeptoren zum einen und einem Liganden zum anderen
Verwendung finden, zum Beispiel wurden Fusionsproteine mit
dem Fc-Teil des menschlichen Immunglobulins in der
EPA 0 464 633 A1 beschrieben.
Als Wirksubstanzen gelten des weiteren Gene für Ribozyme,
welche die mRNA von Genen für Zellzykluskontrollproteine oder
die mRNA von Viren verdauen. Ribozyme katalytisch für HIV
wurden beispielsweise von Christoffersen et al., J. Med.
Chem. 38, 2033 (1995) übersichtlich beschrieben.
Des weiteren ist eine Wirksubstanz im Sinne dieser Erfindung
die DNA-Sequenz für einen Antikörper einer Spezifität, die
das jeweilige Virus inaktiviert oder dessen VH und VL
enthaltende Fragmente oder dessen über einen Linker
verbundene VH und VL Fragmente, hergestellt beispielsweise
entsprechend der von Marasco et al. (Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90, 7889 (1993)) beschriebenen Methodik. Beispiele für
Antikörper einer derartigen Spezifität gegen Viren werden im
Abschnitt 8.4. aufgeführt.
Als Wirksubstanz ist die DNA eines vom Infektionserreger
gebildeten Proteins auszuwählen, welches durch Auslösung
einer Immunreaktion, d. h. durch Antikörperbindung und/oder
durch zytotoxische T-Lymphozyten zur Neutralisierung und/oder
zur Abtötung des Erregers führt. Derartige sogenannte
Neutralisationsantigene werden als Impfantigene bereits
angewandt (siehe Übersicht bei Ellis, Adv. Exp. Med. Biol.
327, 263 (1992)). Beispiele für DNA-Sequenzen, die
Neutralisationsantigene kodieren, sind durch die folgenden
Arbeiten zugänglich:
- - Influenza A-Virus-Antigen
(Ulmer et al., Science 259, 1745 (1993), Robinson et al., Vaccine 11, 957 (1993), Fynan et al., Int. J. Immunopharmac. 17, 79 (1995)) - - HIV-Antigene
(Wang et al., PNAS USA 90, 4156 (1993)) - - Tollwut-Virus-Antigen
(Donnelly et al., Immunol. 2/1, 20 (1994)) - - HSV (Herpes Simplex Virus)-Antigen
(Fleckenstein et al., Nature 274, 57 (1978)) - - RSV (Respiratory Syncytial Virus)-Antigen
(Du et al., Bio/Tech. 12, 813 (1994), Hall, Science 265, 1393 (1993)) - - Parainfluenza-Virus-Antigen
(Du et al., Bio/Techn. 12, 813 (1994)) - - Rotavirus-Antigen
(Albert et al., J. Clin. Microbiol. 25, 183 (1987), Anderson et al., J. Infect. Dis. 153, 823 (1986), Battaglia et al., J. Infect. Dis. 155, 140 (1987), Chanock et al., J. Infect. Dis. 148, 49 (1983), Dyall-Smith et al., J. Virol. 38, 1099 (1981), Glass et al., Science 265, 1389 (1994)) - - VZV (Varizella Zoster Virus)-Antigen
(Straus et al., Ann. Intern. Med. 109, 438 (1988), Gershon, Pediatr. Infect. Dis. 2, 171 (1991), Kinchington et al., J. Virol. 64, 4540 (1990)) - - CMV (Cytomegalo-Virus)-Antigen
(Plotkin, Science 265, 1383 (1994)) - - Masern-Virus-Antigen
(Katz und Kellin, Science 265, 1391 (1994)) - - HPV (Humanes Papillomvirus)-Antigen
(Tindl und Frazer, Curr. Topics Microbiol. Immunol. 186, 217 (1994)) - - HBV (Hepatitis B-Virus)-Antigen
(Valenzuela et al., Nature 280, 815 (1979), Heerman et al., J. Virol. 52, 396 (1984)) - - HCV (Hepatitis C-Virus)-Antigen
(Cerny et al., Curr. Topics Microbiol. Immunol. 189, 169 (1994), Esteban et al., Progr. Liver Dis. 10, 253 (1992), Jung et al., Eur. J. Clin. Invest. 24, 641 (1994)) - - HDV (Hepatitis D-Virus)-Antigen
(Iwarson, Scand. J. Infect. Dis. 24, 129 (1992), Consolo et al., Nephron. 61, 251 (1992)) - - HEV (Hepatitis E-Virus)-Antigen
(Iwarson, Scand. J. Infect. Dis. 24, 129 (1992), Consolo et al., Nephron. 61, 251 (1992)) - - HAV (Hepatitis A-Virus)-Antigen
(d′Hondt, Vaccine 10, 48 (1992), Andre, J. Infect. Dis. 171, 33 (1995), Lemon et al., Vaccine 10, 40 (1992), Melnick et al., Vaccine 10, 24 (1992), Flehmig, Baillieres Clin. Gastroenterol. 4, 707 (1990)) - - Vibrio Cholera-Antigen
(Levine und Kaper, Vaccine 11, 207 (1993)) - - Borrelia Burgdorferi-Antigen
(Schaible et al., Immunol. Letters 36, 219 (1993), Wallich et al., Lab. Med. 17, 669 (1993)) - - Helicobacter pylori-Antigen
(Crabtree et al., Lancet 338, 332 (1991), Blaser, J. Infect. Dis. 161, 626 (1990), Cover und Blaser, J. Biol. Chem. 267, 10570 (1993), Cover et al., Infect. Immunol. 58, 603 (1990), Dunn et al., J. Biol. Chem. 265, 9464 (1990), Dunn et al., Infect. Immunol. 60, 1946 (1992), Lage et al., Acta Gastroenterol. Belg. 56 (suppl.), 61 (1993), Mobley et al., Scand. J. Gastroint. 26 (suppl. 187), 39 (1991)) - - Malaria-Antigen
(Nussenzweig und Long, Science 265, 1381 (1994), Maurice, Science 267, 320 (1995), Enders et al., Vaccines 10, 920 (1992), Knapp et al., Infect. Imm. 60, 2397 (1992)).
Zu derartigen Wirksubstanzen im Sinne der Erfindung gehört
jedoch auch die DNA eines Antiidiotyp-Antikörpers oder seiner
Antigen-bindenden Fragmente, dessen
Antigenbindungsstrukturen, die "complementary determining
regions", Kopien der Protein- oder Kohlenhydratstruktur des
Neutralisationsantigens des Infektionserregers darstellen.
Derartige Antiidiotyp-Antikörper können besonders
Kohlenhydratantigene bei bakteriellen Infektionserregern
ersetzen.
Derartige antiidiotypische Antikörper und ihre Spaltprodukte
wurden von Hawkins et al. (J. Immunother. 14, 273 (1993)) und
Westerink und Apicella (Springer Seminars in Immunopathol.
15, 227 (1993)) übersichtlich beschrieben.
Gegenstand der Erfindung ist des weiteren ein Wirkstoff, in
welchem eine Kombination der DNA-Sequenzen von gleichen
Wirksubstanzen (A, A) oder unterschiedlichen Wirksubstanzen
(A, B) vorliegt. Zur Expression von zwei Sequenzen ist
vorzugsweise die cDNA einer "internal ribosome entry site"
(IRES) als regulatorisches Element zwischengeschaltet.
Derartige IRES wurden beispielsweise von Montford und Smith
(TIG 11, 179 (1995), Kaufman et al., Nucl. Acids Res. 19,
4485 (1991), Morgan et al., Nucl. Acids Res. 20, 1293 (1992),
Dirks et al., Gene 128, 247 (1993), Pelletier und Sonnenberg,
Nature 334, 320 (1988) und Sugitomo et al., BioTechn. 12, 694
(1994) beschrieben.
So kann die cDNA der IRES-Sequenz des Poliovirus (Position
140 bis 630 des 5′ UTR (Pelletier und Sonenberg, Nature
334, 320 (1988)) zur Verknüpfung der DNA der viralen Substanz
A (am 3′-Ende) und der DNA der antiviralen Substanz B (am 5′-
Terminus) verwendet werden.
Ein derartiger Wirkstoff weist je nach Kombination additive
(A+A, A+B1) oder synergistische Wirkung im Sinne der
Erfindung auf.
So können beispielsweise für die Therapie von
Viruserkrankungen zwei gleiche oder zwei unterschiedliche
antivirale Wirksubstanzen miteinander kombiniert werden.
Bei der Prophylaxe von Infektionserkrankungen können mehrere
Wirksubstanzen, die für unterschiedliche Antigene eines
Infektionserregers oder unterschiedlicher Infektionserreger
kodieren, miteinander kombiniert werden. Des weiteren kann
die Wirksubstanz, die für das Antigen eines
Infektionserregers kodiert, kombiniert werden mit einer
Wirksubstanz, die kodiert für ein Cytokin oder einen
Cytokinrezeptor.
Die sich so (nach Injektion des Wirkstoffes) gleichzeitig mit
dem Infektionserregerantigen bildenden Cytokine oder
Cytokinrezeptoren können Einfluß auf die Art und Stärke der
sich entwickelnden Immunreaktion nehmen.
DNA-Sequenzen für Cytokine und Cytokinrezeptoren, welche die
humorale Immunreaktion verstärken, sind bereits unter 6.2.d)
beschrieben, solche zur Verstärkung der zellulären
Immunreaktion unter 6.2.a) und 6.2.c).
DNA-Sequenzen für Cytokine, welche die Immunreaktion
insgesamt verstärken, sind beispielsweise:
- - Il-1α
(Fenton, Int. J. Immunopharm. 14, 401 (1992), Furntani et al., Nucl. Acids Res. 14, 3167 (1986), Lafage et al., Blood 73, 104 (1989), March et al., Nature 315, 641 (1985)) - - Il-1β
(Bensi et al., Gene 52, 95 (1987), Auron et al., PNAS 81, 7907 (1984), Clark et al., Nucl. Acids Res. 14, 7897 (1986)) - - Il-2
(Fletscher et al., Lymphok. Res. 6, 45 (1987), Matsui et al., Lymphokines 12, 1 (1985), Tanaguchi et al., Nature 302, 305 (1983)) - - GM-CSF
(Gough et al., Nature 309, 763 (1984), Nicola et al., J. Biol. Chem. 254, 5290 (1979), Wong et al., Science 228, 810 (1985))
Als Promotor oder Aktivatorsequenz ist eine genregulatorische
Nukleotidsequenz vorgesehen, mit der Transkriptionsfaktoren,
gebildet oder aktiv in Leukämiezellen, interagieren.
Im Sinne dieser Erfindung zählen zu den bevorzugten
Promotoren oder Aktivatorsequenzen genregulatorische
Sequenzen bzw. Elemente aus Genen, die besonders in
Leukämiezellen gebildete Proteine kodieren.
Als Wirksubstanz im Sinne der Erfindung ist eine DNA-Sequenz
zu verstehen, deren exprimiertes Protein die Proliferation
von Zellen, insbesondere auch von Leukämiezellen, inhibiert.
Zu diesen Zellzyklusinhibitoren gehören beispielsweise die
DNA-Sequenzen für inhibitorische zytostatische und
zytotoxische Proteine und Enzyme, wie sie bereits beschrieben
wurden.
Als Zellzyklusinhibitor ist des weiteren eine DNA-Sequenz zu
verstehen, welche ein Protein exprimiert, welches direkt oder
indirekt eine zytostatische oder zytotoxische Wirkung auf
Leukämien aufweist.
Als Zellzyklusinhibitor ist des weiteren die DNA-Sequenz für
ein Ribozym zu verstehen, welches die mRNA der Gene für
Zellzykluskontrollproteine katalysiert.
Als Promotoren oder Aktivatorsequenzen aus Promotoren oder
Enhancern im Sinne der Erfindung sind bevorzugt
genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente aus Genen zu
verwenden, die, besonders in glatten Muskelzellen, gebildete
Protein kodieren.
Als Wirksubstanz im Sinne der Erfindung ist eine DNA-Sequenz
zu verstehen, deren exprimiertes Protein die Proliferation
von glatten Muskelzellen inhibiert. Zu diesen Inhibitoren der
Proliferation gehören die bereits unter 2.2.a) und 2.2.c)
erwähnten Proteine.
Als Wirksubstanz ist jedoch auch die DNA-Sequenz für ein
Enzym zu verstehen, welches eine inaktive Vorstufe eines
Zytostatikums in ein Zytostatikum umwandelt (siehe 2.2.e)).
Als Wirksubstanz ist jedoch auch die DNA-Sequenz für ein
Ribozym spezifisch für die mRNA von Genen für
Zellzykluskontrollproteine zu verstehen (siehe 2.2. f)).
Als Promotoren oder Aktivatorsequenzen im Sinne der Erfindung
sind bevorzugt genregulatorische Sequenzen bzw. Elemente aus
Genen zu verwenden, welche in glatten Muskelzellen, in
aktivierten Endothelzellen, in aktivierten Makrophagen oder
in aktivierten Lymphozyten nachweisbare Proteine kodieren.
Beispiele für Promotorsequenzen für Gene in glatten
Muskelzellen sind bereits erwähnt.
Beispiele für Proteine, welche besonders in aktivierten
Endothelzellen gebildet werden, sind von Burrows et al.
(Pharmac. Ther. 64, 155 (1994)) beschrieben worden. Im
besonderen zählen zu diesen in Endothelzellen verstärkt
auftretenden Proteinen beispielsweise solche Proteine, wie
sie und die Promotorsequenzen ihrer Gene bereits oben
aufgeführt wurden.
Als Aktivatorsequenz im Sinne dieser Erfindung sind außerdem
Promotorsequenzen der Gene für Proteine zu verstehen, welche
bei der Immunreaktion in Makrophagen und/oder in Lymphozyten
verstärkt gebildet werden. Derartige Proteine sind bereits
aufgeführt worden.
Als Wirksubstanz im Sinne dieser Erfindung ist eine DNA-
Sequenz zu verwenden, welche ein Protein kodiert, welches
direkt oder indirekt die Thrombozytenaggregation oder einen
Blutgerinnungsfaktor inhibiert oder die Fibrinolyse
stimuliert.
Eine derartige Wirksubstanz wird als Gerinnungshemmer
bezeichnet. Als Gerinnungshemmer sind Gene für beispielsweise
Plasminogenaktivatoren (PA), so der Gewebe-PA (tPA) oder der
Urokinase-ähnliche PA (uPA) oder Protein C, Antithrombin-III,
C-1S-Inhibitor, µ1-Antitrypsin, der Tissue Factor Pathway
Inhibitor (TFPI) oder Hirudin einzusetzen.
Im besonderen zählen hierzu die Promotorsequenzen für die
Gene von Endothelzell-spezifischen Proteinen.
Als bevorzugte Aktivatorsequenz ist des weiteren eine
Nukleotidsequenz (Promotor- oder Enhancersequenz) zu
verstehen, welche mit Transkriptionsfaktoren im besonderen
Maße gebildet oder aktiv in Gliazellen interagieren.
Als neurospezifische Faktoren im Sinne der Erfindung ist eine
DNA-Sequenz zu verstehen, welche für einen neuronalen
Wachstumsfaktor kodiert.
Anhand der nachfolgenden Beispiele wird die vorliegende
Erfindung näher erläutert.
Die erfindungsgemäße Aktivator-responsive Promotoreinheit
besteht aus folgenden unterschiedlichen, stromabwärts
aufeinanderfolgenden Nukleotidsequenzen:
- - der Promotor des cdc25C-Gens
(Nukleinsäuren -290 bis +121; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995); Zwicker et al., Nucl. Acids Res. 23, 3822 (1995)) - - der cDNA für die DNA-Bindedomäne des LexA-Proteins
(Aminosäuren 1 bis 81; Kim et al., Science 255, 203 (1992)) oder das ganze LexA-Protein (Aminosäuren 1 bis 202; Brent et al., Cell 43, 729 (1985)) - - die cDNA für Gal 80
(Aminosäuren 1 bis 435; Leuther et al., Science 256, 1333 (1992))
- - der Promotor des von Willebrand Faktor-Gens
(Nukleinsäuren -487 bis +247; Jahroudi and Lynch, Mol. Cell. Biol. 14, 999 (1994)) - - der cDNA für die Gal80-Bindungsdomäne von Gal4
(Aminosäuren 851 bis 881; Leuther et al., Science 256, 1333 (1992)) - - dem nukleären Lokalisations-Signal (NLS) von SV40
(SV40 Large T; Aminosäuren 126 bis 132: PKKKRKV; Dingwall et al., TIBS 16, 478 (1991)) - - der sauren Transaktivierungsdomäne (TAD) von HSV-1 VP16
(Aminosäuren 406 bis 488; Triezenberg et al., Genes Developm. 2, 718 (1988); Triezenberg, Curr. Op. Gen. Developm. 5, 190 (1995))
- - der Bindesequenz für LexA (LexA-Operator) mit der Nukleotidsequenz (Brent et al., Nature 612, 312 (1984)) gekoppelt an den basalen Promotor von SV40 (Nukleinsäuren 48 bis 5191; Tooze (ed.), DNA Tumor Viruses (Cold Spring Harbor New York, New York; Cold Spring Harbor Laboratory).
Die Reihenfolge der Nukleotidsequenzen der Aktivator
responsiven Promotoreinheiten ist durch folgendes Schema
dargestellt.
Die Funktionsweise der beschriebenen Aktivatorsequenz ist wie
folgt:
- - Der Promotor cdc25C reguliert zellzyklusspezifisch die Transkription der kombinierten cDNA′s für das Lex-DNA- Bindeprotein und für Gal80.
- - Der Promotor der vWF beschränkt die Transkription der gekoppelten cDNA für die Gal80-Bindungsdomäne von Gal4, das NSL von SV40 und die TAP auf Endothelzellen.
- - Die Expressionsprodukte der Aktivatorsubeinheiten A und B dimerisieren durch Bindung der Gal80-Bindungsdomäne von Gal4 an Gal80.
Die Dimerisierung ist schematisch wie folgt dargestellt:
- - Das dimere Protein stellt einen chimären Transkriptionsfaktor für den Aktivator-responsiven Promotor "LexA-operator" dar.
Der Promotor ist nunmehr an seinem 3′-Ende mit der Sequenz
GCCACC (Kocak, J. Cell. Biol. 108, 229 (1989)) und diese mit
der cDNA für das Signalpeptid des Immunglobulins
(Nukleotidsequenz 63 bis 107; Riechmann et al., Nature
332, 323 (1988)) verknüpft. An diese schließt sich die cDNA
der β-Glucuronidase (Nukleotidsequenz 93 bis 1982; Oshima
et al., PNAS USA 84, 685 (1987)) gemäß folgendem Schema an:
Das so hergestellte Nukleotidkonstrukt wird in pUC18/19 oder
Bluescript-abgeleiteten Plasmidvektoren einkloniert, die
direkt oder in kolloidalen Dispersionssystemen für eine in
vivo Applikation genutzt werden.
Die Verknüpfung der einzelnen Bestandteile des Konstruktes
erfolgt über geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-
Amplifikation an den Termini der verschiedenen Elemente
mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe von dem
Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen
Enzymen und DNA-Ligasen. Diese Enzyme sind käuflich zu
erwerben.
Mit dem beschriebenen Plasmid werden in Kultur gehaltene
menschliche Nabelschnurendothelzellen und Fibroblasten (Wi-
38) mit dem Fachmann bekannter Methode (Lucibello et al.,
EMBO J. 14, 132 (1995)) transfiziert und die Menge an β-
Glucuronidase, produziert von den Endothelzellen, mit Hilfe
von 4-Methylumbelliferyl-β-glucuronid als Substrat gemessen.
Zur Überprüfung der Zellzyklusspezifität werden
Endothelzellen durch Entzug von Methionin über 48 Stunden in
G0/G1 synchronisiert (Nettelbeck et al., Publikation in
Vorbereitung). Der DNA-Gehalt der Zellen wird nach Anfärbung
mit Hoechst 33258 im Fluoreszenzaktivierungs-Cell Sorter
bestimmt (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)).
Folgende Ergebnisse werden erzielt:
In transfizierten Fibroblasten kann keine Zunahme der β- Glucuronidase im Vergleich zu nichttransfizierten Fibroblasten ermittelt werden.
In transfizierten Fibroblasten kann keine Zunahme der β- Glucuronidase im Vergleich zu nichttransfizierten Fibroblasten ermittelt werden.
Transfizierte Endothelzellen exprimieren deutlich mehr β-
Glucuronidase als nichttransfizierte Endothelzellen.
Proliferierende Endothelzellen (DNA < 2 S) sekretieren
deutlich mehr β-Glucuronidase als in G0/G1 synchronisierte
Endothelzellen (DNA = 2 S).
Somit führt die beschriebene Aktivator-responsive
Promotoreinheit zu einer zellspezifischen,
zellzyklusabhängigen Expression des Strukturgenes β-
Glucuronidase.
Ein Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht
nach lokaler Applikation beispielsweise an den Ort des Tumors
oder nach intrakranieller bzw. subarachnoidaler Gabe oder
systemischer, bevorzugt intravenöser oder intraarterieller
Gabe, daß durch die Zellzyklus- und Endothelzellspezifität
der Aktivator-responsiven Promotoreinheit vorwiegend, wenn
nicht ausschließlich, nur proliferierende Endothelzellen β-
Glucuronidase ausscheiden. Diese β-Glucuronidase spaltet ein
nunmehr infiziertes gut verträgliches Doxorubicin-β-
glucuronid (Jacquesy et al., EPO 0511 917 A1) in das
zytostatisch wirkende Doxorubicin. Dieses hemmt die
Endothelzellproliferation und wirkt zytostatisch auf diese
Zellen wie auch auf benachbarte Tumorzellen. Hierdurch kommt
es zur Hemmung des Tumorwachstums.
Da der Wirkstoff sowohl durch seine Zell- als auch
Zellzyklusspezifität ein hohes Maß an Sicherheit verspricht,
kann er auch in hohen Dosierungen und, falls notwendig,
mehrmals in Abständen von Tagen oder Wochen zur Therapie von
Tumorerkrankungen angewandt werden.
Der erfindungsgemäße multiple Promotor besteht aus folgenden
unterschiedlichen, stromabwärts aufeinanderfolgenden
Nukleotidsequenzen:
- - dem Promotor des cdc25C-Gens
(Nukleinsäuren -290 bis +121; Zwicker et al., EMBO J. 14, 4514 (1995); Zwicker et al., Nucl. Acids. Res. 23, 3822 (1995)) - - der Sequenz GCCACC Seq.-ID.-Nr. 1
(Kodak, J. Cell. Biol. 108, 229 (1989)) - - der cDNA für das Signalpeptid des Immunglobulins
(Nukleotidsequenz 63 bis 107; Riechmann et al., Nature 332, 323 (1988)) - - der cDNA der β-Glucuronidase
(Nukleotidsequenz 93 bis 1982; Oshima et al., PNAS USA 84, 685 (1987)) - - der cDNA für RER von HIV-1 Virus als nukleäres Retentions
signal (NRS)
(Nukleotidsequenz 7357 bis 7602; Ratner et al., Nature 313, 277 (1985); Malim et al., Nature 338, 254 (1989)).
- - der Promotor des von Willebrand Faktor (vWF)-Gens
(Nukleinsäuren -487 bis +247; Jahroudi and Lynch, Mol. Cell Biol. 14, 999, 1994)) - - der cDNA für REV von HIV-1 Virus als nukleärer Export-
Faktor (NEF)
(Aminosäuresequenz 1-117; Ratner et al., Nature 313, 277 (1985)).
Die Nukleotidsequenzen von Element A und Element B sind nach
folgendem Schema verknüpft:
Das so hergestellte Nukleotidkonstrukt wird in pUC18/19 oder
Bluescript-abgeleiteten Plasmidvektoren einkloniert, die
direkt oder in kolloidalen Dispersionssystemen für eine in
vivo Applikation genutzt werden.
Die Verknüpfung der einzelnen Bestandteile des Konstruktes
erfolgt über geeignete Restriktionsstellen, die über PCR-
Amplifikation an den Termini der verschiedenen Elemente
mitgeführt werden. Die Verknüpfung erfolgt mit Hilfe von dem
Fachmann bekannten, für die Restriktionsstellen spezifischen
Enzymen und DNA-Ligasen. Diese Enzyme sind käuflich zu
erwerben.
Mit dem beschriebenen Plasmid werden in Kultur gehaltene
menschliche Nabelschnurendothelzellen und Fibroblasten (Wi-
38) mit dem Fachmann bekannter Methode (Lucibello et al.,
EMBO J. 14, 132 (1995)) transfiziert und die Menge an β-
Glucuronidase, produziert von den Endothelzellen, mit Hilfe
von 4-Methylumbelliferyl-β-glucuronid als Substrat gemessen.
Zur Überprüfung der Zellzyklusspezifität werden
Endothelzellen durch Entzug von Methionin über 48 Stunden in
G0/G1 synchronisiert (Nettelbeck et al., Publikation in
Vorbereitung). Der DNA-Gehalt der Zellen wird nach Anfärbung
mit Hoechst 33258 im Fluoreszenzaktivierungs-Cell Sorter
bestimmt (Lucibello et al., EMBO J. 14, 132 (1995)).
Folgende Ergebnisse werden erzielt:
In transfizierten Fibroblasten kann keine Zunahme der β- Glucuronidase im Vergleich zu nichttransfizierten Fibroblasten ermittelt werden.
In transfizierten Fibroblasten kann keine Zunahme der β- Glucuronidase im Vergleich zu nichttransfizierten Fibroblasten ermittelt werden.
Transfizierte Endothelzellen exprimieren deutlich mehr β-
Glucuronidase als nichttransfizierte Endothelzellen.
Proliferierende Endothelzellen (DNA < 2 S) sekretieren
deutlich mehr β-Glucuronidase als in G0/G1 synchronisierte
Endothelzellen (DNA = 2 S).
Somit führt die beschriebene multiple Promotoreinheit zu
einer zellspezifischen, zellzyklusabhängigen Expression des
Strukturgenes β-Glucuronidase.
Ein Wirkstoff gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht
nach lokaler Applikation beispielsweise an den Ort des Tumors
oder nach intrakranieller bzw. subarachnoidaler Gabe oder
systemischer, bevorzugt intravenöser oder intraarterieller
Gabe, daß durch die Zellzyklus- und Endothelzellspezifität
der Aktivator-responsiven Promotoreinheit vorwiegend, wenn
nicht ausschließlich, nur proliferierende Endothelzellen β-
Glucuronidase ausscheiden. Diese β-Glucuronidase spaltet ein
nunmehr infiziertes gut verträgliches Doxorubicin-β-
glucuronid (Jacquesy et al., EPO 0511 917 A1) in das
zytostatisch wirkende Doxorubicin. Dieses hemmt die
Endothelzellproliferation und wirkt zytostatisch auf diese
Zellen wie auch auf benachbarte Tumorzellen. Hierdurch kommt
es zur Hemmung des Tumorwachstums.
Claims (27)
1. Nukleinsäurekonstrukt, dadurch gekennzeichnet, daß es ein
nukleäres Retentions-Signal aufweist, das in Leserichtung
stromabwärts mit einem Transgen verknüpft ist.
2. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 dadurch
gekennzeichnet, daß es folgende Komponenten in Leserichtung
vom 5′-Ende zum 3′-Ende aufweist:
- a) eine erste unspezifische, zellspezifische, virusspezifi sche, metabolisch und/oder zellzyklusspezifisch aktivier bare Promotor- oder Enhancersequenz, die die basale Transkription eines Transgenes aktiviert,
- b) ein Transgen, das als ein Strukturgen für einem Wirkstoff kodiert,
- c) ein nukleäres Retentions-Signal, dessen cDNA am 5′-Ende mit dem 3′-Ende des Strukturgenes mittelbar oder unmit telbar verknüpft ist.
3. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das Transkriptionsprodukt des nukleären
Retentions-Signals eine Bindestruktur für einen nukleären
Export-Faktor aufweist.
4. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 2 oder 3,
dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich zu den Komponenten
a) bis c) folgende Komponenten aufweist:
- d) eine weitere Promotor- oder Enhancersequenz, welche die basale Transkription eines nukleären Export-Faktores ak tiviert und
- e) eine Nukleinsäure kodierend für einen nukleären Export- Faktor, der an das Transkriptionsprodukt des nukleären Retentions-Signals (c) bindet und hierdurch den Transport des Transkriptionsproduktes des Transgens aus dem Zell kern in das Zytoplasma vermittelt.
5. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß die erste Promotor- oder Enhancersequenz
(a) und die zweite Promotor- oder Enhancersequenz (d) gleich
oder unterschiedlich sind und, daß mindestens eine der
Komponenten a) und d) unspezifisch, zellspezifisch,
virusspezifisch, metabolisch, insbesondere durch Hypoxie,
oder zellzyklusspezifisch aktivierbar ist.
6. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4 oder 5, dadurch
gekennzeichnet, daß wenigstens eine der Promotor- oder
Enhancersequenzen (a) und (d) ein chimärer Promotor ist, bei
welchem das Promotormodul CDE-CHR oder E2FBS-CHR mit einer
stromaufwärts benachbarten zellspezifisch, virusspezifisch
oder metabolisch aktivierbaren Aktivatorsequenz interagieren
und dadurch die Expression eines stromabwärts gelegenen Gens
beeinflussen, insbesondere inhibieren kann.
7. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 3 oder 4, dadurch
gekennzeichnet, daß wenigstens eine der Komponenten a) und d)
eine Aktivator-responsive Promotoreinheit darstellt umfassend
folgende Komponenten:
- f) wenigstens eine Promotor- oder Enhancersequenz, die unspezifisch, virusspezifisch, metabolisch, zellspezi fisch und/oder zellzyklusspezifisch aktivierbar ist und
- g) wenigstens eine Aktivatorsubeinheit, die stromabwärts von der Promotor- oder Enhancersequenz (f) gelegen ist und durch die Promotor- oder Enhancersequenz (f) in ihrer ba salen Transkription aktiviert wird,
- h) ein Aktivator-responsiver Promotor, welcher durch die Ex pressionsprodukte von einer Aktivatorsubeinheit (g) oder mehreren gleichen oder unterschiedlichen Aktivatorsubein heiten (g, g′) aktiviert wird.
8. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7, bei welchem die
Promotor- oder Enhancersequenz (a) und/oder (d) und/oder der
Aktivator-responsive Promotor ein chimärer Promotor ist und
die Aktivatorsubeinheit (g) ein Gen für wenigstens einen
Transkriptionsfaktor darstellt, der den chimären Promotor des
Aktivator-responsiven Promotors (h) aktiviert.
9. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 7, dadurch
gekennzeichnet, daß
- - der Aktivator-responsive Promotor (h) der LexA-Operator in Verbindung mit dem SV40 Promotor ist und
- - die Aktivatorsubeinheit (g) die cDNA für das LexA-DNA- Bindeprotein kodierend für die Aminosäuren 1-81 oder 1-202 umfaßt, deren 3′-Ende verknüpft ist mit dem 5′-Ende der cDNA für das Gal80-Protein (Aminosäuren 1-435) darstellt und
- - eine weitere Aktivatorsubeinheit (g′) die cDNA der Gal80- Bindungsdomäne des Gal4-Proteins kodierend für die Amino säuren 851-881 enthält, deren 3′-Ende verknüpft ist mit dem 5′-Ende der cDNA des SV40 large T-Antigens kodierend für die Aminosäuren 126-132, deren 3′-Ende verknüpft ist mit dem 5′-Ende der cDNA für die Transaktivierungsdomäne des VP16 von HSV-1 kodierend für die Aminosäuren 406-488.
10. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen kodierend für
das nukleäre Retentions-Signal (c) ausgewählt ist aus der
Gruppe umfassend das Rev-responsive Element (RRE) von HIV-1
oder HIV-2, das RRE-äquivalente Retentions-Signal von
Retroviren oder das RRE-äquivalente Retentions-Signal des
HBV.
11. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 4, dadurch
gekennzeichnet, daß der nukleäre Export-Faktor (e) ein Gen
ist ausgewählt aus der Gruppe umfassend das Rev-Gen der Viren
HIV-1, HIV-2, Visna-Maidi Virus, Caprine arthritis
encephalitis Virus, das Virus der infektiösen Anämie des
Pferdes, das Immundefizienzvirus der Katze, von Retroviren,
von HTLV oder das Gen des hnRNP-A1-Proteins oder das Gen des
Transkriptionsfaktors TFIII-A.
12. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der
Nukleinsäure um DNS handelt.
13. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem
Nukleinsäurekonstrukt um einen Vektor handelt.
14. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um einen Plasmidvektor handelt.
15. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 13, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich um einem viralen Vektor handelt.
16. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem
Transgen (b) um ein Strukturgen handelt, das für einen
Wirkstoff kodiert, der ausgewählt ist aus der Gruppe
umfassend Cytokine, Wachstumsfaktoren, Fusionsproteine aus
einem Liganden und einem Cytokin oder Wachstumsfaktor,
Rezeptoren für Cytokine oder Wachstumsfaktoren,
antiproliferativ oder zytostatisch wirkende Proteine,
Angioeneseinhibitoren und/oder Thrombose-induzierenden
Proteinen, Gerinnungshemmer, Komplement aktivierende Proteine
wie Cobra Venum Faktor; humanes C3b, modifiziertes C3b;
bakterielle Proteine, Virushüllproteine, bakterielle Antigene
und parasitäre Antigene und Ribozyme.
17. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 16, dadurch
gekennzeichnet, daß es sich bei dem Transgen (b) um ein
Strukturgen handelt, das für ein Ribozym kodiert, welches die
mRNA inaktiviert, welches kodiert für ein Protein ausgewählt
aus der Gruppe umfassend Zellzykluskontrollproteine,
insbesondere Cyclin A, Cyclin B, Cyclin D1, Cyclin E, E2F1-5,
cdc2, cdc25C oder DP1, Virusproteine oder Cytokine oder
Wachstumsfaktoren oder deren Rezeptoren.
18. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Promotor-,
Enhancer- oder Aktivatorsequenz ausgewählt ist aus der Gruppe
von genregulatorischen Nukleotidsequenzen aktiviert in
Endothelzellen, glatten Muskelzellen, quergestreiften
Muskelzellen, Makrophagen, Lymphozyten, Tumorzellen,
Leberzellen, Leukämiezellen und Gliazellen oder von
Promotorsequenzen der Viren HBV, HCV, HSV, HPV, EBV, HTLV
oder HIV.
19. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem
Transgen (b) um ein Strukturgen handelt, das für ein Enzym
kodiert, welches eine Vorstufe eines Pharmakons in ein
Pharmakon spaltet.
20. Nukleinsäurekonstrukt nach einem der vorhergehenden
Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem
Transgen b) um ein Strukturgen handelt, das für ein Ligand-
Enzym-Fusionsprotein kodiert.
21. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 20, dadurch
charakterisiert, daß der Ligand an proliferierende
Endothelzellen bindet und ausgewählt ist aus einer Gruppe
umfassend Antikörper oder deren Fragmente, endständig
Mannose-haltige Proteine, Cytokine wie IL-1 oder TNF,
Wachstumsfaktoren wie PDGF, G-FGF, VEGF, TGFβ oder
Adhäsionsmoleküre wie SLex, LFA-1, MAC-1, LECAM-1 oder VLA-1.
22. Nukleinsäurekonstrukt nach Anspruch 20, dadurch
charakterisiert, daß der Ligand an Tumorzellen bindet.
23. Isolierte Zelle, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein
Nukleinsäurekonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 22
enthält.
24. Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der
Ansprüche 1 bis 22 oder einer Zelle nach Anspruch 23 zur
Bereitstellung eines Heilmittels zur Behandlung einer
Erkrankung.
25. Verwendung eines Nukleinsäurekonstrukts nach einem der
Ansprüche 1 bis 22 oder einer isolierten Zelle gemäß
Anspruch 23 zur Behandlung einer Erkrankung, wobei die
Bereitstellung des Heilmittels die Einführung des
Nukleinsäurekonstrukts in eine Zielzelle umfaßt.
26. Verwendung nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß
die Erkrankung mit übermäßiger Zellvermehrung einhergeht.
27. Verwendung gemäß Anspruch 24 bis 26, dadurch
gekennzeichnet, daß die Bereitstellung des Heilmittels die
Überführung eines Nukleinsäurekonstruktes gemäß einem der
Ansprüche 1 bis 22 in eine Form umfaßt, die die Einführung
des Nukleinsäurekonstrukts in die Zielzelle ermöglicht.
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