DE19732917C1

DE19732917C1 - Verfahren zum Transglutaminase-katalysierten Koppeln von Protein oder Peptid an einen Träger

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Publication number: DE19732917C1
Application number: DE1997132917
Authority: DE
Inventors: Hans-Lothar Fuchsbauer; Ralf Pasternack; Rolf Eymann; Jens Otterbach; Uwe Bechtold
Original assignee: Individual
Current assignee: N Zyme Biotec GmbH
Priority date: 1997-07-30
Filing date: 1997-07-30
Publication date: 1998-10-15
Anticipated expiration: 2017-07-31
Also published as: WO1999006446A2; WO1999006446A3; EP1001992A2

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Transglutaminase- katalysierten Koppeln von Protein oder Peptid an einen Träger unter Erhalt von mindestens 50% der biologischen Aktivität des Proteines oder Peptides, gemäß diesem Verfahren erhältliche trägergekoppelte Proteinimmobilisate und Träger- Protein-Konjugate sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen trägergekop pelten Proteinimmobilisate und Träger-Protein-Konjugate.

Die kovalente Verknüpfung von Proteinen zu stabilen Aggregaten bzw. ihre kova lente Bindung an Trägermaterialien sind wichtige Verfahren in der Medizintech nik, Lebensmitteltechnik und Diagnostik. Üblicherweise findet die Vernetzung mit chemischen Reagenzien statt, unter denen Glutardialdehyd eine herausragende Rolle spielt. Andere organische Verbindungen mit mindestens zwei reaktiven funktionellen Gruppen (eine Ausnahme stellt Formaldehyd dar) können ebenfalls eingesetzt werden. Eine stabile Bindung läßt sich auch dadurch erreichen, daß ein Protein vor der Kopplung mit einem zweiten Protein chemisch aktiviert wird. Eine gängige Methode ist beispielsweise die Oxidation von Glykoproteinen mit Periodsäure unter Öffnung eines Zuckerrings und Erzeugung reaktiver Carbonyl funktionen. Bei Immobilisierungsverfahren besitzt meistens das Trägermaterial schon eine geeignete reaktive Gruppe für die Ausbildung einer kovalenten Bin dung zwischen Protein und Trägermatrix, z. B. eine Oxirangruppe.

Die Proteinkopplung mit chemischen Vernetzungsmitteln verläuft durch die hohe Reaktivität der funktionellen Gruppen in der Regel unter milden Reaktionsbedin gungen, d. h. in neutralem Milieu und bei Raumtemperatur. Diese Verfahrenspa rameter sind auch notwendig, um eine weitgehende Denaturierung der Biomole küle und damit einhergehend den Verlust der biologischen Aktivität zu vermei den. Dennoch läßt sich bei Verwendung chemischer Reagenzien eine Desakti vierung der Proteine nicht verhindern, und in vielen Fällen kommt es zu hohen Verlusten an biologischer Aktivität. Die wesentliche Ursache für den Aktivitätsver lust muß in der vollkommen unkontrollierten und unspezifischen Reaktion zwi schen chemischem Reagenz und Protein gesehen werden.

Es ist bereits bekannt, daß Transglutaminasen (Protein-Glutamin: Amin-γ glutamyltransferase E.C. 2.3.2.13) den Aufbau stabiler Querbrücken zwischen Proteinen spezifisch katalysieren. Dabei wird die γ-Carboxamidfunktion von Glutaminseitenketten auf die ε-Aminogruppe von Lysinresten unter Freisetzung von Ammoniumionen übertragen (Folk und Finlayson, Adv. Protein Chem. 31, 1- 133 (1977)). Die neu gebildete Isopeptidbindung hält auch einer Hydrolyse durch Proteasen stand und wird physiologisch erst nach vollständigem Abbau der Pro teine durch eine γ-Glutamylamin-Cyclotransferase gespalten (Fink et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4564-4568 (1980)).

Transglutaminasen wurden im Stand der Technik bereits zum Immobilisieren von Enzymen verwendet. Beispielsweise beschreibt die JP 59 66 886 ein Verfahren, bei dem Trägermaterial und zu koppelndes Protein zum Herstellen von Pro teinimmobilisaten simultan ausgefällt werden (simultanes Immobilisierungsverfah ren). Dazu wurden verschiedene Enzyme (Glucoseoxidase, Katalase, Diaphora se, RNase, Glucosidase, Mannosidase, Glutamatdehydrogenase) mit <2% (w/v) Trägermaterial in einer gepufferten Lösung vernetzt. Dieses Verfahren wurde auch erfolgreich zum Herstellen aktiver Caseinmembranen verwendet (JP 61 227 783 und Motoki et al., Agric. Biol. Chem. 51, 997-1002 (1987)), indem die Protein lösung unmittelbar nach Zugabe der Enzyme auf eine Vinyl- oder Polymethacry latplatte aufgebracht und an der Luft bei 37-40°C getrocknet wurde. Man erhielt auf diese Weise eine zugfeste Membran oder Folie. Ein Nachteil dieses Verfah rens ist jedoch die geringe spezifische Aktivität des erhaltenen Proteinimmobilisa tes. Die Immobilisatausbeuten variieren zwischen <1% (Glucoseoxidase) und 30% (β-Galactosidase), bezogen auf die Ausgangsaktivität. Die Abhängigkeit der Immobilisatausbeute von Proteinkonzentration und Quervernetzungsgrad wurde von Fuchsbauer et al. (Biomaterials 17, 1481-1488 (1996)) am Beispiel von β- Galactosidase aus Aspergillus oryzae mit dem Trägerprotein Gelatine untersucht. Die höchsten Immobilisatausbeuten (30-46% der Ausgangsaktivität) konnten mit einer 10-15% Gelatinelösung von hoher Gallertfestigkeit, vernetzt mit 2 mE Transglutaminase pro mg Protein, erzielt werden.

Ein weiterer Nachteil des simultanen Immobilisierungsverfahrens ist es, daß die ses nur für Enzyme mit kleinen Substratmolekülen geeignet ist, die ungehindert in die Trägermatrix eindringen können, da die Enzyme in der Matrix eingeschlos sen vorliegen. Größere bzw. polymere Substratmoleküle können in die Trägerma trix nicht eindringen, so daß eine enzymatische Reaktion nicht stattfinden kann. Dieses Problem versuchten Kamata et al. (JP 06 46 855 von 1992 und Biosci. Biotech. Biochem. 56, 1323-1324 (1992)) dadurch zu lösen, daß sie Enzyme mit polymeren Substraten (Trypsin, α-Amylase) an ein Ionenaustauschermaterial banden und anschließend mit Transglutaminase anstelle von Glutardialdehyd stabilisierten. Reaktionsansätze zur Stabilisierung von α-Amylase-Immobilisaten mit pH-Werten von 6 bis 8 lieferten jedoch trotz sehr hoher Transglutaminase konzentrationen (280 mE/mg) keine aktiven Immobilisate. α-Amylase hatte nach einer Immobilisierung an zwei unterschiedlichen Ionenaustauschermaterialien und Transglutaminase-katalysierter Stabilisierung bei pH 4 und pH 9 bis 11 die höchste Restaktivität (1,5-3%). Diese Restaktivität kann wahrscheinlich nicht auf eine Stabilisierung durch Transglutaminase zurückgeführt werden, da Trans glutaminase nur im Bereich von pH 5 bis pH 9 aktiv ist. Die Rolle von Trans glutaminase bei diesem Verfahren bleibt also unklar.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Pro teine oder Peptide unter Erhalt ihrer biologischen Aktivität an einen Träger ge koppelt werden können.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zum Transglutamina se-katalysierten Koppeln von Protein oder Peptid an einen Trager unter Erhalt von mindestens 50% der biologischen Aktivität des Proteines oder Peptides ge löst, wobei der Träger ein bioaktives Molekül oder eine vorgegebene unlösliche Matrix ist, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des Trägers mit dem zu koppelnden Protein und mit Transglutaminase, wobei der Träger und das Protein oder Peptid als Acyl- und/oder Amindonor wirken und als Transglutaminase substrat geeignet sind.

Unter "biologischer Aktivität" des Proteines oder Peptides ist dabei die jeweili ge enzymatische Aktivität von Enzymen, die Antikörper-Bindungsaktivität von Antikörpern, die inhibierende Aktivität von Inhibitoren und die Antigenizität von Antigenen zu verstehen. Im Einklang mit dieser Definition können nicht nur vollständige Proteine, sondern auch Proteinfragmente oder Peptide biologisch aktiv sein.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren lassen sich Protein- oder Peptid- Immobilisate und -Konjugate mit allen von einer Transglutaminase akzeptierten Trägern herstellen. Für die Kopplung benötigen Proteine und Peptide Glutamin- und/oder Lysinreste, die für Transglutaminase zugänglich sind. Andere Verbin dungen sowie modifizierte Proteine oder Peptide müssen mindestens eine Säu reamidfunktion oder eine primäre Amingruppe besitzen. Auch eignen sich Protei ne und andere Verbindungen als Ausgangsmaterialien für die enzymatische Ver netzung, wenn diese zuvor durch Verlängerung mit einer Oligo- oder Poly glutaminylkette, einem Glutaminylpeptid, einer Oligo- oder Polylysinkette oder einem primären Amin unter Zuhilfenahme von chemischen und/oder molekular biologischen Methoden modifiziert worden sind.

Es wird empfohlen, daß vor der enzymatischen Vernetzungsreaktion mit Trans glutaminase alle Reaktionspartner, also der Träger sowie das zu koppelnde Pro tein oder Peptid, auf ihre Eignung als Enzymsubstrat überprüft werden bzw. Re aktionspartner verwendet werden, deren Eignung als Transglutaminase-Substrat bekannt ist. Die Eignung als Transglutaminase-Substrat kann durch den Einbau von in der Regel fluoreszierenden Transglutaminase-Substraten festgestellt wer den. Es wird dabei zwischen Acyl- bzw. Glutamindonoren einerseits und Amindo noren (Glutaminakzeptoren) andererseits unterschieden.

Für den Nachweis reaktiver Carboxamidgruppen kann beispielsweise die von Lorand et al. (Anal. Biochem. 44, 207-220 und 221-231(1971)) eingeführte fluo reszierende Verbindung 5-N-(5'-N'-N'-Dimethylaminonaphthalinsulfonyl)amido pentylamin verwendet werden. Diese Verbindung weist die folgende Formel (I) auf:

Die Identifizierung reaktiver Amine in einem breit angelegten Screening-Prozeß wurde erst mit der Synthese des Dipeptids 1-N-(Carbobenzoxy-L-glutaminyl glycyl)-5-N-(5'-N'-N'-Dimethylaminonaphthalinsulfonyl)diamidopentan möglich, die 1997 durch Pasternack et al. (Anal. Biochem., 249, 54-60 (1997)) eingeführt wurde. Die Verbindung weist die folgende chemische Formel (II) auf:

Bei Proteinen sollten zwei verschiedene Inkubationsansätze je Protein durchge führt werden (Beispiel 2). Der eine enthält neben Transglutaminase ein markier tes Amin, z. B. C-DNS(I), das zur Bestimmung reaktiver Glutaminreste geeignet ist, der andere ein markiertes Säureamid, z. B. CBZ-Gln-Gly-C-DNS(II), zur Be stimmung reaktiver Lysinseitenketten.

Die Proteine werden nach der Inkubation elektrophoretisch aufgetrennt und an schließend durch Bestrahlung mit UV-Licht der Wellenlänge 366 nm sichtbar ge macht. Um Fehlinterpretationen bei unbekannten oder stark verunreinigten Pro teinpräparaten zu vermeiden, wird empfohlen, nach UV-Bestrahlung des Elektro phoresegels und Dokumentation eine Silber- oder Coomassie-Färbung des Gels vorzunehmen. Peptide und andere kleine Moleküle können durch Chromatogra phie, z. B. analytische HPLC, vom Überschußreagenz getrennt und über ihre Emission als Transglutaminase-Substrat erkannt werden. Prinzipiell lassen sich aber auch radioaktive oder biotinylierte Markierungsreagenzien (z. B. Biotinylami dopentyIamin der Fa. Pierce) für die Vorversuche einsetzen. Der Nachweis einer erfolgreichen Markierung erfolgt dann nach der Auftrennung durch Autoradiogra phie oder mit Avidin-/Streptavidin-Enzym-Konjugaten.

Unmodifizierte Proteine lassen sich so in vier Kategorien einordnen:

- Glutamindonoren: Proteine mit ausschließlich reaktiven Glutaminresten (Kategorie 1);
- Glutaminakzeptoren: Proteine mit ausschließlich reaktiven Lysinresten (Kategorie 2);
- Glutamindonoren und -akzeptoren: Proteine mit reaktiven Glutamin- und Lysin resten (Kategorie 3);
- Proteine ohne reaktive Glutamin- und Lysinreste im nativen Zustand (Kategorie 4).

Tabelle 1 zeigt beispielhaft wichtige bioaktive Proteine mit reaktiven Seitenket ten, die als Transglutaminasesubstrate dienen können. Prinzipiell können mit dem beschriebenen Testverfahren auch andere Biopolymere sowie synthetische Polymere als Transglutaminasesubstrate erkannt werden.

Tabelle 1

Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit jeder Art von Acyl- und/oder Amindo nor durchgeführt werden, vorausgesetzt, dieser ist als Transglutaminasesubstrat geeignet, was, wie oben dargelegt, getestet werden kann. In bevorzugten Aus führungsformen ist das zu koppelnde Protein oder Peptid ein Glutamindonor und der Träger umfaßt reaktive Amingruppen. In einer alternativen Ausführungsform ist das zu koppelnde Protein oder Peptid ein Glutaminakzeptor und der Träger stellt reaktive Carboxamidgruppen zur Verfügung. Im Falle von Proteinen mit re aktiven Glutamin- und Lysinseitenketten kann der Träger Amingruppen oder Carboxamidgruppen oder Amin- und Carboxamidgruppen enthalten. Selbstver ständlich kann es sich bei dem Träger auch um ein Protein handeln, so daß die reaktiven Amingruppen des Trägers beispielsweise auch Lysinseitenketten, die reaktiven Carboxamidgruppen des Trägers reaktive Glutaminseitenketten sein können.

Erfindungsgemäß kann es sich bei dem Träger um ein in Lösung vorliegendes bioaktives Molekül handeln. Bevorzugt ist das bioaktive Molekül ein Enzym. Die Kopplung eines Proteines oder Peptides an ein Enzym dient beispielsweise der Bereitstellung von Molekülen mit zwei unterschiedlichen enzymatischen Aktivitä ten. Die Vernetzung zweier Moleküle kann außerdem für die Bereitstellung von Proteindimeren oder höheren Aggregationsformen, die zum Beispiel als Ligand eines Rezeptors eine biologische Aktivität haben, sinnvoll sein. In jedem Fall müssen von mindestens einem Reaktionspartner reaktive Amine und von minde stens einem weiteren Reaktionspartner reaktive Carboxamidgruppen zur Verfü gung gestellt werden.

In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Träger um eine vor gegebene unlösliche Matrix. Die enzymatische Vernetzung von Proteinen, zum Beispiel von Gelatine und Casein, führt zu guten Trägern, die auch bei Tempera turen oberhalb von 100°C stabil bleiben. Vernetzte Proteine sind als unlösliche Matrix bevorzugt.

Das zu koppelnde Protein oder Peptid kann ein natives Protein oder Peptid sein, ein rekombinantes oder ein synthetisch hergestelltes. Weiter kann das zu kop pelnde Protein oder Peptid modifiziert oder unmodifiziert vorliegen. Unter Modifi kationen sind dabei sowohl Mutationen der Primärstruktur einschließlich von De letionen und Insertionen sowie Aminosäureaustausche zu verstehen, als auch chemische Modifikationen, wie die nachträgliche PEGylierung, Glykosylierung oder Deglykosylierung, das nachträgliche An- bzw. Einfügen von Cysteinresten etc. Gleiches gilt für den Träger und bezieht sich sowohl auf die unlösliche Trä germatrix als auch auf das bioaktive Molekül.

Erfindungsgemäß behält das zu koppelnde Protein oder Peptid nach seiner Kopplung mindestens 50% der Ausgangsaktivität bei. In bevorzugten Ausfüh rungsformen beträgt die Aktivität jedoch 60% oder 70%, besonders bevorzugt 80% oder 90% oder sogar mehr als 90% seiner Ausgangsaktivität.

Bei der Herstellung eines Konjugates aus bioaktiven Molekülen und zu koppeln dem Protein oder Peptid ist es bevorzugt, daß die biologische Aktivität des bio aktiven Moleküles ebenfalls mindestens zu 50% bestehen bleibt. Bevorzugte Ausführungsformen sehen hier ebenfalls Aktivitäten von 60 oder 70%, bevorzugt 80, 90 oder mehr als 90% vor.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Anwendung jeder Protein-Glutamin- Amin-γ-glutamyltransferase. Bevorzugt sind bakterielle Transglutaminase, Pflan zen- oder Säugertransglutaminase. Transglutaminasen sind auch in Mollusken und Krustazeen beschrieben worden und sind wahrscheinlich ubiquitär. Beson ders bevorzugt ist die Verwendung einer bakteriellen Transglutaminase. Die am besten charakterisierte bakterielle Transglutaminase ist die Transglutaminase aus Streptoverticillium mobaraense.

Im Fall der Durchführung mit Säugertransglutaminase wird bevorzugt die Trans glutaminase aus Meerschweinchenleber verwendet. Die bisher untersuchten Säugertransglutaminasen reagieren jedoch schwächer als bakterielle Trans glutaminasen und haben teilweise eine höhere Substratspezifität. Ein Beispiel für eine Säugertransglutaminase mit hoher Substratspezifität ist der Blutgerinnungs faktor XIII_a.

Die Bedingungen für die Durchführung der Transglutaminase-katalysierten Kopplung richten sich nach der Herkunft der verwendeten Transglutaminase. Bei Verwendung einer bakteriellen Transglutaminase erfolgt die Transglutaminase- katalysierte Verknüpfung eines Proteins oder Peptids mit einem Träger, z. B. ei ner enzymatisch vernetzten Gelatinefolie (Beispiel 3), bei 20-60°C innerhalb von 24 Stunden in einer gepufferten Lösung bei pH-Werten von 5 bis 9. Die Tempera turen während der enzymatischen Verknüpfung betragen dabei bevorzugt 25 bis 55°C und besonders bevorzugt 30 bis 45°C. In der am höchsten bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Reaktion bei 37°C oder 37°C ± 5°C. Die Inkubati onszeit bewegt sich bevorzugt zwischen einer halben und 18 Stunden und be trägt besonders bevorzugt zwischen 1 und 4 Stunden. Der pH-Wert der gepuffer ten Lösung sollte zwischen pH 5 und 9 liegen; bevorzugte Bereiche hängen vom verwendeten Puffersystem ab und liegen für die meisten Puffer bei pH 6 bis 8, besonders bevorzugt pH 7 ± 0,5. Als Puffer können folgende Pufferlösungen verwendet werden:

Phosphatpuffer	pH 6,0-8,0, bevorzugt pH 6,0-7,0
TRIS¹⁾-HCl-Puffer	pH 7,0-9,0, bevorzugt pH 7,0-8,5
TRIS-Acetat	pH 6,0-9,0, bevorzugt pH 6,0
Tricin²⁾-HCl-Puffer	pH 7,0-9,0, bevorzugt pH 7,5
MOPS³⁾-Puffer	pH 6,0-8,0, bevorzugt pH 7,5
TEA⁴⁾-Puffer	pH 6,0-9,0, bevorzugt pH 7,5

Dabei bedeutet:
¹⁾ TRIS = Tris(hydroxymethyl)aminomethan
²⁾ Tricin = N-[Tris(hydroxymethyl)methylglycin]
³⁾ MOPS = 3-N-Morpholinopropansulfonsäure
⁴⁾ TEA = Triethanolamin

Bei Verwendung von bakterieller Transglutaminase aus Streptoverticillium moba raense ist der bevorzugte Puffer Tricin-HCl-Puffer, während das aus Meer schweinchenleber gewonnene Säugerenzym die besten Ergebnisse in TRIS-HCl- Puffer mit EDTA, Dithiotreitol und Calciumionen erbringt.

Die erhaltenen Träger-gekoppelten Proteinimmobilisate weisen eine unerwartet hohe Belegdichte auf. Man erhält beispielsweise ein Gelatine-Protein-A- Immobilisat mit einer Belegdichte von mindestens 2 ng (50 fmol) Protein A pro mm² Folie, wenn 1 µmol Protein A und 2 g (ca. 4 dm²) Gelatinefolie in Tris-Acetat- Puffer, pH 6,0, mit 50 nmol bakterieller Transglutaminase für 60 min bei 37°C inkubiert werden (Beispiel 4 und 5). Bei der Berechnung der Belegdichte wurde davon ausgegangen, daß immobilisiertes Protein A noch die maximale Zahl von 2 Antikörpermolekülen der Klasse IgG bindet. Möglicherweise wird aber eine hö here Belegdichte mit diesem Verfahren erreicht.

Erfindungsgemäß kann das zu koppelnde Protein oder Peptid mehr als eine Protein- und/oder Peptidsequenz umfassen. Wie in einem Multienzymkomplex können so mehrere Proteine oder biologisch aktive Peptide auf engstem Raum immobilisiert werden (Multi-Enzymimmobilisat).

Das optimale molare Verhältnis von zu koppelndem Protein oder Peptid zu Trä ger kann den jeweiligen Bedürfnissen entsprechend jeweils experimentell be stimmt werden. Das Mischungsverhältnis für beide Verbindungen hängt von der Anzahl reaktiver Gruppen, der Molekülgröße und der beabsichtigten Verwendung des Konjugats ab. Üblicherweise beträgt das molare Verhältnis 5 : 1 bis 1 : 100 (zu koppelndes Protein oder Peptid zu Träger). Bevorzugte Bereiche sind dabei im Fall einer Kopplung an einen unlöslichen Träger 1 : 5 bis 1 : 50.

Zum Herstellen von Konjugaten mit unterschiedlichen biologischen Aktivitäten werden mindestens zwei verschiedene Transglutaminase-Substratmoleküle, idealerweise ein Glutamindonor (Kategorie 1) und ein Glutaminakzeptor (Kate gorie 2), mit Transglutaminase bei pH 5-9 und Temperaturen von 20-60°C inku biert. Im Fall der Bildung von Träger-Protein-Konjugaten ist das bevorzugte Ver hältnis von zu koppelndem Protein oder Peptid zu bioaktivem Molekül 1 : 20 bis 5 : 1.

Nach Beendigung der Reaktion kann das Produkt bei Bedarf durch Dialyse, Ul trafiltration, Fällung oder ein chromatographisches Verfahren gereinigt werden.

Zu den Vorteilen des erfindungsgemäßen Verfahrens zählt es, daß die biologi sche Aktivität der Reaktionspartner in der Regel vollständig erhalten bleibt. Ein weiterer entscheidender Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber einer bekannten chemischen Kopplung ist vor allem darin zu sehen, daß durch Trennverfahren die teuren, nicht umgesetzten Ausgangsverbindungen zurückge wonnen werden können. So kann beispielsweise ein Konjugat mit zwei unter schiedlichen biologischen Aktivitäten hergestellt werden indem man Protein G (ein Protein der Kategorie 2, siehe auch Tabelle 3) mit Soja-Peroxidase (ein Protein der Kategorie 3) im Verhältnis 1 : 20 mit Transglutaminase vernetzt (Beispiel 7). Eine erfolgreiche Kopplung kann dadurch überprüft werden, daß man Antikörper der Klasse G (IgG), die Protein G spezifisch binden, auf einer Nitrozellulosemembran fixiert, die Testlösung aufbringt und nach mehreren Waschschritten mit 4-Chlor-1-naphthol und Wasserstoffperoxid anfärbt ("Dot- Blot"). Eine quantitative Erfassung der gebildeten Konjugate erfolgt über einen Mikrotiterplatten-Assay (Beispiel 8). Eine Anreicherung bzw. vollständige Reini gung der Protein G-Peroxidase-Konjugate sowie die Rückgewinnung der nicht umgesetzten Ausgangsmaterialien wird durch Chromatographie an einem Anio nenaustauscher (Beispiel 9) oder durch Gelpermeationschromatographie er reicht.

Die Erfindung bezieht sich weiterhin auf ein trägergekoppeltes Proteinimmobilisat sowie auf ein Träger-Protein-Konjugat, die durch das erfindungsgemäße Verfah ren erhältlich sind.

Ein bevorzugtes Träger-Protein-Konjugat ist ein durch Transglutaminase kataly sierte Kopplung erhaltenes Konjugat aus monoklonalem oder polyklonalem Anti körper und Markerenzym. Bei diesem Markerenzym kann es sich beispielsweise um alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase oder jedes andere im Stand der Technik bekannte Markerenzym handeln. Dabei erlaubt die Transglutamina se-katalysierte Kopplung die Verbindung eines Antikörpermoleküls mit bis zu 20 Enzymmolekülen, was die Amplifizierung des Signales z. B. bei nachfolgenden Antigen-Antikörper-Reaktionen erlaubt. Auch durch Vernetzung entstandene oli gomere Enzyme verstärken das Signal.

Die Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung eines trägergekoppelten Proteinimmobilisates oder Träger-Protein-Konjugates in der enzymatischen Ana lyse.

Beispielsweise können die in Tabelle 3 aufgelisteten Substratproteine an einen unlöslichen Träger gekoppelt und zur Etablierung eines neuen Transglutamina se-Aktivitätstests herangezogen werden, insbesondere zur Entwicklung eines spezifischen und sensitiven Analyseverfahrens zur Bestimmung von aktivem Faktor XIII_a in humanem Blutserum. Dafür wird eine Mikrotiterplatte mit einem guten Transglutaminase-Substrat, z. B. Casein, beschichtet. Noch freie Bin dungsstellen wurden mit Rinderserumalbumin abgesättigt. Nach Zugabe eines Enzyms, das über reaktive Glutamin- oder Lysinreste verfügt, z. B. alkalische Phosphatase (Beispiel 6), pipettiert man die Transglutaminaseprobe oder eine Vergleichsprobe zu und inkubiert 0,5 bis 5 Stunden oder auch länger, je nach gewünschter Empfindlichkeit, bei pH 5 bis 9 und Temperaturen von 20-50°C. Der kovalent gebundene Enzymanteil wird nach mehrfachem Waschen über eine co lorimetrische Enzymreaktion quantitativ bestimmt, bei alkalischer Phosphatase beispielsweise über die Hydrolyse von para-Nitrophenylphosphat. Bei Verwen dung der Substratproteine Protein A und Protein G, Avidin und Streptavidin ist eine zweite Inkubation mit Antikörper-Enzym-Konjugaten bzw. Biotin-Enzym- Konjugaten notwendig, bevor eine Nachweisreaktion durchgeführt werden kann. Dies verbessert die Sensitivität durch eine höhere Enzymkonzentration auf der Mikrotiterplatte, da Protein A und Protein G bis zu 2, Avidin und Streptavidin bis zu 4 Konjugatmoleküle binden können.

Eine Abwandlung des Tests kann darin bestehen, daß die beschichtete Mikroti terplatte durch eine vernetzte Gelatinefolie ersetzt ist. Diese wird dann in eine Enzymlösung eingetaucht, der nachfolgend die Transglutaminaseprobe zugesetzt wird. Nach Inkubation und mehrfachem Waschen kann der Gelatinestreifen direkt für die photometrische Messung in einer Küvette verwendet werden.

Weitere erfindungsgemäße Verwendungen sehen die Verwendung als Protein modul in oligomerer oder polymerer Form zum Herstellen von Folgeprodukten vor. So können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren durch sequenzielle Im mobilisierung an Trägern Multi-Enzymimmobilisate hergestellt werden, die bei spielsweise bei einer Mehrstufensynthese von organischen oder biologischen Verbindungen eingesetzt werden können. Die erfindungsgemäß hergestellten Multi-Enzymimmobilisate eignen sich auch für diagnostische Anwendungen, bei spielsweise für die Bestimmung von Glycerinlipiden nach enzymatischer Freiset zung und Oxidation von Glycerin, und photometrischer Messung der bei dieser Reaktion gebildeten Reduktionsäquivalente.

Die erfindungsgemäßen Proteinimmobilisate und Träger-Protein-Konjugate kön nen auch zum Herstellen von Biosensoren verwendet werden. Für die Biosensor technik benötigt man stabile bioaktive Verbindungen, die möglichst auf engstem Raum fixiert sind. Aktive Proteinfolien oder andere aktive unlösliche Proteinkom plexe könnten hierbei Vorteile gegenüber löslichen Enzymen bieten. So könnte beispielsweise ein Biosensor konstruiert werden, dessen Oberfläche mit einem bestimmten Antigen, beispielsweise Hepatitis-B-Oberflächenvirusprotein, belegt ist. Nach Inkontaktbringen des Biosensors mit einer Probe, enthaltend eine un bekannte Konzentration von Antikörpern gegen HbsAg und eine bekannte Kon zentration anti-HbsAg-Antikörper-Enzymkonjugat konkurrieren die enzymkonju gierten Antikörper mit den zu bestimmenden Antikörpern um die Bindungsstellen. Nach Besetzung der Bindungsstellen am Biosensor ist ein elektrisches Signal, das durch das Enzym erzeugt wird, umgekehrt proportional zur unbekannten An tikörperkonzentrationen. Der Biosensor kann durch Freisetzen der Antikörper regeneriert werden.

Erfindungsgemäß können die Träger-gekoppelten Proteinimmobilisate beschich tete Mikrotiterplatten mit biologischer Aktivität sein. Weiter können aktive Mem branen, Enzymcarrier und analytische Teststreifen unter Verwendung der erfin dungsgemäßen Proteinimmobilisate hergestellt werden. In der Diagnostik und Analytik sind eine Vielzahl von Teststreifen bekannt die auf der Aktivität eines an dem Teststreifen immobilisierten Enzymes beruhen Teststreifen finden zuneh mend auch im häuslichen Bereich Verwendung. So wurde z. B. in Japan ein Teststäbchen entwickelt, das durch die enzymatische Bestimmung des Kada verinanteils an der Oberfläche von Fisch eine Aussage über dessen Frische er laubt.

Im folgenden wird die Erfindung anhand der beigefügten Abbildungen und der Beispiele im einzelnen beschrieben.

Dabei zeigt

Abb. 1 eine Eichgrade für ein Kaninchen-anti-Huhn-IgG alkalische Phos phatasekonjugat,

Abb. 2 die Bindung von Protein A an eine Gelatinefolie in Abhängigkeit von der Konzentration des Vernetzungsenzyms,

Abb. 3 die Bestimmung von Transglutaminase durch kovalente Bindung von alkalischer Phosphatase an eine mit Casein beschichtete Mikrotiterplatte und nachfolgender Hydrolyse von Paranitrophenylphosphat, und

Abb. 4 die Anreicherung von Protein G Peroxidasekonjugaten durch Ionen austauschchromatographie an Fractogel EDM-TMAE 650 S.

Beispiele Beispiel 1 Erzeugung von bakterieller Transglutaminase

Transglutaminase wurde aus dem Kulturüberstand von Streptoverticillium moba raense, wie von Gerber et al., Biochem. J. 299, 825-829 (1994), beschrieben, durch Chromatographie an einem stark sauren Ionenaustauscher und Material gereinigt. Die Polyacrylamid-Gelelektrophorese zeigte das Enzym als eine ein zelne Bande mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 30 E/mg, wenn es im Einklang mit dem von Grossowicz et al., J. Biol. Chem. 187, 111-125 (1950), be schriebenen Verfahren auf Hydroxamatbildung mit CBZ-Glutaminylglycin getestet wurde. Die Proteinkonzentrationen wurden unter Verwendung eines Bicinchonin säure-Standardprotokolls, wie vom Hersteller beschrieben, bestimmt.

Beispiel 2 Identifizierung von Proteinen als Transglutaminase-Substrate a) Proteinlösungen

Die Proteinlösungen der hier beschriebenen Transglutaminase-Substrate werden mit den in Tab. 2 angegebenen Konzentrationen in 0.02 M Natriumphosphatpuf fer, pH 7.3, gelöst.

Tabelle 2

b) 22 mM C-DNS-Lösung

22 µmol C-DNS (Sigma) werden in 27 µl 1 M HCl und 150 µl 0,2 M Tris-Acetat- Puffer, pH 6.0, gelöst. Nachfolgend wird mit bidest. H₂O auf 1 ml aufgefüllt.

c) 4 mM CBZ-Gln-Gly-C-DNS-Lösung

12 µmol CBZ-Gln-Gly-C-DNS (Synthese siehe Pasternack et al., Anal. Biochem. 249, 54-60 (1997)) werden in 300 µl DMSO gelöst und mit 2.7 ml 0,01 M HCl verdünnt.

d) Transglutaminaselösung

Transglutaminase wird beispielsweise wie in Beispiel 1 beschrieben durch Kulti vierung von Streptoverticillium mobaraense (DSM 40847) gewonnen und durch Ionenaustauschchromatographie nach einem Standardverfahren (Gerber et al., Biochem. J. 299, 825-829 (1994)) angereichert. Die Enzymaktivität wird nach der Methode von Grossowicz et al. (J. Biol. Chem. 187, 111-125 (1950)) bestimmt. Die verwendete Enzymmenge ist in Tab. 2 angegeben.

e) Elektrophorese-Auftragspuffer

2 g Harnstoff werden in einer Mischung aus 2 ml 20% (w/v) Natriumdodecylsulfat (SDS), 2 ml Glycerin, 2 ml gesättigter Bromphenolblaulösung und 2 ml bidest. H₂O gelöst.

f) Reaktionsansätze

Die Reagenzlösungen werden in der Reihenfolge von Tab. 3 gemischt und nach einer vorgegebenen Inkubationszeit analysiert.

Tabelle 3

g) Analytik

Jede Probe wird nach der Methode von Laemmli (Nature 227, 680-685 (1970)) auf 12,5%igen Polyacrylamidgelen mit 5%igen Obergelen elektrophoretisch aufgetrennt und vor der Silberfärbung nach der Methode von Blum et al. (Electrophoresis 8, 93-99 (1987)) mit UV-Licht der Wellenlänge 366 nm unter sucht. Einige Ergebnisse sind in Tab. 1 (s. o.) aufgeführt.

Beispiel 3 Herstellung einer hitzestabilen Gelatinefolie

2 g Gelatine min einer Gallertfestigkeit von 250-300 g Bloom werden mit 8 g H₂O übergossen und nach 30 min bei 60 °C gelöst. Die auf 50 °C abgekühlte Gelati nelösung wird mit Transglutaminase (0,5 E/g Gelatine) versetzt und sofort in eine Foliengießvorrichtung (Folienmaschine oder Gießkammer) übergeführt. Nach 30 min wird die erstarrte Folie abgelöst und an der Luft über Nacht getrocknet.

Beispiel 4 Herstellung einer Gelatinefolie mit Protein-A-Aktivität

Eine vernetzte Gelatinefolie (2 g Trockenmasse) wird in 70 ml 0,2 M Tris-Acetat- Puffer, pH 6,0, auf 37 °C erwärmt. Nach Zugabe von 10 ml 10 mM Protein A in 0,2 M Tris-Acetat-Puffer, pH 6,0, und 20 ml Transglutaminase der Aktivität 4 E/ml inkubiert man 60 min bei 37 °C. Anschließend wird die Folie zweimal mit 100 ml Tris-Acetat-Puffer, pH 6,0, gewaschen, an der Luft getrocknet und in Streifen (ca. 2 mg) geschnitten.

Beispiel 5 Ermittlung der Protein-A-Aktivität a) Eichkurve für ein Antikörper-Alkalische-Phosphatase-Konjugat

Ein Kaninchen-anti-Huhn-Antikörper (IgG) konjugiert mit Alkalischer Phosphatase (Sigma) wird mit 0,05 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, der zusätzlich 150 mM NaCl, 0,005% (v/v) Tween 20 und 0,09% (w/v) NaN₃ enthält (AK-Bindungspuffer), 1 : 2000 bis 1 : 10000 verdünnt. Mit jeder Verdünnung wird eine Farbreaktion nach dem Schema von Tab. 4 durchgeführt. Die Eichgerade zeigt Abb. 1.

Tabelle 4

b) Protein-A-Nachweis

Ein 2-mg-Streifen des Gelatine-Protein-A-Immobilisats wird zum Quellen 30 min in AK-Bindungspuffer gelegt. Das gut abgetropfte Aliquot wird in 100 µl einer 1 : 2000-Verdünnung des Antikörper-Alkalische-Phosphatase-Konjugats überge führt und 10 min bei 37°C inkubiert. Nach dreifachem Waschen mit AK-Bin dungspuffer wird die Farbreaktion nach dem Schema von Tab. 4 durchgeführt. Für den Vergleichsansatz dient eine vernetzte Gelatinefolie ohne Protein A. Abb. 2 zeigt die Abhängigkeit der Protein A-Belegdichte von der Konzentration des Vernetzungsenzyms.

Beispiel 6 Mikrotiterplatten-Assay zum Nachweis von Transglutaminase a) Nicht-kovalente Bindung von Casein

In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol werden 250 µl einer Ca seinlösung (1 mg/ml in Beschichtungspuffer bestehend aus 40 mM Tris-HCl mit 150 mM NaCl, pH 8,3) pipettiert. Die Mikrotiterplatten werden über Nacht bei 4 °C inkubiert und verbliebene Bindungsstellen mit 250 µl einer 1% (w/v) Rinder serumalbumin-Lösung in Beschichtungspuffer abgesättigt.

b) Spezifische Transglutaminase-Reaktion

In jede Vertiefung pipettiert man 20 µl einer Probe oder Vergleichsprobe (z. B. nur den verwendeten Puffer ohne Transglutaminase) und 20 µl einer Alkalische- Phosphatase-Lösung (67 µg/ml in Beschichtungspuffer) und inkubiert 120 min bei Raumtemperatur. Anschließend wird dreimal mit Substratpuffer für Alkalische Phosphatase, bestehend aus 1 M Diethanolamin-HCl-Puffer mit 0,01 mM MgCl₂, pH 9,8, gewaschen.

c) Farbreaktion

100 µl einer Substratlösung aus para-Nitrophenylphosphat in Substratpuffer (2 mg/ml) werden in jede Vertiefung pipettiert, und nach 30 min wird die optische Dichte bei 405 nm (Abb. 3) bestimmt.

Beispiel 7 Herstellung eines Protein-G-Peroxidase-Konjugats

Sojabohnen-Peroxidase und Protein G werden in einem molaren Verhältnis von 20 : 1 in 0,3 M Tris-HCl-Puffer, pH 7,0, gelöst. Nach Zugabe von Transglutamina se (0,5 E/mg Protein) wird 18 h bei 37 °C inkubiert.

Beispiel 8 Quantitativer Nachweis eines Protein G-Peroxidase-Konjugats a) Nichtkovalente Bindung von Kaninchen-Antikörper

In jede Vertiefung einer Mikrotiterplatte aus Polystyrol werden 100 µl einer Lö sung aus 10 µg Kaninchen-Antikörper (IgG, Sigma) in 1 ml Beschichtungspuffer, bestehend aus 40 mM Tris-HCl mit 150 mM NaCl, pH 8,3 pipettiert. Die Mikroti terplatte wird 60 min bei Raumtemperatur inkubiert, entleert und verbleibende Bindungsstellen mit 200 µl einer 1% (w/v) Rinderserumalbumin-Lösung in Be schichtungspuffer abgesättigt. Nachfolgend wird dreimal mit 200 µl Beschich tungspuffer gespült.

b) Spezifische Bindung des Konjugats

In jede Vertiefung werden 100 µl einer Probe oder Vergleichsprobe (z. B. Konju gatansatz ohne Transglutaminase) pipettiert und 60 min bei Raumtemperatur in kubiert. Anschließend wird erneut dreimal mit 200 µl Beschichtungspuffer ge spült.

c) Farbreaktion

Eine Substratlösung wird hergestellt aus 2 ml 0,1 M Phosphatpuffer, pH 6,0, 2 ml einer 5% (w/v) Pyrogallol-Lösung in H₂O, 1 ml 0,05% H₂O₂-Lösung und 13 ml H₂O. In jede Vertiefung der Mikrotiterplatte werden 100 µl der Substratlösung pipettiert, und nach 30 min wird die Extinktion bei 405 nm gemessen.

Beispiel 9 Anreicherung eines Protein-G-Peroxidase-Konjugats und Rückge winnung der Ausgangsmaterialien

Eine 10×150 mm Ionenaustauschersäule gefüllt mit Fractogel-EMD-TMAE-650 S (Merck) wird mit dem fünffachen Bettvolumen an 50 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, äquilibriert. 1 ml einer Protein-G-Peroxidase-Konjugatmischung wird auf die Säule gepumpt, und die nicht-bindenden Proteine (Transglutaminase und Protein G in dieser Reihenfolge) werden mit Äquilibrierpuffer von der Säule ge spült. Anschließend werden die Konjugate durch lineare Erhöhung der Ionenkon zentration mit NaCl von 0 bis 0,15 M innerhalb von 60 min eluiert. Die höchsten Konjugatkonzentrationen finden sich in Fraktionen bei 0,08-0,12 M NaCl (Abb. 4).

Claims

1. Verfahren zum Transglutaminase-katalysierten Koppeln von Protein oder Pep tid an einen Träger unter Erhalt von mindestens 50% der biologischen Aktivität des Proteines oder Peptides, wobei der Träger ein bioaktives Molekül oder eine vorgegebene unlösliche Matrix ist, umfassend den Schritt des Inkontaktbringens des Trägers mit dem zu koppelnden Protein oder Peptid und mit Transglutamina se, wobei der Träger und das Protein als Acyl- und/oder Amindonor wirken und als Transglutaminasesubstrate geeignet sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu koppelnde Protein oder Peptid ein Glutamindonor ist und der Träger reaktive Amingruppen umfaßt.

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu koppelnde Protein oder Peptid ein Glutaminakzeptor ist und der Träger reaktive Carbox amidgruppen enthält.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das zu koppelnde Protein oder Peptid ein Glutamindonor und -akzeptor ist und der Träger reaktive Amin- und/oder Carboxamidgruppen enthält.

5. Verfahren nach Anspruch 2 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Amingruppen des Trägers reaktive Lysinseitenketten sind.

6. Verfahren nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die reaktiven Carboxamidgruppen des Trägers reaktive Glutaminseitenketten sind.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein bioaktives Molekül ist und in Lösung vorliegt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger eine unlösliche Matrix ist und die unlösliche Matrix Protein enthält.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger Gelatine oder Casein ist.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das zu koppelnde Protein oder Peptid ein natives, ein rekombinantes oder ein syn thetisches, modifiziertes oder unmodifiziertes Protein oder Peptid ist.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger ein natives rekombinantes, synthetisches, modifiziertes oder unmodi fiziertes Protein oder Peptid ist.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß das zu koppelnde Protein oder Peptid nach seiner Kopplung mindestens 60, bevorzugt 70, besonders bevorzugt 80 oder 90% oder mehr als 90% seiner Ausgangsaktivität auf weist.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 7 und 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das bioaktive Material nach der Kopplung mindestens 50% seiner Ausgangsaktivi tät aufweist.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das bioaktive Material nach der Kopplung mindestens 60%, bevorzugt 70%, besonders bevorzugt 80% oder 90% oder mehr seiner Ausgangsaktivität aufweist.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Transglutaminase eine bakterielle Transglutaminase, eine Pflanzentransglutaminase oder eine Säugertransglutaminase ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die bakterielle Trans glutaminase aus Streptoverticillium erhalten worden ist.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es bei pH 5 bis 9 durch geführt wird.

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es bei einer Temperatur von 20°C bis 60°C durchgeführt wird.

19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das zu koppelnde Protein oder Peptid mehr als eine Proteinspezies umfaßt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das molare Verhältnis von zu koppelndem Protein oder Peptid zu Träger 5 : 1 bis 1 : 100 be trägt.

21. Trägergekoppeltes Proteinimmobilisat, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, 8 bis 12 und 15 bis 20.

22. Träger-Protein-Konjugat, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7 und 10 bis 20.

23. Verwendung eines trägergekoppelten Proteinimmobilisates oder Träger-Protein- Konjugates in der enzymatischen Analyse oder für Immundiagnostiktests.

24. Verwendung eines trägergekoppelten Proteinimmobilisates nach Anspruch 20 oder Träger-Protein-Konjugates nach Anspruch 22 als Proteinmodul in oligomerer oder po lymerer Form zum Herstellen von Folgeprodukten oder in der Diagnostik.

25. Verwendung nach Anspruch 24 zum Herstellen von Biosensoren, beschichteten Mikrotiterplatten mit biologischer Aktivität, aktiven Membranen, Enzym-Carriern, Analy tikteststreifen.