DE19832007C2 - Verfahren zur fluoreszenzmikroskopischen Unterscheidung lebender und toter Mikroorganismen - Google Patents

Verfahren zur fluoreszenzmikroskopischen Unterscheidung lebender und toter Mikroorganismen

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Description

Die Erfindung betrifft die Medizin, insbesondere die Mikrobio­ logie.
Aus Kronvall, G., Myhre, E.: Differential staining of bacte­ ria in clinical specimens using acridine orange buffered at a low pH. In: Acta Pathologica et Microbiologica Scandinavica (B) 1977, 85: 249-254 ist eine Acricinorange-Fluoreszenz- Färbung von fixierten Präparaten bekannt. Mit diesem Fluoro­ chrom können verschiedene Mikroorganismen, beispielsweise Bak­ terien oder Pilze, gesehen werden. Der Mangel dieses Verfah­ rens besteht darin, daß bei beliebigem pH der Akridinorange- Lösung die Bakterien und Pilze nur orangerot fluoreszieren. Wie aus Strugger, S., Hilbrich, P.: Die fluoreszenzmikroskopi­ sche Unterscheidung lebender und toter Bakterienzellen mit Hilfe der Akridinorange-Färbung. In: Deutsche Tierärzt. Wo­ chenschr. 50: 121-130, 1942, insbesondere S. 129, bekannt ist, kann die vitale Acridinorange-Fluorochromierung zur ex­ akten fluoroskopischen Unterscheidung lebender und toter Zel­ len eingesetzt werden. Im pH-Bereich zwischen 5 und 8 ist es infolge konzentrationsbedingter Änderungen des Fluoreszenz­ spektrums möglich, lebende und tote Bakterienzellen durch ver­ schiedene Fluoreszenzfarben mikroskopisch auseinanderzuhalten. Das lebende Bakterienplasma fluoresziert grün, während das to­ te kupferrot fluoresziert. Das bisher übliche Ausstrichverfah­ ren läßt sich nach Auffasssung der Autoren für diese Fluoro­ chromierung nicht anwenden. Aus Karnovsky, Morris J.: A Form­ aldehyd-Glutaraldehyde Fixative of High Osmolality for Use in Electron Microscopy. In: Journal of Cellbiology 27 (1965) 137A-138A ist ein Paraformaldehyd-Glutaraldehyd-Fixiermittel bekannt, das aus Paraformaldehyd und Glutaraldehyd besteht.
Der im Patentanspruch angegebenen Erfindung liegt das Problem zugrunde, lebende und tote Zellen in fixierten Präparaten zu unterscheiden.
Dieses Problem wird durch die im Patentanspruch angeführten Merkmale gelöst.
Eine klinische Probe wird vorläufig mit Paraformaldehyd- Glutaraldehyd fixiert, danach mit Acridinorange gefärbt und mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet.
Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen darin, daß die Fixierung mit Paraformaldehyd-Glutaraldehyd vor der Mate­ rialapplikation der Zellveränderung vorbeugt und ein breites Farbenspektrum fluoreszierender Bakterien ergibt.
Im folgenden wird ein Ausführungsbeispiel der Erfindung be­ schrieben.
Fixierung der klinischen Probe: 10 ml frischer Spontanurin werden bei 2000 Umdrehungen/min für 5 Minuten zentrifugiert, anschließend wird der Überstand abgeschüttet. Das Sediment im Verhältnis 1 : 1 mit Paraformaldehyd-Glutaraldehyd wird minde­ stens 30 Minuten fixiert. Das fixierte Sediment wird durch er­ neutes 5-minütiges Zentrifugieren bei 2000 Umdrehungen/min vom Fixativ getrennt, der Überstand abgegossen und das Sediment im Phosphatpuffer nach Sörensen pH 6,8-7,2 resuspendiert.
Färbung: Lufttrockene Präparate werden für 10 Minuten in eine mit Puffer nach Sörensen pH 6,8-7,2 verdünnte Acridinorange- Lösung (1 : 25000) getaucht, danach zweimal nacheinander für jeweils eine Minute im Puffer gespült. Die Farbstoffreste auf der Objektträgerunterseite werden mit einem Tuch entfernt und das Präparat wird schräggestellt bei 37°C an der Luft ge­ trocknet.
Mikroskopie: Die Auswertung der Präparate wird mit einem Fluo­ reszenzmikroskop vorgenommen.
Ergebnisse: Die mit der Erfindung erzielten Vorteile bestehen darin, daß die Bakterien in einem breiten (grün - orange - rot) Farbenspektrum fluoreszieren.

Claims (1)

1. Verfahren zur fluoreszenzmikroskopischen Unterscheidung leben­ der und toter Mikroorganismen, bei dem eine klinische Probe vorläufig mit Paraformaldehyd-Glutaraldehyd fixiert, danach mit Acridinorange gefärbt und mit einem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet wird.
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STRUGGER, S., HILBRICH, P.: Die fluoreszenzmikrospopische Unterscheidung lebender und toter Baktierienzellen mit Hilfe der Akridinorange-Färbung, In: Deutsche Tierärzt, Wochenschr. 50: 121-130, 1942 *

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