EP1999457A1 - Verfahren zur bestimmung von molekülen oder molekülteilen in biologischen proben - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von molekülen oder molekülteilen in biologischen proben

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EP1999457A1
EP1999457A1 EP07723151A EP07723151A EP1999457A1 EP 1999457 A1 EP1999457 A1 EP 1999457A1 EP 07723151 A EP07723151 A EP 07723151A EP 07723151 A EP07723151 A EP 07723151A EP 1999457 A1 EP1999457 A1 EP 1999457A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
light
bleaching
fluorescence
marker
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP07723151A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Lars Philipsen
Ansgar J. Pommer
Raik BÖCKELMANN
Bernd Bonnekoh
Harald Gollnick
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
MPB Meltec Patent und Beteiligungs GmbH
Original Assignee
MPB Meltec Patent und Beteiligungs GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by MPB Meltec Patent und Beteiligungs GmbH filed Critical MPB Meltec Patent und Beteiligungs GmbH
Publication of EP1999457A1 publication Critical patent/EP1999457A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/0059—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons using light, e.g. diagnosis by transillumination, diascopy, fluorescence
    • A61B5/0071—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons using light, e.g. diagnosis by transillumination, diascopy, fluorescence by measuring fluorescence emission
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/41—Detecting, measuring or recording for evaluating the immune or lymphatic systems
    • A61B5/414—Evaluating particular organs or parts of the immune or lymphatic systems
    • A61B5/415—Evaluating particular organs or parts of the immune or lymphatic systems the glands, e.g. tonsils, adenoids or thymus
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61B—DIAGNOSIS; SURGERY; IDENTIFICATION
    • A61B5/00—Measuring for diagnostic purposes; Identification of persons
    • A61B5/44—Detecting, measuring or recording for evaluating the integumentary system, e.g. skin, hair or nails
    • A61B5/441—Skin evaluation, e.g. for skin disorder diagnosis
    • A61B5/443—Evaluating skin constituents, e.g. elastin, melanin, water

Definitions

  • the invention relates to a method for the determination of molecules, groups of molecules and / or parts of molecules in biological samples, d.
  • H Samples of human, animal, plant or microbial origin.
  • fiororophore-labeled antibodies for the histo- and cytochemical examination of cells.
  • the fluorophore-labeled antibodies react specifically with antigens that are expressed on the surface of certain cells. Cells carrying such antigens are thus labeled with the fluorophore via the antibody.
  • the fluorophores When the fluorophores are exposed to adequate excitation light, the fluorophores are excited to emit photons, which can be measured by a photodetector.
  • fluorescent labels coupled not only to antibodies but also to other detector molecules such as lectins, nucleic acids, inorganic or organic molecules, probes and other ligands are used to analyze biological samples. Accordingly, the following statements apply mutatis mutandis not only for antibodies, but also for analogous applications with other detector molecules such as lectins, nucleic acids, inorganic or organic molecules or probes and other ligands.
  • Image analysis methods are known from the prior art with which the disturbing autofluorescence can be largely or completely removed from multispectral images. With strong autofluorescence of the samples or unfavorable superimposition of the autofluorescence with the fluorescence of the added markers, however, this can lead to significant signal information being lost.
  • the object of the invention is to eliminate the disadvantages of the prior art.
  • a method for the determination of molecules, groups of molecules and / or parts of molecules in biological samples is to be specified, which is particularly suitable for the investigation of skin tissue of human or animal origin and blood preparations.
  • a method for the determination of molecules, groups of molecules and / or parts of molecules is provided in biological samples, comprising at least one time displacement of the sample with at least one light emitting marker and measuring the light emission of the marker, wherein prior to measuring the light emission of the marker, the light emission inherent in the sample is reduced or eliminated by bleaching becomes.
  • the bleaching of the sample should be done before applying the light-emitting label.
  • the invention is based on the finding that by means of a bleaching step, the light emission inherent in the sample can be reduced or eliminated.
  • the bleaching step is carried out before the first application of a light-emitting marker. Due to the reduction or elimination of the inherent light emission, the light spectrum emitted by the marker after application thereof is not affected by light emissions originating from sources other than the markers. It has surprisingly been found in the experiments carried out according to the invention that the minimization or elimination of autofluorescence and nonspecific fluorescence in cell and tissue samples including tissue sections can advantageously be achieved by repeated soft bleaching, and in particular useful in the analysis of skin tissue samples; see also the following examples.
  • the biological sample is subjected to repeated soft bleaching, i.
  • the bleaching is preferably carried out with light whose wavelength range corresponds to the excitation wavelength of the marker (s) used, such as the wavelength of 488 nm in the case of FITC; see also the following examples.
  • the method of the present invention autofluorescence and specific fluorescence in cell and tissue samples can be achieved within a relatively short time by means of three bleaching steps with light of two wavelengths, i.
  • inherent light emission is understood to mean the emission of light by constituents of the sample without the addition of light-emitting substances to the sample have been.
  • the sample's inherent light emission includes autofluorescence as well as nonspecific fluorescence of the sample, but also any other perturbing light emissions such as fluorescence originating from the coating material of a slide or from substances used for sample fixation.
  • inherent fluorescence used hereinafter is understood to mean the emission of light by constituents of the sample without fluorescence-emitting substances having been added to the sample.
  • the fluorescence inherent in the sample includes autofluorescence as well as nonspecific fluorescence of the sample, but also any other interfering light emissions such as fluorescence originating from the coating material of a slide or from substances used for sample fixation.
  • bleaching is meant the destruction of the fluorophores contained in the sample.
  • destroying the fluorophores involves destroying the fluorophore groups of molecules of the sample which cause the inherent light emission or inherent fluorescence.
  • a biological sample is understood to mean samples of human, animal, plant or microbial origin.
  • microbial derived from the term
  • Merobes includes the entire spectrum of microorganisms including bacteria, viruses, fungi, mono- and multicellulars, algae, blue-green algae as well as
  • Prions see Pschyrembel, KHn. Wörterbuch, 259th edition, de Gruyter Berlin - New York
  • the sample can be, for example, tissue or liquids, such as
  • Blood, lymph or secretions act as well as preparations made from them.
  • blood preparations such as cell preparations of mononuclear cells
  • Lymphocytes, monocytes, granulocytes, platelets and erythrocytes from the blood to be examined by the method according to the invention thus enables the examination of samples which have a strong autofluorescence.
  • the method is therefore particularly suitable for the fluorescence analysis of autofluorescent tissue samples or autofluorescent cell cultures of human or animal origin. Fluorescence analysis of autofluorescent cell cultures involves fluorescence analysis of adherent cells as well as suspension cells.
  • the method according to the invention is particularly suitable for fluorescence analysis of human or animal skin tissue.
  • the inherent fluorescence of a sample is eliminated or reduced according to the invention by bleaching the sample.
  • the bleaching is carried out so that the binding sites for the fluorophore-labeled markers which are applied to the biological sample after bleaching according to the invention are not destroyed.
  • the bleaching of the sample should be done before applying the fluorophore-labeled label.
  • the bleaching of the samples is performed by irradiating the sample with light.
  • the wavelength of the light is chosen so as to destroy the functional groups of molecules of the sample which cause their inherent fluorescence.
  • a light-emitting marker is to be understood as meaning a fluorophore-labeled marker.
  • Fluorophore-labeled markers include, for example, fluorophore-labeled antibodies, lectins, nucleic acids, probes and other binding molecules.
  • the fluorophore-labeled label can be any type of fluorophore, but preferably the fluorophore is selected from the group consisting of fluorescent nanoparticles (quantum dots) and fluorochromes.
  • the bleaching is carried out until the signal intensity of the inherent fluorescence has been reduced to a predetermined level.
  • the sample can be exposed to the light of a specific wavelength for a given period of time.
  • the bleaching according to the invention can be repeated several times. This is particularly advantageous if it is not known what time of exposure of the light is required to reduce the signal intensity of the inherent fluorescence to a predetermined level. In this case, it is preferred that several bleaching cycles be performed, each bleaching cycle comprising bleaching the sample for a predetermined period of time and measuring the signal strength of the residual inherent fluorescence.
  • the light used to bleach the sample is preferably generated by the excitation light source of an inverted or upright fluorescence microscope.
  • the light source may in particular be a mercury-vapor lamp, halogen lamp, xenon lamp, a laser, a light-emitting diode, in each case in single or multiple or combinations thereof.
  • the wavelength of the light used for bleaching in one embodiment of the invention, is chosen to be similar to the excitation wavelength of a fluorophore to be used as a marker. Alternatively, light having a wavelength range including the excitation wavelength of the fluorophore may also be selected.
  • By bleaching the biological sample with light corresponding to or including the wavelength of the fluorophore it is achieved that the inherent fluorescence of the sample excited by that wavelength is destroyed. If, after bleaching according to the invention, the fluorophore-labeled marker is applied to the sample which is excited at this wavelength, the measurement of the fluorescence is thus no longer disturbed by the inherent fluorescence of the sample.
  • the bleaching according to the invention preferably comprises bleaching with light whose wavelength range comprises all excitation wavelengths of the markers used.
  • the bleaching can also take place in n substeps by the action of light with the excitation wavelength of a first marker, then by the action of light with the excitation wavelength of an ith marker and finally by the action of light with the excitation wave of the nth marker.
  • the duration of bleaching depends on the time required to lower the inherent fluorescence of the biological sample below a predetermined level. Conveniently, several bleaching cycles are provided, wherein the duration of the individual bleaching step is preferably between 1 and 60 minutes, more preferably between 5 and 45 minutes, particularly preferably between 10 and 30 minutes.
  • the number of bleaching cycles should be chosen such that the fluorescence inherent in the biological sample which emits at a given excitation wavelength is preferably at most 10%, more preferably at most 3%, most preferably at most 0.3%, based in each case on fluorescence intensity. This also applies if only one bleaching step is carried out.
  • fluorescence measurements should first be carried out in order to determine an indication of the number of bleaching cycles required and the duration of a bleaching step.
  • the method is suitable for the preparation of samples to be analyzed by luminometry, microscopy, fluorescence microscopy, confocal microscopy, multi-epitope-ligand mapping (MELK), flow cytometry or fluorescence activated cell sorting (FACS).
  • MELK multi-epitope ligand cartography
  • fluorophore-labeled marker used here is a synonym for the term "fluorescence-labeled marker”.
  • the method according to the invention can be used in the practical or theoretical disciplines of medicine for diagnostic purposes or for the identification of new pathogenetic or therapeutic target structures or for therapy / medication monitoring.
  • Fig. Ia is a fluorescence micrograph of skin tissue (63-fold
  • FIG. 1b is a graph of the variation of autofluorescence.
  • Fig. 2 fluorescence microscopic images of lymphocytes.
  • the fluorescence micrograph of a skin tissue sample shown in Fig. Ia was obtained prior to carrying out the method according to the invention. It is a strong autofluorescence to detect.
  • the fluorescence intensity in FIG. 1 b is shown as a function of the number of bleaching cycles.
  • the dashed curve corresponds to the region of a hair follicle (hair follicle) of the epidermis bounded by dashed lines in FIG. 1 a
  • Ia bounds the epidermis of the skin tissue sample.
  • the ordinate shows the fluorescence intensity
  • the abscissa represents the number of bleaching cycles
  • the letters b and f used therein for image pick-up after bleaching are before bleaching.
  • the sample was prepared as follows: Biopsies of the skin tissue of patients suffering from psoriasis as well as healthy skin tissue were taken under local anesthesia. The biopsies had a diameter of 6 mm. After removal, the biopsies were snap frozen. Of the frozen biopsies, 5- ⁇ m thick sections were made by means of a cryotome. The sections were then air-dried at room temperature for 10 minutes, then immersed in acetone at room temperature for 10 seconds, dried again and finally stored at -20 ° C. Immediately prior to performing the method of the invention, the sections were dipped for 10 minutes for rehydration in PBS, pH 7.4.
  • the section to be examined ie, skin
  • a sample was applied to a slide and applied to the stage of an inverse wide field fluorescence microscope (Leica DM IRE2 with a xenon fluorescent excitation lamp) equipped with fluorescence filters for fluorescein isothiocyanate (FITC) and phycoerythrin (PE).
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • PE phycoerythrin
  • the sample should be examined using fluorophore-labeled antibodies. As fluorophores FITC and PE were chosen. The sample was examined as follows:
  • the sample obtained according to section A. was admixed in a known manner with a solution containing FITC-labeled antibodies, incubated and the solution containing FITC-labeled antibodies not bound to the sample was removed. Subsequently, the FITC-labeled antibodies bound to binding sites (antigens) on the sample were excited at 488 nm by the action of light and the emitted fluorescence radiation was measured (see FIG. 2C for FITC-labeled antiCD ⁇ antibodies). The obtained photograph shows for the first time the light emitted by added FITC without being influenced by the autofluorescence of the sample). After measurement, the antibody-bound FITC molecules were bleached. After bleaching, the sample may be spiked with other FITC-labeled antibodies in several cycles as described above to determine additional antigens on the sample.
  • the sample was spiked with a solution containing PE-labeled antibodies, incubated, and the solution, the PE-labeled antibodies not bound to the sample contained, removed. Subsequently, the PE-labeled antibodies bound to binding sites (antigens) on the sample were excited at 546 nm by the action of light and the emitted fluorescence radiation was measured. Again, several cycles with different PE-labeled antibodies can be performed.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Molekülen, Molekülgruppen und/oder Molekülteilen in biologischen Proben, umfassend das zumindest einmalige Versetzen der Probe mit zumindest einem lichtemittierenden Marker und das Messen der Lichtemission des Markers. Dabei ist vorgesehen, daß vor der Messung der Lichtemission des Markers die der Probe inhärente Lichtemission mittels Bleichens verringert oder beseitigt wird.

Description

Verfahren zur Bestimmung von Molekülen oder Molekülteilen in biologischen Proben
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Molekülen, Molekülgruppen und/oder Molekülteilen in biologischen Proben, d. h. Proben menschlichen, tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs.
Es ist seit langem üblich, fiuorophor-markierte Antikörper für die histo- und cytochemische Untersuchung von Zellen zu verwenden. Die fluorophor-markierten Antikörper reagieren spezifisch mit Antigenen, die auf der Oberfläche bestimmter Zellen exprimiert werden. Zellen, die derartige Antigene tragen, sind somit über den Antikörper mit dem Fluorophor markiert. Werden die Fluorophore einem adäquaten Anregungslicht ausgesetzt, so werden die Fluorophore zur Emission von Photonen angeregt, die mittels eines Photodetektors gemessen werden kann.
Nach diesem Bindungs-Grundprinzip werden Fluoreszenz-Marker in Ankopplung nicht nur an Antikörper, sondern auch an andere Detektor-Moleküle wie Lektine, Nucleinsäuren, anorganische bzw. organische Moleküle, Sonden und sonstige Liganden verwendet, um biologische Proben zu analysieren. Die folgenden Ausführungen gelten daher sinngemäß nicht nur für Antikörper, sondern auch für analoge Anwendungen mit anderen Detektormolekülen wie Lektine, Nucleinsäuren, anorganische bzw. organische Moleküle bzw. Sonden und sonstige Liganden.
Biologische Zell- und Gewebestrukturen enthalten jedoch bereits genuin eine Vielzahl von Fluorophoren, deren Fluoreszenz die Meßergebnisse nachteilig beeinflussen kann. Dies ist insbesondere dann der Fall, wenn das Spektrum des Lichtes, das von den genuin vorhandenen Fluorophoren emittiert wird, das Lichtemissionsspektrum der Fluorophore der Markierungssubstanzen, beispielsweise der fluorophor-markierten Antikörper, überlagert.
Die genuine Fluoreszenz von Gewebe- oder Zellproben erweist sich beispielsweise bei der Untersuchung von Hautgewebeproben als besonders nachteilig. Es ist bekannt, daß Kollagen einer der endogenen Hautfluorophore ist (Sandby-Moller J, Thieden E, Philipsen PA, Heydenreich J, Wulf HC: Skin auto-fluorescence as a biological UVR dosimeter. Photodermal Photoimmunol Photomed 2004, 20: 33 - 40). Außerdem tragen Hautbestandteile wie reduziertes Nikotinamidadenindinucleotidphosphat, Flavine, Elastin und Melanin zu genuinen Hautfluoreszenz bei (Konig K, Rieman I: High-resolution multiphoton tomography of human skin with subcellular spatial resolution and picosecond time resolution. J biomed Opt 2003, 8; 432 - 439.) Es ist ebenso ein Phänomen bekannt, daß - anders als bei normaler Haut - Psoriasis-Plaques rote Autofluoreszenz aufgrund der Protoporphyrin-IX- Akkumulation in der verhornten Schicht zeigen (Bissonnette R, Zeng H, McLean DI, Schreiber WE, Roscoe DL, Lui H: Psoriatic plaque exhibit red autofluorescence that is due to Protoporphyrin IX. J Invest Dermatol 1998, 11 1 : 586 - 591).
Aus dem Stand der Technik sind Bildanalyseverfahren bekannt, mit denen sich die störende Autofluoreszenz weitgehend oder vollständig aus multispektralen Bildern entfernen lassen soll. Bei starker Autofluoreszenz der Proben oder ungünstiger Überlagerung der Autofluoreszenz mit der Fluoreszenz der zugesetzten Marker kann dies jedoch dazu führen, daß wesentliche Signalinformationen verloren gehen.
Aufgrund der genuinen Fluoreszenz von Hautgewebeproben war es somit bisher nicht oder unzureichend möglich, Hautgewebeproben diesbezüglich störungsfrei unter Einsatz von Fluorophoren zu untersuchen.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es soll insbesondere ein Verfahren zur Bestimmung von Molekülen, Molekülgruppen und/oder Molekülteilen in biologischen Proben angegeben werden, das insbesondere für die Untersuchung von Hautgewebe menschlichen oder tierischen Ursprungs sowie Blut- Präparationen geeignet ist.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen der Erfindungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 18. Nach Maßgabe der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Molekülen, Molekülgruppen und/oder Molekülteilen in biologischen Proben vorgesehen, umfassend das zumindest einmalige Versetzen der Probe mit zumindest einem lichtemittierenden Marker und das Messen der Lichtemission des Markers, wobei vor der Messung der Lichtemission des Markers die der Probe inhärente Lichtemission mittels Bleichens verringert oder beseitigt wird. Das Bleichen der Probe sollte vor dem Aufbringen des lichtemittierenden Markers durchgeführt werden.
Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, daß mittels eines Bleichschrittes die der Probe inhärente Lichtemission verringert oder beseitigt werden kann. Der Bleichschritt wird vor dem erstmaligen Aufbringen eines lichtemittierenden Markers durchgeführt. Aufgrund der Verringerung oder Beseitigung der inhärenten Lichtemission wird das Lichtspektrum, das nach Aufbringen des Markers von diesem emittiert wird, nicht von Lichtemissionen beeinflußt, die aus anderen Quellen als den Markern stammen. Dabei wurde in den Experimenten, die erfindungsgemäß durchgeführt wurden, überraschenderweise gefunden, dass die Minimierung bzw. Eliminierung von Autofluoreszenz und unspezifischer Fluoreszenz in Zell- und Gewebeproben einschließlich Gewebeschnitte vorteilhafterweise durch wiederholtes sanftes Bleichen ("Soft-Bleaching") erzielt werden kann, und insbesondere bei der Analyse von Haut-Gewebeproben von Nutzen ist; siehe auch die nachfolgenden Beispiele. Daher wird in dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Minimierung von Autofluoreszenz die biologische Probe einem wiederholten Soft-Bleaching, d.h. mit mindestens zwei Bleichschritten unterworfen bevor die Probe erstmals mit einem lichtemittierenden Marker versetzt wird. Ferner hat sich in den erfindungsgemäß durchgeführten Experimenten herausgestellt, dass das Bleichen vorzugsweise mit Licht durchgeführt wird, dessen Wellenlängenbereich die Anregungswellenlänge des bzw. der verwendeten Marker entspricht bzw. umfasst wie die Wellenlänge von 488 nm im Falle von FITC; siehe auch die nachfolgenden Beispiele. Wie in den Beispielen gezeigt, kann durch das erfindungsgemäße Verfahren die Autofluoreszenz und spezifische Fluoreszenz in Zell- und Gewebeproben innerhalb einer relativ kurzen Zeit mittels drei Bleichschritten mit Licht von zwei Wellenlängen erreicht werden, d.h. innerhalb von etwa zwei bis drei Stunden, so dass die Probe grundsätzlich keine inherente Fluoreszenz mehr aufweist, die bei der Anregungswellenlänge des zur Verwendung beabsichtigten lichtemittierenden Markers emittiert, und auf der anderen Seite die Probe insoweit intakt ist, dass sie mit lichtemittierenden Markern analysiert werden kann; siehe auch die Figuren 1 und 2.
Unter dem Begriff "inhärente Lichtemission" wird hier die Emission von Licht durch Bestandteile der Probe verstanden, ohne daß der Probe lichtemittierende Substanzen zugesetzt worden sind. Die der Probe inhärente Lichtemission umfaßt die Autofluoreszenz sowie die nicht-spezifische Fluoreszenz der Probe, aber auch alle anderen störenden Lichtemissionen wie beispielsweise Fluoreszenzen, die vom Beschichtungsmaterial eines Objektträgers oder von Substanzen, die zur Probenfixierung verwendet wurden, stammen.
Unter dem nachfolgend verwendeten Begriff "inhärente Fluoreszenz" wird hier die Emission von Licht durch Bestandteile der Probe verstanden, ohne daß der Probe fluoreszenzemittierende Substanzen zugesetzt worden sind. Die der Probe inhärente Fluoreszenz umfaßt die Autofluoreszenz sowie nichtspezifische Fluoreszenz der Probe, aber auch alle anderen störenden Lichtemissionen wie beispielsweise Fluoreszenzen, die vom Beschichtungsmaterial eines Objektträgers oder von Substanzen, die zur Probenfixierung verwendet wurden, stammen.
Unter dem Begriff "Bleichen" (auch als "Bleaching" bezeichnet) wird die Zerstörung der Fluorophore verstanden, die in der Probe enthalten sind. Das Zerstören der Fluorophore umfaßt insbesondere das Zerstören der fluorophoren Gruppen von Molekülen der Probe, die die inhärente Lichtemission oder inhärente Fluoreszenz bewirken.
Unter einer biologischen Probe werden hier Proben menschlichen, tierischem, pflanzlichen oder mikrobi eilen Ursprungs verstanden. Der Begriff "mikrobiell", der von dem Ausdruck
"Mikroben" abgeleitet ist, umfaßt das gesamte Spektrum von Mikroorganismen, einschließend von Bakterien, Viren, Pilzen, Ein- und Mehrzellern, Algen, Blaualgen sowie
Prionen (vgl. Pschyrembel, KHn. Wörterbuch, 259. Auflage, de Gruyter Berlin - New York
2002, S. 1063 + 1064): "Mikroben: s. (siehe) Mikroorganismen. - Mikroorganismen: auch Mikroben, Kleinlebewesen; Bakterien, Viren, Protozoen, Pilze (Kleinpilze, sog. Funguli, s.
Fungi)".). Bei der Probe kann es sich beispielsweise um Gewebe oder um Flüssigkeiten, wie
Blut, Lymphe oder Sekrete handeln, sowie daraus hergestellte Präparate handeln.
Beispielsweise können Blut-Präparationen, wie Zellpräparationen von mononukleären Zellen,
Lymphozyten, Monozyten, Granulozyten, Thrombozyten und Erythrozyten aus dem Blut, mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens untersucht werden. Die Erfindung ermöglicht somit die Untersuchung von Proben, die eine starke Autofluoreszenz aufweisen. Das Verfahren ist somit insbesondere für die Fluoreszenzanalyse von autofluoreszierenden Gewebeproben oder autofluoreszierenden Zellkulturen menschlichen oder tierischen Ursprungs geeignet. Die Fluoreszenzanalyse autofluoreszierender Zellkulturen umfaßt die Fluoreszenzanalyse von adhärenten Zellen als auch von Suspensionszellen. Das erfindungsgemäße Verfahren ist insbesondere für Fluoreszenzanalyse von menschlichen oder tierischen Hautgewebe geeignet.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird nachstehend in Bezug auf die Fluoreszenzanalyse näher erläutert. Dies soll jedoch keine Beschränkung des erfindungsgemäßen Verfahrens auf die hier angegebenen Beispiele der Fluoreszenzanalyse darstellen.
Die inhärente Fluoreszenz einer Probe wird erfindungsgemäß durch das Bleichen der Probe beseitigt oder verringert.
Das Bleichen wird so durchgeführt, daß die Bindungsstellen für die fluorophor-markierten Marker, die nach dem erfindungsgemäßen Bleichen auf die biologische Probe aufgebracht werden, nicht zerstört werden.
Das Bleichen der Probe sollte vor dem Aufbringen des fluorophor-markierten Markers durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Bleichen der Proben durchgeführt, indem die Probe mit Licht bestrahlt wird. Die Wellenlänge des Lichtes wird so gewählt, daß die funktionellen Gruppen von Molekülen der Probe, die deren inhärente Fluoreszenz verursachen, zerstört werden.
Im Fall der Fluoreszenzanalyse ist unter einem lichtemittierenden Marker ein fluorophor- markierter Marker zu verstehen. Fluorophor-markierte Marker umfassen beispielsweise fluorophor-markierte Antikörper, Lektine, Nukleinsäuren, Sonden und andere Bindungsmoleküle. Der fluorophor-markierte Marker kann jede Art von Fluorophor aufweisen, vorzugsweise ist das Fluorophor jedoch aus der Gruppe gewählt, die Fluoreszenz- Nanopartikel (Quantum Dots) und Fluorochrome umfaßt. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das Bleichen durchgeführt, bis die Signalstärke der inhärenten Fluoreszenz auf ein vorgegebenes Niveau verringert worden ist. Dazu kann beispielsweise die Probe dem Licht einer bestimmten Wellenlänge für einen vorgegebenen Zeitraum ausgesetzt werden.
Das erfindungsgemäße Bleichen kann mehrmals wiederholt werden. Dies ist insbesondere dann vorteilhaft, wenn nicht bekannt ist, welche Zeitdauer der Lichteinwirkung erforderlich ist, um die Signalstärke der inhärenten Fluoreszenz auf ein vorgegebenes Niveau zu verringern. In diesem Fall ist es bevorzugt, daß mehrere Bleichzyklen durchgeführt werden, wobei jeder Bleichzyklus -das Bleichen der Probe für eine vorgegebene Zeitdauer und - das Messen der Signalstärke der verbliebenen inhärenten Fluoreszenz umfaßt.
Zweckmäßigerweise wird nach Abschluß des Bleichens das Messen der Signalstärke der verbliebenen inhärenten Fluoreszenz durchgeführt.
Das zum Bleichen der Probe verwendete Licht wird vorzugsweise mittels der Anregungslichtquelle eines inversen oder aufrechten Fluoreszenzmikroskops erzeugt. Demnach kann es sich bei der Lichtquelle insbesondere um eine Quecksilberdampflampe, Halogenlampe, Xenonlampe, einen Laser, eine Leuchtdiode jeweils in Ein- oder Mehrzahl oder Kombinationen dieser handeln.
Die Wellenlänge des zum Bleichen verwendeten Lichtes wird in einer Ausführungsform der Erfindung so gewählt, daß sie der Anregungswellenlänge eines Fluorophors gleicht, das als Marker verwendet werden soll. Alternativ kann auch Licht mit einem Wellenlängenbereich gewählt werden, der die Anregungswellenlänge des Fluorophors umfaßt. Durch das Bleichen der biologischen Probe mit Licht, das der Wellenlänge des Fluorophors entspricht oder diese umfaßt, wird erreicht, daß die inhärente Fluoreszenz der Probe, die durch diese Wellenlänge angeregt wird, vernichtet wird. Wird nach dem erfindungsgemäßen Bleichen der fluorophor- markierte Marker auf die Probe aufgebracht, der bei dieser Wellenlänge angeregt wird, so wird die Messung der Fluoreszenz somit nicht mehr durch die inhärente Fluoreszenz der Probe gestört. Werden zwei oder mehr Marker mit verschiedenen Anregungswellenlängen verwendet, so umfaßt das erfindungsgemäße Bleichen vorzugsweise das Bleichen mit Licht, dessen Wellenlängebereich alle Anregungswellenlängen der verwendeten Marker umfaßt. Selbstverständlich kann das Bleichen auch in n Teilschritten durch Einwirkung von Licht mit der Anregungswellenlänge eines ersten Markers, anschließend durch Einwirkung von Licht mit der Anregungswellenlänge eines i-ten Markers und schließlich durch Einwirkungen von Licht mit der Anregungswelle des n-ten Markers erfolgen.
Die Zeitdauer des Bleichens hängt von der Zeit ab, die benötigt wird, um die inhärente Fluoreszenz der biologischen Probe unter ein vorgegebenes Niveau zu senken. Zweckmäßigerweise sind mehrere Bleichzyklen vorgesehen, wobei die Zeitdauer des einzelnen Bleich-Schrittes bevorzugt zwischen 1 und 60 min, stärker bevorzugt zwischen 5 und 45 min, besonders bevorzugt zwischen 10 und 30 min liegt.
Die Anzahl der Bleichzyklen sollte dabei so gewählt werden, daß die der biologischen Probe inhärente Fluoreszenz, die bei einer vorgegebenen Anregungswellenlänge emittiert, bevorzugt höchstens 10%, stärker bevorzugt höchstens 3%, am stärksten bevorzugt höchstens 0,3% beträgt, jeweils bezogen auf die Fluoreszenzintensität. Dies gilt auch, wenn nur ein Bleichschritt durchgeführt wird.
Zur Bestimmung der inhärenten Fluoreszenz einer Probe sollte vor der Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zunächst Fluoreszenzmessungen durchgeführt werden, um einen Anhaltspunkt für die Anzahl der notwendigen Bleichzyklen und die Dauer eines Bleichschrittes zu ermitteln.
Das Verfahren ist zur Vorbereitung von Proben geeignet, die mittels Luminometrie, Mikroskopie, Fluoreszenzmikroskopie, konfokale Mikroskopie, Multi-Epitope-Ligand- Kartographie (MELK), Durchflußzytometrie oder Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) analysiert werden sollen. Die Multi-Epitope-Ligand-Kartographie (MELK) wird unter anderem in DE 197 09 348 Al und EP 0 810 428 Al beschrieben. Der hier verwendete Begriff "fluorophor-markierter Marker" ist ein Synonym für den Begriff "fluoreszenz-markierter Marker".
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in den praktischen oder theoretischen Disziplinen der Medizin zu diagnostischen Zwecken oder zur Identifizierung neuer pathogenetischer oder therapeutischer Zielstrukturen oder zum Therapie-/Medikamenten-Monitoring eingesetzt werden.
Die Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. Dabei zeigen
Fig. Ia eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von Hautgewebe (63 fache
Vergrößerung);
Fig. Ib eine graphische Darstellung der Veränderung der Autofluoreszenz definierter
Areale der in Fig. Ia gezeigten Probe in Abhängigkeit von der Zahl der Bleichzyklen; und
Fig. 2 fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Lymphozyten. A) mit PBS inkubierte Zellen vor dem erfindungsgemäßen Bleich-Schritt; B) dieselben Zellen nach dem erfindungsgemäßen Bleich-Schritt. C) Fluoreszenzsignal der nachfolgenden Reaktion mit Fluorophormarkiertem Antikörper.
Die in Fig. Ia gezeigte fluoreszenzmikroskopische Aufnahme einer Hautgewebeprobe wurde vor Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten. Es ist eine starke Autofluoreszenz zu erkennen. Für zwei Bereiche der Aufnahme (in Fig. 1 a eingekreist) ist die Fluoreszenzintensität in Fig. Ib in Abhängigkeit von der Zahl der Bleichzyklen dargestellt. Dabei entspricht in Fig. Ib die gestrichelte Kurve dem in Fig. Ia mittels einer gestrichelten Linien umgrenzten Bereich eines Haarfollikels (Haarbalg) der Epidermis, während die in Fig. Ib gepunktete Linie dem in Fig. Ia mittels einer gepunkteten Linien umgrenzten Bereich der Dermis (= Lederhaut) entspricht. Die Strich-Punkt-Linie in Fig. Ia umgrenzt die Epidermis der Hautgewebeprobe. In Fig. Ib zeigt die Ordinate die Fluoreszenzintensität, während die Abszisse die Anzahl der Bleichzyklen, wobei die dort verwendeten Buchstaben b und f für Bildaufnahme nach dem Bleichen bzw. Bildaufnahme vor dem Bleichen stehen. Zu erkennen ist, daß die Signalstärke der Autofluoreszenz nach fünf Bleichzyklen deutlich verringert worden ist.
Probenherstellung
Die Probe wurde wie folgt hergestellt: Biopsien des Hautgewebes von Patienten, die an Psoriasis litten, sowie von gesundem Hautgewebe, wurden unter lokaler Betäubung entnommen. Die Biopsien hatten einen Durchmesser von 6 mm. Nach der Entnahme wurden die Biopsien schockgefroren. Von den gefrorenen Biopsien wurden 5 ?m starke Schnitte mittels eines Kryotoms gefertigt. Die Schnitte wurde anschließend 10 min bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet, dann bei Raumtemperatur 10 s in Aceton getaucht, erneut getrocknet und schließlich bei -20°C aufbewahrt. Unmittelbar vor Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wurden die Schnitte 10 min zur Rehydratisierung in PBS, pH 7,4, getaucht.
Bleichen und Fluoreszenzmessungen
Zur Durchführung der Bleichzyklen wurde der zu untersuchende Schnitt (d.h. Haut), der im folgenden als Probe bezeichnet wird, auf einen Objektträger aufgebracht und auf dem Objekttisch eines inversen Weitfeld-Fluoreszenzmikroskops (Leica DM IRE2 mit einer Xenon-Lampe zur Fluoreszenzanregung) aufgebracht, das mit Fluoreszenzfϊltern für Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Phycoerythrin (PE) ausgestattet war. Für die Fluoreszenzmessungen wurde eine CCD-Kamera (Apogee KX4) verwendet.
Die Probe sollte mittels Fluorphor-markierter Antikörper untersucht werden. Als Fluorophore wurden FITC und PE gewählt. Zur Untersuchung der Probe wurde wie folgt vorgegangen:
A. Beseitigen der inhärenten Fluoreszenz der Probe, die bei den Anregungswellenlängen von FITC und PE emittiert wird. Es wurden drei Bleichzyklen ausgeführt.
1.) Messen der inhärenten Fluoreszenz, wobei jeweils ein Bild mit Fluoreszenzfϊltersätzen für FITC und PE aufgenommen wurde. Die Belichtungszeit betrug 5 s (siehe Fig. 2 A für FITC); 2.) a) Bleichen der Probe mit Licht einer Wellenlänge von 488 nm Anregungswellenlänge von FITC) für 15 min; b) Bleichen der Probe mit Licht einer Wellenlänge von 546 nm für 15 min;
3.) Messen der inhärenten Fluoreszenz wie unter 1.); 4.) 10 min Warten;
5.) Messen der inhärenten Fluoreszenz wie unter 1.);
6.) a) Bleichen der Probe mit Licht einer Wellenlänge von 488 nm
(Anregungswellenlänge von FITC) für 15 min; b) Bleichen der Probe mit Licht einer
Wellenlänge von 546 nm für 15 min; 7.) Messen der inhärenten Fluoreszenz wie unter 1.); 8.) 10 min Warten; 9.) Messen der inhärenten Fluoreszenz; 10.) a) Bleichen der Probe mit Licht einer Wellenlänge von 488 nm
(Anregungswellenlänge von FITC) für 15 min; b) Bleichen der Probe mit Licht einer Wellenlänge von 546 nm für 15 min;
11.) Messen der inhärenten Fluoreszenz wie unter 1.).
Das Ergebnis ist in Fig. 2B für FITC gezeigt. Es ist zu erkennen, daß die Probe keine inhärente Fluoreszenz aufweist, die bei einer Anregungswellenlänge von 488 nm emittiert wird.
B. Bestimmen von Molekülen oder Molekülteilen der Probe unter Verwendung von FITC- markierten Antikörpern und PE-markierten Antikörpern.
Die gemäß Abschnitt A. erhaltene Probe wurde in bekannter Weise mit einer FITC-markierte Antikörper enthaltenden Lösung versetzt, inkubiert und die Lösung, die nicht an die Probe gebundene FITC-markierte Antikörper enthielt, entfernt. Anschließend wurde die an Bindungsstellen (Antigenen) auf der Probe gebundenen FITC-markierten Antikörpern bei 488 nm durch Einwirkung von Licht angeregt und die emittierte Fluoreszenzstrahlung gemessen (siehe Fig. 2C für FITC-markierte antiCDδ-Antikörper). Die erhaltene Aufnahme zeigt erstmals das von zugesetztem FITC emittierte Licht ohne Beeinflussung durch die Autofluoreszenz der Probe). Nach der Messung wurden die über die Antikörper gebundenen FITC-Moleküle gebleicht. Nach dem Bleichen kann die Probe in mehreren Zyklen in der vorstehend beschriebenen Weise mit anderen FITC-markierten Antikörpern versetzt werden, um weitere Antigene auf der Probe zu bestimmen.
Nach dem Zyklus mit FITC-markierten Antikörpern und dem Bleichen der an die Probe gebundenen FITC-Moleküle wurde die Probe mit einer Lösung, die PE-markierte Antikörper enthielt, versetzt, inkubiert und die Lösung, die nicht an die Probe gebundene PE-markierte Antikörper enthielt, entfernt. Anschließend wurden die an Bindungsstellen (Antigenen) auf der Probe gebundenen PE-markierten Antikörper bei 546 nm durch Einwirkung von Licht angeregt und die emittierte Fluoreszenzstrahlung gemessen. Auch hier können mehrere Zyklen mit verschiedenen PE-markierten Antikörpern durchgeführt werden.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Bestimmung von Molekülen, Molekülgruppen und/oder Molekülteilen in biologischen Proben, umfassend das zumindest einmalige Versetzen der Probe mit zumindest einem lichtemittierenden Marker und das Messen der Lichtemission des Markers, dadurch gekennzeichnet, daß vor der Messung der Lichtemission des Markers die der Probe inhärente Lichtemission mittels Bleichens verringert oder beseitigt wird, wobei das Bleichen vor dem Versetzen der Probe mit dem zumindest einen lichtemittierenden Marker durchgeführt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die der Probe inhärente Lichtemission Autofluoreszenz, unspezifische Fluoreszenz oder beides umfaßt.
3. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der lichtemittierende Marker Fluoreszenzlicht emittiert.
4. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Bleichen der Proben durch Einwirkung von Licht auf die Probe erfolgt.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlänge des Lichtes so gewählt wird, daß die funktionellen Gruppen der Probe, die deren inhärente Lichtemission verursachen, zerstört werden.
6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe aus der Gruppe ausgewählt ist, die menschliches, tierisches, pflanzliches und mikrobielles Gewebe umfaßt.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine Blutprobe ist.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das menschliche oder tierische Gewebe Hautgewebe ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Zell-oder Gewebe-Kulturmaterial ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der lichtemittierende Marker eine lichtemittierende Einheit aufweist, die aus der Gruppe gewählt ist, die Fluoreszenz-Nanopartikel (Quantum Dots) und Fluorochrome umfaßt.
11. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die lichtemittierende Einheit mit einem Antikörper, einem Lektin, einer Sonde und/oder einem anderen Liganden konjugiert ist.
12. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Bleichen mehrmals wiederholt wird.
13. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die der Probe inhärente Lichtemission auf eine vorgegebene Signalstärke verringert worden ist.
14. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Bleichen solange durchgeführt wird, bis die der Probe inhärente Lichtemission auf eine vorgegebene Signalstärke verringert worden ist.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß das zum Bleichen der Probe verwendete Licht mittels einer oder mehrerer Quecksilberdampflampen, Halogenlampen, Xenonlampen, Lasern, Leuchtdioden oder Kombinationen dieser erzeugt wird.
16. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe eine Blutpräparation menschlichen oder tierischen Ursprungs ist.
17. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe eine Hautprobe menschlichen Ursprungs ist.
18. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe Zell- oder Gewebe-Kulturmaterial menschlichen Ursprungs ist.
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