DE19903128C2 - Verfahren zur Herstellung von Ethylendiamintetraessigsäure-(2-Aminoethyl)2-Pyridyldisulfid - Google Patents
Verfahren zur Herstellung von Ethylendiamintetraessigsäure-(2-Aminoethyl)2-PyridyldisulfidInfo
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Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von
Ethylendiamintetraessigsäure-(2-Aminoethyl)2-Pyridyldisulfid (EPD) der allgemeinen
Formel
Die Herstellung dieser Verbindung ist schwierig. Die bisher beschriebenen
Synthesen sind nicht trivial oder gehen von teuren Ausgangsstoffen aus.
Bei einer Synthese (Ermacora, M. R., Delfino, J. M., Cuenod, B., Schepartz, A.,
Fox, R. O. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6383-6387) wird der Triethylester
der Ethylendiamintetraessigsäure mit oxidiertem Cystamin kondensiert, anschließend
der Ester verseift, das innere Disulfid reduziert und das entstandene Thiol mit
oxidiertem Pyridyldisulfid umgesetzt. Die Ausbeute bei dem beschriebenen Verfahren
beträgt weniger als 50%, zudem ist der als Ausgangsstoff verwendete Triethylester
extrem teuer.
Vorteilhaft für die Verwendung von EPD ist eine Reaktionsfolge, bei der zunächst der
Komplex aus EPD und einem geeigneten Metallion erzeugt und erst dann das er
haltene Chelat mit einem Protein umgesetzt wird. Geeignete Methoden zur Darstel
lung der Chelate wie etwa die komplexometrische Titration oder die Umsetzung mit
einem Überschuß an Metallion und anschließende Isolation durch Ionenaustausch
chromatografie sind bekannt. Nachteilig bei der komplexometrischen Titration ist die
prinzipielle Anwesenheit von Fremdstoffen. Die Ionenaustauschchromatografie um
geht diesen Mangel, ist aber insbesondere bei größeren Stoffmengen material
intensiv und apparativ aufwendig. Beide Methoden unterscheiden nicht zwischen
EPD und anderen Chelatbildnern, etwa nicht umgesetztem EDTA aus dem
Reaktionsansatz.
Es bestand deshalb die Aufgabe, ein möglichst einfaches Verfahren zur Herstellung
von EPD und zur Charakterisierung des Reaktionsablaufs zu entwickeln.
Dies gelingt erfindungsgemäß durch ein Verfahren, bei dem Salze der Ethylen
diamintetraessigsäure (EDTA) mit Pyridyldithioethanamin (PDEA) in einem Molver
hältnis von 1 Mol PDEA mit mehr als 3 Mol EDTA in Wasser bei einem pH-Wert von 5
bis 8 in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimids als Kondensationsmittel
umgesetzt werden und aus dem Reaktionsgemisch anschließend das EPD
abgetrennt und gereinigt wird.
Besonders geeignete Kondensationsmittel sind:
1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid (CMC) und
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC).
1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimid (CMC) und
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC).
Das Verfahren zur Herstellung von EPD wird zweckmäßig so gestaltet, daß das
Molverhältnis 1 Mol PDEA zu 5 Mol EDTA beträgt.
Als Salze der EDTA kommen vor allem Alkalisalze, insbesondere das Di-
Natriumsalz, in Frage.
Besonders günstig ist es, wenn die Umsetzung bei einem pH-Wert um 7 - zweck
mäßig bei Raumtemperatur - durchgeführt wird.
Die Abtrennung und Reinigung des EPD aus der Reaktionsmischung erfolgt am
besten durch reversed-phase Chromatografie.
Sie kann zweckmäßig so durchgeführt werden, daß ein alkyliertes Silicagel als
stationäre Phase benutzt, die Reaktionsmischung mit verdünnter Trifluoressigsäure
angesäuert und in diesem Zustand an die stationäre Phase gebunden und
anschließend mit einem Gemisch eines organischen Lösungsmittels mit verdünnter
wäßriger Trifluoressigsäure eluiert wird.
Das verwendete Lösungsmittel kann dabei Methanol, Ethanol, Propanol, Isopropa
nol, Acetonitril, Dimethylformamid oder Dimethylsulfoxid sein.
Vorteilhaft ist es, den Reaktionsumsatz durch hydrophobe Interaktionschromato
grafie zu verfolgen, wie sie an sich beispielsweise aus J. Org. Chem. 60 (1995)
Seiten 3924 bis 3927 bekannt ist.
EPD ist ein thiolreaktiver Chelatbildner und wird in dieser Eigenschaft zur ziel
genauen Einführung von Metallionen der Übergangsmetalle in biologische Makro
moleküle, insbesondere in Proteine, verwendet.
Ein ortsgerichteter Einbau in biologische Makromoleküle ist auf solche Spezies be
schränkt, die nur eine oder wenige reduziert vorliegende Thiolfunktionen besitzen.
Das ist oft bei Proteinen der Fall.
Eine typische Anwendung solcher Konjugate ist die Strukturaufklärung von Proteinen
oder von deren Komplexen mit anderen Naturstoffen mit Hilfe der Fenton-Reaktion
(Rana, T. M. und Meares, C. F. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 10578-10582;
Hayes, J. J. (1996) Biochemistry 35(37)-11931-11937; s. a. Ermacora u. a. 1992).
Dabei werden vorzugsweise Eisenionen vom EPD chelatisiert und mit Hilfe der
thiolreaktiven Komponente des EPD am Protein fixiert. Inkubiert man diese
Konjugate mit Wasserstoffperoxid und Ascorbinsäure, so werden Hydroxylradikale
frei die in einem geringen Diffusionsradius zu Spaltreaktionen an biologischen
Makromolekülen führen. Die Analyse der Spaltorte gibt dann Aussagen zur
räumlichen Anordnung der entsprechenden Makromoleküle. Die Technik ist
besonders geeignet zur strukturellen Charakterisierung von Komplexen aus
Proteinen und Nukleinsäuren, da in diesem Fall konventionelle Techniken wie die
chemische Quervernetzung nicht oder nur schwer anwendbar sind und zum anderen
die Spaltorte der Nukleinsäuren sehr einfach analysiert werden können.
Eine andere Verwendungsmöglichkeit von EPD oder Verbindungen dieser Klasse ist
die Fluoreszensmarkierung von biologischen Makromolekülen, insbesondere von
Proteinen. Das läßt sich durch Chelatisierung von Ionen der Lanthaniden, wie etwa
Europium, erreichen (Mukkala, V. M., Mikola, H., Hemmilä, I. (1989) Anal. Bioch. 176,
319-325).
Eine weitere Verwendungsmöglichkeit der Verbindung ist die radioaktive Markierung
von biologischen Makromolekülen mit radioaktiven Metallionen (Meares, C. F.,
McCall. M. J., Reardan, D. T., Goodwin, D. A., Diamanti, C. I., McTigue, M. (1984)
Anal. Bioch. 142, 68-78).
Die Erfindung soll an folgenden Ausführungsbeispielen beschrieben werden, ohne
darauf beschränkt zu sein.
Das Di-Natriumsalz der EDTA (200 mM in Wasser, pH 7) wurde mit PDEA (40 mM)
unter Verwendung von EDC (200 mM) umgesetzt. 4 ml einer solchen Mischung
wurden über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Eine HPLC-Analyse des
Gemisches zeigt nach der Reaktion ein komplettes Verschwinden des für PDEA
charakteristischen Peaks. Es entsteht das Kondensationsprodukt EPD, dessen
Retentionszeit wesentlich geringer ist (Abb. 1). Darin zeigen die gepunktete Linie:
Trennung des Reaktionsgemisches ohne Zusatz von EDC, die durchgezogene Linie:
Reaktionsgemisch nach der Kopplung.
Als Trennmedium der analytischen HPLC wurde eine Säule mit Phenyl-Superose
(Fa. Pharmacia) der Dimension 0,5 . 5 cm verwendet und mit 4 M NaCl in 100 mM
Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan pH 8.0 equilibriert. Proben zur Analyse wurden in
diesem Puffer zehnfach verdünnt und aufgetragen. Die Elution erfolgte für 5 min mit
demselben Puffer bei einer Flußrate von 0,5 ml/min, anschließend wurde ein linearer
Gradient von besagtem Puffer zu 10 mM Tris-(Hydroxymethyl)-Aminomethan pH 8.0
über 20 min zur Elution verwendet.
Zur präparativen Reinigung wurde das Reaktionsgemisch zehnfach mit 0,1%iger
wässriger Trifluoressigsäure verdünnt und in einer Säule der Dimension 1,5 . 10 cm
an Silicagel (Vydac 218 TP) gebunden. Die Säule wurde mit 10 ml wäßriger 0,1%iger
Trifluoressigsäure gewaschen; anschließend wurde das Produkt mit 25% Acetonitril
in 0,1% Trifluoressigsäure eluiert und fraktioniert aufgefangen.
Die Fraktionen des eluierten Materials wurden durch reduktive Freisetzung von 2-
Thiopyridon auf ihren Gehalt an thiolreaktiven Gruppen hin analysiert. Dazu wurde
eine geeignete Menge der jeweiligen Fraktion mit Dithiothreitol (DTT) (10 mM in
100 mM Natriumphosphatpuffer pH 8.0) gemischt und nach 5 min die Extinktion bei
343 nm bestimmt. Die Menge an EPD wurde mittels des Extinktionskoeffizienten für
2-Thiopyridon (ε 343 = 8.08 . 103 M-1cm-1) bestimmt.
Das Produkt wurde unter drei Aspekten charakterisiert:
- a) hinsichtlich seiner Fähigkeit zur Abspaltung von 2-Thiopyridon,
- b) hinsichtlich seiner Komplexbildung mit FeCl3,
- c) hinsichtlich seiner Masse durch Massenspektroskopie vor und nach Chelatisierung.
- d) Die Fähigkeit zur Reduktion wurde im obenstehenden Test überprüft.
- e) Zur Feststellung der chelatisierenden Eigenschaften wurde nach Abschluß der Reaktion ein 20%iger molarer Überschuß an FeCl3 zugegeben. Überschüssiges FeCl3 wurde durch Gelfiltration an Sephadex G10 in Wasser entfernt. Die Analyse selbst ist in Fig. 2 gezeigt. Darin zeigt die durchgezogene Linie das Elutions profil des Gemisches nach Zusatz von FeCl3. Der erste Peak nach 2,5 Minuten ist identisch mit dem Eisenchelat der EDTA, der zweite Peak nach etwa 7 Minuten entspricht dem Chelat des EPD. Nichtkomplexiertes EPD ist nicht mehr nach weisbar. Die gepunktete Linie zeigt zum Vergleich das Elutionsprofil einer nicht komplexierten Mischung.
- f) Die massenspektroskopische Analyse wurde sowohl mit dem chelatisierten Gemisch als auch mit dem gereinigten Produkt durchgeführt. Im Gemisch ließ sich eine Spezies mit einer Masse von 514.1 Atomare Masseneinheiten (AMU) nachweisen, das entspricht der Masse des Komplexes aus Eisen (III) und EPD. Die gereinigte Fraktion enthielt eine Spezies mit einer Masse von 461.1 AMU. Die berechnete Masse für EPD beträgt 461.2 AMU.
Die drei durchgeführten Prüfverfahren bestätigten das Vorhandensein beider
konstitutierender Molekülteile in einem Syntheseprodukt. Anhand der High
Performance Liquid Chromatography (HPLC)-Analyse läßt sich feststellen, daß
sowohl die Kopplung als auch die Chelatisierung quantitativ ablaufen und keine
Nebenprodukte auftreten.
Mit der beschriebenen Form der HPLC-Analyse wurde eine Möglichkeit gefunden,
sowohl den eigentlichen Ablauf der Kopplungsreaktion als auch die Umsetzung des
EPD in die Chelatform zu beschreiben. Vorteilhaft gegenüber der komplexometri
schen Verfolgung der Chelatisierungsreaktion ist der Wegfall von zugesetzten
Fremdstoffen. Ein wesentlicher Vorteil gegenüber der Ionenaustauschchromato
grafie ist die hohe Auflösung der Methode, die auch die Unterscheidung verschie
dener chelatisierender Verbindungen im Reaktionsansatz erlaubt.
Das Eisensalz der EDTA (200 mM in Wasser pH 7) wird mit PDEA (40 mM) unter
Verwendung von EDC (200 mM) umgesetzt. 4 ml einer solchen Mischung werden
über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die HPLC-Analyse des Gemisches zeigt
nach der Reaktion ein komplettes Verschwinden des für PDEA charakteristischen
Peaks und das Entstehen eines neuen Peaks, der dem Kondensationsprodukt
entspricht.
Das Di-Natriumsalz der EDTA (200 mM in Wasser pH 5) wird wie in Beispiel 1
umgesetzt. Die HPLC-Analyse des Gemisches zeigt nach der Reaktion ein
komplettes Verschwinden des für PDEA charakteristischen Peaks und das Entstehen
eines neuen Peaks, der dem Kondensationsprodukt entspricht.
Das Di-Natriumsalz der EDTA (200 mM in Wasser pH 7) wird wie in Beispiel 1
umgesetzt. Die Reaktion wird für 30 min bei 80°C durchgeführt. Die HPLC-Analyse
des Gemisches zeigt nach der Reaktion ein komplettes Verschwinden des für PDEA
charakteristischen Peaks und das Entstehen eines neuen Peaks, der dem Konden
sationsprodukt entspricht.
Das Di-Natriumsalz der EDTA (200 mM in Wasser pH 7) wird wie in Beispiel 1
umgesetzt. Die Reaktion wird für 20 h im Eisbad durchgeführt. Die HPLC-Analyse
des Gemisches zeigt nach der Reaktion ein komplettes Verschwinden des für PDEA
charakteristischen Peaks und das Entstehen eines neuen Peaks, der dem Konden
sationsprodukt entspricht.
Claims (5)
1. Verfahren zur Herstellung von
Ethylendiamintetraessigsäure-(2-Aminoethyl)2-Pyridyldisulfid (EPD),
dadurch gekennzeichnet, daß Salze der Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
mit Pyridyldithioethanamin (PDEA) in einem Molverhältnis von 1 Mol PDEA
mit mehr als 3 Mol EDTA in Wasser bei einem pH-Wert von 5 bis 8
in Gegenwart eines wasserlöslichen Carbodiimids als Kondensationsmittel
umgesetzt werden und aus dem Reaktionsgemisch anschließend das EPD
abgetrennt und gereinigt wird.
2. Verfahren zur Herstellung von EPD nach Anspruch 1, dadurch
gekennzeichnet, daß als Kondensationsmittel
1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl]carbodiimid (EDC) eingesetzt wird.
3. Verfahren zur Herstellung von EPD nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Molverhältnis 1 Mol PDEA zu 5 Mol EDTA beträgt.
4. Verfahren zur Herstellung von EPD nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeich
net, daß die Umsetzung bei einem PH-Wert um 7 durchgeführt wird.
5. Verfahren zur Herstellung von EPD nach Anspruch 1 bis 4, wobei die Abtrennung
aus der Reaktionsmischung und Reinigung mittels reversed-phase
Chromatografie erfolgt und ein alkyliertes Silicagel als stationäre Phase benutzt
wird, die Reaktionsmischung mit verdünnter Trifluoressigsäure angesäuert und in
diesem Zustand an die stationäre Phase gebunden und anschließend mit einem
Gemisch eines organischen Lösungsmittels mit verdünnter wäßriger
Trifluoressigsäure eluiert wird.
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|---|---|---|---|
| DE1999103128 DE19903128C2 (de) | 1999-01-27 | 1999-01-27 | Verfahren zur Herstellung von Ethylendiamintetraessigsäure-(2-Aminoethyl)2-Pyridyldisulfid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE1999103128 DE19903128C2 (de) | 1999-01-27 | 1999-01-27 | Verfahren zur Herstellung von Ethylendiamintetraessigsäure-(2-Aminoethyl)2-Pyridyldisulfid |
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|---|---|
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|---|---|---|---|---|
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1999
- 1999-01-27 DE DE1999103128 patent/DE19903128C2/de not_active Expired - Fee Related
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|---|
| J. Org. Chem. 60(1995) S. 3924-3927 * |
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