DD204849A5 - Verfahren zur herstellung von produkten fuer die behandlung von melanomen - Google Patents

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ricin
antibody
group
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Franz Jansen
Pierre Gros
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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Produkten, insbesondere fuer die Verwendung in Arzneimitteln zur Behandlung von Melanomen, enthaltend einen Wirkstoff,dessen Molekuel eine gebundene Ricin-A-Kette aufweist, durch kovalente Bindung vom Disulfid-Typ zu einem Human-Antimelanom-Antikoerper, gekennzeichnet dadurch, dass man die Ricin-A-Kette, repraesentiert durch die Formel RASH, mit einem Antikoerperderivat AC der Formel AC-S-S-X, in der X einen aktiven Rest darstellt, reagieren laesst.

Description

23 8 9 8 3 1 Berlin, den 27, 8. 82
AP A 61 K/238 983/1 60 694 11/20
Verfahren zur Herstellung von Produkten zur Behandlung von Melanomen
Anwendungsgebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von nützlichen Produkten für die Behandlung von Melanomen.
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen
In den früheren französischen Anmeldungen Nr, 78/27838 vom 28» September 1978 und der Zusatzanmeldung Hr* 79/24655 vom 3» Oktober 1979 hat die Anmelderin die Herstellung von antxcancerogenen Produkten beschrieben. Diese Konjugate wurden durch Kupplung, durch kovalente Bindung der Ricin-A-Kette zu einer Protein-Struktur wie einem Antikörper, einem Immungiobulin oder einem Inununoglobulin-Fragment erhalten und sind imstande, selektiv ein gegebenes Antigen an der Oberfläche von Trägerzellen, die man treffen will, zu erkennen, wie von cancerogenen Zellen. Die wichtigste Eigenschaft dieser Konjugate ist die spezifischer cytotoxischer Mittel für bestimmte Zielzellen,
Die Verwendung der gegen die Antigene der Differenzierung cancerogener Zellen gerichteten Antikörper hatte bereits Konjugate erbracht, die eine bemerkenswerte Spezifität gegenüber den Zielzellen aufweisen, Die Charakterisierung der gebundenen Antigene bei cancerogenen Zellen und die Herstellung der gegen die Antigene gerichteten monoclonalen Antikörper gestatten es, Konjugate ins Auge zu fassen, die eine gesteigerte Spezifität gegenüber den Trägerzellen dieser
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Antigene aufweisen
Ziel der Erfindunp
Ziel der Erfindung ist die Bereitstellung neuer, als Arzneimittel verwendbarer Produkte, vorzugsweise für die Behandlung von Melanomen»
Darlegung des Wesens der Erfindung
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die konjugierten Produkte ausgehend von der Ricin-A-Kette und einem monoclonalen Human-Antimelanom-Antikörper herzustellen,
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Man versteht unter Kon.jugaten künstliche gemischte Moleküle, in denen die Ricin-A-Kette durch eine kovalente Bindung vom Disulfid-Typ zu einem Human-intimelanom-Antikörper gebunden ist und die fähig sind,selektiv ein an cancerogene Zellen gebundenes Antigen zu erkennen.
Die Herstellung der reinen Ricin-A-Kette ist in den früheren Patenten beschrieben. Die Herstellung der gegen Human-Melanome gerichteten monocionalen Antikörper wurde bereits in der wissenschaftlichen Literatur erwähnt (man kann sich insbesondere beziehen auf "Proceedings of the national Academy of Sciences 77 (4), 2183-7, 1980).
Um die !Conjugate zu erhalten ist es notwendig, daß jedes der zur Kupplung vorgesehenen Proteine mindestens ein Schwefelatom trägt, das natürlicherweise fähig ist oder künstlich befähigt wurde, die gesuchte Desulfidbindung auszubilden.
Die Ricin-A-Kette weist von Hatur aus ein einziges Schwefelatom auf, das die gewünschte Kupplung,gestattet. Ea ist dasjenige der Thiolgruppe, die der Cystein-Rest der A-Kette enthält und das für die Bindung dieser Α-Kette an die B-Kette im vollständigen Toxin sorgt.
Die Antimelanom-Antikörper enthalten weder eine freie Thiol-IPunktion noch andere Schwefelatome, die für die Kupplung geeignet sind und dazu verwendet werden können. Bs wird deshalb vorgesehen, ein oder mehrere geeignete Schwefelatome künstlich in das Immunoglobulinmolekül einzuführen, die später mit einem oder mehreren Molekülen der Ricin-A-Kette die Disulfid-Bindung ausbilden.
Rrfindungsgemäß wird die Herstellung des Konjugäts in Anwesenheit der Träger-Ricin-A-Kette mittels ihrer freien
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Q q Q ο ι _ 3 _
SH-Gruppe mit dem Antikörper durchgeführt, in den die SH-Gruppe künstlich in aktiver Form eingeführt wurde, insbesondere in Form eines gemischten Disulfids mit einem annehmbaren organischen Schwefelradikal.
Die Herstellung des Korgugats kann durch das folgende Schema dargestellt werden:
RA - SH + AC - S - S - Z ^ RA - 3 - 3 - AC + XSH
in dem
- RA die Ricin-A-Kette,
- AC den Antikörper und
- Σ das aktivierende Radikal darstellen.
Die durch ein aktives Schwefelatom substituierten Antikörper werden, ausgehend von dem Antikörper selbst, mit Hilfe eines Reaktionspartners erhalten, der ein freies Schwefelatom trägt; gemäß dem Schema:
. ' AC + Y-R- S -S-X ± AC-R-S-S-X
in dem
- AC den Antikörper, darstellt,
- Y eine Funktion repräsentiert,
die die kovalente Bindung des Reaktionspartners an das Protein gewährleistet,
- R eine Gruppierung darstellt, die gleichseit
die Substituenten Y und —3-3-2! tragen kann
- Σ das aktivierende Radikal darstellt.
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•c
Die funktionelle Gruppe Y ist befähigt, sich in kovalenter Weise mit irgendeiner Punktion durch die Seitenketten der entsprechenden Aminosäuren des au substituierenden Proteins au verbinden. Unter diesen sind die imino-Sndgruppen des in dein Protein enthaltenen Lysyl-Restes besonders bevorzugt". In diesem Fall kann Ί insbesondere sein:
- eine Carboxylgruppe, die sich mit einer Aminfunktion des Proteins in Anwesenheit eines Kupplungsinittels, wie Carbodiimid und insbesondere ein in Wasser lösliches Derivat, wie Ethyl-1-(Diethylamino-3-propyl)-3-carbodiiinid, verbindet,
- ein Carboxysäurechlorid, das geeignet ist, direkt mit den Aminfunktionen zu reagieren, um diese zu acylieren,
- ein aktiver Ester, wie ein ortho- oder para-, liitro-
oder Dinitrophenylester oder auch ein N-Hydrosysucciniinidester, der direkt mit den Aminfunktionen reagiert, um diese zu acylieren,
- ein inneres Anhydrid einer Carboxyldisäure wie Bernsteinsäureanhydrid, das spontan mit den Aminfunktionen reagiert, um die Amid-Bindung auszubilden,
- eine Imideester-GruiDpierung
in der R1 eine Alkylgruppe darstellt, die mit den Amin-
gruppen des Proteins in der folgenden Weise reagiert:
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— 5 —
Prot - IiH0 + ¥ - R0 ^- Prot HH-C- R.
R1O
X stellt eine funktioneile Gruppe dar, die fähig ist, mit einem freien TMolrest zu reagieren. Insbesondere kann X eine eventuelle substituierte P-,ridyl-2- oder Pyridyl-4-Gruppe darstellen, substituiert durch ein oder mehrere der Reste Alkyl, Halogen oder Carboxyl. X kann auch eine Pheny!gruppe bedeuten, die vorzugsweise durch eine oder mehrere Nitro- oder Carboxylgruppen substituiert ist. Schließlich kann X auch eine Alkoicycarbony!gruppe wie die Methosycarbonylgruppe' sein.
Der Rest R kennzeichnet jedes Radikal, das befähigt ist, gleichzeitig die Substituenten Y und 3—S-X au tragen. Er soll so gewählt werden, daß er nicht !Punktionen enthält, die geeignet sind, sich im 'Verlauf der späteren Reaktionen mit den verwendeten Reaktionspartnern und den synthetisierten Produkten umzuwandeln. Die Gruppe R kann insbesondere eine Gruppe -(CH2) sein, wobei η zwischen 1 und 10 bedeutet, oder auch eine Gruppe
R3--
CH-
R^ darstellen,
in der E^ Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen ist und R-, kennzeichnet einen Substituenten, der gegenüber den später verwendeten Reaktionspartnern inert ist, wie eine Garbamatgruppe
- UH - Q - OEco
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1 .β.
in der R- eine gerade oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellt, insbesondere die tert. Butylgruppe.
Die Reaktion zwischen der Verbindung Y-R-S-S-X und dem Immunoglobulin wird in homogener flüssiger Phase, meistens in Wasser oder einer Pufferlösung, durchgeführt. Wenn es die Löslichkeit der Reaktionspartner erfordert, ist es möglich, dem Reaktionsmilieu bis zu 20 Vol.,-% eines mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittels hinzuzufügen, z* 3« einen Alkohol, insbesondere tert« 3utanol,
Die Reaktion wird bei Umgebungstemperatur, innerhalb einer variablen Zeitdauer von einigen Stunden bis zu 24 Stunden., durchgeführt. Daraufhin werden mittels Dialyse die Produkte mit niedriger Molekularmasse entfernt, insbesondere die Überschüsse der Reaktionspartner. Dieses Verfahren gestattet es eine Anzahl von Substituentengruppen pro Mol Protein einzuführen, und zwar zwischen 1 und 5, wenn das Protein ein Immunoglobulin der Klasse G ist und zwischen 1 und 15, wenn das Protein ein Immunoglobulin der Klasse M ist.
Unter Verwendung dieser Verbindungen wird die Kupplung mit der Ricin-A-Kette in Anwesenheit einer wäßrigen Lösung der zwei Proteine bei einer Temperatur vollzogen, die 30 C nicht übersteigt und innerhalb einer variablen Zeitdauer von einigen Stunden bis zu einem Tag. Die erhaltene Lösung wird zwecks entfernung der Produkte mit niedriger Molekularmasse dialysiert, danach kann das Konjugat nach verschiedenen bekannten Methoden gereinigt werden.
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S - 6a Au sführunqsbeispiel
Die Erfindung wird nachstehend an einem Beispiel näher erläutert«
Das folgende Beispiel gestattet es, die Erfindung besser
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zu verstehen, ohne ihren Bereich einzuschränken*
Beispiel 1
Kon.jugat, das ausgehend τοπ einem durch eine aktive Disulfid-Gruppe und die Ricin-A-Kette substituierten Human-Ant imelanom-Antikörper (gegen das Antigen P 97 gerichteten Antikörper) erhalten wurde.
a) Huinan-Antimelanom-Antikörper (anti P 97)
Dieser Antikörper wurde nach der in Proceedings of National Academy of Sciences 1980, 77, (4), 2183-7 beschriebenen Methode erhalten. Sr wird einer Hochreinigung durch Dialyse an PSS-Puffer unterzogen (10 ml Phosphat, 140 mM Fatriumchlorid, pH: 7,4).
fr) Ricin-A-Kette
Die Ricin-A-Kette v/urde ebenso hergestellt und gereinigt, wie in den früheren Patentanmeldungen der Anmelderin beschrieben (Patent Er. 78 27 838 und Susatzpatent Nr. 79 24 655).
c) Aktivierter Human-Antimelanom-Antikörper
Zu 0,5 ml einer Lösung von 20 mg/ml (Pyridyl-2-disulfanyl)-3-Propionsäure in tert. Butanol fügt man 0,2 tnl einer Lösung von 60 mg/ml Ethyl-1-(dimethylamino-3-propyl)· 3-carbodiimid und läßt 3 Minuten bei Umgebungstemperatur stehen.
Man fügt 30 ul der auf diese :<veise erhaltenen Lösung zu 1,66 ml einer Antiraeianoia-Antikörper-Losung ,von 2,4 mg/ml in PBS-Puffer« Die Inkubation wird innerhalb
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von 20 Stunden bei 30 0G durchgeführt.
Anschließend dialysiert man die Lösung fortlaufend während 3 Tagen an 21 Liter PBS-Puffer bei 4 0G. Man erhält auf diese Weise 4 mg des aktivierten Antikörpers von einer Konzentration von 2,3 mg/ml.
Durch spektrophotometrische Gewiciitsbestimmung bei 343 nra von freiem Thion-2-pyridin durch Austausch mit reduziertem Glutathion erhält man einen Antikörper, der 2,6 aktivierte Gruppierungen pro Mol Antikörper enthält.
d) Kon.jugat
Zu 1,3 ml einer Lösung aktiven Antikörpers in PBS-Puffer (Konzentration 2,3 mg/ml, was 3 mg an aktivem Antikörper entspricht), fügt man 0,52 ml einer Ricin-A-Kette-Losung des gleichen Puffers (Konzentration 5,3 mg/ml) und f Ü3 durch φ
und fuhrt die Inkubation während 20 Stunden bei 25 G
Jüan Chromatograph!ert die Reaktionsmischung über eine Gelkolonne von Sepha&es G 100. In. jeder Fraktion bestimmt man die Antikörper-Konzentration durch Spektrophotometrie bei 280 mn und die Konzentration der Ricin-A-Kette durch ihre Fähigkeit, die Proteosynthese zu inhibieren, gemessen an einem acellulären System.
Man vereint die identifizierten Fraktionen, die das Konougat enthalten und erhält auf diese Weise ungefähr 1 mg Konjugat mit einer Konzentration von 0,2 mg/ml.
Die durchgeführten analytischen Bestimmungen zeigen, daß die Lösung 50 mg/ml biologisch aktive A-Kette enthält, das sind ungefähr 1,4 Mol Α-Kette pro mol Antikörper.
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Bine durch Cytofluorometrie durchgeführte Untersuchung zeigte außerdem, daß der verwendete Antiinelanom-Antikörper, der entsprechende aktivierte Antikörper und das Konjugat dieser Antikörper mit der Ricin-A-Kette eng benachbarte Fluoreszenz-Histogramme aufweisen, die bestätigen,, daß der Antikörper im Verlauf der Aktivierungsreaktion und der Kupplung, der er unterworfen wurde, keine wesentliche Veränderung erfahren hat, und ^insbesondere, daß er seine I?ähigkeit behalten hat, sogar in der Mitte des Konjugats das Antigen P 97, gegen das er gerichtet ist, zu erkennen.
Das zuvor hergestellte erfindungsgemäße Konjugat wurde in bezug auf seine biologischen Eigenschaft en ;.unt ersucht, insbesondere auf seine anticancerogene Wirkung.
1) Inhibierung; der Proteosynthese
Die grundlegende biologische Eigenschaft der Ricin-A-Kette ist die Inhibierung der cellulären Proteosynthese durch Veränderung der Ribosom-Untereinheit 60 S.
Man hat hier ein cellulares Modell verwendet. Der Test mißt die Wirkung des untersuchten Stoffes über die Inkorpor Seilen in Kultur.
14 über die Inkorporation von C-iiencin in cancerogene
Die verwendeten Zellen gehören zum Zellstamin M 1477, der seinerseits von einem Human-Helanom abstammt, das das Antigen P 97 trägt. Diese Zellen werden nach Trypsination mindestens 24 Stunden vorihkubiert, um die Rees:- pression der Antigene von der eventuell veränderten Oberfläche zu ermöglichen. Nach Zusatz der üntersuchungssubstanz führt man eine neue Inkubation durch, Gegen
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Ende der Inkubation stellt man den Anteil der Inkorporation von ^C-Leucin durch die in dieser Weise "behandelten Zellen fest.
Diese Messung wird nach einer Technik durchgeführt, die an die in "Journal of Biological Chemistry 1974, 249 (11), 3557-62" beschriebene angepaßt wurde, sinter Verwendung von
1A 'C-LeiUcin als Tracer für die Bestimmung des Anteils der
Proteosynthese. Die Bestimmung der inkorporierten Radioaktivität wird hier über die durch Filtration isolierten vollständigen Zellen vorgenommen·
Ausgehend von diesen Bestimmungen kann man die vorliegenden Verhältnisse von Wirkung/Dosis als Kurven aufzeichnen, auf der Abszisse die Konzentration der untersuchten Sub-
14-
stanzen und auf der Ordinate die Inkorporation von C-Leucin, ausgedrückt im prozentualen Verhältnis der Inkorporation von Versuchszellen in Abwesenheit der zu untersuchenden Substanz*-,
Man kann auf diese Weise für jede untersuchte Substanz die Konzentration bestimmen, die 50 % der Inkorporation von ^G-Leiicin inhibiert oder "Inhibie: ("concentration inhibitrice 5O":CI5O).
von ^G-Leiicin inhibiert oder iSInhibierungskonzentration 5On
Die mit dem hergestellten Konjugat in dem vorhergehenden Beispiel (ITHH) erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 1 dargestellt. In dieser Figur sind ebenfalls die Kurven dargestellt, die in entsprechender Weise mit Riein (R), der Ricin-A-Kette (AR) und einem Konjugat Ricin-A-Kette/ Antikörper-Ajiti-Dinitropheny!radikal (DBT) (DS 10) erhalten wurden,- wobei das letztgenannte Konjugat keine Affinität au den Testzellen aufweist.
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lan kann anhand dieser Figur feststellen, daß das vorliegende untersuchte Konjugat eine hohe cytotoxische Aktivität auf v/eist (CI 50 = 5 . 1O~9 M), u: als diejenige der Ricin-A-Kette.
auf v/eist (CI 50 = 5 . 10""·5 M), ungefähr 400 mal stärker
Andererseits hat das Konjugat Anti-DHP (DS 10)keine wirkung auf die Zellen H 1477 bis zur höchsten Versuchskonzentration (10 M). Dagegen erweist sich das gleiche Konjugat DS 10 als cytotoxisch mit einer CI 50 von nahe 10 J M, wenn vorher in Anwesenheit der gleichen Zellen M 1477 künstlich die DHP-Radikale eingebracht wurden. Diese zwei letzten Schlußfolgerungen veranschaulichen den spezifischen Charakter dsr cyt ο toxischen Aktivität des Kon.jugats 12HM.
2. Inhibierung; der Koloniebildung;
Die Kultursellen des Melanoms M 1477 werden von ihrem Träger durch eine Versen-Lösung (PBS-Puffer, enthaltend Ethylendiamintetraessigsäure) oder durch Tr^npsination abgelöst. Diese Zellen werden dann in einem Verhältnis von 2.10' Zellen pro Gefäß in Petrischalen von 5 cm Durchmesser zur Kultur unter Verwendung des folgenden iiährmediums angesetzt:
Medium RPIiH 164Ο (Merieuz), zusätzlich Glutamin ZmM.f Ilatriumbikarbonat 2 g/l, 15 % inaktiviertes Fötalserum vom Kalb (Seromed) und Antibiotika (Penicillin, Streptomycin und Amphotericin 3).
!Jach 24 Stunden werden die Zellen mit den verschiedenen Konzentrationen des zu untersuchenden Konjugats behandelt,
Vergleichsweise vmrde dieselbe Versuchsserie einerseits mit Ricin, andererseits mit der Ricin-A-Kette und schließ-
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238983 1
- 12 -
lieh, mit einem' nicht spezifischen Konjugat dieses Zeil- Stammes durchgeführt (Konjugat zwischen' der Ricin-A-Kette und einem Äntikörper-Anti.DliP; DS 10).
Mach weiteren 24 Stunden wird das Kulturmedium entfernt und durch frisches ersetzt, das frei von allen cjtοtoxischen Substanzen ist.
10 bis 15 Tage später wird die Anzahl der Kolonien, die sich gebildet haben, nach Anfärben mit einer Kristallviolett-Lösung mittels eines automatischen Zahlgerätes für Kolonien bestimmt (System Artek 880).
Diese Methode gestattet den ilachweis einer so geringen Menge, wie von 10 lebensfähigen Zellen pro Gefäß, was anhand von Kontrollkulturen bestätigt werden konnte. 3s wurde auf die gleiche Art und V/eise dargelegt, -daß die Bildung der Kolonien streng proportional der Initialkonzentration der Zellen ist, zumindest im Bereich von 10 bis 10' Zellen pro nhk»
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Figur 2 dargestellt, bei der auf der Ordinate in logarithmischer Teilung die Anzahl der Kolonien pro Gefäß und auf der Abszisse die Konzentration des Produkts aufgetragen wurden, Die Versuche wurden für Ricin (S), die Ricin-A-Kette (AR) sowie für das erfindungsgemäße Konjugat-Produkt (IiTHM) durchgeführt.
Das Kon.jugat TTHM weist eine hohe Aktivität auf, da die letzte Melanomzelle bei einer Konjugatkonzentration von
-9 ungefähr 2 - 10 M abgetötet wird. Diese Konzentration ist
—9 völlig vergleichbar mit der von Riein (1 -*-10 M), während
- 13 -
3UUGi982*ü32ü9i
60 o94 11
23 8 9 83 I-«-
man bei der Riein-A-Kette bis 1O"°M gehen muß um die gleiche Wirkung zu erzielen.
Man kann ebenfalls feststellen, daß das Kon,jugat DS 10 keine Aktivität bis zu 2.10" M als höchster Konzentration, bei der es getestet v/urde, aufweist.
Die Schlußfolgerungen aus diesen "Versuchen bestätigen völlig diejenigen aus der Inhibierung der Proteosynthese.
Die erfindungsgemäß hergestellten Konjugate besitzen demnach eine starke spezifische Wirkung gegenüber Zellstämmen von Human-Melanomen. Sie können daher izider Human-Therapie zur Behandlung von Melanomen und gegebenenfalls anderen krankhaften, caneerogenen oder nicht cancerogenen Zuständen verwendet v/erden, "bei denen eine Sensibilität gegenüber den verwendeten Antikörpern besteht.
Die Konjugate sind für eine Anwendung auf dem V/eg der Injektion vorgesehen. Sie können entweder allein oder in Verbindung mit der Behandlung anderer krankhafter cancerogener Zustände eingesetzt werden, insbesondere im Zusammenhang mit immunodepressiven Medikamenten, um dis natürliche Iramunreaktion des Patienten gegenüber dem Fremdprotein, das das Konjugat für einen Organismus darstellt, aufzuhalten bzw. zu dämpfen.
Um eine totale Eliminierung cancerogener Zellen zu erreichen, sollte die Behandlung mit einer ausreichenden Dosis an Konjugat durchgeführt werden und die Dauer sollte sich in jedem Fall nach dem Patienten und der Uatur der zu behandelnden Erkrankung richten.
3UUG.1982*ü32ü9i

Claims (1)

  1. 238983 1
    Iifrfindungsanspruch
    Verfahren zur Herstellung von Produkten, insbesondere für die Verwendung in Arzneimitteln zur Behandlung von Melanomen, enthaltend einen Wirkstoff, dessen Molekül eine gebundene Ricin-A-Kette aufweist, durch kovalente Bindung vom Diaulfid-Typ zu einem Human-Antimelanom-Antikörper, gekennzeichnet dadurch, daß man die Ricin-A-Kette, repräsentiert durch die Pormel EASH, mit einem Antikörper-Derivat AG der Formel AC-S-S-X, in der X einen aktiven Best darstellt, reagieren läßt.
    Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß der Rest X eine Gruppierung darstellt, die fähig ist, mit einem freien '!hiolrest zu reagieren, insbesondere eine gegebenenfalls substituierte Pyridyl-2- oder Pyridyl—4-&ruppe, eine Phenylgruppe oder eine Alkoxycarb onylgrup pe.
    Hienu_2__iai8ii Zeichnungen
    3UUli1982*O32()91
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