DE19937264A1 - F¶v¶-Antikörper-Konstrukte - Google Patents

F¶v¶-Antikörper-Konstrukte

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft F v -Antikörper-Konstrukte mit Bindungsstellen für einen CD16-Rezeptor und ein CD30-Oberflächenprotein, wobei sich die F v -Antikörper-Konstrukte eignen, eine Regression von Morbus Hodgkin zu induzieren. Ferner betrifft die Erfindung für solche F v -Antikörper-Konstrukte kodierende DNAs sowie ein Verfahren zur Herstellung der F v -Antikörper-Konstrukte und ihre Verwendung.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft FV-Antikörper-Konstrukte, die eine Regression von Morbus Hodgkin induzieren können, für solche FV-Antikörper-Konstrukte kodierende DNAs sowie ein Verfahren zur Herstellung der FV-Antikörper-Konstrukte und ihre Verwendung.
Natürliche Antikörper weisen vier variable Domänen, zwei VH- und zwei VL-Domänen, auf. Die variablen Domänen dienen als Bindungsstellen für ein Antigen, wobei eine Bindungsstelle aus einer VH- und einer VL-Domäne ausgebildet ist. Natürliche Antikörper weisen zwei gleiche Bindungsstellen auf, d. h. sie erkennen ein Antigen und werden daher auch als monospezifisch bezeichnet. Künstliche Antikörper können auch zwei verschiedene Bindungsstellen aufweisen, d. h. sie erkennen dann zwei Antigene und werden entsprechend als bispezifisch bezeichnet. Ein Beispiel solcher Antikörper ist jener, der den FcyIIIA Rezeptor (CD16) von natürlichen Killerzellen (NK- Zellen) und das Oberflächenprotein CD30 von Morbus Hodgkin- Zellen erkennt. Mit diesem Antikörper (bimAbHRS-3/A9) können NK-Zellen aktiviert und gegen Morbus Hodgkin-Zellen ausgerichtet werden, wodurch eine Regression von Morbus Hodgkin induziert wird (vgl. Hartmann, F. et al., Blood 89 (1997), 2042). Andererseits hat sich gezeigt, daß bimAbHRS- 3/A9 nur schwer herstellbar bzw. reinigungsfähig ist. Darüber hinaus hat sich gezeigt, daß bimAbHRS-3/A9 bei vielen Patienten unerwünschte Immunreaktionen hervorruft.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, einen Antikörper bereitzustellen, mit dem eine Regression von Morbus Hodgkin induziert werden kann, wobei vorstehende Nachteile vermieden werden.
Erfindungsgemäß wird dies durch die Gegenstände in den Patentansprüchen erreicht.
Die vorliegende Erfindung beruht auf den Erkenntnissen des Anmelders, daß ein FV-Antikörper-Konstrukt, das Bindungsstellen für einen CD16-Rezeptor und ein CD30-Oberflächenprotein aufweist, eine Regression von Morbus Hodgkin induzieren kann, wobei die Lyse der Tumorzellen stärker ist als mit bimAbHRS- 3/A9. Ferner hat er erkannt, daß ein solches FV-Antikörper- Konstrukt in großen Mengen und hoher Reinheit hergestellt werden kann. Desweiteren zeichnet sich das FV-Antikörper- Konstrukt dadurch aus, daß es keine Teile enthält, die zu unerwünschten Immunreaktionen bei Patienten führen können.
Erfindungsgemäß werden die Erkenntnisse des Anmelders genutzt, ein FV-Antikörper-Konstrukt bereitzustellen, das Bindungsstellen für einen CD16-Rezeptor und ein CD30- Oberflächenprotein aufweist.
Der Ausdruck "FV-Antikörper-Konstrukt" weist auf ein Antikörper-Konstrukt hin, das variable Domänen, nicht aber konstante Domänen aufweist. Als variable Domänen liegen insbesondere Bindungsstellen für einen CD16-Rezeptor und ein CD30-Oberflächenprotein vor.
Der Ausdruck "Bindungsstelle" weist auf eine VH- und eine VL- Domäne hin, mittels derer das FV-Antikörper-Konstrukt an einen CD16-Rezeptor bzw. ein CD30-Oberflächenprotein binden kann.
Der Ausdruck "CD16-Rezeptor" umfaßt einen CD16-Rezeptor jeglicher Art und Abstammung. Beispielsweise kann der CD16- Rezeptor von NK-Zellen, Makrophagen oder aktivierten Monocyten stammen. Auch kann der CD16-Rezeptor in Wildtyp- oder veränderter Form vorliegen, wobei letztere Form auch ein Fragment eines CD16-Rezeptors umfaßt, an das ein gegen einen CD16-Rezeptor gerichteter Antikörper binden kann.
Der Ausdruck "CD30-Rezeptor" umfaßt einen CD30-Rezeptor jeglicher Art und Abstammung. Beispielsweise kann der CD30- Rezeptor von Morbus Hodgkin- oder Reed-Sternberg-Zellen stammen. Auch kann der CD30-Rezeptor in Wildtyp- oder veränderter Form vorliegen, wobei letztere Form auch ein Fragment eines CD30-Rezeptors umfaßt, an das ein gegen einen CD30-Rezeptor gerichteter Antikörper binden kann.
Ein erfindungsgemäßes FV-Antikörper-Konstrukt weist eine oder mehrere Bindungsstellen für einen CD16-Rezeptor und eine oder mehrere Bindungsstellen für ein CD30-Oberflächenprotein auf. Vorzugsweise weist das FV-Antikörper-Konstrukt eine oder zwei Bindungsstellen für einen CD16-Rezeptor und eine oder zwei Bindungsstellen für ein CD30-Oberflächenprotein auf.
Ein erfindungsgemäßes FV-Antikörper-Konstrukt kann durch verschiedene Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise kann ein FV-Antikörper-Konstrukt, das eine Bindungsstelle für einen CD16-Rezeptor und eine Bindungsstelle für ein CD30- Oberflächenprotein aufweist, z. B. dadurch hergestellt werden, daß ein erstes einzelkettiges FV-Antikörper-Konstrukt, das eine VH-Domäne eines anti-CD16-Antikörpers und eine VL-Domäne eines anti-CD30-Antikörpers aufweist, zusammen mit einem zweiten einzelkettigen FV-Antikörper-Konstrukt, das eine VL-Domäne eines anti-CD16-Antikörpers und eine VH-Domäne eines anti-CD30- Antikörpers aufweist, exprimiert wird, wodurch sich beide aneinanderlagern und das erfindungsgemäße FV-Antikörper- Konstrukt ausgebildet wird. Ergänzend wird auf die Beispiele 1-3 verwiesen.
Ferner kann ein Fv-Antikörper-Konstrukt, das zwei bis vier Bindungsstellen für einen CD16-Rezeptor und zwei Bindungsstellen für ein CD30-Oberflächenprotein aufweist, z. B. dadurch hergestellt werden, daß ein einzelkettiges FV- Antikörper-Konstrukt exprimiert wird, das die Elemente (a) und (b) umfaßt:
  • a) eine VH-Domäne eines anti-CD16-Antikörpers und eine VL- Domäne eines anti-CD30-Antikörpers, wobei die Domänen über einen Peptidlinker 1 miteinander verbunden sind, der jegliche Aminosäuren, insbesondere Glycin (G), Serin (S) und Prolin (P) und vorzugsweise 0-10 Aminosäuren umfassen kann,
  • b) ine VH-Domäne eines anti-CD30-Antikörpers und eine VL- Domäne eines anti-CD16-Antikörpers, wobei die Domänen über vorstehenden Peptidlinker 1 miteinander verbunden sind,
wobei die Elemente (a) und (b) über einen Peptidlinker 2 miteinander verbunden sind, der jegliche Aminosäuren, insbesondere Glycin, Serin und Prolin und vorzugsweise 3-10 Aminosäuren und ganz besonders die Aminosäuresequenz GGPGS umfassen kann. Ergänzend wird auf die Patentanmeldung 198 19 846.9 des Anmelders verwiesen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Nukleinsäure, insbesondere eine DNA, die für ein vorstehendes FV-Antikörper-Konstrukt kodiert. Ferner sind Expressions­ vektoren, die eine solche DNA enthalten, ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Bevorzugt wird der Expressionsvektor pKTD16-30 von Fig. 1. Dieser wurde bei der DSMZ (Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellen) am 29. Juli 1999 unter DSM 12 960 hinterlegt. Desweiteren sind Zellen, die einen vorstehenden Expressionsvektor enthalten, ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Kit, umfassend:
  • a) ein erfindungsgemäßes FV-Antikörper-Konstrukt, und/oder
  • b) einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor, sowie
  • c) übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Lösungsmittel, Träger, Kontrollen und Marker.
Von den einzelnen Komponenten können ein oder mehrere Vertreter vorliegen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein FV-Antikörper-Konstrukt bereit, das Bindungsstellen für einen CD16-Rezeptor und ein CD30-Oberflächenprotein aufweist. Dieses FV-Antikörper- Konstrukt läßt sich in großen Mengen und großer Reinheit herstellen. Auch weist es keine Teile auf, die zu unerwünschten Immunreaktionen bei Patienten führen können. Besonders kennzeichnet sich das FV-Antikörper-Konstrukt dadurch, daß es NK-Zellen aktivieren und gegen CD30- Oberflächenproteine exprimierende Zellen, insbesondere Tumorzellen, ganz besonders Morbus Hodgkin- oder Reed- Sternberg Zellen, ausrichten kann, wodurch diese Zellen lysiert werden. Somit eignet sich die vorliegende Erfindung gegen Erkrankungen vorzugehen, bei denen CD30- Oberflächenproteine exprimierende Zellen eine Rolle spielen. Solche Erkrankungen sind z. B. Tumorerkrankungen, insbesondere Morbus Hodgkin.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Fig. 1 zeigt den erfindungsgemäßen Expressionsvektor pKIDl6-30. Dieser kodiert für zwei einzelkettige FV-Antikörper-Konstrukte, von denen das eine die VH- Domäne eines anti-CD16-Antikörpers und die VL-Domäne eines anti-CD30-Antikörpers und das andere die VH- Domäne eines anti-CD30-Antikörpers und die VL-Domäne eines anti-CD16-Antikörpers aufweist. Nach Expression der einzelkettigen FV-Antikörper- Konstrukte lagern sich diese aneinander, wodurch ein erfindungsgemäßes FV-Antikörper-Konstrukt erhalten wird.
Fig. 2 zeigt eine FACS-Analyse der Bindung eines erfindungsgemäßen FV-Antikörper-Konstruktes an CD30+ L540CY Morbus Hodgkin-Zellen und CD16+ Granulocyten. Die Tumorzellen und die Granulocyten wurden jeweils mit 20 µg des erfindungsgemäßen FV-Antikörper- Konstruktes inkubiert. Die Bindung des FV- Antikörper-Konstruktes wurde mit dem anti-c-myc Antikörper 9E10 und Fluoresceinkonjugiertem Ziege- anti-Maus IgG bestimmt. Als Negativ-Kontrolle wurden die Zellen alleine mit 9E10 und Fluorescein­ konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG inkubiert.
Fig. 3 zeigt die cytolytische Aktivität von in peripheren Blutlymphozyten (PBL-Zellen) enthaltenen NK-Zellen (Effektor) gegenüber CD30+ L540CY Morbus Hogdkin- Zellen (Zielzellen) bei unterschiedlichen Effektor- Zielzellen-Verhältnissesn in einem 5 h JAM-Test. Ein erfindungsgemäßes FV-Antikörper-Konstrukt (⚫) wurde mit einer Konzentration von 1 µg/ml verabreicht. Als Kontrolle wurde bimAbHRS-3/A9 (▲) mit einer Konzentration von 4 µg/ml verwendet. Als Negativ- Kontrolle wurden das erfindungsgemäße FV-Antikörper- Konstrukt ohne NK-Zellen (○) und NK-Zellen alleine () verwendet.
Fig. 4 zeigt die Behandlung von SCID Mäusen, die Morbus Hodgkin-Xenotransplantate tragen, mit einem erfindungsgemäßen FV-Antikörper-Konstrukt. Die Mäuse wurden am Tag 0 i.V. mit 100 µg eines­ erfindungsgemäßen FV-Antikörper-Konstruktes zusammen mit NK-Zellen enthaltenden PBL-Zellen (⚫) bzw. ohne solche (○), mit 200 µl PBS (*), mit 1 × 107 PBL- Zellen (), bzw. mit einem Gemisch von 100 µg mAb­ HRS-3 und A9 zusammen mit PBL-Zellen (◊) behandelt. Tumor-Durchmesser wurden zweimal pro Woche gemessen und das Tumor-Volumen wurde mit folgender Formel berechnet: Volumen = d2x Dxπ/6, wobei d der kleinere und D der größere Tumor-Durchmesser ist.
Beispiel 1 Konstruktion des erfindungsgemäßen Expressionsvektors pKID16-30
Die cDNA der VH- und VL-Domänen eines anti-CD16-Antikörpers mAb A9 wurde einer PCR unterzogen. Hierfür wurden die folgenden Primer verwendet:
Die PCR wurde wie folgt durchgeführt: Ein Zyklus; 5 min bei 94°C, 3 min bei 58°C und 2 min bei 72°C, gefolgt von 30 Zyklen; 80 sec bei 94°C, 80 sec bei 58°C und 2 min bei 72°C bzw. letzteres 10 min im letzten Zyklus. Die PCR-Produkte wurden Gel-gereinigt und in den Vektor pCR-Script SK(+) (Stratagene) zur Sequenzierung inseriert. Zur Expression wurde die VH-Domäne über NcoI/HindIII und die VL-Domäne über MluI/NotI in den Vektor pHOG21 inseriert.
Die VH- und VL-Domänen eines anti-CD30-scFV-Fragmentes wurden einer PCR unterzogen. Hierfür wurden die folgenden Primer verwendet:
Die VH- und VL-Domänen des anti-CD30-scFv-Fragmentes bzw. des anti-CD16-scFv-Fragmentes wurden in den Expressionsvektor pKID inseriert, wodurch der erfindungsgemäße Expressionsvektor pKID 16-30 erhalten wurde. Dieser kodiert für die einzelkettigen FV- Antikörper-Konstrukte VH 16-VL 30 und VH 30-VL 16.
Beispiel 2 Expression des erfindungsgemäßen F7-Antikörper- Konstruktes in Bakterien
E.coli-X11 Blue-Zellen (Stratagene, La Jolla, CA), die mit dem Expressionsplasmid pKID16-30 transformiert worden waren, wurden über Nacht in 2YT-Medium mit 100 µg/ml Ampicillin und 100 mM Glucose bei 37°C gezüchtet. 1 : 20-Verdünnungen der über Nacht-Kulturen wurden als Kolbenkulturen in 2YT-Medium bei 38°C unter Schütteln mit 280 rpm gezüchtet. Bei einem OD600-Wert von 0,8 wurden die Bakterien durch 10minütige Zentrifugation mit 1500 g bei 20°C pelletiert und in dem gleichen Volumen eines frischen 2YT-Mediums, das 100 µg/ml Ampicillin und 0,4 M Saccharose enthielt, resuspendiert. IPTG wurde mit einer Endkonzentration von 0,1 M zugesetzt und das Wachstum wurde bei 21°C (20-22°C) 18-20 h fortgesetzt. Das FV-Antikörper- Konstrukt wurde wie in Kipriyanov, S. M. et al., Protein Engineering 10, (1997), 445 beschrieben, isoliert. Anschließend wurde es durch eine Ammoniumsulfatfällung (Endkonzentration 70% Sättigung) eingeengt. Das Proteinpräzipitat wurde durch Zentrifugation (30000 g, 4°C, 45 min) gewonnen und in 10% des Anfangsvolumens von 50 mM Tris- HCl, 1 M NaCl, pH 7,0 aufgelöst. Eine immobilisierte Metallaffinitäts-Chromatographie (IMAC) wurde wie in Kipriyanov, S. M. et al., J. Immunol. Methods 200, (1997), 69 beschrieben, durchgeführt. Das gereinigte FV-Antikörper- Konstrukt wurde gegen eine Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung dialysiert.
Beispiel 3 Charakterisierung des erfindungsgemäßen Fv- Antikörper-Konstruktes (A) Durchflußcytometrie
Zum Nachweis der Bindung eines erfindungsgemäßen FV-Antikörper- Konstruktes an CD16+ Granulocyten und CD30+ L540CY-Morbus Hodgkin-Zellen wurde eine FACScan (Beckton Dickinson)-Analyse durchgeführt. Hierzu wurden 1 × 106-Zellen zweimal in eiskaltem PBS-N (PBS, 0,05% NaN3) gewaschen und mit 100 µl des FV- Antikörper-Konstruktes von Beispiel 2 45 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden 5 min mit 1200 rpm bei 4°C pelletiert und mit 2 ml PBS-N gewaschen. Die Zellen wurden in 100 µl PBS-N, das 10 µg/ml des an das c-myc bindenden Antikörpers 9E10 (ICI Chemikalien) enthielt, resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden pelletiert und wie vorstehend gewaschen. Danach wurden die Zellen mit Fluoresceinmarkiertem Ziege-anti-Maus IgG (Gibco BRL; 1 : 100 verdünnt in PBS-N), resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Nach erneutem Waschen mit PBS-N waren die Zellen für die Analyse mit PBS-N, das 1 µg/ml Propidiumjodid (Sigma) enthielt, bereit. Hintergrund-Fluoreszenz wurde bestimmt, indem die Zellen mit dem Antikörper 9E10 und Fluorescein­ markiertem Ziege-anti-Maus-IgG unter gleichen Bedingungen inkubiert wurden.
Es zeigte sich, daß das erfindungsgemäße FV-Antikörper- Konstrukt sowohl CD16+ Granolocyten als auch CD30+ L540CY Morbus Hodgkin-Zellen erkennt und an sie bindet.
(B) Cytotoxizitätstest
Zum Nachweis der Aktivität eines erfindungsgemäßen FV- Antikörper-Konstruktes NK-Zellen zu aktivieren, CD30+ L540CY Morbus Hodgkin-Zellen zu lysieren wurde ein Cytotoxizitätstest entsprechend des in Matzinger, P., J. Immunol. Meth. 145 (1991), 185 beschriebenen JAM-Tests durchgeführt. In dem Cytotoxizitätstest wird die DNA-Fragmentierung bewertet. Zellen wurden mit [3H] Thymidin bis zu einer Endkonzentration von 2,5-5 µCi/ml für 4-6 h markiert. Die Zellen wurden pelletiert, einmal mit Kulturmedium gewaschen und auf 104 Zellen/Vertiefung einer 96-Lochplatte eingestellt. Nach Zugabe von Effektor-Zellen (NK Zellen enthaltende periphere Blutzellen "PBL-Zellen") in verschiedenen Verdünnungen wurde die 96.Lochplatte in einer befeuchteten Atmosphäre mit 7,5% CO2 für 4 h inkubiert. Die Zellen und das Medium wurden auf Fiberglas-Filter gesaugt. Nach Waschen und Trocknen der Filter wurden sie in Plastik-Tüten überführt, die eine Szintillationsflüssigkeit enthielten und unter Verwendung eines Flüssig-Szintillations-Zählers (LKB) gezählt. Die gemessene Radioaktivität bezieht sich auf intakte DNA, da DNA aus toten Zellen in kleine Fragmente abgebaut ist, die nicht von den Filtern festgehalten werden. Zur Bestimmung der Cytotoxizität, d. h. der Abtötung von Zellen, wurde die Standardformel für den JAM-Test verwendet: % spezifische Abtötung = (S-E)/S 100, wobei E = experimentell erhaltene DNA in Gegenwart von Effektor-Zellen (in cpm) und S = erhaltene DNA in Abweseneheit von Effektor-Zellen (spontan).
Es zeigte sich, daß ein erfindungsgemäßes FV-Antikörper- Konstrukt NK-Zellen aktivieren kann, CD30+ L540CY Morbus Hodgkin-Zellen zu lysieren, wobei die Lyse stärker ist als bei Verwendung von bimAbHRS-3/A9.
(C) Einfluß auf Tumoren von Mäusen
CD30+ L540CY Hodgkin's Lymphome wurden in SCID Mäusen, wie in Hombach, A. et al., Int. J. Cancer 55, (1993), 830; Renner, C. et al., J. Hematotherapy 4, (1995), 447 beschrieben, etabliert. Hierzu wurden 1,5 × 107 Tumorzellen in 200 µl PBS subcutan in die rechte Flanke der Mäuse injiziert. Die Tumor- Entwicklung, d. h. der Tumor-Durchmesser, wurde zweimal pro Woche bestimmt. Mäuse mit Tumoren von 4-6 mm im Durchmesser wurden in verschiedene Gruppen eingeteilt und erhielten ein erfindungsgemäßes FV-Antikörper-Konstrukt in 200 µl PBS zusammen mit NK-Zellen enthaltenden peripheren Blutlymphozyten (PBL- Zellen). Das Tumorvolumen und seine Entwicklung wurden bestimmt (vgl. Legende zu Fig. 4).
Es zeigte sich, daß ein erfindungsgemäßes FV-Antikörper- Konstrukt nicht nur in vitro sondern auch in vivo NK-Zellen aktivieren kann, CD30+ L540CY Morbus Hodgkin-Zellen zu lysieren.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims (14)

1. FV-Antikörper-Konstrukt mit Bindungsstellen für einen CD16-Rezeptor und ein CD30-Oberflächenprotein.
2. FV-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 1, wobei der CD16- Rezeptor von NK-Zellen stammt.
3. FV-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 1 oder 2, wobei das CD30-Oberflächenprotein von Morbus Hodgkin- oder Reed- Sternberg-Zellen stammt.
4. FV-Antikörper-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-3, wobei jeweils eine Bindungsstelle vorliegt.
5. FV-Antikörper-Konstrukt nach Anspruch 4, kodiert durch den Expressionsvektor pKID16-30 (DSM 12960).
6. FV-Antikörper-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-3, wobei jeweils zwei Bindungsstellen vorliegen.
7. Expressionsvektor, kodierend für das FV-Antikörper- Konstrukt nach einem der Ansprüche 1-6.
8. Expressionsvektor nach Anspruch 7, nämlich pKID16-30 (DSM 12 960).
9. Transformante, enthaltend den Expressionsvektor nach Anspruch 7 oder 8.
10. Verfahren zur Herstellung des FV-Antikörper-Konstruktes nach einem der Ansprüche 1-6, umfassend die Kultivierung der Transformante nach Anspruch 9 unter geeigneten Bedingungen.
11. Kit, umfassend:
  • a) ein erfindungsgemäßes FV-Antikörper-Konstrukt,
und/oder
  • a) einen erfindungsgemäßen Expressionsvektor, sowie
  • b) übliche Hilfsstoffe, wie Puffer, Lösungsmittel, Träger, Kontrollen und Marker,
wobei von den einzelnen Komponenten ein oder mehrere Vertreter vorliegen können.
12. Verwendung des FV-Antikörper-Konstruktes nach einem der Ansprüche 1-6 zur Lyse von CD30-Oberflächenproteinen exprimierenden Zellen.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Zellen Tumorzellen sind.
14. Verwendung nach Anspruch 13, wobei die Tumorzellen Morbus Hodgkin- oder Reed-Sternberg-Zellen sind.
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