DE19948867A1

DE19948867A1 - TNFalpha bindende Peptide und ihre Anwendung für Detektion, Inaktivierung und/oder Entfernung von TNFalpha aus biologischen Flüssigkeiten

Info

Publication number: DE19948867A1
Application number: DE19948867A
Authority: DE
Inventors: Heinz-Juergen Wagner; Hans-Werner Heinrich; Udo Meyer
Original assignee: Bioserv AG
Current assignee: Bioserv AG
Priority date: 1998-10-09
Filing date: 1999-10-08
Publication date: 2000-08-17
Also published as: WO2000021981A3; WO2000021981A2

Abstract

Die erfindungsgemäßen Peptide mit den Formeln NH¶2¶-IQTLHAQ-COOH und NH¶2¶-RLANTFHVY-COOH binden in vitro wie ex vivo spezifisch TNFalpha. Sie eignen sich für die Herstellung von Testsystemen von TNFalpha, die Inaktivierung von TNFalpha und/oder dessen Entfernung aus Körperflüssigkeiten mittels z. B. Plasmapherese.

Description

Die Erfindung betrifft die Konstruktion und Verwendung von Peptiden, die geeignet sind, an TNFα spezifisch zu binden. Diese Peptide kommen nach derzeitigem Wissen in der Natur nicht vor. Mit ihrer Hilfe kann TNFα spezifisch gebunden, biologisch inaktiviert und/oder aus Stoffgemischen entfernt werden.

TNF ist ein lösliches Protein (rel. Molmasse 17 kD), das in Reaktion auf Endotoxine oder andere Noxen vornehmlich von Monozyten und Makrophagen produziert und abgegeben wird. Es wurde erstmals beschrieben von Carswell, E. A. et al. (PNAS USA 72 (1975), 3666), die es im Serum von Tieren nachwiesen, welche vorher mit Endotoxin und Bacillus Calmette Guerin (BCG) behandelt wurden.

Die biologisch aktive Form ist das Trimere aus den 17-kDa-Untereinheiten. Es kommt in Form der ähnlichen Varianten TNFα und β vor.

TNF spielt eine zentrale Rolle in der Regulation der körpereigenen Abwehrmechanismen nach Infektionen und Verletzungen, in der Aufrechterhaltung immunpathologischer Prozesse und der Tumorrückbildung (Buetler, B. et al., Bueder, B. Hrsg. Tumor Necrosis Factors: the Molecules and Their Emerging Role in Medicine (Raven Press, New York, 1992)). Es greift in die Regulation einer Vielzahl biologischer Phänomene ein, wie z. B. die Aktivierung der polymorphkernigen Granulozyten, Zellwachstum, Hemmung der Lipoproteinlipase, antivirale Aktivität, Stimulierung der Kollagenase, Stimulierung von Prostaglandin E, Aktivierung von T- und B-Zellen, erhöhte Expression von MHC-Molekülen u. a.

Eine überhöhte Aktivität von TNF ist von pathogenetischer Bedeutung für chronische Entzündungsprozesse (z. B. Rheumatoide Arthritis), Septikämischem Schock und Kachexie. Die erhöhte TNF-Produktion verursacht eine exzessive Freisetzung von Interleukin (IL) 6 und Granulozyten/Makrophagen-Kolonie Stimulierenden Faktor (GM- CSF). Diese Zytokine verstärken die Zytotoxizität von polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten und die Expression zellulärer Adhäsinsproteine. Beide Phänomene sind mitverantwortlich für die Aufrechterhaltung der Entzündungsprozesse (Williams et al., PNAS USA, 98 (1992), 9784).

Die Kachexie (Anorexie in Verbindung mit fortschreitendem Körpermasseverlust) bei Tumorpatienten bzw. infolge von Infektionskrankheiten führt zu lebensbedrohlichen Zuständen. TNF ist ein entscheidender Mediator für Kachexie bei diesen Erkrankungen. Wiederholte TNF-Gaben an Mäuse verursachen Anorexie, Gewichtsverlust sowie Abbau von Körperfett und Protein innerhalb von 7-10 Tagen (Carami et al., Immunol. Lett. 11 (1985), 173). Diese Effekte werden durch die gleichzeitige Verabreichung von Antikörpern gegen TNF reduziert.

TNF kommt eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie der Sepsis mit Gram-negativen Mikroorganismen und Endotoxinschock zu. Endotoxine der Gram-negativen Bakterien stimulieren die Monozyten/Makrophagen zur TNF-Freisetzung (in Gefolge mit der Synthese weiterer Zytokine). TNF und andere Monozyten-Zytokine vermitteln die metabolische imd neurohormonelle Antwort des Organismus auf Endotoxine (Fieber, Überkeit, Anorexie und Kachexie), wobei TNF allein in der Lage ist, diese klinischen Symptome zu verursachen. Chronische intravenöse TNF-Infusionen sind verbunden mit Anorexie, Wasserretension, Akute-Phase-Reaktion und negativer Stickstoffbilanz (Michie, H. R. et al., Ann. Surg. 209 (1989), 19).

Erhöhte TNF-Werte werden bei Transplantationspatienten in der akuten Phase der Organabstoßungsreaktion gemessen (Maury und Teppo; 1. Exil. Med. 166 (1987), 1132). Die Applikation von Antikörpern gegen TNF verhindert im Tierversuch die typischen histologischen Veränderungen einer "graft versus host"-Reaktion.

Die vielfältigen biologischen Effekte des TNF (alpha und beta) werden durch zwei Transmembranrezeptoren vermittelt. (TNF-R55 und TNF-R75). Die extrazellulären Domänen beider Rezeptorproteine weisen eine 28%ige Aminosäuresequenz-Homologie auf und besitzen beide vier relativ konservierte Subdomänen. Die zytoplasmatischen Abschnitte beider Rezeptorproteine weisen keine Homologien auf, was auf eine unterschiedliche Weise der Signaltransduktion hinweist.

Durch Proteolyse des extrazellulären Rezeptorabschnittes werden in vivo lösliche Proteine freigesetzt, die in der Lage sind, TNF zu binden und zu inaktivieren (TNF binding protein). Solche TNF-Inhibitoren können im Urin gesunder Menschen ebenso nachgewiesen werden, wie im Serum von Tumorpatienten. Viele Einflüsse, die zur Aktivierung der TNF-Freisetzung führen, bewirken gleichzeitig eine vermehrte Abgabe von löslichen TNF-Rezeptoren. Das läßt den Schluß zu, daß sie im Sinne eines negativen feedback auf die TNF-Synthese wirken.

Die Hemmung von TNF könnte von großer Bedeutung sein für die Basis- oder unterstützende Therapie vieler Krankheiten.

Viele Verfahren sind beschrieben zur Inaktivierung und/oder Entfernung von TNF aus Patienten. In WO 96/16666 wird ein Verfahren zur Entfernung von TNF mittels Immunadsorption und Plasmapherese beschrieben. Dazu werden Antikörper gegen TNF an eine Matrix gekoppelt, die als spezifische Liganden während der Plasmapherese TNF binden.

In den Patenten WO 90/06938 und WO 90/06947 (Boehm et al.) werden eine Vielzahl von Peptiden beansprucht, die von der Aminosäuresequenz des TNF abgeleitet wurden und den TNF-Rezeptor blockieren.

Rathjen (WO 93/06128, WO 93/01211) beschreibt Peptide, die von der TNF- Rezeptorstruktur abgeleitet wurden und in der Lage sind, am TNF spezifisch zu binden und seine biologische Funktion zu inaktivieren. Mit diesen Peptiden gelang es in vitro wie in vivo (Tumorregression, TNF-Toxizität_Maus, Malaria_Maus) biologische Effekte zu neutralisieren.

Im Patent WO 92/11285 beschreiben Boehm et al. weitere Peptide, die von der TNF- Aminosäuresequenz abgeleitet wurden und durch das Besetzen des TNF-Rezeptors die Bindung und damit den biologischen Effekt des nativen TNF verhindern.

Alle Beispiele für die Wirksamkeit der Rezeptorblockade wurden in vitro demonstriert. Auf Tierexperimente gestützte Aussagen zur pharmakologischen Wirksamkeit werden jedoch nicht erbracht.

In den Ansprüchen des Patents WO 97/02345 werden alle Stoffe geschützt, die in der Lage sind, an der intrazellulären Domäne des TNF zu binden und dadurch die TNF- Wirkung in irgendeiner Form zu beeinflussen.

Gegenstand der Erfindung ist ein empirisches Verfahren zur Ermittlung von Oligopeptidstrukturen, die geeignet sind, an TNFα spezifisch zu binden. Herkömmlich werden solche Peptide im Ergebnis von Ligand - Rezeptor - Untersuchungen konstruiert oder auf der Grundlage der Analytik der Liganden, deren natürlichen Rezeptoren der anti-Sense Peptide.

Auf der Grundlage dieses Verfahrens wurden die erfindungsgemäßen Peptide NH₂- IQTLHAQ-COOH und NH₂-RLANTFHVY-COOH synthetisiert, die selektiv TNFα erkennen, binden und deren biologische Wirkung in vitro inaktivieren.

Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1-12 realisiert.

Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.

I. bis IV. Ausführungsbeispiele für die Bindung von TNF-alpha durch das trägergebundene Oligopeptid T2

Bindungssystem:

1. Äquilibrieren des trägergebundenen Oligopeptides in 300 µl BP für 1 h bei 37°C
2. Blockieren des trägergebundenen Oligopeptid-Trägers in 200 µl BP mit 1% BSA für 3 h bei 37°C
3. Waschen des trägergebundenen Oligopeptids in je 250 µl BP für 2 × 20 min bei 37°C
4. Inkubieren von ¹²⁵J-TNF und/oder nichtmarkiertem TNF mit dem trägergebundenen Oligopeptid in 100 µl BP für 90 min bei 25°C
5. Waschen des trägergebundenen Oligopeptids in je 300 µl BP für 2 × 20 min bei 25°C
6. Messung per cpm

Jede einzelne Bindung wurde als Doppelbestimmung ausgeführt. Bindungspuffer (BP):
100 mM Tris, 0,1% Tween-20, 140 mM NaCl, 0,1% BSA

I. Zusammenhang zwischen Bindung von TNF und der TNF-Konzentration im Bindungsansatz, Bestimmung der Bindungskonstante

Abb.

1: Bindung von ¹²⁵

J-TNF an Oligo T2
[¹²⁵

J-TNF] = 0,227-10 nM

Meßwerte zu Abb. 1

Abb. 2: Bindung von ¹²⁵J-TNF an Oligo T2
[¹²⁵J-TNF] = 10-40 nM

Meßwerte zu Abb. 2

Durch die Auswertung der Kurven aus Abb. 1 und Abb. 2 läßt sich für die Bindung von TNF durch das trägergebundene Oligopeptid T2 eine Bindungskonstante von 15-20 nM bestimmen.

II. Spezifische Hemmung der Bindung von ¹²⁵J-TNF am trägergebundenen Oligopeptid T2 durch nichtmarkiertes TNF (Kompetitionshemmung)

Abb.

3: Kornpetition der Bindung von 125J-TNF an Oligo T2 durch unmarkiertes TNF ¹²⁵

J-TNF] = 4,55 nM

Meßwerte zu Abb. 3

III. Bindung von ¹²⁵J-TNF aus verdünntem Blutplasma durch trägergebundenes Oligopeptid T2

Tabelle 1

TNF-Bindung im Bindungspuffer und im mit BP verdünnten Plasma

IV. Spezifische Hemmung der Bindung von ¹²⁵J-TNF am trägergebundenen Oligopeptid T2 im mit BP verdünnten Plasma durch nichtmarkiertes TNF (Kompetitionshemmung)

Abb.

4: Kompetition der Bindung von ¹²⁵

J-TNF an Oligo T2 durch unmarkiertes TNF in Anwesenheit von Blutplasma
[¹²⁵

J-TNF] = 0,85 nM
Anteil von Blutplasma im BP = 25%

Meßwerte zu Abb. 4

V. Ausführungsbeispiel - TNFα-Zytotoxizitäts-Versuch

Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Peptide, am TNFα zu binden und dadurch dessen zytotoxische Eigenschaften zu neutralisieren, wurde unter Verwendung von Mäusebiofibroblasten (Zellinie L929) demonstriert.

Die Zellen wurden in Dulbecco's modifizierten Eagle's Medium (DMEM) unter Verwendung von 10% fötalem Kälberserum (FKS) vermehrt.

24 Stunden vor dem Versuch werden die Zellen des geschlossenen Monolayer mit Trypsin/EDTA vereinzelt und in DMEM/FKS aufgenommen. In die Wells einer 96- Kavitäten-Zellzuchtplatte werden je 5 × 10⁴ Zellen in 50 ml eingesät. Die Zellzuchtplatten werden 3-5 Stunden bei 37°C in einer 5%igen CO₂ Atmosphäre inkubiert. Der Monolayer sollte vor Verwendung etwa zu 50% geschlossen sein. Von den zu testenden Peptiden werden etwa 2-mM-Lösungen in 10 mM HEPES (pH 7,5) hergestellt. Die Lösungen werden steril filtriert (200 nm) und in Verdünnungsstufen 1 : 4 in 10 mM HEPES (pH 7,5) verdünnt. Als Kontrolle dient der monoklonale Antikörper TA-31 (Sigma) mit bekannter Inaktivierungsaktivität.

DMEM/FKS wird mit Actinomycin D (10 µg/ml) und rekombinantem humanen TNFα (1 ng/ml) versetzt. 75 µl dieser Lösung werden mit 75 µl der jeweiligen Peptidverdünnung, bzw. des Antikörpers (Kontrolle I) oder HEPES (Kontrolle 2) gemischt. Nach einer Inkubation von 30 min bei Raumtemperatur wird das Gemisch jeder Peptidverdünnungsstufe bzw. der Kontrollen in jeweils 3 Kavitäten inokuliert (je 50 µl/Kavität), in denen je 50 µl der Zellsuspension vorinkubiert wurde. Als Kontrolle 3 dienen ein Gemisch von 25 µl/Well DMEM/FKS mit Actinomycin D (10 mg/ml) und 25 µl/Well HEPES (pH 7,5).

Die Zellzuchtplatten werden über Nacht bei 37°C in einer 5%igen CO₂-Atmosphäre inkubiert. Nach Kristallviolettanfärbung der nicht lysierten Zellen wird die relative Hemmung der zytotoxischen TNFα-Aktivität durch die Peptide ermittelt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. TNFα bindende Peptide, bestehend aus 4-9 Aminosäuren.

2. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Aminosäure-Sequenz I
NH₂-I-Q-T-L-H-A-Q-COOH I

3. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mindestens 4 Aminosäuren langen Bruchstücken der Formel I bestehen.

4. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne Aminosäuren durch analoge Aminosäuren ausgetauscht sind.

5. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Aminosäure-Sequenz II
NH₂-R-L-A-N-T-F-H-V-Y-COOH II

6. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mindestens 4 Aminosäuren langen Bruchstücken der Formel II bestehen.

7. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne Aminosäuren durch analoge Aminosäuren ausgetauscht sind.

8. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 1-7, dadurch gekennzeichnet, daß sie am N- und/oder C-Terminus blockiert sind.

9. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Acetylierung, Alkylierung, Aralkylierung oder Amidierung blockiert sind.

10. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1-9 als Diagnostikum zur Detektion von TNFα.

11. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1-9 zur Inaktivierung und/oder Entfernung von TNFα in Körperflüssigkeiten.

12. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1-9 als Arzneimittel zur Bekämpfung neoplastischer und Autoimmun-Erkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen bzw. als spezifischer Ligand zur Detoxikation allein oder in Kombination mit geeigneten Trägern.