WO2000021981A2 - TNFα BINDENDE PEPTIDE UND IHRE ANWENDUNG FÜR DIE DETEKTION, INAKTIVIERUNG UND/ODER ENTFERNUNG VON TNFα AUS BIOLOGISCHEN FLÜSSIGKEITEN - Google Patents

TNFα BINDENDE PEPTIDE UND IHRE ANWENDUNG FÜR DIE DETEKTION, INAKTIVIERUNG UND/ODER ENTFERNUNG VON TNFα AUS BIOLOGISCHEN FLÜSSIGKEITEN Download PDF

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Definitions

  • TNF ⁇ binding peptides and their application for the detection, inactivation and / or removal of TNF ⁇ from biological fluids
  • the invention relates to the construction and use of peptides which are capable of specifically binding to TNF ⁇ . According to current knowledge, these peptides do not occur in nature. With their help, TNF ⁇ can be specifically bound, biologically inactivated and / or removed from mixtures of substances.
  • TNF is a soluble protein (relative molecular weight 17 kD), which is produced and released primarily by monocytes and macrophages in response to endotoxins or other noxae. It was first described by Carswell, E.A. et al. (PNAS USA 72 (1975), 3666), who detected it in the serum of animals which had previously been treated with endotoxin and Bacillus Calmette Guerin (BCG).
  • the biologically active form is the trimere from the 17 kDa subunits. It occurs in the form of the similar variants TNF ⁇ and ß.
  • TNF plays a central role in the regulation of the body's defense mechanisms after infections and injuries, in the maintenance of immunopathological processes and tumor regression (Buetler, B. et al., Buetler, B. Ed. Tumor Necrosis Factors: the Molecules and Their Emerging Role in Medicine (Raven Press, New York, 1992)). It intervenes in the regulation of a variety of biological phenomena, such as B. the activation of poiymo nucleated granulocytes, cell growth, inhibition of lipoprotein lipase, antiviral activity, stimulation of collagenase, stimulation of prostaglandin E, activation of T and B cells, increased expression of MHC molecules, etc.
  • TNF chronic inflammatory processes
  • IL interleukin
  • GM-CSF granulocyte / macrophage colony stimulating factor
  • TNF is a crucial mediator for cachexia in these diseases. Repeated doses of TNF to mice cause anorexia, weight loss and the breakdown of body fat and protein within 7-10 days (Carami et al., Immunol. Lett. 11 (1985), 173). These effects are reduced by the simultaneous administration of antibodies against TNF.
  • TNF plays a central role in the pathophysiology of sepsis with gram-negative microorganisms and endotoxin shock. Endotoxins of the Gram-negative bacteria stimulate the monocytes / macrophages to release TNF (in the wake of the synthesis of further cytokines). TNF and other monocyte cytokines mediate the organism's metabolic and neurohormonal response to endotoxins (fever, nausea, anorexia and cachexia), and TNF alone is capable of causing these clinical symptoms. Chronic intravenous TNF infusions are associated with anorexia, water retention, acute phase reaction and negative nitrogen balance (Michie, H.R. et al., Ann. Surg. 209 (1989), 19).
  • TNF values are measured in transplant patients in the acute phase of the organ rejection reaction (Maury and Teppo; J. Exp. Med. 166 (1987), 1132).
  • the application of antibodies against TNF prevents the typical histological changes of a 'graft versus host' reaction in animal experiments.
  • TNF-R55 and TNF-R75 The diverse biological effects of TNF (alpha and beta) are mediated by two transmembrane receptors.
  • TNF-R55 and TNF-R75 The extracellular domains of both receptor proteins have a 28% amino acid sequence homology and both have four relatively conserved subdomains.
  • the cytoplasmic sections of both receptor proteins have no homologies, which indicates a different way of signal transduction.
  • TNF TNF binding protein
  • WO 96/16666 describes a method for removing TNF by means of immunoadsorption and plasmapheresis. Antibodies against TNF are coupled to a matrix, which bind TNF as specific ligands during plasmapheresis.
  • Patents WO 90/06938 and WO 90/06947 Claim a large number of peptides which are derived from the amino acid sequence of the TNF and block the TNF receptor.
  • Rathjen (WO 93/06128, WO 93/01211) describes peptides which have been derived from the TNF receptor structure and are able to bind specifically to the TNF and to inactivate its biological function. These peptides were able to neutralize biological effects in vitro and in vivo (tumor regression, TNF toxicity M. , malaria M ).
  • Boehm et al. further peptides which were derived from the TNF amino acid sequence and which prevent the binding and thus the biological effect of the native TNF by occupying the TNF receptor.
  • the invention relates to an empirical method for determining oligopeptide structures which are suitable for specifically binding to TNF ⁇ .
  • Such peptides are conventionally constructed as a result of ligand-receptor studies or on the basis of the analysis of the ligands, their natural receptors as anti-sense peptides.
  • the peptides NH 2 - IQTLHAQ-COOH and NH - RLANTFHVY-COOH according to the invention were synthesized, which selectively recognize and bind TNF ⁇ and inactivate their biological action in vitro.
  • a binding constant of 15 - 20 nM can be determined for the binding of TNF by the carrier-bound oligopeptide T2.
  • the cells were grown in Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) using 10% fetal calf serum (FKS).
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • FKS fetal calf serum
  • the cells of the closed monolayer are separated with trypsin / EDTA and taken up in DMEM / FKS. 5 ⁇ 10 4 cells in 50 ml are sown into the wells of a 96-well cell culture plate. The cell culture plates are incubated for 3-5 hours at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. The monolayer should be closed approximately 50% before use. About 2 mM solutions in 10 mM HEPES (pH 7.5) are prepared from the peptides to be tested. The solutions are sterile filtered (200 nm) and diluted 1: 4 in 10 mM HEPES (pH 7.5). The monoclonal antibody TA-31 (Sigma) with known inactivation activity serves as a control.
  • DMEM / FKS is mixed with actinomycin D (10 ⁇ g / ml) and recombinant human TNF ⁇ (1 ng / ml). 75 ⁇ l of this solution are mixed with 75 ⁇ l of the respective peptide dilution or of the antibody (control 1) or HEPES (control 2). After an incubation of 30 min at room temperature, the mixture of each peptide dilution stage or of the controls is inoculated in 3 cavities (50 ⁇ l / cavity each), in each of which 50 ⁇ l of the cell suspension was preincubated. Control 3 is a mixture of 25 ⁇ l / well DMEM / FKS with actinomycin D (10 mg / ml) and 25 l / well HEPES (pH 7.5).
  • the cell culture plates are incubated overnight at 37 ° C. in a 5% CO 2 atmosphere. After crystal violet staining of the non-lysed cells, the relative inhibition of the cytotoxic TNF ⁇ activity by the peptides is determined.

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Abstract

Die erfindungsgemässen Peptide mit den Formeln NH2-IQTLHAQ-COOH und NH2-RLANTFHVY-COOH binden in vitro wie ex vivo spezifisch TNF alpha . Sie eignen sich für die Herstellung von Testsystemen von TNF alpha , die Inaktivierung von TNF alpha und/oder dessen Entfernung aus Körperflüssigkeiten mittels z.B. Plasmapherese.

Description

TNFα bindende Peptide und ihre Anwendung für die Detektion, Inaktivierung und/oder Entfernung von TNFα aus biologischen Flüssigkeiten
Die Erfindung betrifift die Konstruktion und Verwendung von Peptiden, die geeignet sind, an TNFα spezifisch zu binden. Diese Peptide kommen nach derzeitigem Wissen in der Natur nicht vor. Mit ihrer Hilfe kann TNFα spezifisch gebunden, biologisch inaktiviert und/oder aus Stoffgemischen entfernt werden.
TNF ist ein lösliches Protein (rel. Molmasse 17 kD), das in Reaktion auf Endotoxine oder andere Noxen vornehmlich von Monozyten und Makrophagen produziert und abgegeben wird. Es wurde erstmals beschrieben von Carswell, E.A. et al. (PNAS USA 72 (1975), 3666), die es im Serum von Tieren nachwiesen, welche vorher mit Endotoxin und Bacillus Calmette Guerin (BCG) behandelt wurden.
Die biologisch aktive Form ist das Trimere aus den 17-kDa-Untereinheiten. Es kommt in Form der ähnlichen Varianten TNFα und ß vor.
TNF spielt eine zentrale Rolle in der Regulation der körpereigenen Abwehrmechanismen nach Infektionen und Verletzungen, in der Aufrechterhaltung immunpathologischer Prozesse und der Tumorrückbildung (Buetler, B. et al., Buetler, B. Hrsg. Tumor Necrosis Factors: the Molecules and Their Emerging Role in Medicine (Raven Press, New York, 1992)). Es greift in die Regulation einer Vielzahl biologischer Phänomene ein, wie z. B. die Aktivierung der poiymo hkernigen Granulozyten, Zellwachstum, Hemmung der Lipoproteinlipase, antivirale Aktivität, Stimulierung der Kollagenase, Stimulierung von Prostaglandin E, Aktivierung von T- und B-Zellen, erhöhte Expression von MHC-Molekülen u.a.
Eine überhöhte Aktivität von TNF ist von pathogenetischer Bedeutung für chronische Entzündungsprozesse (z. B. Rheumatoide Arthritis), Septikämischem Schock und Kachexie. Die erhöhte TNF-Produktion verursacht eine exzessive Freisetzung von Interleukin (IL) 6 und Granulozyten/Makrophagen-Kolonie Stimulierenden Faktor (GM- CSF). Diese Zytokine verstärken die Zytotoxizität von poiymorphkernigen neutrophilen Granulozyten und die Expression zellulärer Adhäsinsproteine. Beide Phänomene sind mitverantwortlich für die Aufrechterhaltung der Entzündungsprozesse (Williams et al. PNAS USA, 98 (1992), 9784). Die Kachexie (Anorexie in Verbindung mit fortschreitendem Körpermasseverlust) bei Tumorpatienten bzw. in Folge von Infektionskrankheiten führt zu lebensbedrohlichen Zuständen. TNF ist ein entscheidender Mediator für Kachexie bei diesen Erkrankungen. Wiederholte TNF-Gaben an Mäuse verursachen Anorexie, Gewichtsverlust sowie Abbau von Körperfett und Protein innerhalb von 7 - 10 Tagen (Carami et al., Immunol. Lett.. 11 (1985), 173). Diese Effekte werden durch die gleichzeitige Verabreichung von Antikörpern gegen TNF reduziert.
TNF kommt eine zentrale Rolle in der Pathophysiologie der Sepsis mit Gram-negativen Mikroorganismen und Endotoxinschock zu. Endotoxine der Gram-negativen Bakterien stimulieren die Monozyten/Makrophagen zur TNF-Freisetzung (in Gefolge mit der Synthese weiterer Zytokine). TNF und andere Monozyten-Zytokine vermitteln die metabolische imd neurohormonelle Antwort des Organismus auf Endotoxine (Fieber, Uberkeit, Anorexie und Kachexie), wobei TNF allein in der Lage ist, diese klinischen Symptome zu verursachen. Chronische intravenöse TNF-Infusionen sind verbunden mit Anorexie, Wasserretension, Akute-Phase-Reaktion und negativer Stickstoffbilanz (Michie, H.R. et al., Ann. Surg. 209 (1989), 19).
Erhöhte TNF-Werte werden bei Transplantionspatienten in der akuten Phase der Organabstoßungsreaktion gemessen (Maury und Teppo; J. Exp. Med. 166 (1987), 1132). Die Applikation von Antikörpern gegen TNF verhindert im Tierversuch die typischen histologischen Veränderungen einer 'graft versus host' Reaktion.
Die vielfältigen biologischen Effekte des TNF (alpha und beta) werden durch zwei Transmembranrezeptoren vermittelt. (TNF-R55 und TNF-R75). Die extrazellulären Domänen beider Rezeptorproteine weisen eine 28 %ige Aminosäuresequenz-Homologie auf und besitzen beide vier relativ konservierte Subdomänen. Die zytoplasmatischen Abschnitte beider Rezeptorproteine weisen keine Homologien auf, was auf eine unterschiedliche Weise der Signaltransduktion hinweist.
Durch Proteolyse des extrazellulären Rezeptorabschnittes werden in vivo lösliche Proteine freigesetzt, die in der Lage sind, TNF zu binden und zu inaktivieren (TNF binding protein). Solche TNF-Inhibitoren können im Urin gesunder Menschen ebenso nachgewiesen werden, wie im Serum von Tumorpatienten. Viele Einflüsse, die zur Aktivierung der TNF-Freisetzung führen, bewirken gleichzeitig eine vermehrte Abgabe von löslichen TNF-Rezeptoren. Das läßt den Schluß zu, daß sie im Sinne eines negativen feedback auf die TNF-Synthese wirken. Die Hemmung von TNF könnte von großer Bedeutung sein für die Basis- oder unterstützende Therapie vieler Krankheiten.
Viele Verfahren sind beschrieben zur Inaktivierung und/oder Entfernung von TNF aus Patienten. In WO 96/16666 wird ein Verfahren zur Entfernung von TNF mittels Immunadsorption und Plasmapherese beschrieben. Dazu werden Antikörper gegen TNF an eine Matrix gekoppelt, die als spezifische Liganden während der Plasmapherese TNF binden.
In den Patenten WO 90/06938 und WO 90/06947 (Boehm et al.) werden eine Vielzahl von Peptiden beansprucht, die von der Aminosäuresequenz des TNF abgeleitet wurden und den TNF-Rezeptor blockieren.
Rathjen (WO 93/06128, WO 93/01211) beschreibt Peptide, die von der TNF- Rezeptorstruktur abgeleitet wurden und in der Lage sind, am TNF spezifisch zu binden und seine biologische Funktion zu inaktivieren. Mit diesen Peptiden gelang es in vitro wie in vivo (Tumorregression, TNF-ToxizitätM.--, MalariaM- biologische Effekte zu neutralisieren.
Im Patent WO 92/11285 beschreiben Boehm et al. weitere Peptide, die von der TNF- Aminosäuresequenz abgeleitet wurden und durch das Besetzen des TNF-Rezeptors die Bindung und damit den biologischen Effekt des nativen TNF verhindern.
Alle Beispiele für die Wirksamkeit der Rezeptorblockade wurden in vitro demonstriert. Auf Tierexperimente gestützte Aussagen zur pharmakologischen Wirksamkeit werden jedoch nicht erbracht.
In den Ansprüchen des Patents WO 97/02345 werden alle Stoffe geschützt, die in der Lage sind, an der intrazellulären Domäne des TNF zu binden und dadurch die TNF- Wirkung in irgendeiner Form zu beeinflussen.
Gegenstand der Erfindung ist ein empirisches Verfahren zur Ermittlung von Oligopeptidstrukturen, die geeignet sind, an TNFα spezifisch zu binden. Herkömmlich werden solche Peptide im Ergebnis von Ligand - Rezeptor - Untersuchungen konstruiert oder auf der Grundlage der Analytik der Liganden, deren natürlichen Rezeptoren ider anti-Sense Peptide. Auf der Grundlage dieses Verfahrens wurden die erfindungsgemäßen Peptide NH2- IQTLHAQ-COOH und NH--RLANTFHVY-COOH synthetisiert, die selektiv TNFα erkennen, binden und deren biologische Wirkung in vitro inaktivieren.
Die Erfindung wird gemäß den Ansprüchen 1 - 12 realisiert.
Die Erfindung soll nachfolgend durch Ausführungsbeispiele näher erläutert werden.
I. bis IV. Ausführungsbeispiele für die Bindung von TNF-alpha durch das trägergebundene Oligopeptid T2
Bindungssystem :
1. Äquilibrieren des trägergebundenen Oligopeptides in 300 μl BP für lh bei 37 °C
2. Blockieren des trägergebundenen Oligopeptid Trägers in 200 μl BP mit 1 % BSA für 3h bei 37 °C
3. Waschen des trägergebundenen Oligopeptids in je 250 μl BP für 2 x 20 min bei 37 °C
4. Inkubieren von 125J-TNF und/oder nichtmarkiertem TNF mit dem trägergebundenen Oligopeptid in 100 μl BP für 90 min bei 25 °C
5. Waschen des trägergebundenen Oligopeptids in je 300 μl BP für 2 x 20min bei 25 °C
6. Messung per cpm
Jede einzelne Bindung wurde als Doppelbestimmung ausgeführt.
Bindungspuffer (BP):
100 mM Tris, 0,1 % Tween-20, 140 mM NaCl, 0,1 % BSA
I. Zusammenhang zwischen Bindung von TNF und der TNF-Konzentration im Bindungsansatz, Bestimmung der Bindungskonstante
Abb. l: Bindung von 1ΛJ-TNF an Oligo T2
[ r!"25'Jι-TNF] = 0,227 - 10 nM
Meßwerte zu Abb. 1 :
J-TNF HSA+BSA cpm T2 LW
227 pM 1,56 μM 3054 394
500 pM 1,62 μM 5240 672
I nM 1,74 μM 9571 875
5 nM 3,3 μM 28593 2578
10 nM 6,6 μM 59168 5536 Abb.2: Bindung von 125J-TNF an Oligo T2 [,25J-TNF] = 10 - 40 nM
Meßwerte zu Abb. 2:
"J-TNF HSA+BSA cpm T2 LW
10 nM 15 μM 6037 1680
20 nM 15 μM 25889 6021
40 nM 15 μM 31735 13785
Durch die Auswertung der Kurven aus Abb. l und Abb. 2 läßt sich für die Bindung von TNF durch das trägergebundene Oligopeptid T2 eine Bindungskonstante von 15 - 20 nM bestimmen.
II. Spezifische Hemmung der Bindung von 125 J-TNF am trägergebundenen Oligopeptid T2 durch nichtmarkiertes TNF (Kompetitionshemmung)
Abb. 3: Kompetition der Bindung von 125 J,-TNF an Oligo T2 durch unmarkiertes TNF [125J-TNF] = 4,55 nM
Meßwerte zu Abb. 3:
TNF-kalt 125J-TNF BSA+HSA cpm zu
TNF-kalt
0 1 : 0 3,00 μM 21609
4,550 nM 1 : 1 3,06 μM 18487
9,100 nM 1 : 2 3,12 μM 17170
18,200 nM 1 : 4 3,24 μM 13762 III. Bindung von J25 J-TNF aus verdünntem Blutplasma durch trägergebundenes Oligopeptid T2
Tabelle 1 : TNF-Bindung im Bindungspuffer und im mit BP verdünnten Plasma
[I25J-TNF] Plasmaanteil im TNF-Bindung
Bindungspuffer
2 nM 0 100 %
25 % 52 %
50 % 30 %
20 nM 0 100 %
25 % 58 %
59 % 33 %
IV. Spezifische Hemmung der Bindung von 125 J-TNF am trägergebundenen Oligopeptid T2 im mit BP verdünnten Plasma durch nichtmarkiertes TNF (Kompetitionshemmung)
Abb. 4: Kompetition der Bindung von I25 J-TNF an Oligo T2 durch unmarkiertes TNF in Anwesenheit von Blutplasma [125J-TNF] = 0,85 nM Anteil von Blutplasma im BP = 25 %
Meßwerte zu Abb. 4:
TNF-kalt 125J-TNF cpm zu TNF-kalt
0 1 : 0 8319
0,85 nM 1 : 1 5117
3,40 nM 1 : 4 5078 V. Ausführungsbeispiel - TNFα-Zytotoxizitäts- Versuch
Die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Peptide, am TNFα zu binden und dadurch dessen zytotoxische Eigenschaften zu neutralisieren, wurde unter Verwendung von Mäusebiofibroblasten (Zellinie L929) demonstriert.
Die Zellen wurden in Dulbecco s modifizierten Eagle s Medium (DMEM) unter Verwendung von 10 % fötalem Kälberserum (FKS) vermehrt.
24 Stunden vor dem Versuch werden die Zellen des geschlossenen Monolayer mit Trypsin/EDTA vereinzelt und in DMEM/FKS aufgenommen. In die Wells einer 96- Kavitäten-Zellzuchtplatte werden je 5 x 104 Zellen in 50 ml eingesät. Die Zellzuchtplatten werdem 3 - 5 Stunden bei 37 °C in einer 5 %igen CO2- Atmosphäre inkubiert. Der Monolayer sollte vor Verwendung etwa zu 50 % geschlossen sein. Von den zu testenden Peptiden werden etwa 2 mM-Lösungen in 10 mM HEPES (pH 7,5) hergestellt. Die Lösungen werden steril filtriert (200 nm) und in Verdünnungsstufen 1 : 4 in 10 mM HEPES (pH 7,5) verdünnt. Als Kontrolle dient der monoklonale Antikörper TA-31 (Sigma) mit bekannter Inaktivierungsaktivität.
DMEM/FKS wird mit Actinomycin D (10 μg/ml) und rekombinantem humanen TNFα (1 ng/ml) versetzt. 75 μl dieser Lösung werden mit 75 μl der jeweiligen Peptidverdünnung, bzw. des Antikörpers (Kontrolle 1) oder HEPES (Kontrolle 2) gemischt. Nach einer Inkubation von 30 min bei Raumtemperatur wird das Gemisch jeder Peptidverdünnungsstufe bzw. der Kontrollen in jeweils 3 Kavitäten inokuliert (je 50 μl/Kavität), in denen je 50 μl der Zellsuspension vorinkubiert wurde. Als Kontrolle 3 dienen ein Gemisch von 25 μl/Well DMEM/FKS mit Actinomycin D (10 mg/ml) und 25 l/Well HEPES (pH 7,5).
Die Zellzuchtplatten werden über Nacht bei 37 °C in einer 5 %igen CO2- Atmosphäre inkubiert. Nach Kristallviolettanl rbung der nicht lysierten Zellen wird die relative Hemmung der zytotoxischen TNFα-Aktivität durch die Peptide ermittelt.

Claims

Patentansprüche
1. TNFα bindende Peptide, bestehend aus 4-9 Aminosäuren.
2. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Aminosäure-Sequenz I
I NH--I-Q-T-L-H-A-Q-COOH
3. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mindestens 4 Aminosäuren langen Bruchstücken der Formel I bestehen.
4. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 2 und 3, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne Aminosäuren durch analoge Aminosäuren ausgetauscht sind.
5. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 1, gekennzeichnet durch die Aminosäure-Sequenz II
II NH2-R-L-A-N-T-F-H-V-Y-COOH
6. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 1 und 5, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus mindestens 4 Aminosäuren langen Bruchstücken der Formel II bestehen.
7. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, daß einzelne Aminosäuren durch analoge Aminosäuren ausgetauscht sind.
8. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 1 - 7, dadurch gekennzeichnet, daß sie am N- und/oder C-Terminus blockiert sind.
9. TNFα bindende Peptide nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie durch Acetylierung, Alkylierung, Aralkylierung oder Amidierung blockiert sind.
10. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 - 9 als Diagnostikum zur Detektion von TNFα.
11. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 - 9 zur Inaktivierung und/oder Entfernung von TNFα in Körperflüssigkeiten.
12. Verwendung der Peptide gemäß Anspruch 1 - 9 als Arzneimittel zur Bekämpfung neoplastischer und Autoimmun-Erkrankungen sowie zur Bekämpfung und Prophylaxe von Infektionen, Entzündungen und Abstoßungsreaktionen bei Transplantationen bzw. als spezifischer Ligand zur Detoxikation allein oder in Kombination mit geeigneten Trägern.
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