DE20002319U1 - Vorrichtung zur Ermittlung von im Körper eines Individuums gegebenenfalls vorhandenen bestimmten Zellen, insbesondere von malignen Zellen - Google Patents

Vorrichtung zur Ermittlung von im Körper eines Individuums gegebenenfalls vorhandenen bestimmten Zellen, insbesondere von malignen Zellen

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Description

Dr. Kubier GmbH 20 U 021
Vorrichtung zur Ermittlung von im Körper eines Individuums gegebenenfalls vorhandenen bestimmten Zellen, insbesondere von malignen Zellen
Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Ermittlung von im Körper eines Individuums gegebenenfalls vorhandenen bestimmten Zellen, insbesondere von malignen Zellen, durch Bestimmen der im Blut des betreffenden Individuums enthaltenen Zellen mittels einer Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungstechnik (FISH).
Im Zusammenhang mit der Ermittlung von Tumorzellen, die im peripheren Blut von Patienten mit einem Mammakarzinom oder Ovarkarzinom zirkulieren, ist bereits ein molekulares cytogenes Verfahren bekannt (British Journal of Cancer (1999) 81(7), Seiten 1165-1173). Durch dieses bekannte Verfahren soll die Ermittlung von Mikrometastasen zur Diagnose und zur Entwicklung neuer therapeutischer Ansätze genutzt werden. Dabei wird das Vorhandensein von Tumorzellen im peripheren Patientenblut durch die kombinierte Anwendung eines magnetisch aktivierten Zeilsortierverfahrens (MACS) und eines Fluoreszenz-insitu-Hybridisierungsverfahrens (FISH) durchgeführt. Es hat sich allerdings gezeigt, dass die magnetische Zelltrennung die für Diagnose- und Therapiezwecke zu erfassenden Tumorzellen nicht in dem erwünschten Umfang bereitzustellen imstande ist, wie dies für eine effiziente Vorgehensweise notwendig ist.
Es ist ferner ein Verfahren zur Isolierung und Kultivierung von im Blutstrom eines Individuums zirkulierenden transformierten Zellen bekannt (DE 42 28 389 C2), bei dem man durch Zentrifugation von Blut mittels einer zur Abtrennung von
Lymphozyten geeigneten, kontinuierlich betriebenen Zentrifuge einen Buffy-Coat, der die transformierten Zellen, Leukozyten und Lymphozyten enthält, über einen der Zentrifuge nachgeschalteten Bypass entnimmt und den Buffy-Coat unter Vermehrung der transformierten Zellen kultiviert. Durch diese Maßnahme gelingt es, in effizienter Weise in Kultur vermehrte, transformierte Zellen bereitzustellen, die sowohl für Diagnosezwecke als auch für Therapiezwecke genutzt werden können. So können die in Kultur vermehrten transformierten Zellen zur Herstellung von Individuum-spezifischen, gegen Tumorantigene gerichteten monoklonalen Antikörpern verwendet werden. Um die betreffenden transformierten Zellen in der verwendeten Kultur für die erwähnten Aufgaben nutzen zu können, beansprucht der durchzuführende Kultivierungsschritt allerdings eine gewisse Zeitspanne. Diese Zeitspanne für die Durchführung einer raschen Diagnose zur Bestimmung der malignen Zellen zu verkürzen ist sehr erwünscht.
Der Erfindung liegt demgemäß die Aufgabe zugrunde, einen Weg 0 zu zeigen, wie eine Vorrichtung der eingangs genannten Art auszubilden ist, um im Körper eines Individuums gegebenenfalls vorhandene bestimmte Zellen, und zwar insbesondere maligne Zellen, sowohl schneller als bei dem zuletzt betrachteten bekannten Verfahren als auch effizienter ermitteln und damit bestimmen zu können, als dies bei dem eingangs genannten Verfahren möglich ist.
Gelöst wird die vorstehend aufgezeigte Aufgabe bei einer Vorrichtung der eingangs genannten Art erfindungsgemäß dadurch, dass eine Blutaufnahmestufe vorgesehen ist, in der Blut des genannten Individuums aufnehmbar ist, dass mit der Blutentnahmestufe eine Zentrifugationsstufe verbunden ist, in der aus dem in der Blutaufnahmestufe aufgenommenen Blut das für eine Zellbestimmung dienende Zellmaterial bereitstellbar ist,
dass der Zentrifugationsstufe eine Zellenaufnahmestufe mit einer Zellenaufnahmeeinrichtung nachgeordnet ist, in der von
der Zentrifugationsstufe bereitgestelltes Zellmaterial aufnehmbar ist,
dass der Zellenaufnahmestufe eine Wasch- und Zentrifugationsstuf e nachgeordnet ist, in der von dem Zellmaterial, welches in der Zellenaufnahmeeinrichtung aufgenommenen ist, lediglich eine Einfachschicht aus Zellen festgehalten bleibt, dass eine Premix-Äbgabestufe vorgesehen ist, in der an die Zellen in der von der Wasch- und Zentrifugationsstufe abgegebenen Zellenaufnahmeeinrichtung ein eine Hybridisierung ermöglichendes DNA- oder mRNA-Material abgebbar ist, dass eine DNA- bzw. mRNA-Sondenstufe vorgesehen ist, in der ein den zu bestimmenden Zellen entsprechender fluorisierbarer Farbstoff an die in der Zellenaufnahmeeinrichtung befindlichen Zellen abgebbar ist,
und dass eine Auswertestufe vorgesehen ist, in der mittels einer optischen Erkennungseinrichtung die in der Zellenaufnahmeeinrichtung befindlichen, durch die genannte DNA- bzw. mRNA-Sondenstufe mit fluorisierbarem Farbstoff versehenen Zellen bestimmbar sind.
Die Erfindung bringt den Vorteil mit sich, dass gegenüber dem eingangs betrachteten bekannten Verfahren mit der magnetisch aktivierten Zellsortierung (MACS) und der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) eine wesentlich effizientere Bereitstellung der jeweils zu ermittelnden und zu bestimmenden Zellen, insbesondere von malignen Zellen, möglich ist und dass dies überdies während einer wesentlich kürzeren Zeitspanne in Verbindung mit einem spezifischeren und empfindlicheren Nachweis der jeweiligen Zellen ermöglicht ist als bei dem oben betrachteten Verfahren, bei dem die im Blutstrom eines Individuums zirkulierenden transformierten Zellen apheretisch mittels einer Zentrifuge und nachgeschalteter Zellkultivierung gewonnen werden. Die erwähnte Zeitersparnis gegenüber dem zuletzt erwähnten bekannten Verfahren beträgt bei Anwendung der Erfindung etwa 70%. Im übrigen werden bei der Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung die bei dem eingangs betrachteten Verfahren mit magnetisch aktivierter Zellsortierung (MACS) ange-
wandten Schritte nicht einfach durch Schritte ersetzt, wie sie bei dem oben aufgezeigten bekannten apheretisch arbeitenden Zeilgewinnungsverfahren angewandt sind. Vielmehr sind einzelne Verfahrensschritte dieses zuletzt erwähnten Verfahrens ausführende Vorrichtungsstufen mit für die Ausführung der FISH-Technik dienenden Vorrichtungsstufen in spezifischer Weise optimal kombiniert, was indessen durch einfache Zusammenfassung der betreffenden bekannten Verfahren nicht erreichbar ist.
Durch die vorliegende Erfindung wird in der Zellenaufnahmeeinrichtung stets eine Einfachschicht (Monolayer) aus den zu bestimmenden Zellen erhalten, indem lediglich peripheres Blut des jeweiligen Individuums verwendet wird. Dabei sind eine Parafinisierung und eine Entparafinisierung der Zellen nicht erforderlich, wie dies bei der herkömmlichen FISH-Technik allerdings notwendig ist. Durch die direkte Zuordnung von Chromosomen bzw. des mRNA-Materials zu den einzelnen Zellen ist eine genaue qualitative Unterscheidung und Quantifizierung der Zellen möglich.
Zweckmäßigerweise weist die bei der Vorrichtung gemäß der Erfindung vorgesehene Zentrifugationsstufe eine Aphereseeinrichtung auf. Dies bringt den Vorteil eines besonders geringen konstruktiven Aufwands hinsichtlich der Zentrifugationsstufe mit sich. Im Hinblick auf die Bestimmung von malignen Zellen ist dadurch sichergestellt, dass in dieser Vorrichtungsstufe ein repräsentativer Querschnitt der im peripheren Blut des jeweiligen Individuums befindlichen malignen Zellen bzw. Tumorzellen bereitgestellt wird.
Von besonderem Vorteil ist es, wenn die optische Erkennungseinrichtung ein Fluoreszenzmikroskop enthält. Dadurch läßt sich die erwähnte FISH-Technik in besonders effizienter Weise für die Ermittlung und Bestimmung von Zellen, insbesondere von malignen Zellen, nutzen.
Es ist aber auch möglich, dass die optische Erkennungseinrichtung eine optische Abtast- und Farberkennungseinrichtung enthält. Durch diese Maßnahme läßt sich der Einsatz der Vorrichtung gemäß der Erfindung automatisieren, und außerdem sind durch Einsatz einer solchen optischen Abtast- und Farberkennungseinrichtung Auswerteergebnisse in der Regel schneller und genauer erzielbar als durch direkte visuelle Auswertung.
Von Vorteil im Falle der zuletzt betrachteten optischen Erkennungseinrichtung ist es ferner, wenn mit der Abtast- und Farberkennungseinrichtung eine Zähleinrichtung verbunden ist. Dadurch lassen sich die mit unterschiedlicher Färbung sichtbaren Zellen besonders einfach für ihre Klassifizierung erfassen.
Anhand einer Zeichnung wird die Erfindung nachstehend beispielsweise näher erläutert.
In der Zeichnung ist in einem Blockdiagramm der prinzipielle Aufbau einer Vorrichtung gemäß der Erfindung veranschaulicht.
Die in der Zeichnung dargestellte Vorrichtung weist zunächst eine Blutaufnahmestufe 1 auf, der eine Zentrifugationsstufe 2 nachgeordnet ist, die vorzugsweise eine Aphereseeinrichtung aufweist. In der Blutaufnahmestufe 1 wird Blut von einem Individuum aufgenommen, welches in der nachgeordneten Zentrifugationsstufe 2 dann einer solchen Zentrifugation unterzogen wird, dass aus dem in der Blutaufnahmestufe 1 aufgenommenen Blut das für eine Zellbestimmung dienende Zellmaterial bereitstellbar ist. Gegebenenfalls können die Blutaufnahmestufe und die Zentrifugationsstufe 2 eine einzige Stufe bilden, die die erwähnte Aphereseeinrichtung enthält.
Der Zentrifugationsstufe 2 ist eine Zellenaufnahmestufe 3 mit einer Zellenaufnahmeeinrichtung nachgeordnet, in der von der Zentrifugationsstufe 2 bereitgestelltes Zellmaterial aufnehmbar ist. Die betreffende Zellenaufnahmeeinrichtung erhält zumindest einen Teil der von der Zentrifugationsstufe 2 abgege-
benen Zellen nach deren Reinigung und Aufnahme in einem Nähmedium (HBSS), wie beispielsweise etwa 300 000 Zellen. Als Zellenaufnahmeeinrichtung dient dabei vorzugsweise eine mit Vertiefungen für die Aufnahme der Zellen dienende, insbesondere mit Glutaraldehyd beschichtete Trägerplatte (fachspezifisch als Well eines Chamber-Slides (Nunc, 8 Well-Chamber-Slit) bezeichnet).
Der Zellenaufnahmestufe 3 ist eine Wasch- und Zentrifugationsstufe 4 nachgeordnet, in der von dem Zellmaterial, welches von der Zellenaufnahmeeinrichtung aufgenommen ist, lediglich eine Einfachschicht (auch als Monolayer bezeichnet) aus Zellen festgehalten bleibt. Dazu wird die erwähnte Zellenaufnahmeeinrichtung in der Wasch- und Zentrifugationsstufe 4 zentrifugiert, woraufhin die Zellen bei einer Temperatur von beispielsweise 370C etwa 20 Minuten lang einer z. B. 0,28%igen wässrigen Kaliumchloridlösung ausgesetzt werden (300pl/Well). Bevor in der Wasch- und Zentrifugationsstufe 4 ein weiterer Zentrifugationsvorgang ausgeführt wird, wird vorzugsweise der 0 erwähnten Zellenaufnahmeeinrichtung etwa 100&mgr;1 einer Lösung hinzugesetzt, die aus Methanol und Eisessig (im Verhältnis von beispielsweise 3:1) besteht. Anschließend wird die Zellenaufnahmeeinrichtung mit den an ihr haftenden Zellen in der Wasch- und Zentrifugationsstufe 4 bei einer Temperatur von etwa 40C der Methanol-Eisessig-Lösung während einer Dauer von ca. 30 Minuten ausgesetzt.
Neben den zuvor betrachteten Stufen weist die Vorrichtung gemäß der Erfindung auch eine der Wasch- und Zentrifugationsstufe 4 gewissermaßen nachgeordnete Premix-Abgabestufe 5 auf, in der an die Zellen in der von der Wasch- und Zentrifugationsstufe 4 abgegebenen Zellenaufnahmeeinrichtung ein eine Hybridisierung ermöglichendes DNA- oder mRNA-Material abgebbar ist. Damit ist die nachfolgend durchzuführende Fluoreszenz-insitu-Hybridisierung entsprechend den jeweils zu ermittelnden und bestimmenden Zellen vorbereitet. Das betreffende DNA- oder
mRNA-Material ist dabei entsprechend der jeweiligen Herstellervorschrift zu verwenden.
Bevor das DNA- oder mRNA-Material an die in der Zellenaufnahmeeinrichtung aufgenommenen Zellen abgebbar ist, wird die in der betreffenden Zellenaufnahmeeinrichtung noch befindliche Methanol-Eisessig-Lösung entfernt, und zwar vorzugsweise bis auf einen geringen Teil.
In einer der Premix-Abgabestufe 5 nachgeordneten mRNA-/DNA-Sondenstufe 6 ist an die in der Zellenaufnahmeeinrichtung befindlichen Zellen ein den zu bestimmenden Zellen entsprechender fluorisierbarer Farbstoff abgebbar. Die betreffende DNA bzw. mRNA-Sondenstufe 6 weist im übrigen eine Temperatureinrichtung auf, die die für das Anbinden des betreffenden fluorisierbaren Farbstoffs an das zuvor erwähnte DNA- oder mRNA-Material erforderliche bzw. begünstigende Wärme liefert.
In der DNA- bzw. mRNA-Sondenstufe 6 kann ferner eine Wascheinrichtung enthalten sein, mit der nach der durchgeführten Hybridisierung die Zellenaufnahmeeinrichtung mit ihren Zellen, dem DNA oder mRNA-Material und dem fluorisierbaren Farbstoff einem Waschprogramm unterziehbar ist. Ferner können in der DNA- bzw. mRNA-Sondenstufe 6 ein Farbreagenz und ein Eindickmittel auf die von der Zellenaufnahmeeinrichtung aufgenommene Probe mittels entsprechender Abgabeeinrichtungen abgegeben werden.
An die vorstehend betrachtete DNA- bzw. mRNA-Sondenstufe 6 schließt sich als letzte Stufe der Vorrichtung gemäß der Erfindung eine Auswertestufe 7 an, in der mittels einer optischen Erkennungseinrichtung die in der Zellenaufnahmeeinrichtung befindlichen, durch die genannte DNA- bzw. mRNA-Sondenstufe 6 mit fluorisierbarem Farbstoff versehenen Zellen bestimmbar sind. Vorzugsweise enthält die betreffende Auswertestufe ein mit einer UV-Lichtquelle ausgestattetes Fluoreszenzmikroskop, mit dem die Zellbestimmung visuell vorgenommen wer-
den kann. Es ist aber auch möglich und für eine automatisiert arbeitende Vorrichtung zweckmäßig, als optische Erkennungseinrichtung eine optische Abtast- und Farberkennungseinrichtung vorzusehen, mit der vorzugsweise eine Zähleinrichtung verbunden ist. Diese Zähleinrichtung kann dann die Anzahl der in
unterschiedlichen Farben erscheinenden Zellen der jeweiligen Probe zählen, so dass die betreffenden Zellen für weitere Auswertungen klassifiziert werden können.
Abschließend sie noch angemerkt, dass die in der vorstehenden Figurenbeschreibung im Zusammenhang mit in einzelnen Vorrichtungsstufen verwendeten Stoffen und deren Mengen bzw. Zusammensetzungen
angegebenen Zahlenwerte typische Angaben im Hinblick auf die Ermittlung und Bestimmung von malignen Zellen
sind, die im Blut eines Individuums zirkulieren, in dessen
Körper sich mindestens ein solider Tumor befindet. Zur Ermittlung und Bestimmung von anderen Zellen eines Individuums sind diesen Zellen entsprechend angepaßte Stoffe, Mengen und Zusammensetzungen anzuwenden.

Claims (5)

1. Vorrichtung zur Ermittlung von im Körper eines Individuums gegebenenfalls vorhandenen bestimmten Zellen, insbesondere von malignen Zellen, durch Bestimmen der im Blut des betreffenden Individuums enthaltenen Zellen mittels einer Fluoreszenz-insitu-Hybridisierungstechnik (FISH), dadurch gekennzeichnet,
dass eine Blutaufnahmestufe (1) vorgesehen ist, in der Blut des genannten Individuums aufnehmbar ist,
dass mit der Blutentnahmestufe (1) eine Zentrifugationsstufe (2) verbunden ist, in der aus dem in der Blutaufnahmestufe (1) aufgenommenen Blut das für eine Zellbestimmung dienende Zellmaterial bereitstellbar ist,
dass der Zentrifugationsstufe (2) eine Zellenaufnahmestufe (3) mit einer Zellenaufnahmeeinrichtung nachgeordnet ist, in der von der Zentrifugationsstufe (2) bereitgestelltes Zellmaterial aufnehmbar ist,
dass der Zellenaufnahmestufe (3) eine Wasch- und Zentrifugationsstufe (4) nachgeordnet ist, in der von dem Zellmaterial, welches in der Zellenaufnahmeeinrichtung aufgenommenen ist,
lediglich eine Einfachschicht aus Zellen festgehalten bleibt, dass eine Premix-Abgabestufe (5) vorgesehen ist, in der an die Zellen in der von der Wasch- und Zentrifugationsstufe (4) abgegebenen Zellenaufnahmeeinrichtung ein eine Hybridisierung ermöglichendes DNA- oder mRNA-Material abgebbar ist,
dass eine DNA- bzw. mRNA-Sondenstufe (6) vorgesehen ist, in der ein den zu bestimmenden Zellen entsprechender fluorisierbarer Farbstoff an die in der Zellenaufnahmeeinrichtung befindlichen Zellen abgebbar ist,
und dass eine Auswertestufe (7) vorgesehen ist, in der mittels einer optischen Erkennungseinrichtung die in der Zellenaufnahmeeinrichtung befindlichen, durch die genannte DNA- bzw. mB-NA- Sondenstufe (6) mit fluorisierbarem Farbstoff versehenen Zellen bestimmbar sind.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Zentrifugationsstufe (2) eine Aphereseeinrichtung aufweist.
3. Vorrichtung nach Ansprüche 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Erkennungseinrichtung ein Fluoreszenzmikroskop enthält.
4. Vorrichtung nach Ansprüche 1 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die optische Erkennungseinrichtung eine optische Abtast- und Farberkennungseinrichtung enthält.
5. Vorrichtung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass mit der Abtast- und Farberkennungseinrichtung eine Zähleinrichtung verbunden ist.
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