DE3852004T2

DE3852004T2 - Verfahren zur feststellung der expression bioregulatorischer gene in mikrokulturen eukariontischer zellen.

Info

Publication number: DE3852004T2
Application number: DE3852004T
Authority: DE
Inventors: Gila Arrad; Lisya Gerez; Raymond Kaempfer
Original assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Current assignee: Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date: 1987-04-15
Filing date: 1988-04-05
Publication date: 1995-06-01
Anticipated expiration: 2008-04-06
Also published as: EP0309558A4; WO1988008038A1; EP0309558A1; DE3852004D1; ES2009261A6; ATE113665T1; JPH01503598A; PT87224B; EP0309558B1; PT87224A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Expression bioregulatorischer Gene in Mikrokulturen eukaryotischer Zellen. Die vorliegende Erfindung ist insbesondere sowohl für die Diagnose als auch zur Gewinnung eines grundlegenden Verständnisses der Entstehung und der Dynamik viraler, bakterieller, pilzbedingter, onkogener und immunregulatorischer Erkrankungen verwendbar. Sie ist ferner zur Überwachung der Wirksamkeit von Therapien bei diesen Krankheiten verwendbar. Ferner werden Diagnose-Kits zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angegeben.
Cytokine, bei denen es sich um lösliche Zellprodukte handelt, die sich wie lokal wirkende Hormone verhalten, die das Wachstum und Verhalten anderer Zellen regulieren, sind am normalen Ablauf physiologischer Prozesse beteiligt. Zu den Cytokinen gehören die Interferone, Interleukine, Tumornekrosefaktoren und ähnliche Substanzen und die Wachstumsfaktoren.
Die Untersuchung der Cytokine hat zu der wichtigen medizinischen Entwicklung der Biotherapie geführt. Die Biotherapie mit Cytokinen stellt eine Verbesserung im Vergleich zu vorhandenen Methoden zur Behandlung viraler, bakterieller, pilzbedingter, onkogener und immunregulatorischer Erkrankungen dar.
Eukaryotische Zellen, wie z.B. Lymphocyten, Monocyten, Fibroblasten, Keratinocyten, Astrocyten, Endothelzellen, Gliazellen und Blutplättchen, produzieren Cytokine als Reaktion auf verschiedene biologische Erfordernisse und Funktionen.
In eukaryotischen Zellen ist die Genexpression mit der Bildung von Messenger-RNA während des Vorgangs der Proteinsynthese verbunden. Es ist deshalb möglich, die Genexpression durch quantitative Bestimmung der vorhandenen Menge an mRNA, die für verschiedene Cytokine spezifisch ist, zu messen.
Zur Zeit gibt es kein direktes Verfahren als Test für die Dynamik der Immunantwort bei einem bestimmten Patienten, obwohl diese Information von großer klinischer Bedeutung für Diagnose und Ausrichtung der Therapie bei vielen Krankheiten, zu denen Krebs, Autoimmunerkrankungen und Immundefekt- Syndrome gehören, sein könnte. Monoklonale Antikörper können zur Zählung von Untergruppen von T-Zellen verwendet werden, geben aber keine Informationen über die Funktion und das dynamische Ansprechvermögen des Immunsystems. Drei Gene des Menschen haben eine Schlüsselbedeutung bei der Bestimmung der Stärke der Immunantwort. Sie codieren Interleukin 2 (IL- 2) oder T-Zell-Wachstumsfaktor, den Rezeptor für IL-2 (IL- 2R) und Immun-Interferon oder γ-Interferon (IFN-γ). Die Expression dieser Gene, die durch Immunstimulantien hervorgerufen wird, ist normalerweise durch vor kurzem erkannte molekulare Mechanismen in erheblichem Umfang heruntergeregelt (bis zu 99 %), [S. Efrat und R. Kaempfer, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, S. 2601-2605 (1984); S. Efrat, S. Zelig, B. Yagen und R. Kaempfer, Biochem. Biophys Res. Commun. 123, S. 842-848 (1984); R. Kaempfer und S. Efrat, Cellular and Molecular Biology of Lymphokines (C. Sorg und A. Schimpl, Hrsg.), Academic Press, Orlando, Fla., S. 605-618 (1985); R. Kaempfer, S. Efrat und S. Marsh, Molecular Cloning and Analysis of Lymphokines (D.R. Webb and D. Goeddel, Hrsg.) Academic Press, Orlando, Fla., S. 59-72 (1987); M.A. Lebendiker, C. Tal, D. Sayar, S. Pilo, A. Eilon, Y. Banai und R. Kaempfer, EMBO J. 6, S. 585-589 (1987)], was teilweise durch Wechselwirkungen zwischen Untergruppen von Zellen des Immunsystems hervorgerufen wird [R. Kaempfer und S. Efrat, Leukocytes and Host Defense (J.J. Oppenheim and D.M. Jacobs, Hrsg.) Alan R. Liss, Inc., NY, S. 57-68 (1986); M.A. Lebendiker, C. Tal, D. Sayar, S. Pilo, A. Eilon, Y. Banai und R. Kaempfer, EMBO J. 6, S. 585-589 (1987); R. Kaempfer, D. Sayar, S. Efrat, M. Lebendiker, M. Ketzinel und C. Tal, Lymphokine Research 6, Band 1, 5th International Lymphokine Workshop Abstr. 1640 (1987)]. Außerdem ist die Expression dieser drei Gene funktionell verknüpft, wodurch eine Korelation wechselwirkender Gene hervorgerufen wird, die in verschiedenen Lymphocyten exprimiert werden. Herkömmliche Verfahren zur Gewinnung von RNA aus Zellen umfassen üblicherweise die Lyse der Zellen und Ultrazentifugation im Cäsiumchlorid-Dichtegradienten, sind zeitaufwendig, beschwerlich und erfordern eine große Anzahl an Zellen und eine aufwendige Ausrüstung. Verfahren, von denen man weiß, daß sie für eine kleine Anzahl an Zellen geeignet sind, weisen bei Anwendung auf periphere Blutzellen den Nachteil auf, daß die quantitative Bestimmung der durch ein spezielles Gen codierten RNA für eine präzise Messung der Genexpression nicht genau genug ist.
Die herkömmlichen SDS- und NP-40-Verfahren zur Gewinnung von mRNA [B.A. White und F.C.S. Bancroft, J. Biol. Chem., 257, S. 8569 (1982)] sind für den Nachweis von Cytokinen ungeeignet, weil durch die Gegenwart verunreinigender Proteine die vorhandene RNA überdeckt wird und ein gewisser Abbau der RNA während der vielen Arbeitsgänge, die mit diesen Verfahren verbunden sind, stattfindet.
Der Direkt-Blot mit Guanidiniumthiocyanat (GCN) [M. Matsuyama, K. Sugamura, Y. Kawade und Y.J. Hinuma, Immunology 129, S. 450 (1982)] ist ungeeignet, weil die Verarbeitung der RNA-Fraktionen durch die Viskosität der DNA gestört wird. Dieses Verfahren ist dadurch limitiert, daß nicht mehr als 10&sup5; Zellen analysiert werden können, was zu wenig ist für den Nachweis der Expression von Cytokine-Genen, die auf niedrigerem Niveau als die Expression der meisten anderen Gene stattfindet.
Andere Verfahren zur Gewinnung von RNA, die auf Guanidiniumthiocyanat basieren, wie z.B. das GCN-LiCl-Verfahren (J.F. Cathala G. Savouret, B. Mendet, B.L. West, M. Karin, J.A. Martial und J.D. Baxter, DNA, 2, S. 239 1983) ergeben reine mRNA, sind jedoch für die bequeme Verarbeitung einer großen Anzahl von Proben mit zu vielen Schritten verbunden und verursachen einen beträchtlichen Verlust an RNA.
Ein auf Guanidinhydrochlorid basierendes Verfahren [(S. Cheley und R. Andersen, Anal. Biochem., 137, S. 15 (1984)] wurde zum Nachweis viraler RNA verwendet, die bei chronischen Virusinfektionen exprimiert wird.
Verfahren zur Gewinnung von RNA unter Verwendung von Guanidiniumsalzen, typischerweise Guanidinhydrochlorid und Guanidiniumthiocyanat, sind von J.R. MacDonald, G.H. Swift, A.E. Przybyla und J.M. Chirgwin (Methods in Enzymology, 152, S. 219 (1987)) veröffentlicht worden; in diesen Artikeln wird festgestellt, daß selektive Fällungen aus Guanidinium-Lösungen gegebenenfalls nicht quantitativ sind und in nicht vorhersehbarer Weise durch Bestandteile des Homogenisats beeinflußt werden. Dort ist offenbart, daß dieses Problem im allgemeinen dann größer ist, wenn die RNA-Konzentration im Homogenisat sehr gering ist.
Die Erfinder haben festgestellt, daß eine modifizierte Form dieses Verfahrens zum Nachweis der Expression bioregulatorischer Gene in eukaryotischen Zellen unter der Voraussetzung verwendet werden kann, daß geeignete Schritte zur Induzierung der Expression von einem oder mehreren bioregulatorischen Genen durchgeführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur zuverlässigen und wiederholten Identifizierung und Quantifizierung der Expression bioregulatorischer Gene in nur wenigen Millilitern peripheren Bluts verwendet werden, das einem bestimmten Patienten entnommen worden ist. Die Erfinder haben außerdem festgestellt, daß durch den Einsatz einer Vielzahl von induzierenden Prozessen bei verschiedenen Proben der eukaryotischen Zellen ein wesentlich besseres Verständnis der dynamischen Funktionalität der Gene in der Zellprobe erhalten werden kann als dies mit irgendeiner bekannten Technik möglich ist.
Die Erfinder haben ein Verfahren ausgewählt und angegeben, mit dem die Nachteile des Standes der Technik bei der Messung der Genexpression in Zellen, die Cytokine produzieren, überwunden werden, bei dem die Expression von Cytokine produzierenden Zellen induziert und diese Expression in einer kleineren Anzahl an Zellen nachgewiesen wird, als dies bisher möglich war, unter definierten Kultivierungsbedingungen, die nicht nur die Messung der tatsächlichen Expression eines Cytokine-Gens, sondern auch der funktionellen Intaktheit der Regulationsmechanismen, die die Expression dieser Gene kontrollieren, und ihre Störung in pathologischen Zuständen ermöglicht. Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein hocheffizientes Verfahren zur Gewinnung von mRNA aus geeignet kultivierten einkernigen Zellpopulationen des peripheren menschlichen Blutes anzugeben, durch das die Empfindlichkeit beim Nachweis der Expression von Cytokine-Genen erhöht wird und Poolartefakte, die bei Anwendung der standardmäßigen Northern-Blot-Analyse auftreten, vermieden werden, um die normale oder anomale Expression von Cytokine-Genen und ihre Regulation zu testen.

Zusammenfassung der Erfindung

Es ist den Erfindern nun gelungen, ein Verfahren anzugeben, das den genauen und empfindlichen Nachweis der transienten Expression bioregulatorischer Gene in Situationen erlaubt, in denen die Expression üblicherweise sehr gering ausfällt und fast nicht nachweisbar ist und nur kleine Zellproben zur Verfügung stehen.
Mit dem erfindungemäßen Verfahren kann nach bevorzugten Ausführungsformen das Ausmaß der Genexpression in nur einer halben Million Zellen oder in bis zu 500fach weniger Zellen im Vergleich zu der Anzahl an Zellen, die bei den Standardverfahren gebraucht werden, die bisher zum Nachweis der Expression solcher Gene verwendet wurden, genau überwacht werden. Dies erlaubt die Untersuchung der Expression verschiedener bioregulatorischer Gene in nur wenigen Millilitern Peripheren Bluts, das dem Patienten leicht entnommen werden kann und in dem viele Gene mit Schlüsselbedeutung für die Bioregulation exprimiert werden.
Es ist Gegenstand der Erfindung, ein allgemeines Verfahren zum Nachweis der Expression bioregulatorischer Gene in Mikrokulturen eukaryotischer Zellen anzugeben, das einen großen diagnostischen und therapeutischen Wert aufweist, das folgende Schritte umfaßt:
(a) Isolieren einer Probe der eukaryotischen Zellen,
(b) Aufteilen in mindestens zwei Aliquote,
(c) Kultivieren der Zellen in jedem Aliquot,
(d) Lysieren der kultivierten Zellen mit Guanidiniumthiocyanat oder Guanidinhydrochlorid,
(e) Homogenisieren und darauffolgend selektives Fällen der Ribonucleinsäure durch aufeinanderfolgende Zugabe von Natrium- oder Kaliumacetatlösung und von absolutem Ethanol zur homogenisierten Zellzubereitung,
(f) Gewinnen und Blotting der RNA aus jedem Aliquot auf eine Trägermatrix,
(g) Hybridisieren der gewonnenen und durch Blotting übertragenen RNA mit einer markierten RNA-Sonde, die für mindestens eines der obengenannten Gene spezifisch ist, und
(h) quantitative Bestimmung des Ausmaßes der Bindung der markierten RNA-Sonde an die durch Blotting übertragene RNA,
wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß in Schritt (c):
(c) (i) die Zellen in dem ersten Aliquot in Gegenwart eines Mittels kultiviert werden, das die Expression des bioregulatorischen Gens induziert, und
(c) (ii) die Zellen in dem zweiten Aliquot ohne eine induzierendes Mittel kultiviert werden,
und daß
(i) das Verhältnis des Ausmaßes der Genexpression im ersten Aliquot zum Ausmaß der Genexpression im zweiten Aliquot berechnet wird, wobei dieses Verhältnis ein Maß für die Induzierbarkeit des bioregulatorischen Gens liefert.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform wird der Lyse-Schritt (d) unter Zugabe von Guanidiniumthiocyanat und das selektive Fällen in Schritt (e) unter aufeinanderfolgender Zugabe von Lithiumchlorid, Natrium- oder Kaliumacetatlösung und absolutem Ethanol durchgeführt.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise zum Nachweis der Expression bioregulatorischer Gene, die unter Genen ausgewählt sind, die Interferone, Interleukine, Tumornekrosefaktoren und Wachstumsfaktoren codieren, durchgeführt, wobei die eukaryotischen Zellen Lymphocyten, Monocyten, Keratinocyten, Fibroblasten, Astrocyten, Endothelzellen, Gliazellen und Blutplättchen umfassen. Die Expression bioregulatorischer Gene wird vorzugsweise durch Verbindungen wie Phytohämagglutinin oder Concanavalin A induziert, gegebenenfalls mit Cycloheximid und unter Bestrahlung mit γ-Strahlen oder einer geeigneten Kombination davon. Die Bestrahlung mit γ-Strahlen verhindert beispielsweise die Aktivierung von T-Suppressorzellen [M. Gullberg, E.L. Larsson, Journal of Immunology, 128, S. 746 (1982)], wodurch die Expression des IFN-γ-Gens beeinflußt wird [M.A. Lebendiker, C. Tal, D. Sayer, S. Pilo, Y. Banai, A. Eilon und R. Kaempfer, EMBO, 6, S. 658 (1987)]. Cycloheximid ist ein Mittel, das zu einer anomalen Expression des IL-2-Gens [S. Efrat und R. Kaempfer, Proc. Natl. Adac. Sci., USA, 81, S. 2601 (1984)] und des IFN-γ-Gens (M.A. Lebendiker, C. Tal, D. Sayar, S. Pilo, Y. Banai, A. Eilon und R. Kaempfer, EMBO, 6, S. 585 (1987)] führt.
Ein geeignetes induzierendes Mittel ist Phytohämagglutinin. Das Verhältnis des Niveaus der induzierten Expression zum Grundniveau der Expression läßt darauf schließen, ob die Genregulation normal ist oder nicht. Gewünschtenfalls kann die Induzierung in getrennten Aliquoten der Zellprobe durchgeführt werden, um kinetische Informationen über den Ablauf der Induzierung zu erhalten.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden weitere oder andere induzierende Mittel, wie z.B. Cycloheximid, in zusätzliche Aliquote der Zellprobe zur Superinduzierung der Zellen gegeben. Eine solche Superinduzierung kann das maximale Potential der Genexpression anzeigen. Dies ist wiederum ein Anhaltspunkt für das Ausmaß, in dem das Grundniveau der Expression dem maximalen Ausmaß der Genexpression nahekommt.
Es ist festgestellt worden, daß T-Suppressorzellen mindestens einige Cytokine-Gene herunterregulieren. Die Bestrahlung mit γ-Strahlen verhindert die Aktivierung der T-Suppressorzellen. Es ist demnach vorteilhaft, wenn ein Aliquot der Zellprobe einer Superinduzierung und der Bestrahlung mit γ-Strahlen unterzogen wird. Solch eine Probe zeigt das Ausmaß an, in dem T-Suppressorzellen die Expression des untersuchten Gens herunterregulieren.
Für das erfindungsgemäße Verfahren muß die RNA-Sonde mit einer nachweisbaren chemischen Gruppe markiert sein, die gegebenenfalls ein Isotop enthält.
Die Erfindung bietet die bequeme Analyse vieler Proben (48 und mehr) ohne Verwendung einer aufwendigen Ausrüstung und die schnelle Quantifizierung von Daten in numerischer Form.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann bequem und ohne Notwendigkeit der Verwendung einer Ultrazentrifuge durchgeführt werden, was die schnelle Analyse einer großen Anzahl an Proben ermöglicht; darüberhinaus ermöglichst es den reproduzierbaren Nachweis der Genexpression über einen 200fachen Bereich. Als Ausrüstung wird einfache Standard-Ausrüstung benötigt: Mikrozentrifugen, Zellzentrifugen, CO&sub2;-Inkubatoren, Dot-Blot-Vorrichtungen und Wasserbäder.
Eine 10-ml-Blutprobe ergibt üblicherweise 10&sup7; Zellen, was die mehrfache Untersuchung der Genexpression (verschiedene Gene, unterschiedliche Bedingungen bei der Induzierung) erlaubt. Die Möglichkeit, mit einer einzigen Blutprobe mehrere Messungen durchzuführen, erlaubt es, die verschiedenen Bedingungen zur Induzierung zu verfeinern, um die Funktionsfähigkeit genregulierender Mechanismen bei einer Krankheit zu messen.
Das Ansprechverhalten ist linear bei zunehmender RNA-Zugabe. Der Meßwert nimmt sowohl mit der Anzahl an Zellen als auch mit der Menge an RNA linear zu. Die dreifache Menge an Zellen erzeugt ein Signal, das der dreifachen Menge an RNA entspricht, d.h. es ist dreimal so groß. Das Signal der Genexpression ist über einen Bereich bis zum mindestens 200fachen linear. Somit stellen sowohl Hybridisierung als auch Filmschwärzung quantitative Messungen dar. Diese Eigenschaften machen das Verfahren hoch reproduzierbar und aussagekräftig.
Das Produkt besteht aus der RNA und der mRNA der gesamten Zelle, die beide unbeschädigt sind, mit nicht mehr als 5 % verunreinigender DNA und noch weniger Proteinen.
Das Hybridisierungssignal wird nicht von Proteinen maskiert. Das Hybridisierungssignal ist genauso groß wie das von reiner, durch Lysieren mit Guanidiniumthiocyanat und Ultrazentrifugation im CsCl-Dichtegradienten hergestellter RNA, was ein langwieriges und beschwerliches Verfahren darstellt.
Das Signal einer spezifischen mRNA, z.B. der mRNA für Interleukin-2 (IL-2) oder γ-Interferon (IFN-γ), kann in nur 5 10&sup5; Zellen nach 24stündiger Exposition des Films nachgewiesen werden. Dies sind 20- bis 100mal weniger Zellen als bei diesen Genen für ein standardmäßiges Northern-Blot-Signal benötigt werden.
Die im folgenden verwendeten Einheiten "ug" und "ul" bedeuten Mikrogramm bzw. Mikroliter.

Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 stellt eine graphische Skizze des erfindungsgemäßen Verfahrens dar;
Fig. 2 zeigt die Anwendung des Tests zur Messung der Expression des IFN-γ-Gens. 4 10&sup6; einkernige Zellen des peripheren menschlichen Blutes wurden für die Expression des IFN-γ-Gens induziert. Die aus diesen Zellen gewonnene RNA wurde in einer Reihe von vier Verdünnungen (0,125, 0,25, 0,5 und 1) unter Verwendung einer Mehrfach-Dot-Blot-Vorrichtung analysiert. Das Nitrocellulose-Filter wurde mit einer RNA-Sonde für IFN-γ hybridisiert. Die Bestrahlung mit γ-Strahlen wurde vor der Zugabe von 0,4 Vol.-% Phytohämagglutinin (PHA) durchgeführt, wobei die Dosis 1500 rad betrug. Nach Zugabe von PHA wurde mehreren Kulturen Cycloheximid (CHX) zugesetzt. Nach Hybridisierung wurde dem Filter ein Film ausgesetzt; das zugehörige Autoradiogramm ist abgebildet.
Fig. 3 ist eine Graphik, die die Linearität des erfindungsgemäßen Tests zeigt. proben, die die IL-2-RNA oder die IFN-γ-RNA auf unterschiedlichem Niveau exprimieren, wurden in einer Reihe von vier Verdünnungen (0,125, 0,25, 0,5 und 1,0) unter Verwendung einer Mehrfach-Dot-Blot-Vorrichtung analysiert. Nach Hybridisierung mit spezifischen RNA-Sonden und Autoradiographie der Nitrocellulosefilter wurde die Extinktion der einzelnen Punkte bei 630 nm in einem automatischen Mikro-ELISA-Meßgerät ermittelt.
Fig. 4 ist eine Graphik, die die Linearität und einander entspechende Meßwerte des Tests in Abhängigkeit von der zunehmenden Zellzahl oder der zunehmenden RNA-Zugabe zeigt. 4 10&sup6; Zellen, die zur Expression des IL-2-Gens induziert wurden, wurden in einer Reihe verdünnt, wonach die RNA gewonnen wurde ( ). Wahlweise wurde die RNA aus den 4 10&sup6; Zellen gewonnen, die daraufhin in einer Reihe verdünnt wurde (o).
Fig. 5 ist eine Graphik, die die Kinetik des IL-2-mRNA-Niveaus in Lymphocyten des peripheren menschlichen Blutes (LPB) zeigt, die mit Phytohämagglutinin (PHA) induziert wurden. Die Zellen wurden zum Zeitpunkt 0 h mit 0,4 Vol.-% PHA induziert. Zu jedem angegebenen Zeitpunkt wurden Proben mit 4 10&sup6; Zellen entnommen und anschließend die RNA gewonnen. Nach 21 h wurde Cycloheximid (CHX, 20 ug/ml) zugegeben; nach 24 h wurde die RNA analysiert ( ).
Die graphische Darstellung in Fig. 6 zeigt in quantifizierter Form die Expression des IL-2-Gens und des IFN-γ-Gens in LPB von neun Blutspendern. Jedem Spender wurden 10 ml peripheres Blut entnommen. Die Zellen von jedem Spender wurden in folgender Weise inkubiert:
1.) Ohne Zusätze (Untergrund, UG),
2.) Zusatz von 0,4 Vol.-% PHA,
3.) Zusatz von PHA nach Bestrahlung der Zellen mit γ-Strahlen (1.500 rad),
4.) Zusatz von PHA, worauf nach 16 h die Zugabe von CHX (20 ug/ml) folgt.
Aus allen Proben wurde die RNA 20 h nach Zusatz von PHA gewonnen, wonach die Dot-Blot-Filter getrennt mit einer Sonde für IL-2 bzw. einer Sonde für IFN-γ hybridisiert wurden. Die Balken geben die optische Dichte des Films, die in dem automatischen Mikro-ELISA-Meßgerät gemessen wurde, für den jeweiligen Test an.
Die graphische Darstellung in Fig. 7 zeigt die Verteilung des Niveaus der Expression des IL-2-Gens und des IFN-γ-Gens in Zellen der neun Blutspender, wie in Fig. 6 beschrieben, dargestellt über die Extinktion des Films bei 630 nm, die der Menge an hybridisierter RNA entspricht.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Verfahren wird wie folgt durchgeführt:

Beispiel 1 - Kultivierung Von Lymphocyten

1. Entnahme von 10 ml peripheren Blutes von Patienten in in heparinisierte Röhrchen.
2. Zweifache Verdünnung mit phosphatgepuf ferter Kochsalzlösung (PBS).
3. Überschichten mit zwei Volumina Ficoll (Pharmacia).
4. 30 min Zentrifugieren bei 200 g und Raumtemperatur in einer Zellzentrifuge.
5. Zweimal Waschen mit RPM1-1640-Medium ohne Serum.
6. Erneutes Suspendieren der Zellen bis zu einer Dichte von 4 10&sup6; Zellen in 10-ml-Kultivierungsröhrchen aus Kunststoff mit Schraubverschluß und rundem Boden (Cel- Cult) in RPM1-1640-Medium, das enthält:
2 mM Glutamin,
10 mM MEM nicht essentielle Aminosäuren,
100 mM MEM Natriumpyruvat,
10 mM HEPES, pH 7,2,
100 E/ml Penicillin,
100 ug/ml Streptomycin,
40 ug/ml Gentamycin,
5 10&supmin;&sup5; M 2-Mercaptoethanol,
2 % Kälberfetalserum,
5 ug/ml Nystatin.
7. Inkubieren über Nacht bei 37 ºC in einer Atmosphäre, die 5 % CO&sub2; enthält.

Beispiel 2 - Induzierungsbedingungen

Die Zellen jedes Blutspenders wurden folgendermaßen inkubiert:
1. ohne Zusätze (Untergrund, UG),
2. Zusatz von 0,4 Vol.-% PHA,
3. Zusatz von PHA nach Bestrahlung der Zellen mit γ-Strahlen (1.500 rad.).
4. Zusatz von PHA, worauf nach 16 h die Zugabe von CHX (20 ug/ml) folgt.
20 Stunden nach Zusatz von PHA wurde die RNA aus allen Proben gewonnen.

Beispiel 3 - Analyse -Verfahrensschritte, RNA-Gewinnung

Alle Schritte werden in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen von 1,5 ml Inhalt unter Verwendung einer serienmäßigen Tisch-Mikrozentrifuge (Eppendorf) durchgeführt.
1. 5 min Zentrifugieren von 1 ml Zellsuspension in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 500 min&supmin;¹.
2. Zugabe von 0,4 ml 7,5 M Guanidiniumthiocyanat-Lösung (GTC), kann wie in Beispiel 4 beschrieben verwendet werden.
3. Homogenisieren durch mindestens 30 s Schütteln des Röhrchens, bis sich alles aufgelöst hat.
4. Zugabe von 20 ul 2 M KOAc, pH 5,1. Mischen und anschließend Zugabe von 250 ul absolutem Ethanol. Erneutes Mischen.
5. Über Nacht bei -20 ºC Stehenlassen.
6. 30 min Zentrifugieren bei 15.000 min&supmin;¹ bei 4 ºC in einer Eppendorf-Zentrifuge.
7. Den Überstand verwerfen.
8. Auflösen des Bodenkörpers in 50 ul 37%igem Formaldehyd. Mischen in einer Schüttel-Vorrichtung, bis die Auflösung stattgefunden hat. Anschließend Zugabe von 50 ul einer 3 M NaCL-Lösung und 0,3 M Natriumcitratlösung.
9. 15 min bei 60 ºC Stehenlassen.
10. Durchführung der Dot-Blot-Verfahrensschritte. Die Probe wird in eine einzelne Vertiefung einer Mikrotiter- Platte mit 96 Vertiefungen (Nunc) pipettiert und in einer Reihe in jeweils zwei Schritten mit 1,5 M NaCl-Lösung und 0,15 M Natriumcitrat-Lösung (10 x SSC) verdünnt und in benachbarte Vertiefungen pipettiert. Nach Verdünnung aller Proben wird der Inhalt jeder Vertiefung im Vakuum in eine Mehrfach-Dot-Blot-Vorrichtung (Schleicher & Schüll) mit 96 Vertiefungen gegeben, die ein 9 x 13 cm großes Nitrocellulose-Blatt (Schleicher & Schüll GB 003 Fließpapier) enthält. Das Nitrocellulose- Blatt und das Fließpapier wurden vorab in destilliertem Wasser und dann in 10 x SSC vorgeweicht. Jede Vertiefung wird einmal mit 100 ul 10 x SSC gewaschen. Die Nitrocellulose wird 2 h im Vakuum bei 80 ºC getrocknet und anschließend mit der gewünschten RNA-Sonde für ein Gen entsprechend der Beschreibung in Beispiel 5 oder 6 untersucht.
11. Quantifizierung der Schwärzungspunkte in einem automatischen Mikro-ELISA-Meßgerät.
Zu diesem Zweck wird der der Strahlung ausgesetzte und entwickelte Röntgenfilm in die Form einer Mikrotiter- Platte geschnitten und so auf der Platte angeordnet, daß Dots und Vertiefungen übereinander angeordnet sind, wonach der Film in das automatische Meßgerät (z.B. Dynatech ) eingeführt wird. Die Proben werden bei einer Wellenlänge von 630 nm vermessen.

Beispiel 4 - Alternatives Verfahren zur RNA-Gewinnung

1. 5 min Zentrifugieren von 1 ml Zellkultur in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 500 min&supmin;¹.
2. Überstand verwerfen und Bodenkörper trocknen.
3. Zugabe von 100 ul lysierendem Puffer, der aus 5 M GTC, 10 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl von pH 7,5 und 8 Vol.-% 2-Mercaptoethanol (frisch zugegeben) besteht.
4. Dreimal 10 s Mischen in einer Schüttel-Vorrichtung. Zugabe von 700 ul 4 LiCl-Lösung und 20 h Stehenlassen (über Nacht) bei 4 ºC.
5. 90 min Zentrifugieren bei 12.000 min&supmin;¹ und 4 ºC in einer Eppendorf-Zentrifuge.
6. Überstand verwerfen, Bodenkörper trocknen. Zugabe von 50 ul RNA-solubilisierendem Puffer aus 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA und 10 mM Tris-HCl von pH 7,5.
7. Mischen durch 20 s Schütteln. Erneutes Mischen im Abstand von 10 min über insgesamt 40 min. Dieser Schritt wird bei Raumtemperatur durchgeführt.
8. Extrahieren der Lösung durch Schütteln mit Phenol/Chloroform im Volumenverhältnis 1:1, Sammeln der oberen Phase.
9. Zugabe von 1/10 Volumen 3 M NaOAc von pH 5,1, Mischen, Zugabe von 2,5 Volumina absolutem Ethanol und 20 h Stehenlassen bei -20 ºC.
10. Ausfällen der RNA bei 4 ºC durch 45minütiges Zentrifugieren bei 15.000 min&supmin;¹ in einer Eppendorf-Zentrifuge.
11. Waschen des Bodenkörpers mit 70%igem Ethanol.
12. Den Überstand verwerfen und den Bodenkörper trocknen.
13. Die Schritte 8 bis 11 aus Beispiel 3 durchführen.

Beispiel 5 - Herstellung der RNA-Sonde für IL-2

Die RNA-Sonde wird unter Verwendung des Promega-Biotec-RNA- Sonde-Kits synthetisiert. cDNA für IL-2 wurde aus dem Plasmid p3-16 (T. Taniguchi, H. Matsui, T. Fujita, C. Takaoka, N. Kashima, R. Yoshimoto, J. Hamuro, Nature 302, (1983), S. 305, mit Pst I herausgeschnitten und in pGEM-e (Promega Biotec), an der Pst-I-Stelle eingesetzt. Die Orientierung, in der die Transkription ab dem T7-Promotor den gewünschten RNA-Strang ergibt, wurde ausgewählt.
a) Die Transkription wurde wie folgt durchgeführt:
1. 4 ul Transkriptionspuffer
2. 2 ul Dithiotreit (DDT) (100 mM).
3. 0,6 ul RNasin (350 E/ml).
4. Jeweils 1 ul der Nucleotide UTP, CTP, GTP (0,5 mM).
5. 1 ul T7-RNA-Polymerase (15 E/ml).
6. 1 ul Plasmid, das die cDNA für IL-2 enthält (1 ug/1 ul).
7. 10 ul [α-³²P]-ATP (10 mCi/ml).
8. 10 ul [α-³&sup5;P]-ATP (10 mCi/ml) (Amersham) können das [α-³²p]-ATP im vorhergehenden Schritt ersetzen.
b) 1 h Inkubieren des Gemisches bei 37 ºC.
c) 1 ul DNase (ohne RNase, 1 E/ml wird zugegeben, wonach die Inkubation 15 min bei 37 ºC fortgesetzt wird.
d) Die RNA wird wie folgt gewonnen:
1. Zugabe von 20 ul Phenol/Chloroform (1:1), worauf Mischen in einer Schüttel-Vorrichtung und 2 min Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge folgt.
2. Die obere (wäßrige) Phase wird sorgfältig gesammelt.
3. Die untere Phase aus Phenol/Chloroform wird mit 20 ul TE-Puffer aus 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, und 1 mM EDTA gewaschen.
4. Nach 2 min Schütteln und 2 min Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge wird die obere Phase gesammelt und zu der zuvor gesammelten wäßrigen Phase gegeben.
5. 40 ul Chloroform werden den vereinigten wäßrigen Phasen zugesetzt.
6. Nach 2 min Schütteln und Zentrifugieren in einer Eppendorf-Zentrifuge wird die obere Phase gesammelt.
7. Die untere Phase wird mit 40 ul TE-Puffer, wie in den Schritten 3 und 4 beschrieben, extrahiert, wonach die wäßrige Phase mit der in Schritt 6 gesammelten wäßrigen Phase vereint wird.
8. 8 ul 3 M NaOAc von pH 5,1 und 2,5 Volumina absoluten Ethanols werden den vereinigten wäßrigen Phasen zugegeben.
9. Die Lösung wird 20 h (über Nacht) bei -20 ºC oder 2 h bei -70 ºC gelagert.
10. 30 min Zentrifugieren bei 4 ºC in einer Eppendorf- Zentrifuge bei 15.000 min&supmin;¹.
11. Waschen des Bodenkörpers mit 1 ml 70%igem Ethanol.
12. Trocknen des Bodenkörpers im Vakuum.
13. Erneutes Suspendieren des Bodenkörpers in 100 ul TEN-Puffer, der enthält: 10 mM Tris-HCl, pH 7,6, 1 mM EDTA, 0,1 M Nacl und 20 ug/ml tRNA von E. coli MRE 600 (Boehringer).
14. Aufgeben auf eine 1 ml-Sephadex -G-50-Säule, die in einer 2-ml-Spritze erzeugt und mit TEN-Puffer äquilibriert wurde.
15. 5 min Zentrifugieren der Säule bei 1000 min&supmin;¹ in einer Zellzentrifuge und Sammeln der durchgeflossenen Flüssigkeit in einem Röhrchen.
16. Eingeben einer Probe von 1 ul in eiskalte 10%ige Trichloressigsäure und Bestimmung der ausfällbaren Radioaktivität.
17. Ein gutes Präparat ergibt 3 10&sup5; bis 1 10&sup6; cpm/ul.

Beispiel 6 - Herstellung der RNA-Sonde für IFN-γ

Die RNA-Sonde für die Expression des IFN-γ-Gens wurde entsprechend dem in Beispiel 5 beschriebenen Verfahren synthetisiert. Die cDNA für IFN-γ wurde aus dem Plasmid pH11F-SV-γ H.Y. Heuverswyn, W. Fiers, Nucl. Acids Res. 10 (1982), S. 2487) herausgeschnitten und in pGEM-3 an der Bam-H1-Stelle eingesetzt. Die Orientierung, in der die Transkription ab dem T7-Promotor die gewünschte RNA ergibt, wurde ausgewählt.

Beispiel 7 - Hybridisierung von Nitrocellulosefiltern

1. Die Filter wurden 4 h bei 60 ºC in einem verschlossenen Kunststoffbeutel prähybridisiert. Der Puffer für die vorab durchgeführte Hybridisierung enthält:
25 % Formamid,
10 % Dextransulfat (Molgewicht 5000),
1 % SDS,
50 mM Tris-HCl, pH 7,5,
100 ug/ml Lachssperma-DNA, die 10 min gekocht und anschließend schnell abgekühlt wurde,
100 ug/ml tRNA (E.coli MRE 600),
0,7 M NaCl.
2. Für die Hybridisierung sind zuzugegeben:
5 106 cpm/ml RNA-Sonde (siehe oben) x 1,
Denhardt-Lösung: 0,02 (g/v) Ficoll , 0,02 % (g/v) Polyvinylpyrrolidon, 0,02 % (g/v) BSA-Fraktion V (Sigma),
100 ug/ml tRNA (E. coli MRE 600);
16 - 18 h Inkubieren, jedoch nicht länger, bei 60 ºC.
3. Nach der Hybridisierung werden die Filter gewaschen:
1. Zweimal Waschen mit 2 x SSC (500 ml) bei Raumtemperatur über 15 min,
2. zweimal Waschen mit 2 x SSC, 1 % SDS (500 ml
2. zweimal Waschen mit 2 x SSC, 1 % SDS (500 ml bei 68 ºC) über 30 min,
3. einmal Waschen mit 0,2 x SSC, 0,2 % SDS (500 ml) bei 68 ºC über 30 min.
Ein Röntgenfilm wird 5 bis 25 h bei -70 ºC den getrockneten Filtern ausgesetzt.

Analyse der Ergebnisse

Die Ergebnisse können wie folgt analysiert werden: ohne induzierendes Mittel PHA + Cycloheximid PHA + Bestrahlung mit γ-Strahlen
(a) Grundniveau der Genexpression:
1A, 1B.
(b) Induzierbarkeit der Gene:
Verhältnis 2A/1A, 2B/1B Verhältnis 3A/1A, 3B/1B.
Der Unterschied zischen den Proben 2 und 3 hat kinetische Ursachen: Die transiente Expression dieser Gene kann nach 16 oder 20 h in Abhängigkeit vom Donor ihr sein; wenn sie darunterliegen, bedeutet dies entweder, daß die Gene hochaktiviert sind oder nicht auf die Induzierung zu reagieren vermögen. Diese Möglichkeiten können im folgenden Schritt (c) unterschieden werden.
(c) Superinduzierbarkeit durch Cycloheximid:
A4/A3, B4/B3.
Das Verhältnis zeigt das Protential der Genexpression. Normalerweise sollte dieses Verhältnis deutlich größer als 1 (1,5 - 5 oder darüber) sein. Falls dies nicht der Fall ist, bedeutet dies, daß entweder die Grundexpression sehr hoch ausfällt, wobei dann die Verhältnisse A4/A1 und B4/B1 ungefähr 1 betragen sollten oder alternativ die induzierte Genexpression sehr groß und unkontrolliert ist, wobei dann die Verhältnisse A3/A4 und B3/B4 groß sein sollten.
(d) Superinduzierbarkeit durch Bestrahlung mit γ-Strahlen A5/A3, B5/B3.
Normalerweise sollte dieses Verhältnis deutlich größer als 1 (1,5 - 3) sein. Normalerweise ist das Verhältnis B5/B3 größer als das Verhältnis A5/A3. Mit diesen Werten wird das Ausmaß gemessen, in dem T-Suppressorzellen die Expression des IL-2-Gens und des IFN-γ-Gens herabregulieren; das IFN-γ-Gen wird in dieser Weise stärker reguliert. Je größer diese Verhältnisse sind, desto stärker wird herabreguliert.

Claims

1. Verfahren zur Berechnung der Induzierbarkeit eines bioregulatorischen Gens in einer Probe von eukaryotischen Zellen, das folgende Schritte umfaßt:

a) Isolieren einer Probe der eukaryotischen Zellen,

b) Aufteilen der Probe in mindestens zwei Aliquote,

c) Kultivieren der Zellen in jedem Aliquot,

d) Lysieren der kultivierten Zellen in jedem Aliquot durch Zugabe von Guanidiniumthiocyanat oder Guanidinhydrochlorid als lysierendes Mittel,

e) Homogenisieren jedes Aliquots und darauffolgend selektives Fällen der RNA in jedem Aliquot durch aufeinanderfolgende Zugabe von Natrium- oder Kaliumacetat und absolutem Ethanol,

f) Gewinnen und Blotting der RNA aus jedem Aliquot auf eine Trägermatrix,

g) Hybridisieren der aus jedem Aliquot gewonnenen und durch Blotting übertragenen RNA mit einer markierten, für das bioregulatorische Gen spezifischen RNA-Sonde und

h) quantitative Bestimmung des Ausmaßes der Expression des bioregulatorischen Gens durch Messen des Ausmaßes der Bindung der markierten RNA-Sonde an die übertragene RNA,

wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß in Schritt c):

(c) (i) die Zellen in dem ersten Aliquot in Gegenwart eines Mittels kultiviert werden, das die Expression des bioregulatorischen Gens induziert, und

(c) (ii) die Zellen in dem zweiten Aliquot ohne ein induzierendes Mittel kultiviert werden,

und daß

i) das Verhältnis des Ausmaßes der Genexpression im ersten Aliquot zum Ausmaß der Genexpression im zweiten Aliquot berechnet wird, wobei dieses Verhältnis ein Maß für die Induzierbarkeit des bioregulatorischen Gens liefert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe der eukaryotischen Zellen eine Probe von Zellen ist, die unter einkernigen Zellen des peripheren menschlichen Blutes, Lymphocyten, Monocyten, Fibroblasten, Astrocyten, Endothelzellen, Gliazellen, Keratinocyten und Blutplättchen ausgewählt sind.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das induzierende Mittel Phytohämagglutinin (PHA) oder Concanavalin A ist.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen in einem dritten Aliquot superinduziert werden und das Verhältnis des Ausmaßes der Genexpression in dem dritten Aliquot zum Ausmaß der Genexpression in dem ersten Aliquot berechnet wird, womit ein Maß für das maximale Ausmaß der Expression des bioregulatorischen Gens geliefert wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zellen in dem dritten Aliquot in Gegenwart eines superinduzierenden Mittels, das unter Cycloheximid, Cycloheximid + Phytohämagglutinin und Cycloheximid + Concanavalin A ausgewählt ist, kultiviert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Zellen in dem dritten Aliquot in Gegenwart eines induzierenden Mittels, das unter Phytohämagglutinin und Concanavalin A ausgewählt ist, kultiviert werden und bei dem die Zellen vor der Zugabe des induzierenden Mittels zur Superinduzierung bei diesen Zellen mit γ-Strahlen bestrahlt werden.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA-Sonde in Schritt (g) für ein bioregulatorisches Gen spezifisch ist, das unter den Genen ausgewählt ist, die Interferone, Interleukine, Tumornekrosefaktoren und Wachstumsfaktoren codieren.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA-Sonde in Schritt (g) spezifisch ist für ein bioregulatorisches Gen, das IL-2 oder IFN-γ codiert.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei in Schritt (e) jedem Aliquot vor der Zugabe von Natrium- oder Kaliumacetat Lithiumchlorid und Guanidiniumthiocyanat zugegeben werden.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die RNA-Sonde mit einer nachweisbaren chemischen Gruppe markiert ist, die gegebenenfalls ein Isotop enthält.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die RNA-Sonde mit einem Isotop markiert ist und in Schritt (h) das Ausmaß der Bindung durch Messen des Absorptionsvermögens eines photographischen Films gemessen wird, der dadurch geschwärzt wurde, daß er der Trägermatrix ausgesetzt wurde, die die RNA und die hybridisierte, markierte RNA-Sonde trägt.

12. Verfahren zur Ermittlung der dynamischen Funktionalität der Immunantwort in einer Probe eukaryotischer Zellen, das ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 einschließt, bei dem diese Probe verwendet wird.

13. In-vitro-Diagnoseverfahren zur Diagnose von viralen, bakteriellen, pilzbedingten, onkogenen und immunregulatorischen Erkrankungen bei Patienten, das ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 einschließt, bei dem eine Blutprobe des Patienten verwendet wird.