DE2010759A1 - Octadekapeptide und Verfahren zu ihrer Herstellung - Google Patents

Description

^H Qctadekapeptide und" Verfahren zu ihrer Herstellung "

Prioritätί 6. März 1969, Japan, Nr. 17117/69 28. Mai 1969, Japan, Nr, 41481/69

Aus verschiedenen Laboratorien sind Synthesen einer grossen Anzahl von CorticotropineACTH)-Peptidanalogen berichtet worden. Bei den Peptidanalogen sind einzelne.Aminosäuren der natürlichen Sequenz gegen andere Aminosäuren ausgetauscht, z.B. die erste Aminosäure Serin gegen Glycin.oder D-Serin, die vierte Aminosäure Methionin gegen Valin oder Norleucin, die fünfte Aminosäure Glutaminsäure gegen Glutamin, die 17. und 18. Aminosäure Arginin gegen Lysin oder Ornithin oder die 25. Aminosäure Asparaginsäure gegen Valin. Obwohl viele corticotrope Peptide mit einer geringfügig veränderten Aminosäuresequenz bisher synthetisiert worden sind, zeigte bis auf ein paar Ausnahmen keines dieser Peptide eine grössere Aktivität als das natürliche Corticotropin. Von besonderem Interesse ist das Peptid • D-Ser¹-NLe⁴'-Val²⁵-ACTH(l-25)-NH₂, das einen D-Se-rinresV am Aminoende anstelle des nativen L-Serins, einen Valinamidrest

009839/2304

an Carboxylende anstelle des Asparaginsäurerestes und in Stellung 4 anstelle des Methioninrestes beim Corticotropin einen Norleucinrest enthält. Dieses Peptid ist nach den Angaben der Literatur biologisch aktiver als das native Corticotropin; vergl. Experientia, 2_2, 526 (1966). Es scheint sehr wahrscheinlich, dass das beim D-Ser¹- NLe⁴-Val²⁵-ACTH(l-25)-liH₂ beobachtete Anwachsen der Aktivität eine Folge der verringerten Anfälligkeit des Peptides gegenüber der Wirkung von Aminopeptidase und Carboxypeptidase ist. Dies ist auf die Gegenwart einer D-^Aminosäure am Arainoende und eines Valinamids am Carboxylende und auf die Ta.tsache zurückzuführen, dass die Oxydation von Methionin in Stellung 4 zu Methioninsulfoxid bei Inaktivierung nicht auftreten kann, da der Methioninrest durch einen Korleucinrest ersetzt ist. D-Ser -HIe -VaI -ACTH(l-25)-NH₂ ist zwar ein ausgezeichnetes corticotropes Peptid mit hoher biologischer Aktivität, es ist nicht das Idealmittel, da es einige Probleme bei seiner Anwendung in der Humanmedizin mit sich bringt.·"Da·' D-Ser -KLe- -VaI² -ACTH(1-25)-NH₂ drei modifizierte Aminosäuren, d.h. D-Serin-, Norleucin- und Valinreste enthält, besteht die Gefahr einer anaphylaktischen Reaktion beim Verabreichen an Kenschen wegen dieses Unterschiedes in der Aminosäuresequenz zwischen menschlichem Corticotropin und dem synthetischen Peptid. Es ist bekannt, dass die anaphylaktische Reaktion häufig' auftritt, wenn im Handel erhältliches, aus Hypophjaenvon Tieren, wie Schweinen, Rindern oder Schafen, stammendes Corticotropin Ken-· sehen verabreicht wird. Diese unerwünschte Erscheinung kann eine Folge der strukturellen Unterschiede in den Aminosäuresequenzen in den Stellungen 25 - 33 zwischen menschlichem und tierischem Corticotropin sein und kann auch auf bestimmte proteinähnliche

009839/2304

BAD ORIGINAL

Verunreinigungen, die nicht vollkommen aus dem natürlichen, aus den genannten tierischen Quellen stammenden Corticotropin entfernt werden können, zurückzuführen'sein. Weiter weiss man, dass die Reaktivität der Hydroxylgruppe des Serins, die Labilität der Seryl-Peptidbindung unter alkalischen Bedingungen, die lie igung zu ß-Eliminationsreaktionen unter Bildung von Dehydro-Peptiden und die H-? O Acyl-Verschiebung die Herstellung von Serin enthaltenden Peptiden sehr erschweren, die wegen Labilität unter alkalischen Bedingungen oft von Racemisierungsprodukten begleitet sind* Ausserdem erfordert die Synthese einer langen Peptidkette einen grossen Aufwand an Arbeitszeit und Arbeitskraft. Deswegen ist es sehr wünschenswert, ein hochaktives corticotropes Peptid herzustellen, dessen Aminosäuresequenz so kurz wie möglich ist.

In der Zeitschrift J. Am. Chem, Soc., 87, 2696 (1965) und J.Biochem. (Tokio), 58, 512 (1965) ist die Synthese eines corticotropen, hochaktiveh Octadekapeptida^ids beschrieben, das den ersten 18 Aminosäureresten des Cortico" spins entspricht, mit der einen Ausnahme, dass das Carboxylende in das Amid überführt wurde. Ausserdem gelang es, ein Gctadekapeptid zu synthetisieren, in dem das aminoterminale Serin des Corticotropins durch einen Glycinrest ersetzt und dessen Carboxylende in das Amid überführt ist; vergl. Bull. Chem» Soc. Japan., 43, 196 (1970). Beide Peptide weisen eine hohe eorticotrope Aktivität auf. In vivo entsprechen die steroidgenetischen Aktivitäten bei Intravenöser Verabreichung an Hatten denen von Schafcorticotropin. Jedoch ist die steroidgenetische Aktivität in vitro- etwas geringer als die von Schafcorticotropin.

009839/23(H

BAD ORIGINAL

Aufgabe der Erfindung war es daher, neue corticotrope Peptide zu schaffen, die ausgeprägte biologische Eigenschaften, stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde, lipolytische Aktivität und melanozytenstimulierende Aktivität aufweisen, die alle höher sind als die Aktivitäten von natürlichem Corticotropin und von bisher bekannten synthetischen Corticotropin-Peptiden. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst«

Gegenstand der Erfindung sind somit neue Octadekapqptide der allgemeinen Formel I

ß-Alanyl-Ii-tyrosyl-L-eeryl-L-methionyl-L-X-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-I-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L- ^' prolyl-L-valyl-glycyl-L-lyeyl-L-lysyl-L-arginyl-L-Y,

in der X ein Glutaminsäure- oder ein Glutaminrest und Y ein Arginin- oder ein Argininamidrest ist, ihre nicht toxischen Säureadditionssalze, Komplexe mit Schwermetallen, und Polyaminosäuren oder deren Gemische.

Wenn nichts anderes angegeben ist, so weisen alle im folgenden beschriebenen Aminosäuren die !-Konfiguration auf. Die Abkürzungen für Aminosäuren, Peptide und ihre Derivate stimmen mit den Empfehlungen der IUPAC-IUB-Nomenklaturkommission überein.

Die Octaaekapeptide der Erfindung haben eine langer anhaltende corticotrope Aktivität, was wahrscheinlich auf die V.'iderstandsfähigkeit gegen die Wirkung von Aminopeptidase zurückzuführen ist. V/eiterhin wurde festgestellt, dass die Komplexe der Octadekapeptide eine langanhaltende Aktivität aufweisen.

009839/2304

BAD ORIGINAL

Ferner war es Aufgabe der Erfindung,.ein Verfahren zur Herstellung der Octadekapeptide, der Säureadditionssalze und der Korn-' .plexe in reiner Form und in hoher Ausbeute zu schaffen, wobei keine Inaktivierung, Kebenreaktionen und Racemisierungen auftreten. Eine weitere Aufgabe der ^Erfindung war es, Zwischenprodukte für die Herstellung der Octadekapeptide der Erfindung zu. schaffen. Auch diese Aufgaben werden durch die Erfindung gelöst.

Im allgemeinen werden Polypeptide nach verschiedenen Verfahren hergestellt, indem die Aminosäurereste nacheinander oder vorher synthetisierte Peptidbruchstücke zu einer angegebenen Sequenz verknüpft werden. Dabei können die Aminosäure oder die Peptideinheit durch bekannte Verfahren mit weiteren Aminosäuren oder Peptidbruchstücken verknüpft werden.

Zur Herstellung der Octadekapeptide der Erfindung und ihrer Zwischenprodukte werden alle freien, funktioneilen, an der Beaktion nicht teilnehmenden Gruppen vorteilhaft durch Reste geschützt, die leicht durch z.B. Säurehydrolyse, spaltende Hydrierung oder Hydrolyse entfernt werden können. Die Carboxylgruppe wird vorzugsweise durch Veresterung ,z.B. mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopro-.panol oder tert.-Butanol, oder einem niederen Arylalkylalkohol, wie Benzylalkohol, p-Nitröbenzy!alkohol oder p-Methoxybenzylalkohol, oder durch Amidbildung geschützt. Die Aminogruppe wird vorzugsweise durch Gruppen, wie die tert.-Butyloxycarbonyl-, die tert.-Amyloxycarbonyl-, die p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, die Benzyloxycarbonyl-, die p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, die Trityl-, die Z-Cp-DiphenylJ-isopropyloxycarbonyl- oder die Pormylgruppe geschützt. Zum Schutz der Guanidinogruppe im Arginin wird vor-

009839/2304

zugsweise die fritro- oder Tosylgruppe verwendet, jedoch ist es nicht immer notwendig, die Guanidinogruppe des Arginins während der Reaktion zu schützen. Ebenso wird die £ -Aminogruppe des Lysins vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonyl-, die tert.-Ainyloxycarbonyl-, die Benzyl oxycarbonyl- oder die · 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonylgruppe geschützt. Ausserdem wird die >'-Carboxylgruppe der Glutaminsäure vorzugsweise in Form eines niederen Esters, wie den Methyl-, Äthyl-, Propyl- oder tert.-Butylester, oder eines niederen Arylalkylesters, wie den Benzyl-, p-Nitrobenzyl- oder p-Methoxybenzylester, oder durch Amidbildung geschützt. Die Iminogruppe von Histidin kann z.B. durch die Benzyloxycarbonyl- oder die Benzylgruppe geschützt werden.

Als Kondensationsverfahren für die Bildung der Peptidbindung können z.B. folgende Verfahren Verwendung finden: Das Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, das Azidverfahren, das Aktivesterverfahren, z.B. mit dem Cyanomethyl-, p-Nitrophenylthiol-, p-Nitrophenyl-, K-Hydroxysuccinimid-, 8-Chinolyl- oder 1-Piperidylester, das gemischte Anhydridverfahren, das K-Carboxyanhydridverfahren, das Tetraäthylpyrophosphitverfahren, das Athylchlorphosphitverfahren, eine Kombination dieser Verfahren und andere, auf dem Gebiet der Peptidchemie üblicherweise verwendete Verfahren. Die gewünschten Peptide können auch nach der sogenannten Synthese in fester Phase hergestellt werden, bei der die Synthese vom Carboxylende des Peptide ausgeht, das esterähnlich an ein Polymer gebunden ist, und die Aminosäuren nacheinander angehängt werden. Alle genannten Verfahren können zur Bildung aller Peptidbindungen der Octadekapeptide der Erfindung

009839/2304

und deren Zwischenprodukte verwendet werden.

Wie vorstehend erwähnt, gibt es eine Reihe von verschiedenen Wegen zur Herstellung der Octadekapeptide aus Aminosäuren oder Peptideinheiten. Z.B. können nach einem Verfahren die Octadekapeptide der allgemeinen Formel· I, in der X ein Glutaminsäure- oder Giutaminrest und Y ein Arginin- oder Argininamidrest ist, dadurch hergestellt werden, dass man ein Dekapeptid der allgemeinen Formel II

R₁-G-Alanyl-tyrosyl-8eryl-methionyl-/^R₂-glutainyl-his tidy 1-

phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin,

/in der R₁ eine Aminoschutzgruppe und R₂ eine Carboxylschützgruppe ist, mit einem Octapeptid der allgemeinen Formel III

arginyl-Y, (III)

in der R, eine Aminoschutsgruppe ist und Y die oben angegebene Bedeutung hat, in einem inerten Lösungsmit* j±, wie Dimethylformamid, DimethyIsulfoxyd, Pyridin, Dimethoxyäthan, Hexamethylphosphortriamid, Dioxan oder einem Gemisch dieses Lösungsmittels 2 bis 96 Std. bei Temperaturen von -20 bis 5O⁰C in an sich bekannter Weise kondensiert, und die Schutzgruppen aus dem erhaltenen Octadekapeptid der allgemeinen Formel IV

histidyl-phenylalanyl-arginyl-xryptophyl-glycyl-rK B^lysyl-prplyl-valyl-glycyl-K^—Rj-lysyl-N^-Rj-lysylarginyl-Ύ, (IV)

in der R₁, R₂, R, und Y die"oben angegebene Bedeutung haben, in an sich bekannter Weise, wie Säurehydrolyse, hydrierende

009839/2304

BAD ORIGINAL

— α —

Spaltung oaer Hydrolyse ,entfernt.

1.Ti folgenden Synthesescheraa ist ein bevorzugtes Verfahren für die herstellung der Octadekapeptide angegeben.

009839/2304

Syntheseschema für die Octadekapeptide

BOC-ß-Ala.OH + H.Tyr.OMe BOC-Ser.OH + H.Met.OMe

BOC-B-AIa.Tyr.OMe BOC-Ser.Met.OMe

(ΜΊΛ I <^VII> I

^{V Xl} INH₂NH₂-H₂O J^-H⁺

BOC-B-AIa.Tyr.NHNH₀ + H.Ser.Met.OMe·

CVIII) ■ . ² (IX)

BOC-ß-Ala.Tyr.Ser.Met.OMe

I NH₂NH₂-H₂O "
BOC-ß-Ala.Tyr.Ser.Met.NHNH₂

-(XI) '

NO

I ²

BOC-Arg.Trp.Gly.OMe

(XIIJ

j HCOOH

BOC-Phe.OH + H.Arg.Trp.Gly.OMe

(XIII)

NO₂

NO_{2 r}

BOC-Phe.Arg.Trp.Gly.OMe

(XIV) ι ■

j HCOOH

' f ^N,°2

Z-His.ONP + H^he.Arg.Trp.GIy.OMe

(XV)" ,

Z NO₂I Z-His.Phe.Arg.Trp.GIy.OMo

_ (i) oh-; Ui) hf

OBu¹

Z-GIu-ONP + H.His.Phe.Arg.Trp.GIy.OH (XVII)

OBu* *

ι
Z-GIu.nis.Phe.Arg.Trp.GIy.OH

OBu*

H,/Pd

H.Glu.His.^he.Arg.Trp.Gly.OH (XIX)¹ . . '

009839/2304

XI

XIX

CD O (O CD

ro t*> ο

OBu I

BOC-ß-Ala.Tyr.Ser.Met.Glu.IIis.Phe.Arg.Trp.Gly.Oil

(XX) _t ., , I NHS, DCCI

OBu* I BOC BOC BOC

BOC-ß-Ala.Tyr.Ser.Met.Glu.His.Phe.Arg.Ti-p.Gly.ON'IIS + H. Ly s. Pro. VaI .GIy.Ly s.Lys. Arg. Arg.R '

(XXI)

OBu¹ BOC i BOC BOC

BOC-{^-Λla.TyΓ.SoΓ.Mot.Glu.His.Γhc.AΓg.TΓp.Gly.L·ys.Pro.Val.Gly.I.ys.I,ys.AΓ£;.Ar£;.Π¹

(XX II I) , \ ·

(i) saure Hydrolyse (ii) Chromatographie an CMC

.Arg,B¹

H-ß-Ala.Tyr.Ser.Met.GIu. His.Phe. Arg.Trp.GIy.I.y s.Pro .VaI .G Iy (XXIV) I

In obigem Schema werden folgende Abkürzungen verwendet: CKG = Carboxylmethylcellulose, DCCI = K.N'-Dicyclohexylcarbodiimid, KHS = K-Hydroxysuccinimid, 3OC = tert.-Butyloxycarbonyl» OBu = tert.-Butylester, R¹ = KH₂ oder OH, Z = Benzyloxycarbonyl, OKP = p-Kitrophenylester.

Wie aus obigem Syntheseschema hervorgeht, kann das typische K-terminale Decapeptid der Formel XX tert.-Butyl rxycarbonyl-ßalanyl-tyrosy1-seryl-methionyl-^-tert.-butyl-glutamyl-histidylphenylalanyl-arginyl-tryptophyl-giycin, das eine neue Verbindung darstellt und als Zwischenprodukt für die Herstellung der. Octadekapeptide der Erfindung ist, hergestellt werden, indem tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-tyrosyl-seryl-methionin-hydrazid (XI) mit f -tert. -Butyl-glutaiayl-his tidy 1-phenylalanyl-arginyltryptophyi-glycin (XIX) nach aem Azidverfahren umgesetzt wird. Das 'Tetrapeptidhydrazi'd tert.-Butyloxycarbonyl-ß-ralanyl-tyrosylseryl-methionin-hydrazid ^!(XI)ist ebenfalls eine neue Verbindung und als Zwischenprodukt bei der Herstellung äer Octaaekapeptiae der Erfindung wertvoll. Es kann hergestellt werden, indem die tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Hilfe eines Agens, das die tert.-Butyloxycarbonylgruppe einführt, wie terx.-Butylazidfqrmiat, tert.-Butyl-p-nitrophenylcarbonat oder Ghlora^eisensäureterx.-butylester, in ß-Alanin eingeführt wird, das erhaltene tert.-Butyloxycarbonyl-ii-alanin (V) mit 2yrosinrr.ethylester kondensiert wird, der erhaltene Dipeptidsethylester (VI) nit- Hydrazinhyurat in das entsprecriei.de Hydrazid (VIII)überführt wird, da.s tert.-3utyloxycarbonyl-S-alanyl-tyrosin-hydrazid nach dem Azidverfahren mit Seryl-aiethioniii-methylester (IX) umgesetzt und der Tetrapeptide st er (X) mit HydrazirJiydrat in das entsprechende

009839/23CU __XI

BAD ORIGINAL

Hydrazid (XI) überführt wird. Das entsprechende tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-tyrosyl-serylmethionin kann auf ähnliche Weise, wie oben besenrieben, erhalten werden.

Das Hexapeptid ^-tert.-Butyl-glutamyl-histidyl-phenylalanylarginyl-tryptophyl-glycin (XIX·) ist in Bull.Chem.Soc. Japan., 38, 1148 (I965) beschrieben. Erfindungsgemäss kann dieses Hexapeptid aber nach einein verbesserten Verfahren synthetisiert werden, was in hohem Kasse zur Steigerung der Ausbeute und des Reinheitsgrades bei der Herstellung der Octadekapeptide beiträgt. Das verbesserte Verfahren zur Herstellung des Hexapeptids (XIX) umfasst die Verwendung von Ameisensäure zur Entfernung der tert.-Butyloxycarbonylgruppe von den geschützten Tryptophanpeptiaen ohne Zersetzung von Tryptophan und die Verwendung von Fluorwasserstoff zur Entfernung der Nitrogruppe vom Nitroargininrest ohne Beeinträchtigung des säurelabilen Tryptophanrestes. Es ist bekannt, dass in saurem Medium tryptophanhaltige Peptide oft nur in sehr geringer Ausbeute erhalten werden, was auf die Bildung von Nebenprodukten zurückzuführen ist, vergl. Helv.Ghim.Acta, 41, 1867 (1958) und J. Am.Chem. Soc., 82_, 2062 k (I960). Es ist ebenfalls bekannt, dass die Reduktion eines Kitroargininrestes in einer Peptidkette häufig eine lange Hydrierungszeit erfordert - vergl. Can.J.Cnem. , 38_, 1946 (I960) - und cass die katalytische Reduktion häufig auf der Stufe von Amino- ' guanidin stehen bleibt; vergl. HeIv. Chim.Acta, _44, 2042 (1961). Bei der Herstellung des Kexapeptids (XIX) mit den genannten Aminosäureresten gelangt man zu einer hohen Ausbeute ohne Nebenreaktionen, wenn man das verbesserte Verfahren anwendet. Das Hexapeptid (XIX) wird dadurch hergestellt, cass man die tert.-

009839/2304

BAD ORIGINAL

Butyloxycarbonylgruppe des N -rtert.-Butyloxycarbonyl-N -nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylesters (XII) mit Ameisensäure .abspaltet, das erhaltene Tripeptid (XIII) mit tert„-Butyloxycarbonyl-phenylalanin nach dem Dicydohexylcarbodiimidverfahren kondensiert, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe aus dem entstandenen Tetrapeptid tert.-Butyloxycarbonyl-phenylalanyl-N -nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylester (XIV)mit Ameisensäure abspaltet, das entstandene Tetrapeptid (XV) mit· U^ ,N ^m-Dibenzyloxycarbonyl-histidin-p-nitrophenylester zum entsprechenden Pentapeptid N⁰^ ,N -Dibenzyloxycarbonyl-histidyl-phenylalanyl-N nitro-arginyl-tryptophyl-glycin-methylester (XVI) umsetzt, diesen verseift, dann mit Fluorwasserstoff behandelt und hierauf das erhaltene Pentapeptid (XVIl) mit N · -Benzyloxycarbonyl- ^-tert.-■butyl-glutaminsäure-p-nitrophenylester kondensiert, und das entstandene Ν** -Benzyloxycarbonyl-/"-tert.-butyl-glutamyl-histidylphenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin (XVIII) hydriert.

Bei der vorstehend geschilderten Reaktion wird die Abspaltung der tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Ameisensäure während etwa 2 bis 4 Stunden bei Temperaturen von etwa 20 - 60 C unter Verwendung von 'etwa der 5 bis 15-fachen Gewichtsmenge Ameisensäure, bezogen auf das tertο-Butyloxycarbonylpeptid, durchgeführt. Die Nitrogruppe wird durch Lösen des Nitroarginylpeptids in Fluorwasserstoff (etwa der 5 bis 10-fachen Gewichtsmenge des Peptids) und 30 bis 60 minütiges Stehenlassen der Lösung bei Temperaturen von etwa 0 - 25°C entfernt.

Das typische C-terminale Octapeptid der allgemeinen Formel ^-terto-Butyloxycarbonyl-lysyl-prolyl-valyl-glycyl-K^-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-Nⁱ r-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-

009839/2304

Y, in der Y ein Arginin- oder Argininamidrest ist, kann nach dem in Bull. Chen. Soc. Japan., _^9, 832 (1966) beschriebenen Verfahren hergestellt werden. So kann das gewünschte Gctadekapeptid hergestellt werden, indem tert.-Butyloxycarbonyi-ß-alanyltyrcsyl-seryl-methionyl-/'-tert.-butyl-glutamyl-histiayl-phenyialanyl-arginyl-tryptophyi-glycin mit K^' -tert.-Butyloxycarbonyllysyl-propyi-valyl-giycyl-2»'£ -tert.-butyloxycarbonyi-iysyl-N^ tert.-butyloxycarbonyl—lysyl-arginyl—Y, in dem Y die oben angegebene Bedeutung hat, nach dem Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, dem K-Hydroxysuceinimidesterverfahren oder einer Kombination f dieser Verfahren während 2 bis 96 Stunden bei Temperaturen von -20 bis 50 C umgesetzt wira, und alle Schutzgruppen aus dem erhaltenen geschützten Octadekapeptid tert.-Butyloxycarbonyl-ßalanyl-tyrosyl-seryl-methionyl-Z'-terto-butyl-glutamyi-histidyl- phenylalanyl-arginyl-tryptcj?hyl-glycyl-K -tert.-butyloxycarbonyl-

propyl-valyl-glyoyl- -X^-tert. -butyloxycarbonyl-lvoyl ' lysyl-/L\^t-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl/-argmyi-Y, in dem Y die oben angegebene Bedeutung hat, in einem sauren Medium, wie einem Halogenwasserstoff, einer Halogenwasserstoffsäure, Trifluoressigsäure, Ameisensäure, Essigsäure oder einem Gemisch derselben bei Temperaturen von etwa -10 bis 40⁰G in einer Reaktionszeit von 10 - 90 Minuten entfernt werden.

Nach einem anderen Verfahren können die Octadekapeptide durch Kondensation des Tetrapeptide tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyltyrosyl-seryl-methionin mit einem Tetradekapeptid der allgemeinen Formel /'-tert.-Butyl-glutamyl(oder glutaminyl)-hiatidylphenyl-alanyl-arginyl-tryptophyl-glycyl-li^f -tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-propyl-valyl-glycyl-K^ -tert.-butyloxycarbony1-lysyl-N^ -tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y, in der Y die oben

009839/2304

BAD ORIGINAL

angegebene Bedeutung hat, in bekannter V/eise hergestellt werden.

Ebenso erhält man die Octadekapeptide der Erfindung, indem man t ert.-Butyloxy carbonyl-ß-alanyl-tyrosyl-seryl-me thionyl-/'-1 er t. butyl-glutamyl-histidy1-phenylalany1-arginyl-tryptophyl-glycyl-N* -tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-propyl-valyi-glycin mit Xf -tert.-Butyloxycarbonyl-lysyl-N^ -tert.-butyloxycarbonyllysyl-arginyl-Y, in dem Y die oben angegebene Bedeutung hat, in bekannter Weise kondensiert.

Alle beim Verfahren der Erfindung verwendeten Schutzgruppen können durch katalytisehe Reduktion, Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak, Hydrolyse oder Behandlung'mit einem sauren Kedium, wie Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure, einem Kalogenwasserstoff, z.B. Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Chlorwasserstoff, einer Halogenwasserstoffsäure, z.B. Fluorwasserstoffsäure, Bromwasserstoff säure oder Cxilorwasserstoff säure, oder ein Gemisch dieser Verbindungen, entf-- jit werden.

Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Cctaaekapeptide können nach bekannten Verfahren, wie Säulenchromatographie mit lonenaustauscherharzen, lonenaustauschercellulose oder Sephadexionenaustauscher oder Gegenstromverteilungsverfahren,gereinigt werden.

Je nach den verwendeten Reaktionsoedingungen erhält man die Gctadekapeptide der Erfindung in Form der freien Basen oder ihrer pharmakologisch verträglichen, nicht toxischen Säureadditionssalze. Liese Salze können hergestellt werden, indes man die Peptide mit anorganischen Säuren, wie einer Halogenwas-

009839 /23 (H

BAD ORSGSNAL

serstoffsäure, z.B. Fluorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure oder Chlorwasserstoffsäure, einem Halogenwasserstoff, z.B. Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Fluorwasserstoff, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, oder mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Glycolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, !•lal e insäur e, Fumarsäure, Weinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure oder Toluolsulfonsäure, in bekannter Weise umsetzt.

Die so hergestellten Octadekapeptide zeigen ausgeprägte biologi- w scne Aktivitäten, z.B. eine stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde, lipolytische und melanozytenstimulierende Wirkung, die höher sind, als die von natürlichem Corticotropin und von verwandten, bekannten Peptiden.

Die Octadekapeptide der Erfindung sind deshalb besonders bei der Behandlung von akutem und chronischem Gelenkrheumatismus und allergischen Krankheiten verschiedener Organe von Tieren und Menschen wertvoll. Die verscniedenen pharmakologischen Eigenscnaften der Cctadekapeptide, sowie deren biologische Daten ) gehen aus folgendem hervor.

Die corticotrope Aktivität eines Octadekapeptids der Erfindung wurde nach fünf verscniedenen Verfahren bestimmt, wobei als Vergleichssubstanzen natives Schafcorticotropin, (# -ACTH), ACTH(1-18)-KH₂ und GIy¹^ACIH(I-Ie)-IiH₂ dienten. Die asco.rbinsäureentziehende Aktivität der liebennierenrinde von hypophyseneittOEierten Hatten wurde nach dem in United States Pharmacopeia XVII, 147 (I965) beschriebenen Verfahren bestimmt. Die in vitro-

009839/2304

BAD ORiGiNAL

steroidbildende Aktivität wurde nach dem Verfahren von Saffran und Schally (Endocrinol. , 5jo, 525 (1955)) bestimmt. Die in vivosteroidbildende Aktivität bei intravenöser Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten wurde nach dem Verfahren von Lipscomb und Nelson (Endocrinol., 71» 13 (1962)) mit einer kleineren Modifikation (A.Tanaka und C.H.Li, Endocrinol. Japonica»_: 13_t 180 (1966)) bestimmt» Die in vivo-steroidbildende Aktivität wurde auch an der mit Dexamethason-Pentobarbital betäubten Maus bestimmt (A. Tanaka und N.Nakamura, "Integrative mechanism of neuroendocrine system", Hokkaido University Medical Library Series, Vol. 1^, 49 (1968)). Zusätzlich wurde die steroidbildende Aktivität bei intramuskulärer Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten bestimmt, wobei ein Präparat von 0,05 ml/Ratte in den Rattenschenkelmuskel injiziert wurde und 30 Minuten nach der Injektion eine Blutprobe aus der abdominalen Aorta_r entnommen wurde."Während des ganzen Experimentes wurde der "Third USP Corticotropin Reference Standard" als Standard verwendet und die Bildung von 11-Hydroxycorticosteroiden (11-OHCS) nach dem fluorometrischen Verfahren von Peterson (J.Biol.Chem., 225, 25 (1957)) bestimmt. Bei jedem BeStimmungsverfahren wurden üblicherweise mehrere Messungen durchgeführt und die unabhängig voneinander erhaltenen Werte wurden nach dem statistischen Verfahren von Sheps und Moore ausgewertet- (J.Pharmacol.Extl.Therap., 128, 99 (I960)). Die Ergebnisse dieser Bestimmungen mit dem Octadekapeptid der Erfindung werden im folgenden mit den Ergebnissen von bekannten Corticotropinpeptiden und von natürlichem Corticotropin verglichen.

009839/2304 BAD

Tabelle I

Adrenocorticotrope Aktivitäten von Schafcorticotropin und verwandten, synthetischen Octadekapeptiden

Verfahren	Verabrei chung s art	Ia	Peptid Ib I	135	ος-ACTH
Adrenale ascorbinsäure- entziehende Wirkung	subkutan	45,4	25,6	237	120
In vitro-Steroidgenese	in vitro	13,7	20,8	125 -285	120
In vivo-Steroidgenese	intra venös	92,0	167		100 -180
In vivo-Steroidgenese bei				259
mit Dexamethason- Nembutal betäubter Maus	intra venös	L39	70 -168	124
peripherem Blut von hypophysenektomierter Ratte	intra muskulär		35,4

Anmerkung: Die Aktivitäten werden ausgedrückt in USP-Einheiten/ mg, in Bezug auf den "Third USP Corticotropin Reference Standard". Die Abkürzungen bedeuten: Ia = ACTH(1-18)- NH₂, Ib = GIy¹- ACTH(1-18)-NH₂,

I = (B-AIa¹J-ACTH (1-18)-ΝΗ₅, <K = natives Schafcorticotropin.

Wie aus Tabelle I hervorgeht, hat das nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Peptid I in jeder Beziehung eine hohe nebennierenstimulierende Aktivität. Die in vivo-steroidbilaende Aktivität von I liegt bei intravenöser Verabreichung in der gleichen Grössenordnung wie Ia und Ib und C/ -ACTH, Jedoch weist

das Peptid I eine auffallend hönere Aktivität als Ia und Ib auf, wenn sie durch die in vitro-Steroidgenese und den adrenalen Ascorbinsäureentzug bestimmt wird. Ausserdem ist es bemerkenswert,

009839/2304

BAD ORIGIN'^

dass das Verhältnis von subkutaner Verabreichung oder "bei in vitro-Bestimmung zur intravenösen Verabreichung für das Peptid den Wert 1 : 0,5 ist, während die Verhältnisse für die Peptide Ia und Ib den Wert 1 : 7 bzw. 1 : 8 haben. Peptid I gleicht in dieser Hinsicht mehr als Ia und Ib dem nativen Hormon ((Y -ACTH),

welches das Verhältnis 1 : 1.aufweist.

Pig. 1 zeigt, dass (ß-Ala¹)-ACTH(1-18)-NH₂ (I) länger aktiv bleibt als GIy^3--ACTH(I-Ie)-NH₂ (Ib) und natürliches ACTH, wenn die Peptide I und Ib in einer Dosis von 5>ig/Ratte (1 mg Peptid/ ml) und natürliches ACTH (125 Killieinheiten) intramukulär in aen Schenkelmuskel von hypophysenektomierten Ratten injiziert werden, wobei die steroidbildende Aktivität durch den 11-Hydroxycorticosteroid-(ll-OHCS)-Spiegel im Plasma ausgedrückt wird.

Das Octadekapeptid (ß-Ala)-ACTH(1-18)-NH₂ (I) weist eine ausgeprägt hohe lipolytische Aktivität auf, die in Tabelle II mit den Aktivitäten von synthetischen Peptiden verglichen wird: ACTH(1-18)-NH₂ (Ia), GIy³^-ACTH(I-IS)-NH₂ (I -j) und Schafcorticotropin ( o( -ACTH).

Tabelle II

In vitro-lipolytische Aktivität von natürlichem Corticotropin und verwandten'synthetischen Octaaekapeptiden.

;	Adipöses Kattengewebe Aaipöses Kaninchengewebe Verhältnis Hatte/Kaninchen (annähernd)	Minimale wirksame Dosis (IO~ mg/5C mg Gewebe) Ia -Ib I «„-ACCH.
3,C 6,3 C.62 6,0 0,CC4· 0,35 · GfOo5 7,1

009839/230A

BAD ORIGINAL

Anmerkung:

Die lipolytische Aktivität wurde nach dem von Tanaka et al. beschriebenen Verfahren (Ar eh. Bi ο ehem. Biophys., 39_, 294 (1962)) mit Rattenepidymal- und Kaninchenperirenaladiposegeweben bestimmt. Das Ansteigen der Konzentration von freien Fettsäuren im Medium und im Gewebe dient als Parameter. Die Aktivität wird ausgedrückt durch die minimale wirksame Dosis pro 50 mg Gewebe.

Wie aus Tabelle II hervorgent, ist die lipolytische Aktivität aes nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Octadekapeptids I ungefähr 10 Mal grosser als die von Ia, Ib und y -ACTH, wenn sie an der Ratte bestimmt wird. Im Vergleich zur Ratte kann beim Kanincnen eine geringere Menge von I die gleiche Aktivität ausüben. Dasselbe Verhältnis wird bei den anderen Peptiden Ia und Ib beobachtet. Es ist jedoch festzustellen, dass das- Verhältnis der minimalen wirksamen Dosis beim Fettgewebe der Ratte zur Dosis beim Fettgewebe·' des Kaninchens für I kleiner ist als für Ib und Ia. Dies bedeutet, dass das Peptid I der Erfindung dem natürlicnen Hormon verwandter ist als die Peptide Ia und Ib.

Die Figuren 2 und 3 geben die Inaktivierung von I und Ib als lipolytische Kittel in frischem Plasma und in Puffer, aer Bruchstücke von Rattenmuskulatur enthält, wieder. Dabei wurde im Fall von Plasma kein signifikanter Unterschied zwischen I und Ib festgestellt, während im Gewebe die Inaktivierung von I gegenüber der von Ib merklien verzögert war. Die Inaktivierung der lipolytischen Aktivität durch Plasma und durch Gewebe wurde auf folgende Weise durchgeführt. Eine Peptidprobe wurde in .frischem Plasma von betäubten Ratten oder in Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer ge-

009839/2304 _{BAD 0RielNAL}

löst, der Rinderserumalbumin, Bruchstücke von Rattenschenkelmuskulator und Glucose enthielt. Das Gemisch wurde dann bei 37 C inkubiert und die lipoyltische Aktivität nach dem oben angegebenen Verfahren nach Inkubationszeiten von 0,5, 1, 2 und 4 Stunden bestimmt. '

Die biologische Halbwertszeit von (B-AIa¹J-AGTH(I-IS)-NH₂ (I), das intravenös hypophysenektomierten Ratten mit einem Gewicht von 200 - 250 g injiziert worden war, wurde bestimmt. Zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion wurden Blutproben aus der abdominalen Aorta entnommen. Das abgetrennte Plasma wurde auf einen p^-Wert von 4-5 mit 1 η Salzsäure eingestellt, und als Parameter für die verbleibende biologische Aktivität im Plasma wurde die in vitro-lipolytische Aktivität unter Verwendung von epidymalem Rattenfettgewebe, wie oben erwähnt, bestimmt. Die Ergebnisse sind im Vergleich zu den lipolytischen Aktivitäten von natürlichem Corticotropin (ACTH) und GIy^1--ACTH(I-IS)-NH₂ (Ib) in folgender Tabelle wiedergegeben.

009839/23CU

Tahelιe III

KJ O) O

In vit ο lipolytische Aktivität von (ß-Ala¹)-ACTH(l-18)-NH₂,

natürlichem Corticotropin (intravenöse Injektion).

und

Anmerkung:

Zeit nach Injektion, Min.	natürl	Erzeugung von freien Fettsäuren	I	(100 #)	0,094	Ib	, μ Äq/100	mg	I	(100	Si)
0	0,129 +	. ACTi		(83 °J>)'	3,004	± 0,016			+ 0,076	(49	Si)
0,5	3,082 ■+	0,028	(77- J6).·-	1,21?	± 0,236	#	0,179	+ 0,228	(29	Si)
1	2;587 +	0,447	(77 io)	1,6?2	+ 0,139	(loo io)	2,148	+ 0,099	(32	£)
2	2,409 +	0,556	(33 io)	0,777	± 0,239	(39 Si)	1,140	+ 0,053	(13	Si)
4	2,396 +	0,337		0,243	+ 0,113	(53 si)	0,751"	+ 0,090	(16	Si)
8	1,108 +	0,364	( 9 io)	0,252	+ 0,087	(24 io)	0,815	+ 0,079	(17	Si)
12		0,180	( 3 io)	0,263	+ 0,063	( 5 Si)	0,431	i 0,180
16	0,580 +	-			+ 0,079	( 5 Si)	0,487	+ 0,055
32	0,212 i	0,056	-	( 6 Ji)	0,512	—
	0,028

Die Zahlen in Klammern sind die relativen Aktivitäten in Bezug auf den 0,5 Minuten-Y/ert für jedes Hormon.

NJ CD

CD

cn CO

Aus den oben angegebenen Vierten wurde die Halbwertszeit von natürlichem ACTE₁ Ib und I der Iipolytischen Aktivität zu 266 Sekunden, 117 Sekunden bzw. 188 Sekunden bestimmt. Eine Darstellung der Iipolytischen Aktivität dieser Peptide ist in Fig. 4 gegeben. Ss ist ersichtlich, dass (B-AIa¹J-AGTH(I-IS)-KH₂. (I) im. Plasma signifikant langer als GIy -ACTH(1-18)-NH₂ (Ib) beständig ist.

In ähnlicher Weise wurde die biologische Halbwertszeit von I bei intramuskulärer Injektion an hypophysenektomierten Ratten gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV und in Fig. 5 wiedergegeben.-

BAD 009839/2304

Tabelle IV

OO C*> CD

Lipolytische Aktivität von natürlichem Corticotropin (ACTH), GIy^ACTH (1-18 )-NH₂ (Ib) und (ß-Ala J-ACTH(I-Ie)-NH₉ (1) bei intramuskulärer Injektion

Zeit nach Injektion, Min.	0,097	natürl.	Erzeugung	*>·	von freien	Fettsäuren,	033	(57,7	1°)	Ä'q/100 mg	I	0,060	(100	°/	9	O
0	0,922	+ 0,032	ACTH	JO		Ib		(100 S	O		0,193 +		(54,	9	Ji)
CVJ	1,693	± 0,540		JO		o,	322	(50,9	*)		—		(97,	8	1o)
VJl	1,797	+ 0,356	(48,5	jO			229	(56,2	30		—	0,631	(92,	0	1")
10	1,264	i 0,392	(93,9	JO		0,	235	(64,5	56)		3,630 +	0,285	(49,		1°)
20	1,061	+ 0,320	(100	70		0,	429	(45,0			2,080 ±	0,407
30	0,474	+ 0,396	(68,6	JO		0,	098			3,558 +	0,542
60	0,209	+ 0,302	(56,7		0,	121			3,382 +	0,337
90		+ 0,056	(22,2		0,				1,876 +
	(6,6		0,
	0,033 +
—
1,772 +
3,047 +
1,568 +
1,727 +
1,977 +
1,390 +

Anmerkung: Die Zahlen in Klammern geben die relative lipolytische Aktivität in Bezug auf den 10-Minuten-Wert nach der Injektion für jedes Hormon wieder.

KJl CO

Die Halbwertszeit von ACTH₁. Ib und I wurde zu 1389,. 4-516 bzw. 4516 Sekunden bestimmt. Es ist festzustellen, dass die Halb- ■-•wertszeit des nach,: dem Verfahren der Erfindung hergestellten Octadekapeptids I ungefähr dreimal so lang ist, wie die von natürlichem Corticotropin, wie aus Fig. 5 hervorgeht.

Die Angreifbarkeit von (ß-Ala¹)-ACTH(l-18)-liH₂ (I). durch.Schwel-

nenieren-LeucinaminOpeptidase (LAP) wurde mit der von

AC£H(1-18)-NH- (Ia) und GIy¹WLGiEH(I-IS)-NHn (Ib) verglichen.

Cm U*

EIg. 6 zeigt die Wirkung von mit Diisopropylfluorphosphat (DPP)-behandelter Aminopeptidase auf die Peptide I, Ia und Ib. Aus Fig. 6 geht hervor, dass das nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Qctadekapeptid über einen längeren Zeitraum hinweg als die bekannten Peptide Ia und Ib ohne eine rasche'Inaktivierung: durch einen Angriff der Aminopeptidase im Gewebe beständig bleibt, weswegen das Peptid I für therapeutische Zwelcke sehr wertvoll ist. Die^: Untersuchungen der Angreifbarkeit der synthetischen Peptide werden im- folgenden näher beschrieben.

Es war in. Vorversuchen, festgestellt worden, dass ein Präparat von handelsüblicher LAP (Washington Biochemical Co._r Freehold, New Jersey, V.St.Ä.)(ß-/aa¹)-ACa!H(l-lö)-QH, das aus dem entsprechenden, geschützten Dekapeptld tert.-Butyloxycarbonyl-ßalanyl-tyrOsyl-seryl-methionyl-.ir-tert.-butyl-glutamyl-^histidylphenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycln (XVI) durch Behandlung mit Ameisensäure hergestellt wurde, und (ß-Ala¹)-ACTH(1-18)-NH₂ (I), aber nicht ß-Alanyl-tyrosyl-seryl-methioninhydrazid, das aus tert.-ButyloxycarbOnyl-ß-alanyl-tyrosyl-seryl-methioninhydrazid (VII) durch Behandlung mit Ameisensäure hergestellt wurde, hydrolytisch spaltet. Durch einen Aminosäureanalysator

009839/2304

BAD ORIGINAL

wurde in den enzymatischen Spaltprodukten kein ß-Alanin entdeckt. Deshalb muss die beobachtete Hydrolyse auf die Gegenwart einer Endopeptidasenverunreinigung in der LAP-Präparation zurückzuführen sein. Diese scheinbare Empfindlichkeit von ß-Alanylpeptiden gegenüber dem LAP-Präparat verschwand vollständig, wenn das Enzympräparat vorher mit Diisopropylfluorphosphat (DPP) behandelt worden war. Durch die DFP-behandelte LAP wurde das Ser -Peptid (la) schneller als das GIy -Peptid (Ib) hydrolysiert, während am 13-AIa -Peptid (I) innerhalb der Messgenauigkeit keine Hydrolyse beobachtet wurde.

Die DPP-behandelte LAP wurde dadurch erhalten, dass man eine Suspension des Enzyms in zu 75 i» gesättigter Ammoniumsulfatlösung bei 4 C gegen eine 0,005 m Magnesiumchloridlösung dialysierte, die 5 mg Enzym enthaltende LAP-Suspension mit 0,0005 m Tris-Puffer auf das fünffache verdünnte, die verdünnte Enzymlöi...p^ m: ΐ 0,08 ml 1 m Diisopropylfluorphosphat in Isopröpanol versetzte, das Gemisch 45 Hinuten bei 37⁰C inkubierte und dann das Gemisch bei 4°C gegen 0,0005 m 'Iris-Puffer dialysierte.

Die LAP-Aktivität der Enzymlösung wurde bei einem p^-Wert von 8,3 und 25°C gemäss Tuppy et al. (Z.Physiol. Chem. 329, 278 (1962)) mit einigen Modifikationen unter Verwendung von L-Leucin-p-nitraanilid (LNA) als Substrat bestimmt. Eine LAP-Einheit wurde vorläufig als die Enzymmenge definiert, die bei 400 mu gegenüber einer Leercuvette einen Sxtinktionszuwach3 von 0,001 pro Minute erzeugt. Es wurden 1 cm-Cuvetten in einem Hitachi-Ppektrophotometer verwendet.

009839/230A _ßAD original

Für die Messungen der Spaltung des synthetischen Substrates durch LAP wurde ein Gemisch aus 1 Teil 0,1 milliraolarer Lösung des Substrates in V/asser, 1 Teil 0,05 hi Tris-Puffer vom p_H-Y/ert 8,3 una einem halben Teil Enzym (4,88 Einheiten/ml LKA als Substrat) bei 57° inkubiert. Aus dem inkubierten Gemisch wurden 0,5 ml Proben entnommen und sofort mit jeweils 0,5 ml Ninhydrin-Keagens vermischt. Das Gemisch wurde dann im kochenden Wasserbad 15 Minuten lang erhitzt. Kach dem Abkühlen und geeigneter Verdünnung mit 50 9o-igem Äthanol wurde die Absorption bei 570 mx mit einem Hitachi-Spektrophotometer gemessen. Bei jeder Durchführung aes Versuchs wurden zur Kontrolle Inkubationsgemische ohne Substrat oder ohne Enzym bestimmt. Bei der Ninhydrinreaktion wurde auch eine Standardlösung von L-Leucin jeweils als Bezug getestet. Die Ergebnisse der enzymatischen Spaltung der Peptide I, Ia und Ib durch DFP-behandelte LAP sind in Fig. 6 wiedergegeben, wobei die Aminosäurefreisetzung als Leucinkonzentration angegeben ist.

Bestimmung der in vitro-melanosyteiistimülierenden Aktivität von (ß-Ala )-ACTH(1-18)-KH₂ wurde nach einem von K. Shizume, A.5.Lerner und T.B. Fitzpatrick (Endocrinol., 54,. 553 (1954)) angegebenen Verfahren unter Verwendung von Rana pipiens als Versuchstier durchgeführt, wobei mit den Aktivitäten von GIy^x-A02H(l-18)-HH₂ und ACTH (1.-24)-OH (Synacthen ®, CibaCo.,) verglichen wurde. Als Bezugswert wurde natürliches reines Cf -melanozytenstimulierendes Hormon (öi -MSH) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V wiedergegeben.

009839/2304 BAD ORIGINAL

Tabelle V

In vitro-melanozytenstimulierende Aktivität von (ß-Ala )■ ACTH(1-18)-NH₂, GIy³VACTH(I-IS)-NH₂ und ACTH(l-24)-OH.

Verbindung	MSH-Aktivität, Einheiten/g
(ß-Ala1)-ACTH(1-18)-NH2 SIy1--ACTHC 1-18)-NH2 ACTH(l-24)-OH	9,6 χ 109 6,7 x 108 2,1 χ 108

Die melanozytenstimulierende Aktivität von (ß-Ala )-ACTH(1-18)-KH₂ ist auffallend höher als die von GIy^ACTH(I-Ie)-NH₂ und ACTH(l-24)-OH. Da natürliches Schweinecorticotropin nach R.G. Shepherd et al. (J.Am.Chem.Soc., 78, 5051 (1956) eine

melanozytenstimulierende Aktivität von 1,7 χ 10 Einheiten/g aufweist, ist die melanozytenstimulierende Aktivität von (ß-Ala )-ACTH (1-18)-KH₂, das nach·'dem Verfahren der Erfindung hergestellt wurde, ungefähr 50 Mal so gross wie die von natürlichem Schweinecorticotropin.

Die nach dem Verfahren der Erfindung hergestellten Octadekapeptide können in entsprechende Schwermetallkomplexe, z.B. mit Zinkchlorid, Zinkhydroxid, Zinkacetat, Zinksulfat, Kupferchlorid, Nickeichlorid, Kobaltchlorid oder Eisenchlorid, in Komplexe mit Polyaminosäuren, z.B. Poly-L-glutaminsäure, PoIy-D-glutaniinsäure, Poly-DL-glutaminsäure, Poly-L-asparaginsäure, Poly-D-asparaginsäure, Poly-DL-asparaginsäure oder Copoly-L-giutamyi-Tyrosin oder in gemischte Komplexe überführt werden, die eine länger anhaltende Aktivität im Blut als die freien Octadekapeptide zeigen. Wenn z.B. ein Zinkkomplex von (ß-Ala )-

009839/2304

BAD ORIGINAL

₂, der aus 0,5 mg Peptid, 0,25 ml einer 40 millimolaren Zinkchloridlösung, 4,5 mg Natriumchlorid und 0,25 ml

' einer 40 millimolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung besteht, durch intramuskuläre Injektion an Batten in einer Dosis von 5 jul/Eatt'e verabreicht wurde, betrug die Menge an 11-Hydroxycorticosteroid im Plasma 2 Stunden nach der Injektion 80 jug/ml,' ■während im Fall einer Präparation ohne Zinkchlorid nur 6 jig/ml Corticosteroid gefunden wurden. Deshalb ist es-vorteilhaft, diese Komplexe für therapeutische Zwecke zu verwenden. Man erhält diese Komplexe, indem man die Octadekapeptide mit einer Schwermetallverbindung oder einer Polyaminosäure oder einem Ge- I misch derselben in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1 s 0,1 bis 20 unter schwach sauren Bedingungen, insbesondere bei einem p„-Wert von 6,5 - 7,0 ,behandelt. Bei der Behandlung von Polyaminosäuren beträgt das bevorzugte Molekulargewicht der Polyaminosäuren etwa 1000 bis 100 000, insbesondere 2000 bis 6000. Bei der Herstellung der Komplexe können.gegebenenfalls ge-.eignete Träger, Konservierungsmittel, Puffer, Stabilisatoren und isotonisierende Verbindungen zugesetzt werden.

Ss sei angemerkt, dass die oben angegebenen Werte für (ß-Ala J-ACTH(I-Ie)-NH₂ nur als Beispiele dienen. Da die anderen Verbindungen der Erfindung fast die gleichen Eigenschaften und Vorteile wie jene haben, deren Untersuchungsergebnisse oben angegeben sind,, sind die. Verbindungen der Erfindung für therapeutische .Zwecke, z.B. zur Behandlung von akutem oder chronischem Gelenkrheumatismus und allergischen Krankheiten verschiedener Organe von Menschen und Haustieren,sehr wertvoll und, vorteilhaft.

09839/2304

Die Cctadekapeptide der Erfindung, ihre Additionssalze und Komplexe können oral oder parenteral in üblichen Darreichungsformen verabreicht werden, z.B. als Injektionspräparate, Flüssigkeiten, Suspensionen, Emulsionen, Aerosole oder Tabletten, im Gemisch mit Trägern, Stabilisatoren, Emulgatoren, Konservierungsmitteln, Puffern^sotonisierenden Verbindungen und/oder Netzmitteln.

Die wirksame Dosis kann von Ärzten leicht unter Zugrundelegung der hier angegebenen Werte bestiramt werden. Z.B. beträgt eine typische klinische Dosis der Verbindungen der Erfindung ungefähr 0,2 Einheiten/kg - 0,8 Einheiten/kg für eine normale erwachsene Person. Die Octadekapeptide der Erfindung werden vorzugsweise in Form eines Injektionspräparates verabreicht.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen verhalten sich Gewichtstsile zu Volumenteilen wie Gramm zu Milliliter.

Beispiel 1 ^:

Herstellung von N⁰* -tert.-Butyloxycarboayl-ß-alanyl-tyrosylseryl-methionin-hydrazid (XI)
1.N⁰^-tert.^Butyloxycarbonyi-ß-alanin (V) ™ 8,91 Gewichtsteile 3-Alanin werden in 100 Volumenteilen 1 η Natriumhydroxydlosung gelöst. Die lösung wird mit 21 Gewichtsteilen Natriumhydrogencarbonat und 70 Gewichts teilen Dioxan versetzt. Die Lösung wird bei 50 C gerührt und eine Lösung von

17,2 Gewichtsteilen (Azidameisensäure-tert.-butylester) in 30 , Volumenteilen Dioxan wird tropfenweise augesetzt. Das Gemisch wird 41,3 Stunden bei der gleichen Temperatur gerührt und hierauf unter ve ruiniertem Druck auf etwa 100 Volumenteile eingedampft. Die .-ronzt/icrierte Lösung wird mit Eis gekühlt und mit 180 VoIu-

009339/2304

menteilen 4 η Salzsäure auf p^ 2 eingestellt. Die Lösung wird mit ungefähr 100 Volumenteilen eiskaltem Essigsäureäthylester ausgeschüttelt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bis zu einem sirupösen Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäureäthylester/Petroläther kristallisiert. Man erhält 12,6 Gewichtsteile des gewünschten Produktes vom F. 77 bis 78⁰G.

	C	78}	H	99;	7	N-
ber.s	50,	99}	7,	06;	7	,40;
gef.:	* 50,	8,		,47.

2. M* -tert.-Butyloxycarbonyl-ß-elänyl-tyrösin^methylester (VI) 3,48 Gewichtsteile Tyrosinmethylester-hydrochlorid werden in 15 Volusaenteilen Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 5 Volumenteilen 5GSo-iger Kaliumearbonatlösung unter Eiskühlung versetzt und das Gemisch wird bei 4 C 40 Minuten stehen gelassen. Die gebildeten Kristalle werden'abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Man erhält 2,55 Gewichtsteile Tyrosiniaethylester.

Andererseits werden 1,89 Gewichtsteile des oben erhaltenen j;** -tert.-ButyJ.oxycarbonyl-ß-alanins in wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wird auf -10⁰C abgekühlt. Diese Lösung wird anschliessend langsam und unter Rühren mit 2,04 Gewichtsteilen n—tert,—Butylamin und 1,19 Gewichtsteilen Chlorameisensäureathylester versetzt. Nach 10 Minuten wird eine Suspension von 1,95 Gewichtsteilen des oben erhaltenen Tyrosinmethylesters in 20 Voluiaenteilen wässerfreiem Tetrahydrofuran .zugesetzt. Das Geniisch wird 30 Minuten bei -10⁰C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. AnscflijLiessend wird das Lösungsmittel unter ver-

009839/2304

' BAD ORIGINAL

minderten! Druck abgedampft. Der erhaltene Rückstand wird-in Essigsäureäthylester gelöst, anschiiessend mit 1 η Salzsäure, Wasser, 5$-iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Durck wird der erhaltene Rückstand zur Ausfällung von Kristallen mit Äther versetzt. Man lässt 20 Stunden stehen, filtriert die gebildeten Kristalle ab und trocknet im Exsikkator. Man erhält 2,99 Gewichtsteile des Dipeptidesters. Nach dem Umkristallisieren aus Methanol/Äther erhält man Kristalle vom P. 141 - 14-2⁰C; [<yj£⁵ ₌ + 8,2i O,5°(c=l,O2O, Methanol).

CHN C₁₈H₂₆N₂O₆; ber.: 59,00; 7,15; 7,65;

gef.: 59,03; 7,12; 7,63.

3. K* -tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-tyrosin-hydrazid (VIII) 2,56 Gewichtsteile N** -tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-tyrosinmethylester (VI) werden in 26 Volumenteilen wasserfreiem Äthanol gelöst. 1,7 Volumenteile Hydrazinhydrat werden der Lösung zugesetzt, und das Gemisch wird 5 Stunden bei Raumtemperatur und 20 Stunden bei 4⁰C genalten. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert, mit Äthanol und Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält 2,54 Gewichtsteile des gewünschten Dipeptid-hydrazids. Nach dem Umkristallisieren aus heissem Wasser erhält man Kristalle vom F. 213,5 - 215⁰C; Z"O(Jp³ » + 3,6 ί 0,6°(c=0,978,

5G#-ige Essigsäure).

CHN

C₁₇H₁₆N₄O₅; ber.: 55,72; 7,15; 15,29;

gef.: 55,74; 7,11; 15,30.

009839/2304

4. N* -tert.-^Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-tyrosyl-seryl-methioninmethylester (X) .

" 1,10 Gewichtsteile IP-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-tyrosinhydrazid (VIII) werden in 7,5 Volumenteilen kalter 1 η Salzsäure g-elöst. Die Lösung wird bei ungefähr -1O⁰C gehalten und 3,6 Volumenteile 2 m kalte Natriumnitritlösung wird der Lösung zugesetzt. Man lässt das Gemisch 4 Minuten stehen, schüttelt das entstandene Azid mit Äther aus, wäscht mit 1 m Natriumhydrogencarbonatlösung und trocknet über wasserfreiem Natriumsulfat. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von ungefähr 1O⁰C wird der entstandene Rückstand in kaltem'Acetonitril gelöst. Man gibt 0,756 Gewichtsteile Seryl-methxonin-methylester (IX) zu, der nach den Vorschriften der Literatur: Bull.Chem.Soc.Japan, 39, 1171 (1966) hergestellt wurde, und lässt das Gemisch 48 Stunden stehen. Das Lösungsmittel wird durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wird durch Zugabe von Essigsäureäthylester und portionsweise Zugabe von Wasser gelöst. Die Lösung wird anschliessend mit 1 η kalter Salzsäure, Wasser, 5^-iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck wird das entstandene gelatinöse Produkt abfiltriert, mit kaltem Essigsäureäthylester und Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält 1,20 Gewichtsteile des gewünschten Tetrapeptidmethylesters. Das Produkt wird durch Umfallen aus Essigsäureäthylester gereinigt. F. 121,5 - 123⁰C [^J²Q - -13,0 % O,6°(c=O,997, Methanol) . Rf₁ 0_r53 (bei Dünnsehichtchrömatographie im Lösungsmittelsystem

099839/2304

BAD ORIGINAL

Methanol ; Essigsäure = 15ί85).

C HN S

C₂₆H₄₀K₄O₉S; ber.: 52,41; 6,90; 9,58; 5,48; .

gef.: 52,94; 6,85; 9,65; 5,48.

5. N⁰* -tert.-Butyloxycarbonyl-iä-alanyl-tyrosyl-seryl-methioninhyarazid (XI)

0,97 Gewichtsteile li^-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-tyrosylseryl-methionin-methylester (X) werden in 6 Volumenteilen Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 0,5 Volumenteilen Ky- ^ drazinhydrat versetzt und das Gemisch wird 43 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Die Lösung wird mit Essigsäureäthylester versetzt. Es entsteht ein gelatinöses Produkt, das abfiltriert, mit kaltem Essigsäureäthylester gewaschen und getrocknet wird. Man erhält 1,01 Gewichtsteile des gewünscnten ületrapeptid-hydrazids. Nach dem Umkristallisieren aus Wassei* erhält man Kristalle vom P. 186,5 - 188⁰C; [<Χ]ψ.= -20,1 i O_t5° (c=l,346, 50^-iges Methanol).

	. HgOber.; 49	C	7	(XIX)	H N	S
C25H40°8N6S<	gef.i 49	,82;	7		,02; 13,	94; 5,32;
	,72;	von /"-tert.-3utyl-glu	,05; 14,	50; 5,15.
Darstellung		arginyl-tryptophyl-glycin	tamyl-hist	idyl-ühenylalanyl-

1. Nitroarginyi-tryptophyl-glycin-methylester-formiat (XIII) 5,77 Gewichtsteile tert.-Butyioxycarbonyl-N -nitro-arginyltryptophyl-glycin-methylester (XII) werden in 50 Volumenteilen 98-100^-iger Ameisensäure gelöst. Die Lösung wird 3,5 Stünden stehen gelassen.. Danach wird die Ameisensäure durch Eindampfen bei einer Badtemperatur von 40 - 45°C entfernt und der Rückstand in Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Äther gewaschen und lyo-

009839/2304

philisiert. Man erhält 4,86 Gewichtsteile des gewünschten Produkts vom f. 107 - 111⁰C; £OfJ^³ = +13,0 + 0,5° (e=2,062-, Methanol).

CH N

C₂₀H₂₈N₈O₆.HGOOH.1/2H₂O ber.: 47,45; 5,88; 21,08;

gef.': 47,25; 6,03; 20,90.

2. tert.-Butyloxyearbonyl-phenylalanyl-N -nitro-arginyl-tryptophyl-glycin-methylester (XIV)

Diese Verbindung wird genau nach den Angaben der Literatur: Bull.Chem. Soc.Japan,, j>8, 1148 (1965) synthetisiert, mit der Ausnahme, dass das oben erhaltene Cripeptidesterformiat anstelle des Trifluoracetats verwendet wird. Man erhält 4,06 Gewichtsteile der gewünschten Verbindung, indem man 4,81 Gewichtsteile N -Kitro-arginyl-tryptophyl-glycin-methylester-formiat mit 4,42 Gewichtsteilen tert.-Butyloxycarbonyl-phenylalanin-dicyclohexylaminsalz in Acetonitril nach dem Dicyelohexylcarbodiimidverfahren umsetzt. Man erhält ein Produkt vom P. 176 - 177⁰G;

A(J7S -	-20,	4	i 2°	(c=2, Methanol)	•	6	H	17	N
				C		6	,27;	17	,42
C34H45N9	O9 ·"		ber	.: 56,42;		,22;		,58
			gef	.: 56,34;

* G

3. Phenylalanyl-2* -nitro-arginyl-tryptophyl-glycin-methylester-

formiat (XV)

1,81 Gewichtsteile tert.-Butyloxycarbonyl-phönylalanyl-K -nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylester (XIV) werden in 18 Volumenteilen Ameisensäure gelöst. Lie Lösung wird 3,5 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Nach dem Entfernen der Ameisensäure wird der Rückstand aus n-Butanol kristallisiert. Das kristalline

009839/2304

- 5b - -

Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Man erhält 1,71 Gewichtsteile vom F. 124 - 125,5⁰C; £<x.J^ = -9,0 i 0,5° (c= 0,977, Methanol).

C H N C₂₉H₅₇N₉O₇,HGOOH.1/2H₂Oj ber.i 54,38; 6,28; 17,84.

gef.s 53,00; 6,10; 17,79.

4. N^a,N ^m-Dibenzyloxycarbonyl-histidyl~phenylalanyl-N -nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylestex· (XVI) Man erhält dieses Peptid nach dem in Bull.Chem.Soc.Japan., 38, 1148 (I965) angegebenen Verfahren, mit der Ausnahme, dass aristelle des entsprechenden Irifluoracetats das oben erhaltene Tetrapeptidesterformiat verwendet wird. Man stellt den Pentapeptidester aus 2,60 Gewientstellen Phenylalanyl-N -nitro-arginyl-tryptophyl-glycin-methylester-formiat und 1,91 Gewichtstei« len K ,N -Dibenzyloxycarbonyl-histidin-p-nitrophenylester her. Man erhält 2,70 Gewichtsfeile; /*#Jp⁷ « -22,3 + 0,3° (c=2,084, Dimethylformamid).

^C51^H56^X12°12^#H2^O;

5.Histidyl-phenylalanyl-arginyl~tryptophyl--glycin--monoacetat

(XVII)

1,44 Gewientsteile N⁰^N -Dibenzyloxycarbonyl-histidyl-phenyl-

alanyl-K -nitro-arginyl-tryptophyl-glycin-methylester (XVI) werden in 9G$£--igeffi Dioxan hydrolysiert und aus Essigsäure lyophilisiert. Man erhält 1,35 Gewichtsteile Benzyloxycarbonyl-histidylphenyl-alanyl'-N -nitro-arginyl-tryptophyl-glycin entsprechend dem in Bull.Chem.Soc. Japan., 3,§» 1148 (1965) angegebenen Verfahren.

009839/2304

BAD ORIGINAL

	58	C	5	H	16	N
ber.:	58	,5C;	5	,58;	15	,05; .
gef.:	,63;	,70;	,89.

0,72 Gewichtsteile des oben erhaltenen Pentapeptids und 0,72 Volumenteile Anisol werden in 7-8 Volumenteilen wasserfreiem .Fluorwasserstoff bei einer Badtemperatur von Trockeneis/Aceton-Gemisch gelöst. Danach wird das Gemisch 30 Minuten bei O⁰C gerührt. Nach dem.Entfernen des Fluorwasserstoffes durch Eindampfen wird der Rückstand Ί5 Stunden über Natriumhydroxydplätzchen getrocknet. Der Rückstand wird in 20 Volumenteilen Wasser gelöst und die Lösung gründlich mit Essigsäureäthylester gewaschen und dann über eine kleine Amberlite CG-400 (Acetatform)-Säule gegeben. Die Säule wird portionsweise mit Wasser gewaschen. Die wässrigen Eluate werden vereinigt und lyophilisiert. Man erhält 0,64 Gewichtsteile, λ °^ ^{n HC1} = 279 mu (E^_m 66,2), 288 mu

53,5) UBaAP^ ^{n HftQH} = 280 mu (E^_m 65,0), 288 mu

54,5). PapierChromatographie in n-Butanol: Essigsäure : Pyridin : Wasser = 30 ; 6 :20 : 24 Volumentei-le. Es treten eine Hauptkompopente rom. R^. 0,47 - 0,53 und zwei Spuren auf, die alle auf Ninhydrin-, Pauly- und Ehrlichreagentien reagieren. Nur die Hauptkomponente reagiert mit Sakaguchireagens.

6· Benzyloxycarbony1-/"-tert,-butyl-glutamyl-histidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycln^nionoacetat (XVJlI), Eine Iiösung von 0,83 Gewicht st eilen der Verbindung (XVII) und 0,28 V-olxuaenteilen Driäthylamin in ZO Volumenteilen 90$-igem Dime thylforiaainid wird bei O⁰C gerührt und mit 0,4S Gewiehtsteilen B enay 1 oxyear b ony l-/¹-1.er t;, -but^^yl-glaatamiasäure-p-nAt r ophe».jl-

■ ester verse tut. J3as Gejaiseh wird 15 Stunden bei 4°ö gerührt. Eine zusätzliche Menge von 0,46 Gewichtstelleia äes aktiven Esters wird ÄUgßfeben un€ das G®rai'sc3a wlr,d bei 4% Penta^eptid |17II) sich um:eh

t) OBlGtNAL

nicht mehr nachweisen lässt, üas Reaktionsgemisch wird dann tropfenweise in 100 Volument<iile eiskalten Essigsäureäthylester gegeben. Man erhält einen gelatinösen Niederschlag, der abfiltriert, mit Essigsäureäthylester gewaschen und im Exsikkator getrocknet wird. Das aus Essigsäure/Wasser ausgefällte Produkt ist das gewünschte Hexapeptid. Man erhält 0,84 Gewichtsteile;

/*<*7ß³ = -26,6 + 0,5° (c= 1,377, 50 #-ige Essigsäure).

CHN

^C51^H64^K12°11*^GH3^COOH*^7H2^{O; ber#:} 52,86; 6,74; 13,98;

gef.i 52,73; 6,85; 13,92.

7. /'-tert.-Butyl-glutamyl-histidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin-monoacetat (XIX)

0,265 Gewichtsteile der Verbindung XVIII werden in 10 Volumenteilen 50?o-iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Palladiumschwarz 2,5 Stunden hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Piltrat unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 45 - 50 C eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert und über Natriumhydroxydplätzchen im Exsikkator getrocknet. Man erhält 0,22 Gewichtsteile. Das Produkt verhält sich bei der Dünnschichtchromatographie in n-Butanol: Essigsäure : Wasser =4:1:2 Volumenteile einheitlich.

CH N C₄₃H₅₈N₁₂O₉.CH₃COOH.8H₂O; ber.: 49,53; 7,21; 15,40;

gef.: 49,46; 6,77; 15,49.

BAD ORIGINAL 009839/2304

Herstellung von tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-tyrosyl-serylmethionyl~/'-tert,-butyl-glutamyl-histidyl-phenylalanyl-arginyl-

■tryptophyl-glycin (XX)

der Verbindung Eine Lösung von 0,45 Gewichtsteilen/XI in 4,5 Volumenteilen 9O#-igem Dimethylformamid wird in einer Kochsalz/Eis-Mischung gekühlt und mit 2,0 Volumenteilen eiskalter 1 η Salzsäure und 0,83 Volumenteilen eiskalter 1 m Natriumnitratlösung versetzt. Das Gemisch wird 4 Minuten gerührt und dann mit 20 Volumenteilen eiskalter gesättigter Katriumchloridlösung und eiskaltem Essigsäureäthylester versetzt. Die wässrige Schicht wird abgetrennt und 2 mal mit Essigsäureäthylester ausgeschüttelt. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit 5 $~iger kalter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einer Lösung von 0,50 Gewichtsteilen XIX und 0,21 Volunenteilen Triäthylamin in 15 Volumenteilen Dimethylformamid gegeben. Das Gemisch wird bei einer Badtemperatur von 10.- 15⁰C unter vermindertem Druck zur Entfernung des Essigsäureäthylesters eingedampft. Die erhaltene klare Lösung wird 15 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Eine zusätzliche Menge von Azid, das aus 0,23 Gewichtsteilen XI nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, wird zugesetzt und das Reaktionsgemisch wird weitere 24 Stunden bei 4 G gehalten. Anschliessend wird das Gemisch tropfenweise in 200 Voluiaenteile eiskaltenSssigsäureäthylester gegeben» Man erhält einen amorphen Niederschlag, der abfiltriert, mit Sssigsäureäthylester gewaschen und im Exsikkator getrocknet wird. Man erhält 0,69 Gewichtsteile. Nach Umfallen aus Dimethylformamid/Methanol (2s5) erhält man das reine Dekapeptidderivat; £<XJj? ^β -19,4 +0,7° (c=0,882, Dimethylformamid). Bei der .

DünnschichtChromatographie in Dimethylformamid ι Essigsäure-

009839/2304

BAD ORIGINAL

äthylester : Essigsäure = 15 ι 10 s 2 Volumenteile verhält sich das Produkt einheitlich (R_f = 0,54 - 0,57).

C H-N S C₆₈H₉₄K₁₆O₁₇S.8H₂O; ber.: 51,57; 7,00; 14,15; 2,02;

gef.: 51,62; 6,66; 14,06; 2,64.

Herstellung von ß-Alanyl-tyrosyl-seryl-methionyl-glutamyl-histidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycyl-lysyl-propyl-valylglycyl-lysyl-lysyl-arginyl-arginlnamid" (XXIV) Eine Lösung von 0,37 Gewichtsteilen der Verbindung XX in 10 Volumenteilen Dimethylformamid wird bei O⁰C mit 0,25 Volumenteilen eiskalter 1 η Salzsäure versetzt. Die Lösung wird sofort in 200 Volumenteile eiskaltes Gemisch aus Essigsäureäthylester und Äther (1:1) gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Die erhaltenen 0,36 Gewichtsteile werden in 5 Volumenteilen Dimethylformamid gelöst, und dazu werden 0,3,15 Gewichtsteile N-Hydroxysuccinimid und 0,21 Gewichtsteile XjN'-Dicyclohexyicarbodiimid nacheinander zugegeben. Das Gemisch wird 15 Stunden bei 4 C stehen gelassen. Xacr, eiern Abfiltrieren der Harnstoff verbindung wird das Piltrat · in ein eiskaltes Gemisch aus 200 Volumenteilen Äthylacetat und Äther (1:1) gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Man erhält 0,39 Gewichtsteile des aktiven Esters des Dekapeptids.

0,23 Gewichtsteile des Triacetate von N^ -tert.-Butyloxycarbonyllysyl-prolyl-valyl-glycyl-K * -tert.-butyloxycarbonyl-ly&y1-N^ -

arginin

tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-^mid werden in 3 Volumenteilen Dimethylformamid gelöst und mit 0,24 VolumenteilenTriäthylamin versetzt. Dazu wird eine Lösung von 0,39 Gewichtstei-

009839/2304

BAD ORIGINAL

len des oben·erhaltenen aktiven Dekapeptidesters in Dimethylfor-.mamid gegeben und das Reaktionsgemisch (Gesamtvolumen ca. 5 Volumenteile) wird 60 Stunden bei 4⁰C stehen gelassen. Man erhält das Rohprodukt des geschützten Octadekapeptids als amorphen Pe st stoff, wenn das Reaktionsge.misch zu 100 Volumenteilen kaltem Essigsäureäthylester gegeben wird. Ausbeute 0,55 Gewichtsteile..

0,55 Gewichtsteile des geschützten Peptids werden zum Entfernen der Schutzgruppen in 6 Volumenteilen 90$-iger Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird 60 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Danach wird das Lösungsmittel durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in V/asser gelöst und die Lösung über eine Amberlite CG-400 (Acetatform)-Säule (2,2x7cm) gegeben. Die Säule wird portionsweise mit Wasser gewaschen. Die wässrigen Lösungen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 10 - 15 Volumenteile eingedampft. Zu der eingedampften Lösung wird 1 Volumenteil 1^: m Mereaptoäthanollösung gegeben und das Gemisch wird 15 Stunden bei 37°C inkubiert und lyophilisiert. Man erhält 0,51 Gewichtsteile Rohpeptid ohne Schutzgruppen, das zur weiteren Reinigung an einer mit Carboxymethylcellulose ■ (CMC, Serva 0,6 Milliäquivalent/g) beschickten Säule chromatographiert wird, wobei 4000 Volumenteile eines Ammoriiumacetatpuff ers vom· pjT-Wert 6,8 mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,05 - 0,4 m verwendet werden. Die dem Hauptgipfel entsprechenden Fraktionen 166 - 245 mit je 15 ml werden vereinigt, und der Hauptteil des Lösungsmittels wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird wiederholt bis zur Gewicht skonstanz lyophilisiert· Man erhält 0,22 Gewichtsteile des teilweise gereinigten Octadekapeptids. 0,2 Gewichtsteile des'

Ö0SS3S/2304 _o

Produktes werden zur weiteren Reinigung an einer CMC-Säule (2,2 χ 18 ein; Serva, 0,6 Kiliiäquivalent/g) unter Verwendung von 2000 Volumenteilen eines Ammoniumacetatpuffers vom p_K-Wert 6,8 mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,05 - 0,8 m chromatographiert. Die dem Hauptgipfel entsprechenden Fraktionen 125 - 16C von je 7,5 ml werden vereinigt, eingedampft und Iy ophilisiertt Man erhält 0,17 Gewichtsteile des reinen Peptids ß-Alanyl-tyrosyl-seryl-methionyl-glutaiayl-histidyl-phenylalanylarginyl-tryptophyl-glycyl-lysyl-prolyl-valyl-glycyl-lysyl-lysylarginyl-argininamid; /X/^⁷ = -54,0 + l,8°(c=O,515, O₁In Essig-.λ £äx " ^Ka0H ■ ²⁸° Ψ <^ElL Ζ'·«». Asihult«¹ - ²⁸⁸·5 ψ ⁷-⁵ί ^und λ°£ ^{η Ka0H} =281,5 <ψ (E^_n, 24,9), 288 ΐπμ 24,3).

Das Produkt verhält sich bei der Papierchromatographie mit n-Butanol:Essigsäure;Pyridin:V/asser = 30 : 6 : 20 ; 24 als Laufmittel gegenüber Ninhydrüa-, Pauly-, Ehrlich-, Sakaguchi- und Methioninreagens (PtJr) und bei der Papierelektrophorese (600V/ 36 cm in 2 η Essigsäure) einheitlich. Das Verhältnis der Aminosäuren bei saurer Hydrolyse ist folgendes: Ser 0,75, GIu 0,90, Pro 0,91, GIy 1,89, VaI 1,00, Met 0,96, Tyr 1,01, Phe 0,97, ß-Ala 1,00, Lys 2,83, His 0,92, Arg 2,82 ,Trp 0,-55, NH₅ 1,42. Das Trp/Tyr-Verhältnis im intakten Octadekapeptid bestimmt man spektrophotometrisch zu 1,16 : 1.

Beispiel 2

5 Gewichtsteile (ß-Ala¹)-ACTH(l-18)-liH₂-acetat werden in 2,5 Gewichtsteilen 40 millimolarer Zinkchloridlösung gelöst. Die Lösung wird mit 2,5 Volumenteilen einer 45 Gewichtsteile üatriumchlorid enthaltenden 40 millimolaren Dinatriumhydrogenphosphat-

009 8 3 9/2304

w BAD ORiGIMAL

lösung versetzt. Man erhält eine Suspension des Zinkchlorid-Komplexes»

Dieses Präparat wird in Dosen von 5 ^.l/Ratte hypophysektomierten Ratten intramuskulär injiziert. Nach 2 Stunden wurde die ll-Hydroxycorticosteroid-Menge" im Plasma zu 80/ig/100 ml' bestimmt. Im Gegensatz dazu erhielt man bei der Verabreichung eines auf die gleiche l/eise erhaltenen Präparates, das aber kein Zinkchlorid enthielt, eine ll-Hydroxycorticosteroid-Menge von 6 μβ/ΙΟΟ "ml. ·

Die Bestimmung wurde nach dem in Endocrinol.Japoniea, 13, 180 (1966) beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Verwendet man Kobaltchlorid, Kupferchlorid, .Nickelchlorid oder Eisenchlorid anstelle von Zinkchlorid, so erhält' man die entsprechenden Komplexe.

Beispiel 3

10 Gewichtsteile (B-AIa¹J-ACTHC1-18)-XK₂~acetat werden in 2 Gewichtsteilen destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung v/ird unter Rühren mit einer Lösung von 20 Gewichtsteilen Poly-L-asparaginsäure vom Molekulargewicht 3000 versetzt, die vor der Verwendung mit.3 Volumenteilen 0,1 η Katriumhydroxydlösung neutralisiert worden war. So erhält man eine Suspension eines weissen liiederschlags. Die gewünschte Suspension des Komplexes erhält man, wenn man zu der oben erhaltenen Suspension 5 Volumenteile einer m/15' Dinatriumhydrogenphosphat/Dikaliumhydrogenphosphatl'ösung, _v die 90 Gewichtsteile Jiatriumchlorid enthält, zusetzt.

Das Präparat wird in einer Losis von 5 jii/Ratte in hypophys- ·

009838/2304

ektomierte Ratten intramuskulär injiziert. 2 Stunden nach der Injektion wurde die ll-Hydroxycorticosteroidmenge im Plasma zu 45 /ig/1OC ml bestimmt, während die Menge bei Verabreichung einer auf die gleiche V/eise erhaltenen Präparation, die aber keine Poly-L-asparaginsäure enthielt, 6jug/lOO ml betrug.

Beispiel 4

5 Gewichtsteile (ß-Ala )-ACTH(1-18)-NH₂-acetat werden in 1,5 Volumenteilen destilliertem Wasser gelost. Die Lösung wird mit 1 Volucenteil einer Lösung von 5 Gewichtsteilen einer PoIy-L-glutaminsäure vom Molekulargewicht 15OO-2OOO versetzt, die vorher mit 0,1 η Xatriumhydroxydlösung neutralisiert worden war. Man erhält so eine Suspension des Komplexes. Durch Zugabe von 2,5 Volumenteilen eines 90 Gewichtsteile Natriumchlorid enthaltenden m/30 Phoephatpuffers zu der Suspension erhält man das gewünschte Präparat des Komplexes.

Beispiel 5

5 Gewichtsteile (B-AIa )-ACIH(1-18)-XH₂~acetat-werden in 15 Volumenteilen einer ICO millimolaren Zinkchloridlösung gelöst. AnGererseits werden 5 Gewichtsteile einer Poly-L-glutaminsäure vom Molekulargewicht 1500 - 2000mit 1 Volumenteil Ο,1·η Natriumhydroxydlösung neutralisiert und mit 45 Gewichtsteilen Natriumchlorid und mit 25 Volumenteilen einer 40 millimolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung .versetzt. Die so erhaltenen Lösungen des Octadekapeptids und der Polyglutaminsäure werden vereinigt, Man erhält eine Suspension des gewünschten Komplexes.

EAD ORIGINAL

009839/2304

Claims (17)

1. - 45 Patentansprüche

   ß-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-X-L-histidyl-L-ph'enylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L- prolyl-1-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-Y,

   in der X der !-Glutaminsäure'- oder L-Glutaminrest und Y der L-Arginin-·oder der L-Argininamidrest ist, ihre nicht toxischen Säureadditionssalze, Komplexe mit Schwermetallen und Polyaminosäuren oder deren Gemische.
2. 2. ß-Älanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L'-phenylalanyl-L-arginyl-L-'tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid, seine nicht toxischen Säureadditionssalze und Komplexe mit Zink, Kobalt, Nickel, Kupfer, Bisen, Poly-L-glutaminsäure, PoIy-D-glutaminsäure, Poly-DL-glutamiiisäure_r Poly-L^aspäraginsäure, Poly-DL-asparaginsäure, Copoly-L^glutamyl-tyrosin oder deren Gemische»
3. 3» Verbindung der allgemeinen Formel

   R^-ß-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-^Rg-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L'-arginyl-L-tryptqphyl-glycyl-N ■£ - H^-L-Iysyl-L^prolyl-L-valyl-glycyl-lil^ -H,-L-lysyl-N^ -Ε,-L-lysyl-L-arginyl-Y,

   in der R^ eine Aminosohutzgruppe., R₂ eine Car boxy !schutzgruppe, R-Z eine Amino schutzgruppe und Y -ein L-Arginin-, L-Argininamid,-, L-^Argininester- oder L-Argininhydrazid.rest ist.» '
4. 4. Verbindung .nach Anspruch 3, dadurch g e κ e η η z e ich n'et, dass R-^ und R, jeweils eine tert.-Butyloxycarbonyl-, ΐert.-AmyIoxycarbonyl-, 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, p-Kethoxybenzyloxycarbonylp-^itro-benzyloxycarbonyl-, Formyl-, Tosyl-, oder Tritylgruppe und Rp ein niederer Alkylester-, niederer Arylalkylester- oder Amidrest ist.
5. 5· Verbindung der allgemeinen Formel R-i-ß-Alanyl-L-tyro sy 1-L-seryl-L-me thionyl-/"-Rp-L-glutaziyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-l-arginyl-L— tryptophyl-Z,

   in der R-^ eine Aniinoschutzgruppe, R₂ eine Carboxylschutzgruppe und Z ein Glycin-, Glycinester-, oder Glycinhydrazidrest ist.
6. 6. Verbindung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, "dass R₁ eine tert.-Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, p-Methoxy benzyl oxy carbonyl-, p-Jiitrobenzylbxycarbonyl-, ?orn;yl-, Tosyl- oder Tritylgruppe und Rp ein niederer Alkylester-, niederer Arylalkylester- oder Amidrest ist.
7. 7. Verbindungen der Formeln tert.-rButyloxycarbonyl-iä-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-I-methionyl-/'-tert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin, tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-Z'-tert.-butyl-> L-glutamyl-L-histidyl-l-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycinester und tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-/'-tert.-butyl-1-glutamyl-L-histidy1-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-hydrazid.

   009839/2304 _BAd orsginal

   ■ - 47 - .
8. 8. Verbindung der allgemeinen Formel R^-ß-Alanyl-L-tyrosyl-l-seryl-W,

   in der R-^ eine Aminoschutzgruppe und W ein L-Methionin—, L-Methioninester- oder L-Kethioninhydrazidrest ist.
9. 9* Verbindung nach Anspruch 8, dadurch gekennz e i c h η e t, dass R^ eine tert.-Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-, 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyi—, p-Kethoxybenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, Pormyl-, Tosyi- oder Tritylgruppe ist.
10. 10« Verbindungen der JOriaeln tert.-Butyloxycarbonyl-S-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionin, tert^-Butyloxycarbonyl-fl-alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methioninester und tert.-Butyloxycarbonyl-ßalanyl-L^tyrosyl-L-seryl-L-methionin—hydrazid.
11. 11·' Verfahren zur herstellung von Oetadekapeptiden nach Anspruch 1, , d a d u r c h g e k e η η ζ e i c h η e t, dass man die Aminosäuren in der angegebenen Reihenfolge verknüpft, indem man schrittweise verlängert oder Peptideinheiten kondensiert, und gegebenenfalls die erhaltenen Octadekapeptide in an sich bekannter Weise in die entsprechenden nicht toxischen Säureadditionssalze oder Komplexe überführt. _f
12. 12. Verfahren zur Herstellung von Cc'taäekapeptiden nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e η η ζ e i c h η e t, dass man ein

    Dekapeptid der allgemeinen Formel

    R^-ß-Alänyl-L-tyrosyl-L-sery1-L-me thi onyl-^-Rg-L-glut amyl-L-histidyl-L-phenylalanyi-L-arginyl-L-tryptcphyl-glycin

    in der R₁ eine Aminoschutzgruppe und Rp eine Carboxylschutzgruppe

    ist, mit einem Octapeptid der allgemeinen Formel

    009839/2304 BAD original

    Ki-H^-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N* -lU-L-lysyl-N£ R^-L-lysyl-L-arginyl-Y,

    in der IU eine Aminoschutzgruppe ist und Y die oben angegebene Bedeutung hat, nach dem Dicyclohexylcarbodiimid-, Säurechlorid-, Azid-, Aktivester-, gemischten' Anhydrid-, Isocyanat-, Äthylchlorphosphit-, Ietraathylpyrophosph.it- oder kombinierten Verfahren kondensiert, die Schutzgruppen von dem erhaltenen Octadekapeptid der allgemeinen Formel

    Ü2~^ß--Ä-lanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-/'-R2-L-glutamyl-L- W histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-N*- R₅-L-lysyl-L-prolyl~L-valyl-glycyl-N^£" -R₃-L-IySyI-N^e -R₅-L-

    lysyl-L-arginyl-Y,

    in der R-^, R₂, R₃ und Y die oben angegebene Bedeutung haben, durch hydrierende Spaltung, Hydrolyse oder Säurehydrolyse entfernt und gegebenenfalls die so erhaltenen Octadekapeptide in an sich bekannter Weise in die entsprechenden nicht toxischen Säureadditionssalze oder Komplexe überführt,
13. 13. Verfahren zur Herstellung von ß-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-P methionyl-L-giutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginy1-L-tryptophyl-glycyl-Lylysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid, dadurch gekennzeichnet, dass man das Dekapeptid tert.-Butyloxycarbonylß-aianyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-/^tert.-butyl-L-glutaπlyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin mit dem Octapeptid K^-tert.-Butyloxycarbonyl-L—lysyl-L-prolyl-L-yalylglycyl-L'i-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-Jj -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamia nach dem Dicyciohexylcarbo-

    009839/230A

    BAD ORIGINAL

    diimid-, Säurechlorid-, Azid-, Aktivester-, gemischten Anhydrid-, Isoeyanat-, Ithylchlorphosphit-, Tetraäthylpyrophosphit-.oder ■einem gemischten Verfahren in einem inerten Lösungsmittel 2 96 Stunden bei -20 - 50 G umsetzt und die Schutzgruppen vom' entstandenen Octadekapeptid t er t„^Butyloxy.eart)onyl-ß-aIanyl-]L-tyrosyl-L-seryl-L-methi:onyl-/'-tert»-butyl-L-glutamyl-Ii-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-Ir-tryptöphyl-glycyl-II* -tert. -ibutyloxycariDonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-iN^-tert.-toutyloxy-

    -L-lysyl

    amid in einem sauren Medium bei !Eemperaturen von —10 bis 50 -G in einer Reaktionszeit von 10 - 90 Minuten entfernt»
14. 14* Verfahren zur Herstellung von Verbindungen der allgemeinen Formel

    E-^-ß-Alanyl-L- tyr ο syl-l-s e ryl-Ii-aie thionyl-/-l2~i'"'e^;3-wtamy 1-

    in der ft-, eine Aminoschutfegrappe, E₂ eine und 2 ein SIyCiH-, Glysinester- ©dar GlycinhydraZidrest i .dadurch gekennzeichnet, dass man ein peptid der allgemeinen

    in der E^ die oben angegebene Bedeutung hat, mit einem Hexapeptid der allgemeinen Formel

    idyl·-^^

    ■in der R? und Z die oben angegebene Bedeutung haben, in an sich bekannter Weise kondensiert·

    BAD ORiGtNAL

    008039/2304
15. 15. Verfahren zur Herstellung von R-^-ß-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-W, in der R-^ eine Aminoschutzgruppe und W ein L-Methionin-, L-Methioninester- oder L-Methioninhydrazidrest ist, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Dipeptid der allgemeinen Formel

    R₁-ß-Alanyl-P,

    in der R-^ eine Aminoschutzgruppe und P ein L-Tyrosin- oder ein Ir-Tyrosinhydrazidrest ist, mit einem Dipeptid der allgemeinen Formel

    L-Seryl-W,

    in der W ein L-Methionin-, L-Methioninester- oder L-Methioninhydraaidrest ist, umsetzt.
16. 16. Verfahren nur Herstellung des Hexapeptids /s-tert.-Butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophylglycin, dadurch gekennzeichnet, dass man aus N^-tert.-Butyl oxy car "bony l-N-nitro-L-arginyl-Ir-tryptophylglycin-methylester mit Hilfe von Ameisensäure die tert.-Butyloxycarbonylgruppe abspaltet, den entstandenen Tripeptidester mit tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin kondensiert, die tert.-Butyloxycarbonylgruppe mittels Ameisensäure vom tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-ü -nitro-L-arginyl-L-tryptophylglycin-methylester abspaltet, das entstandene Pentapeptid mit N*, K -Dibenzyloxycarbonyl-L-histidin-p-nitrophenylester kondensiert, den erhaltenen K⁰* ,N -Dibenzyloxycarbonyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-N -nitro-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin-methylester hydrolysiert, mit Fluorwasserstoff behandelt und fflit Benzyloxycarbonyl-/*^ert.-butyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin umsetzt.

    009839/2304

    ^BAD ORIGINAL
17. 17. Verwendung der Verbindungen nach Anspruch 1 zur Herstellung von Arzneipräparaten.

    009839/2304