DE2026076C3

DE2026076C3 - Verfahren zum selektiven Adsorbieren von einem oder mehreren, spezifischen, nicht-viralen Proteinen aus flüssigem Plasma oder Serum

Info

Publication number: DE2026076C3
Application number: DE2026076A
Authority: DE
Inventors: Joseph Louis Melnick; Craig Wallis
Original assignee: Monsanto Co
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1969-05-29
Filing date: 1970-05-27
Publication date: 1980-01-03
Also published as: DE2026076A1; GB1269868A; NL170419C; BE751088A; NL170419B; NL7007707A; DE2026076B2; CA925017A; FR2048934A5; US3555001A

Description

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Die vorliegende Erfindung betrifft den im Anspruch gekennzeichneten Gegenstand.

Plasma und Serum (also ein Plasma, aus welchem Fibrinogen und rote Blutkörperchen entfernt worden sind) von Säugetieren enthalten zahlreiche Proteine, wie Albumine, Lipoproteine und Globuline. Wegen des medizinischen Werts gewisser Blutprotein-Fraktionen, insbesondere von Globulinen, die als Immunsera und zur Behandlung von hämophilen Fällen, und von Albuminen, die zur Behandlung von Schockzuständen wertvoll sind, hat man bisher verschiedene Verfahren, die gewöhnlich das Ausfällen einer besonderen Fraktion vorsehen, zur Fraktionierung von Plasma und Serum benutzt Beispielsweise sind im Falle von Humanblutse- y, rum die Proteine in Lösung, die einen Salzgehalt von ungefähr 0,17 Mol pro Liter aufweist. Wenn zunächst im wesentlichen alte Salze aus dem Serum entfernt werden, können die in Lösung vorhandenen Globuline durch Ausfällen entfernt und die Albumine in der Lösung belassen werden. Obwohl die Fällungsverfahren im allgemeinen zur Abtrennung von Globulinen von den Albuminen erfolgreich sind, erhält man jedoch keine reinen Globulin-Fraktionen, da zusammen mit den Globulinen andere Serumproteine ausgefällt werden.

Aus der US-PS 33 98 092 ist ein Verfahren zum Reinigen von Wasser durch selektive Herabsetzung der Konzentration von Viren, Coliform-Bakterien, anderen Mikroorganismen und/oder grenzflächenaktiven Mitteln in Wasser beschrieben, in welchem man das Wasser v> mit einem hydrophilen, Wasserunlöslichen, vernetzten Polynmpholyt kontaktiert, der sich von einem Mischpolymerisat aus einem Olefin mit 2 bis 12 Kohlenstoffatomen und einem Monomeren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus (1) einer Mischung einer ungesättigten Polycarbonsäure und einem ungesättigten Polycarbonsäurcderivat, und (2) Polycarbonsäurederivaten, ableitet. Es handelt sich hier offenbar um die Beseitigung von noch vermehrungsfähigen Mikroorganismen, die unbeschadet ihrer differierenden Größen mi (Virus im Gegensatz zu großem ßakterium) gegebenenfalls sogar zusammen mit unbelebter Materie von diesen Polyampholaten aus dem Wasser in völlig unselektiver Weise herausgeholt werden. Ein Hinweis, daß derartige Polyampholate in von Wasser völlig verschiedenen μ Medien eine Selektivität, etwa für nicht-virale Proteine entwickeln können, ist dieser Patentschrift nirgends zu entnehmen.

Der vorliegenden Erfindung lag nun die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zu schaffen, das eine einfache und selektive Gewinnung von einem oder mehreren, spezifischen, nicht-viralen Proteinen aus flüssigem Plasma oder Serum durch selektive Adsorption ermöglicht

Diese Aufgabe wurde gemäß der Erfindung durch das im Anspruch umrissene Verfahren gelöst

Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten wasserunlöslichen Mischpolymerisate sind polykationischer oder polyampholytischer Natur und enthalten Dimethylaminopropylimidgruppen und/oder Methylimino-bis(propylimid)-Bindungen, d. h. sie sind Polyelektrolytpolymerisate. Viele der normalerweise wasserlöslichen Polyelektrolytpolymerisate werden dadurch in die wasserunlösliche Form überführt, daß man in bekannter Weise eine ausreichende Ar zahl von Vernetzungen einführt, die entweder während der Herstellung des Mischpolymerisats, oder durch eine nachfolgende Behandlung desselben ausgebildet werden können. Zu typischen Vernetzungsmitteln gehören Dimethylaminopropylamin, Methylimino-bis(propylamin), Divinylbenzol und Äthylendiamin. Weitere Vernetzungsmittel sind in der US-PS 3165486 beschrieben. Wenn Methylimino-bis(propylamin) als Vernetzungsmittel verwendet wird, werden Methyliminobis(propylimid)-Bindungen in das Mischpolymerisat eingeführt Die Wasserunlöslichkeit des Mischpolymerisats kann durch Einstellung seines Vernetzungsgrades variiert werden. Der hier verwendete Ausdruck »wasserunlöslich« bedeutet, daß sich das in Frage kommende Mischpolymerisat nicht in Wasser oder einer wässerigen Lösung löst, obgleich es infolge einer Solvatation durch Wasser einen hohen Quellungsgrad aufweisen kann, so daß es sogar in Gelform vorliegen kann.

Unter »Polyelektrolytpolymerisaten« sind nur solche polymere organische Substanzen zu verstehen, die beim in-Kontaktbringen mit einem wässerigen, wässerig-alkalischen oder wässerig-sauren Medium organische Ionen mit elektrischen Ladungen aufweisen, die über viele Stellen des Moleküls verteilt sind.

Die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzten Mischpolymerisate haben vorzugsweise ein durchschnittliches Molekulargewicht von wenigstens 1000 und einen Polymerisationsgrad von wenigstens 8. Es wird ferner bevorzugt, daß das Mischpolymerisat, d. h. die reaktionsfähigen Stellen darin, eine wesentliche Anzahl (d.h. ungefähr 2 bis 100%) ar, Dimethylaminopropylimidgruppen und/oder Methylimino-bis(propylimi j)-Bindungen enthalten.

Die Herstellung der erfindungsgemäß eingesetzten Mischpolymerisate ist bereits in der US-PS 33 98 092 beschrieben und es sind viele davon auch kommerziell verfügbar. Solche, die erforderlichen Imidgruppen enthaltenden Mischpolymerisate sind wasserunlöslich und ihrer Beschaffenheit nach polykationisch oder polyampholytisch.

Maleinsäureanhydrid/Olefin-Mischpolymerisate sind ferner auch in den US-Patentschriften 23 78 629, 23 96 785, 3157 595 und 33 40 680 beschrieben. Im allgemeinen werden die Mischpolymerisate dadurch hergestellt, daß man Äthylen oder ein anderes geeignetes Monomeres mit dem Säureanhydrid in Gegenwart eines Peroxiclkatalysators in einem aliphatischen oder aromatischen Kohlenwasserstoff-Lösungsmittel für die Monomeren, aber Nichtlösungsmittel für das gebildete Mischpolymerisat, umsetzt. Zu geeigneten

IO

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Lösungsmitteln gehören Benzol, Toluol, Xylol, chloriertes Benzol und dergleichen. Während Benzoylperoxid gewöhnlich der bevorzugte Katalysator ist, sind andere Peroxide, wie Acetylperoxid, Butyrylperoxid, ditertiäres Butylperoxid, Lauroylperoxid und dergleichen, oder einer der zahlreichen Azokatalysatoren zufriedenstellend, weil sie in organischen Lösungsmitteln löslich sind. Das Mischpolymerisat enthält vorzugsweise im wesentlichen äquimolare Mengen Olefinreste und Anhydridreste. Im allgemeinen sollte es einen Polymerisationsgrad von 8 bis 100 000, vorzugsweise von ungefähr 100 bis 5000 und ein Molekulargewicht von ungefähr 1000 bis 1000 000, vorzugsweise ungefähr 10 000 bis 500 000, aufweisen. Die Eigenschaften des Polymerisats, wie beispielsweise das Molekulargewicht, werden durch die geeignete Auswahl des Katalysators und durch Steuerung von einer oder mehreren der Variablen, wie des Verhältnisses der Reaktionspartner, der Temperatur und Katalysatorkonzentration, oder durch die Zugabe von regulierender* Kettenübertragungsmitteln, wie Diisopropylbenzol, Propionsäure, Alkyialdehyden oder dergleichen, eingestellt

Wie bereits gesagt, sind die basischen Gruppen des erfindungsgemäß eingesetzten polykationischen oder polyampholytischen Polyelektrolyts (PE) Imidgruppen, die dadurch hergestellt werden, daß taan Dimethylaminopropylamin mit den Carboxylgruppen eines vorher hergestellten Mischpolymerisats umsetzt oder ein Olefin mit einem ungesättigten Anhydrid oder einer ungesättigten Säure, die solche vorgebildeten Imidgrup- uo pen wenigstens iu einem Teil des ungesättigten Polycarbonsäure-Reaktionspsrtners enthalten, polymerisiert Nach der Erfindung werden solche Gruppen für die Zwecke dieser Erfindung bevorzugt Gegebenenfalls können, unabhängig davon, ob solche Gruppen vorhanden sind oder nicht, Imidgruppen durch Vernetzen des Polymerisats mit Methylimino-bis(propylamin) gebildet werden, was bei dem Vernetzungsverfahren durch Reaktion zwischen den endständigen Amingruppen des Vernetzungsmittels und Carboxylgruppen der Polymerisatkette die Bildung von Iminogruppen an beiden Enden der Vernetzungskette zur Folge hat unter Bildung der gewünschten Methylimino*bis(propylimid)-Bindungen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Polyelektrolyt-Mischpolymerisat der das Proteingemisch enthaltenden Flüssigkeit so lange unter Rühren zugegeben werden, bis das gewünschte Protein selektiv adsorbiert worden ist Anschließend kann das Mischpolymerisat mit dem daran adsorbierten Protein nach einem beliebigen geeigneten Verfahren, beispielsweise durch Filtration, abgetrennt werden.

Es ist jedoch auch möglich, das Mischpolymerisat als stationäre Phase in einer Kolonne anzuordnen und die proteinhaltige Flüssigkeit durchlaufen zu lassen.

Die Adsorptionswirkung eines PE bei der selektiven Adsorption des jeweiligen Proteins hängt insbesondere von dem pH-Wert des Plasmas oder des Serums und dem isoelektrischen Punkt vom PE, dem zu adsorbierenden Protein und dem nicht zu adsorbierenden Protein ab. Die Bestimmung des isoelektrischen Punktes ist dem Fachmann bekannt. Der isoelekIrische Punkt einer Reihe von erfindungsgemäß eingesetzten PE wurde in isotonischen (0,15 M) Kochsalzlösungen bestimmt und ist in der nachfolgenden Tabelle I angegeben. Diese Werte wurden unter Gleichgewichtsbedingungen durch Interpretation von potentiometrischen pH-Titrationsversuchen erhalten.

Tabelle I

45

50

55

	%Di-	Isoelektri
	methyl-	scher Punkt
	amino-
	propylimid
Äthylen/Maleinsäurc-	*2)**	3,10
anhydrid-Mischpolymerisat	5	4,01
	10	3,98
	15	4,00
	20	4,46
	30	4,90
	50	5,87
	70	8,54
	100	10,30
Isobutylen/Maleinsäure-	5	2,65
anhydrid-Mischpolymerisat	10	2,64
	15	2,73
	20	3,05
	30	3,75
	50	7,68
	70	8,13
	100	9,20
Styrol/Maleinsäure-	5	2,96
anhydrid-MischpoIymerisat	10	2,95
	15	3,48
	20	3,62
	30	3,79
	50	5,85
	70	7,76
	100	9,63
2-MethyIpenten-l/Maleinsäüre-	5	3,13
anhydrid-Mischpolymerisat	10	3,40
	15	4,00
	20	4,87
	30	6,70
	50	7,98
	70	8,15
	100	8,82

*) Methylimino-bis(propylimino)-Bindungen

Nach Abtrennen des Polymerisats mit dem daran adsorbierten Protein von dem Plasma oder Serum, kann das Protein daraus mittels eines geeigneten Elulionsverfahrens gewonnen werden. Es ist beispielsweise zweckmäßig, dem Polymerisat, welches das adsorbierte Protein enthält, ein geeignetes Elutionsmittel zuzugeben und das Gemisch ausreichend lange stehen zu lassen, um das Eluieren zu bewirken. Um die Elutionszeit abzukürzen, ist es wünschenswert, das Gemisch beispielsweise durch Schütteln oder Rühren zu bewegen.

Die Auswahl eines geeigneten Elutionsmittels kann unter anderem hauptsächlich von dem jeweils verwendeten Polyelektrolyt und dem jeweils zur Elution vorgesehenen Protein abhängen. Im allgemeinen wurde festgestellt, daß das Eluieren leichter bewirkt wird, wenn der Imid-Prozentgchalt des Polyelektrolyts wenigstens 2% beträgt und als Dimethylaminopropylimid-Gruppe vorhanden ist.

Zu geeigneten Elutionsmitteln gehören gepufferte Lösungen, beispielsweise Borstpuffer und Phosphatpuffer, wässerige Lösungen,dieüberschössigeHydrwtylionen enthalten, beispielsweise wässerige Lösungen von Alkalimetall und Erdalkalimetallhydroxid und Lösungen größerer lonenstärke, wie Salzlösungen. Oberflächenaktive Mittel können ebenso als geeignete Elutionsmittel dienen.

Es gibt zahlreiche Anwendungen der vorliegenden Erfindung, einschließlich der selektiven Abtrennung von Globulinen aus Serum oder Plasma, der selektiven Abtrennung des Antitrypsin-Faktors aus Serum oder Plasma, der selektive« Abtrennung von Interferon aus Serum oder Plasma und der selektiven Abtrennung von Albumin aus Serum oder Plasma. is

Wie bereits oben erwähnt, sind die Herstellung der eingesetzten Mischpolymerisate sowie deren Vernetzung bereits bekannt (z.B. US-PS 33 98 092), beziehungsweise sind die Mischpolymerisate nach dem Fachmann bekannten Verfahren Iticht zugänglich.

Die nachfolgenden Beispiele dienen uir weiteren Erläuterung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die selektive Abtrennung von Nicht-y-Globulin-Protein aus normalem Humansammelserum.

Zu 10 ml Humansammelserum, das 1000 mg% γ-Globulici, 5000 mg% Albumin, 500 mg% «-Globulin und 500 mg% ^-Globulin enthielt, wurde 1 g Styrol/Maleinsäureanhydrid-Mischpoiymerisat zugegeben. Das Polymerisat war mit Divinylbenzol vernetzt und enthielt 70% Dimethylaminopropylimid-Gruppen. Die erhaltene Suspension wurde 1 Stunde lang geschüttelt und dann zentrifugiert, um das Polymerisat zu sedimentieren. Die überstehende Flüssigkeit wurde abdekantiert und auf Protein geprüft. Sie enthielt 1000 mg% y-GlobuIin, also gleichviel wie vor der Behandlung, war jedoch im wesentlichen frei von anderen Proteinen, wie dies durch Elektrophorese und die Protein-Bestimmungsmethoden nach Lowry bestätigt wurde.

Beispiel 2

Ein Tierserum (40 ml), das Lipoproteine enthielt, die dafür bekannt sind, daß sie Vir.cn inhibieren, wurde in vier 10-ml-Anteile aufgeteilt, die mit A bzw. B, Cund D bezeichnet wurden. Die Anteile A und B wurden hinsichtlich ihrer Fähigkeit, Rubella-Virus zu inhibieren, nach dem Hämagglutinationsinhibierungstest geprüft Vor dem Test wurde der Anteil B mit Rubella-Virus immunisiert. Beide Anteile A und B zeigten, daß sie Rubella-Virus inhibieren.

Die Anteile Cund D wurden wie folgt behandelt: Zu 10ml Serum wurde Ig Styrol/Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat zugegeben. Das Mischpolymerisat war mit Divinylbenzol vernetzt und enthielt 70% Dimethylaminopropylimid-Gruppen. Die erhaltene Suspension wurde 1 Stunde lang gerührt, zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abdekantiert. Vor der Behandlung mit dem Mischpolymerisat wurde der m Anteil D mit Rubella-Virus immunisiert. Nach der Behandlung mit dem Mischpolymerisat wurden die Anteile Cund Dauf ihre Fähigkeit geprüft, Rubella-Virus zu inhibieren. Bei dem Anteil D wurde festgestellt, daß er Rubelta-Virus in dem diagnostischen Hämagglutinationstest bis zu einem Titer von 1 :40 inhibiert, während der Anteil C Rubella-Virus nicht inhibiert. Diese Ergebnisse zeigen, daß der Lipoprotein-Inhibitor aus dem Anteil Centfemt wurde.

Da Laboratoriumsuntersuchungen zur Diagnose von Vfruserkrankungen die Verwendung vom Serum erfordern, das spezifische Antikörper gegen den unter Versuch stehenden Virus enthält, wobei es von lipoproteinhaltigen Inhibitoren, die allgemein in den meisten humanen und tierischen Sera vorhanden sind, befreit sein muß, ist das vorausgehende Verfahren und die Anwendung dieses Verfahrens auf Sera von anderen Spezies, und zwar sowohl von Tieren als auch Menschen, und für diagnostische Untersuchungen zur Bestimmung anderer Viren, offensichtlich von erheblicher Bedeutung.

Beispiel 3

Zu einem 10-ml-Anteil von Humansammelserum, das 100 mg Hämoglobin in Form von Harn, einem basischen Protein, enthielt, wurde 1 g Polyelektrolytpolymerisat (vernetztes Styrol/Maleinsäureanhydrid mit einem Gehalt von 70% DimethylamhKipiopylimid) zugegeben. Die erhaltene Suspension wurde 1 Srcinde lang gerührt, dann zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit (Serum) abdekantiert. Die Analyse der überstehenden Flüssigkeit oder des Serums zeigte, daß darin alle vorhandenen Ausgangsproteine, ausgenommen Harn, enthalten waren, wobei dies durch hämoglobinometrische Standardverfahren und durch Vergleich mit unbehandelten Vergleichsproben festgestellt wurde.

Es ist daher möglich, sowohl aus Human-, als auch aus Tierplasma und -serum Produkte zu entfernen, die für eine Transfusion unerwünscht sind. Beispielsweise schließt die »Federal Drug Administration« die Verwendung von Serum oder Plasma für die Humantransfusion aus, wenn das Serum oder Plasma wesentliche Mengen an zerrissenem Harn (Hämoglobin), bekannt als Erythrozyten, enthält Weil Harn ein basisches Protein ist und weil Proteine in Serum und Plasma saure Proteine sind, wurde die selektive Entfernung von Harn aus dem Serum durch die Verwendung des obigen Polyelektrolyten bewirkt Derartige Verfahren ermöglichen die Regenerierung von nicht anerkannten Serum- und Plasmaproben, die häufig verworfen werden müssen, und sie sind ebenso brauchbar zur Herstellung von Serum, das als Gewebekultur-Nährstoff in Laboratoriumsverfahren verwendet werden soll.

Beispiel 4

Proteine können unter Verwendung von PE in isotonischen Salzlösungen entweder durch Adsorption des gewünschten Proteins auf den PE unter nachfolgendem Eluieren des gewünschten Materials, oder durch selektives Entfernen einer Anzahl von Proteinen in einer Proteinmischung mittels Adsorption an den PE gereinigt werden, wobei bestimmte andtre Proteine in reiner Form in Lösung verbleiben. Ergebnisse von Versuchen mit einer Anzahl gereinigter Proteine sind beispielsweise in der Tabelle 11 beschrieben, wozu drei typische PE verwendet wurden, und es wurde dadurch eine selektive Adsorption der spezifischen Proteine erreicht.

Bei jedem der Proteine wurde eine 3-ml-Probe, die 100 mg% Protein in gereinigter Form enthielt, mit 100 mg des jeweiligen PE 1 Stunde lang geschüttelt. Jede überstehende Flüssigkeit wurde auf die Gesamtmenge an zurückbleibendem Protein im Vergleich zu einer Kontrollprobe (die rieht mit dem untersuchten PE behandelt worden war) uniersucht.

Tabelle II Adsorption von gereinigten Proteinen an unlöslichen Polyelektrolyten

Untersuchtes Protein	Aus der Lösung durch Adsorption an Polyelektrolyten entfernte Proteinmenge (in mg %)	Vernetztes Styrol/ Maleinsäureanhydrid mit 70% Dimelhyl- aminopropylimid- gruppen	Vemetzles Styrol/ Maleinsäureanhydrid mit 100% Dimethyl- aminopropylimid- gruppen als quartäres Methyljodid
100 mg % in Ausgangs und unbehandelten Kcntrollproben	Vernetztes Styrol/ Maleinsäureanhydrid mit 100% Dimethyl- aminopropylimid- gruppen	100	100
Rinderalbumin	0	75	100
Casein	100	100	0
Protaminsulfat	0	η	!00
*■ Ij y^ti* ■**	Q	0	0
j?-Lipoprotein	100	0	100
y-Globulin	0

Beispiel 5

Entsprechend den Erkenntnissen von Beispiel 4 wurden die folgenden Abtrennungen aus isotonischer Salzlösung durchgeführt, wozu man vernetztes Styrol/ Maleinsäureanhydrid mit 100% Dimethylaminopropylimid-Gruppen in gleicher Weise wie im Beispiel 4 einsetzte, wobei in jedem Fall eines der Proteine durch den Polyelektrolyt nicht und das angegebene Protein hingegen adsorbiert wurde.

Casein wurde aus Gemischen mit Rinderalbumin, Protaminsulfat. Trypsin und y-Globulin adsorbiert, so daß in jedem Falle die Adsorption von Casein im wesentlichen quantitativ war.

/?-Lipoprotein wurde aus Gemischen mit Rinderalbumin, Protaminsulfat, Trypsin und y-Globulin adsorbiert, wobei in jedem Falle die Adsorption von j3-Lipoprotein

niionlif oli

Beispiel 6

Entsprechend den Erkenntnissen von Beispiel 4 wurden die nachfolgenden Abtrennungen aus isotonischer Kochsalzlösung durchgeführt, wozu man vernetztes Styrol/Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat mit 70% Dimethylaminopropylimid-Gruppen wie in Beispiel 4 einsetzte, wobei in jedem Falle eines der Proteine durch den Polyelekl.olyt nicht und das angegebene Protein adsorbiert wurde.

Rinderalbumin adsorbierte aus Gemischen mit Trypsin, /MJpoprotein und y-Globulin, wobei die Adsorption von Rinderalbumin in jedem Fall im wesentlichen quantitativ war.

Protaminsulfat adsorbierte aus Gemischen mit Trypsin, /MJpoprotein und y-Globulin, wobei in jedem Fail die Adsorption von Protaminsulfat im wesentlichen quantitativ war.

Casein adsorbierte aus Gemischen mit Trypsin, /MJpoprotein und y-GIobulin, wobei in jedem Fall die Adsorption von Casein im wesentlichen quantitativ war.

Beispiel 7

Entsprechend den Erkenntnissen von Beispiel 4 wurden die nachfolgenden Abtrennungen aus isotonischer Kochsalzlösung durchgeführt, wozu man vernetz- 2; tes Styrol/Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat mit 100% Dimethylaminopropylimid-Gruppen als quartäres MethylVydid in der Weise von Beispiel 4 einsetzte, wobei in jedem Fall eines der Proteine durch den Polyelektrolyt nicht und das angegebene Protein

so adsorbiert wurde.

Rinderalbumin adsorbiert aus Gemischen mit Protaminsulfat und /MJpoprotein, wobei die Adsorption von Rinderalbumin in jedem Fall im wesentlichen quantitativ war.

j-, Casein adsorbierte aus Gemischen mit Protaminsulfat und /MJpoprotein, wobei die Adsorption von Casein in jedem Fall im wesentlichen quantitativ war.

Trypsin adsorbierte aus Gemischen mit Protaminsulfat und /3-Lipoprotein, wobei die Adsorption von Trypsin in jedem Fall im wesentlichen quantitativ war.

u.Olnhnlin aHsnrhiprtp aus Cipmisrhpn mit Prntaminsulfat und /J-Lipoprotein, wobei die Adsorption von y-Globulin in jedem Fall im wesentlichen quantitativ war.

Es wurde demzufolge festgestellt, daß Gemische von Proteinen unterschiedlich getrennt werden können, wodurch man gereinigte Aufbereitungen eines einzelnen Proteins erhält. Beispielsweise wird y-Globulin zur passiven Immunisierung von Mensch und Tier derzeit

so kommerziell nach Verfahren hergestellt, die nicht nur das y-Globulin, sondern ebenso andere Serumproteine ausfällen. So enthält kommerziell nach Verfahren nach dem Stand der Technik hergestelltes y-GIobuIin andere fremde Serumproteine. Es wurde nunmehr gefunden, daß die Behandlung von Serum mit PE, besonders einem vernetzten Styrol/Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisat, das 70% Dimethylaminopropylimid-Gruppen enthält, die Entfernung aller Proteine außer y-GIobulin aus dem Serum bewirkt Es sind daher die überstehenden Flüssigkeiten solcher Aufbereitungen frei von Fremden Serumproteinen und enthalten nur das gewünschte y-Globulin.

Beispiel8

Dieses Beispiel zeigt die Entfernung des Anti-Trypsinfaktors (ATF) aus Kälber-Fötalserum unter Verwen-

dung von vernetzten Polyelektrolytpolymerisaten, die die notwendigen Imidgruppen enthalten.

Das Verfahren wurde wie folgt durchgeführt: Kälber-Fötalserum wurde mit destilliertem Wasser im Verhältnis I : 30 verdünnt. PE (1 mg) wurde zu 4 ml verdünntem Kälber-Fötalserum zugegeben. Die erhaltene Suspension wurde ungefähr JO Minuten lang gerührt, dann zentrifugiert und zur Entfernung des PE filtriert. Ein gleiches Volumen mit Kochsalzlösung im Verhältnis I : 1000 verdünntes Trypsin wurde zu dem filtrierten Serum zugegeben. Verdünnte Milch (0,5 ml)

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(mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1 :10 verdünnt) wurde zugegeben und das Gemisch bei 37°C 30 Minuten lang gehalten. Das erhitzte Gemisch wurde dann zur Bestimmung der Gegenwart von ATF beobachtet. Eine klare Lösung zeigt die Digestion der Milch durch das Trypsin an, was eine im wesentlichen vollständige Entfernung des ATF bedeutet. Im Gegensatz dazu bedeutet eine trübe Lösung die Inhibierung der Milchdigestion durch das Trypsin, wodurch die Anwesenheit des ATF angezeigt wird. Die Ergebnisse sind in derTabelle III niedergelegt.

Tabelle III	% Dimethyl-	Aussehen
Mischpolymerisat	aminopropy!-	UCl LUMiilg
	imidgruppen
		Trübe
Vergleichsversuch	30	Klar
Isobutylen/Maleinsäure-
anhydrid	50	Klar
	70	Klar
	4*)	Klar
	50	Klar
Äthylen/Maleinsäure-
anhydrid	-Bindungen
*) Methylimino-bis(propylimid)

Bei den Vergleichsversuchen wurden 4 ml Kälber-Fötalserum, die mit destilliertem Wasser im Verhältnis 1 :30 verdünnt worden waren, wie oben behandelt, wobei jedoch kein PE zugesetzt wurde.

Beispiel 9

Dieses Dcispic! beschreib: die Fraktic-ieri^s ycp. Kälber-Fötalserum durch selektive Adsorption des spezifischen Proteins an vernetzten Polyelektrolytpolymerisaten, welche die notwendigen Imidgruppen enthalten.

Das bei dem Versuch verwendete Verfahren wurde wie folgt durchgeführt: 300 mg PE wurden in 3 ml Kälber-Fötalserum suspendiert. Die Suspension wurde 1 Stunde lang gerührt, dann 5 Minuten lang mit 2000 UpM zentrifugiert und die überstehende Schicht abdekantiert. Der PE wurde in 3 ml Kochsalzlösung suspendiert und die erhaltene Suspension zur Entfer-η,,ηπ ^rtc '»/^crvrKiiirtpn Prntpin«; aiK dpm PF diirrh Eluieren gerührt. Der PE wurde aus dem Eluat durch Filtration entfernt. Der Proteingehalt der überstehenden Schicht und des Eluats wurde durch Elektrophorese bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle IV niedergelegt.

Tabelle IV

Mischpolymerisat % Dimethyl- Serum Ü.F* E^D Albumin

iminopropylimid (ρ,,) (ph) (Ph) Ü.F^x E°

ffi-Protein a-₂-Protein /9-Protein Globuline Ü.F* E^D Ü.F* E^D Ü.F^X E^D Ü.F^X E^D

Äthylen/Maleinsäureanhydrid

Styrol-Maleinsäureanhydrid

Isobutylen/Maleinsäureanhydrid

100

5
10
15
70

15
50

7,9	5,5	8,2	±	+	±
7,6	5,2	8,2	+	+	-
7,7	8,7	8,8	+	+	+
8,1	8,1	9,1	±	+	±
8,0	7,7	9,1	±		±
7,7	6,9	8,9	±	+	-
7,7		9,1		±	-
7,9	7,7	8,8	±	+	-
7,7	8,4	8,9	±	±	—

ForlscUung

Albumin ίη-Protein σ-2-Protein /^-Protein Globuline

Mischpolymerisat % Dimethyl- Serum Ü.F^X

iminopropyl-

(pn) (ρ,,) Ü.F^X Eⁿ Ü.F^X E^D Ü.F^X Ε^α Ü.F^X E^D Ü.F^X Ε^α

*\ ι*	2-MethyIpenten-l/	imid	(Pit)	(PH)	(Pll)	Ü
! .-.■	Maleinsäureanhydrid	4*	7,9	8,5	9,2	±
!:-■		5	7,8	8,1	9,1	±
		15	7,5	8,3	9,2	±
		50	7,7	8,4	9,2	+
		70	8,0	8,6	9,2	+
	100	8,1	8,6	9,2	±

Methylimino-bis(propylimid)-Bindungen Ü.F = Überstehende Flüssigkeit

Die überstehende Flüssigkeit ist im wesentlichen frei von Proteinfraktion (im wesentlichen vollständige Adsorption der Proteinfraktion an dem PE), oder das Eluat enthält im wesentlichen die gesamte Proteinfraktion (im wesentlichen vollständige Eluierung der Ausgangsproleinfraktion aus PE).

Die überstehende Flüssigkeit enthält einen Teil der Proteinfraktion (feststellbare Adsorption der Proteinfraktion an dem PE), oder das Eluat enthält einen Teil der Proteinrraktion (feststellbare Eluierung von Proteinfraktion aus PE).
Die überstehende Flüssigkeit enthält im wesentlichen die gesamte Proteinfraktion (keine feststellbare Adsorption von Proteinfraktion an dem PE), oder das Eluat ist im wesentlichen frei von Proteinfraktion.

Beispiel

Dieses Beispiel zeigt die Fraktionierung von entmineralisiertem Kälber-Fötalserum durch selektive Adsorption des spezifischen Proteins an vernetzten Polyelektrolytpolymerisaten, welche die erforderlichen Imidgruppen enthalten. Die Entmineralisierung wurde mittels Durchleiten des Kälber-Fötalserums durch eine Ionenaustauscher-Säule bewirkt

Das Verfahren wurde wie folgt durchgeführt: 300 mg PE wurden in 3 ml Kälber-Fötalserum suspendiert und die Suspension 1 Stunde lang gerührt, dann 5 Minuten mit 2000 UpM zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit abdekantiert. Der PE wurde in 3 ml Kochsalzlösung suspendiert und die Suspension zum Eluieren des adsorbierten Proteins gerührt. Der PE wurde von dem Eluat durch Filtration abgetrennt. Der Proteingehalt der überstehenden Schicht und des Eluats wurde durch Elektrophorese bestimmt. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle V angegeben.

Tabelle V

Mischpolymerisat % Dimethyl- Serum Ü.F^X E° Albumin σ,-Protein ai-Protein //-Protein Globuline

iminopropylimid (p„) (p„) (p„) Ü.F* E^D Ü.F^X E^D Ü.F* Eⁿ Ü.F^X E^D Ü.F^X E°

	Athylen/Malein-	10	7,6	6,6	8,6	±	1+
	säureanhydrid	20*	7,3	7,9	7,1	±	±
I	Styrol/Malein-	5	94	8,7	9,2	±	±
	säureanhydrid	10	7,3	7,7	9a	±	±
i		15*	7,3	7,7	9a	±	±
IfS		20	74	8,0	9a	±	±
ψ		30	5,6	8,6	9a	±	±
m		50	6,2	8,2	9a	±	±
1		100	6,1	8,3	9,0	±	±

Isobutylen/Malein- 4*
Säureanhydrid

5,7

5.7 8,7 ± ±

2-Methyl-penten-l/ 4* 5,7

Maleinsäureanhydrid 5 5,6

10 5.9

6,4 9a ± ± 6,9 9a ± ± 6,1 9,1 ± ±

13 14

Fortsetzung

Mischpolymerisat % Dimethyl- Serum Ü.F^X E^a Albumin αϊ-Protein <r₂-Protein 0-Protein Globuline

iminopropylimid (ρ,,) (ph) (Ph) Ü.F" EP Ü.F^x E° Ü.F^x E° Ü.F^x E^d Ü.F^x E^ü

2-Methyi-penten-l/	15	6,0	6,0	9,2	±	—
Maleinsäureanhydrid	50	6,8	8,1	9,2	±	±
	70	9,2	8,7	9,2	±	±
	100	9,2	8,7	9,2	±	±

* Methylimino-bis(propylimid)-Bindungen

χ Ü.F = Überstehende Flüssigkeit

OE = Eluai

+ Die überstehende Flüssigkeit ist im wesentlichen frei von Proteinfraklion (im wesentlichen vollständige Adsorption der Proteinfraktion an dem PE), oder das Eluat enthält im wesentlichen die gesamte Proteinfraktion (im wesentlichen vollständige Eluierung der Ausgangsproteinfraktion aus PE).

± Die überstehende Flüssigkeit enthäit einen Teii der Proieinfrakiion (fesisieübare Adsorption ücr rruieiiiirakiiuii an licni PE), oder das Eluat enthält einen Teil der Proteinfraktion (feststellbare Eluierung von Proteinfraktion aus PE).

- Die überstehende Flüssigkeit enthält im wesentlichen die gesamte Proteinfraktion (keine feststellbare Adsorption von Proteinfraktiori an dem PE), oder das Eluat ist im wesentlichen frei von Proteinfraktion.

. 2^r> pH-Wert des wässerigen Mediums ab. Unter dem

Beispiel isoelektrischen Punkt wird der pH-Wert verstanden, bei.

In gleicher Weise wie in den vorausgehenden dem (als Zahlenwert ausgedrückt) elektrische Neutrali-Beispielen wurden nach dem erfindungsgemäßen tat zwischen ( + ) und (-) besteht. Bei pH-Werten Verfahren die wasserunlöslichen Polyelektrolyte zur oberhalb des isoelektrischen Punktes ist das jeweilige selektiven Abtrennung von r;icht-viralem Protein aus so Protein überwiegend negativ [mehr negative ( —) flüssigem Plasma und Serum verwendet. Ladungen als positive ( + ) Ladungen] und daher

Die Adsorption einer geladenen Proteinart an eine anionischer Natur. Unterhalb des isoelektrischen

geladene, unlösliche Substratoberfläche durch elektro- Punktes gilt das Umgekehrte und das Protein ist

statische Wechselwirkungen zwischen den Stellen kationisch. Die elektrostatische (ionische) Wechselwir-

entgegengesetzter Ladung hängt von dem pH-Wert des i^r> kung wird zwischen Spezies entgegengesetzter Nettola-

isoelektrischen Punktes der Proteinart und dem dung erhöht.

Claims

Patentanspruch;

Verfahren zum selektiven Adsorbieren von einem oder mehreren, spezifischen, nicht-viralen Proteinen aus flössigem Plasma oder Serum, dadurch gekennzeichnet, daß man die das Proteingemisch enthaltende Flüssigkeit mit wasserunlöslichen, Dimethylaminopropylimidgruppen und/oder Menhylimino-bis(propylimid)-Bindungen enthaltenden ÄthyLen/Maleinsäureanhydrid-, Styrol/Maleinsäureanhydrid-, Isobutylen/Maleinsäureanhydrid-

und/oder 2-Methylpenten-l/Maleinsäureanhydrid-Mischpolymerisaten kontaktiert und gegebenenfalls das adsorbierte Protein eluiert