JPS5843369B2 - 血清蛋白質の分画方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 この発明は血清から各蛋白質成分を分離する血清蛋白質
の分画方法に関する。

血清は体外へ出て凝固した血液を遠心して得られる上澄
であり、血漿からフィブリノーゲンを除去したものであ
る。

血清あるいは血液に含まれる主な成分はアルブミン、グ
ロブリン（α１− 。

α２− 、β−９γ−）等の蛋白質であり、その他にフ
ィブリノーゲン、プロトロンビン、抗血友病グロブリン
、リポ蛋白質、補体成分、トロンポプラストン、イソア
グルチニン、コレステロール、ホスファチット、及び多
くの酵素が含まれているが、その量は少ない。

すなわち、血清蛋白質はアルブミン及びグロブリンがそ
の大部分を占めている。

今日、血清の分画や分離した各成分の臨床的使用は普通
におこなわれている。

従来、血清や血液の各成分を分離し、精製する方法とし
て知られているものは、以下の操作の一つ又はそれ以上
の複雑な操作から構成されている。

（ｉ） 低分子量塩類による沈殿、 （ｉｌ）有機溶媒（こよる沈殿、 （ｉｉＤ リン酸カルシウムゲル又は硫酸バリウムに
よる選択吸着、 （ｉＶ）等電点沈殿、 Ｍ カルボキシメチルセルロースやＤＥＡＥ−セルロー
スのような吸着剤による吸着又はセファーデツクスゲル
濾過法Ｅこよるクロマトグラフィ（ｖｆ） グリシン
やβ−アラニンのようなアミノ酸、ポリエチレングリコ
ールやポリプロピレングリコールのような水溶性有機高
分子化合物、塩基性アミノ基を有する水不溶性電解質に
よる沈殿。

しかしながら、いずれの場合においても、その操作は、
ｐＨ１イオン強度、温度、高分子化合物濃度等の条件を
厳密（例えば、イオン強度は、±０．０５ 、 ｐＨは
±０．１の範囲内）に制御しておこなわなければならず
、一つの成分蛋白質を純度よく精製分離するためには多
くの複雑かつ厳密な工程を必要としていた。

最近、少なくとも５０％のエチレンオキシドを含有する
エチレンオキシド／プロピレンオキシドブロック共重合
体（ポリプロピレンオキシド単位の分子量９００以上）
を用いた方法が特開昭４９−１０８２１６号公報に開示
されたが、操作条件の緩和、使用高分子化合物量の節減
、得られる蛋白質の高純度化という点でなお改善の余地
が残されている。

この発明は上記背景に基づいてなされたものであり、比
較的簡単かつ少ない操作工程により迅速に室温Ｅこおい
ても蛋白質の変性を来すことなく血清から高純度に各成
分蛋白質を大量に精製分離することができる血清蛋白質
の分画方法を提供することを目的とする。

この発明によれば、血清を適当な蛋白質分離剤で処理す
ることによって血清蛋白質を分画する方法において、蛋
白質分離剤として、少なくとも５０％のエチレンオキシ
ド単位を含有するエチレンオキシドとプロピレンオキシ
ドとの交互又はランダム共重合体、連鎖内にケトン基、
水酸基、−級又は二級アミン基を含有する合成高分子化
合物、及びカルボキシル基を有する高分子電解質よりな
る群の中から選ばれた水溶性高分子化合物又はこれら高
分子化合物が架橋した水不溶性高分子化合物を用いるこ
とを特徴とする血清蛋白質の分画方法が提供される。

上記のようにこの発明の方法は水溶性高分子化合物を用
いる場合と、その水溶性高分子化合物を適当な架橋結合
により架橋した水不溶性高分子化合物を使用する場合と
の二つに分けることができるが、蛋白質分離に際しての
これら高分子化合物の有効性は蛋白質と上記高分子化合
物間の二次結合力（特に、水素結合、疎水結合、イオン
結合）の強弱による相手分子の識別とそれに伴なう集合
体形成に基因するものと考えられる。

この発明に用いられる水溶性高分子化合物はこれを以下
の三つに分類することができる。

（１）少なくとも５０％のエチレンオキシド単位を含有
するエチレンオキシドとプロピレンオキシドとの交互又
はランダム共重合体。

この共重合体のエチレンオキシド単位含量は６０ないし
９０％であるのが好ましい。

（２）連鎖にケトン基、水酸基、−級又は二級アミン基
よりなる群の中から選ばれた水素結合能を有する極性基
を含有する非電解質合成高分子化合物。

その具体例を挙げると、ビニルピロリドン、アクリルア
ミド又はビニルアルコールの単独重合体、これら相互の
共重合体又はこれらと適当な共重合性単量体例えばスチ
レン、アクリル酸エステル等との共重合体等である。

（３）カルボキシル基を有する高分子電解質。

その具体例を挙げると、アクリル酸、メタクリル酸、イ
タコン酸、マレイン酸等の単独重合体、これら相互の共
重合体又はこれらと適当な共重合性単量体例えばスチレ
ン等との共重合体である。

上記のような水溶性高分子化合物による血清からの蛋白
質の分離・分画はこの水溶性高分子化合物と蛋白質ある
いは脂質等蛋白質以外の血清成分との二次結合による沈
殿に基づくものである。

この発明の方法によれば、上記沈殿に際してのｐＨ値の
調整及び（又は）用いる水溶性高分子化合物の濃度の規
制によって所望蛋白質を容易に得ることができ、又ｐＨ
値の調整及び高分子化合物濃度の規制も、従来の方法と
は異なり、比較的広い範囲に亘っておこなうことができ
る。

前記エチレンオキシド／プロピレンオキシド共重合体又
は極性基を有する合成高分子化合物を用いる場合、一般
に、血清に対し血清の５ないし１０重量優相当量加える
ことによって蛋白質以外の血清成分は、血清のｐＨ値に
かかわらず、用いた高分子化合物と結合して沈殿し、残
存液中に血清蛋白質のみが残る。

この残存液からアルブミンを得ようとする場合は、この
残存液のｐＨ値を約６以上に調整し、上記高分子化合物
をより少量、一般に、残存液の２ないし５重量φ相当量
加えることによってアルブミン以外の血清蛋白質は全て
沈殿し、アルブミンのみが溶液中に残存する。

方、上記残存液のｐＨ値を約６未満に保持するとアルブ
ミンが沈殿し易い条件となり、以下同様の操作により、
グロブリンが得られる。

又、血清からアルブミンのみを一挙に得たい場合は、血
清をｐＨ６以上に調整し、この血清に上記水溶性高分子
化合物を血清の１２ないし２０重量★相当量加えれば、
アルブミンのみが溶液中に残存することとなる。

この発明に用いられる水溶性高分子化合物として前記高
分子電解質を用いた場合には、血清を弱酸性（一般にｐ
Ｈ約５ないし約７）に保持し、これに血清の０．１重量
饅以下一般に０．０１重重量板上に相当する量加えるこ
とによってアルブミン以外の血清成分は沈殿する。

なお、血清のｐＨは約７．４である。

以上の操作に用いられる水溶性高分子化合物はその分子
量が３０００ないし５００００の範囲内のものが適して
いる。

分子量が３０００未満のものでは沈殿収率が悪く、分子
量が５００００を超えるものでは血清成分に対する選択
性が悪くなり、従って分離された各血清蛋白質の純度が
低下する。

上記操作で生じた沈殿を分離するには、濾過、遠心分離
、傾瀉法あるいはこれらに類似する手段が用いられる。

分離した沈殿は適当なｐＨ値の調整によってこれを水溶
性高分子化合物とそれに二次結合した血清成分とに完全
かつ容易に分離することができる。

また、上記操作におけるｐＨ値の調整はリン酸等生理的
に許容できる弱酸によっておこなうことができる。

既述のよう（こ、この発明の方法は以上述べた水溶性高
分子化合物にアミド結合、エーテル結合、エステル結合
、アミンの二級若しくは三級化等）共有結合による分子
間架橋を施し、水不溶性としたものを用いても実施でき
る。

この際の架橋率は高分子化合物の種類又は架橋の種類に
よって異なるが、一般に５ないし６０％、好ましくは１
０ないし５０％である。

用いた高分子化合物に対してどのような架橋剤を選択す
るかは当業者には明らかであろう。

例えば、カルボン酸基を有する高分子電解質の場合には
、ヘキサメチレンジアミン等のジアミンを用いることに
よってアミド結合による架橋が達成できる。

このような架橋高分子化合物による血清成分の分離はそ
の架橋高分子化合物に対する各血清成分の選択的な吸着
力の差に因るものであり、血清のｐＨ調整をとくにおこ
なうことなく、これをバッチ方式又はカラム方式でおこ
なうことができる。

バッチ方式Ｅこよる場合は血清（好ましくは、適当な希
釈剤で希釈する）と架橋高分子化合物（通常、適当な大
きさ例えば１００〜１５０メツシユに揃える）とを所定
時間接触させた後、上澄液中に残存する蛋白質と吸着さ
れた蛋白質とを分離する。

一方、カラム方式による場合は、適当な大きさ例えば１
００〜１５０メツシユに揃えた架橋高分子化合物を充填
したカラムに、血清をそのまま、好ましくは適当な希釈
剤で希釈して流し、ついで所望の流出液を流すと流出液
中に各血清蛋白質が順次流出してくる。

以上の操作に用いられる希釈剤及び流出液としては生理
的に許容し得る媒質（水、食塩水、リン酸緩衝液、その
他同様の水性媒質）を使用する。

なお処理に供した架橋高分子化合物はこれを同様の希釈
剤又は流出液で洗浄することによって再使用することが
できる。

この発明の方法は、蛋白質が熱変性を受は易いことを考
慮すると、室温以下の温度でおこなうのが有利であるが
、この発明方法は大量の血清を迅速に処理することがで
きるので、以下の実施例に示すように、室温（約２５℃
）でも実施することができ、好都合である。

なお、上澄液や流出液中の血清蛋白質は例えばミリポア
フィルタ−による滅菌濾過あるいは凍結乾燥によってそ
のまま保存可能なものとすることができる。

なお、この発明方法におけるｐＨの調整は、血清蛋白質
が変性しないようなｐＨ値一般に３．５ないし８．５、
好ましくは４．０ないし７．５の範囲内でおこなうのが
よい。

以上述べたように、この発明の血清蛋白質の分画方法は
その操作が簡単で、ｐＨ値等処理条件の厳密な制御を必
要とすることなく大量の血清を迅速に処理することがで
きる。

また、最終的昏こ得られる血清蛋白質の純度も高く、工
業的あるいは臨床学的な観点から極めて有用なものであ
るといえる。

以下、この発明の実施例を記す。

実施例において、得られた各蛋白質成分の同定は通常の
電気泳動法により、又その純度は通常の超遠心法又はカ
ラム分離法によった。

実施例 １ 血清に、エチレンオキシド単位を８０％含有する分子量
８７００のエチレンオキシド／プロピレンオキシドラン
ダム共重合体を血清の２０重量袈相当量加え、この混合
物を室温で３０分間攪拌した。

この攪拌中沈殿が生じ、混合物は懸濁した。この懸濁液
を５００ Ｏｒ、ｐ、ｍで６０分間遠心分離し、分離し
た沈殿を棄て、残存する上澄液を凍結乾燥し、アルブミ
ンを得た。

収率および純度はそれぞれ９５％および９８．５％であ
った。

なお、攪拌時間はこれを１０分間まで短縮しても同様の
結果を得た。

また、上記共重合体と同一組成比および同一分子量を有
するブロック共重合体を用いて同様の操作をおこなった
ところ、アルブミンの収率は９２［有］であり、純度は
９５％であった。

実施例 ２ 血清に、エチレンオキシド単位を８０％含有する分子１
ｘ１ｏｏｏのエチレンオキシド／プロピレンオキシドラ
ンダム共重合体を血清の５重量φ相当量加え、この混合
物を室温で３０分間攪拌した。

得られた懸濁液を５００ Ｏｒ、ｐ、ｍで６０分間遠心
分離し、分離した沈殿を棄て、残存する上澄液にリン酸
−ナトリウムを加えてｐＨを４．６に調整した。

この上澄液に上記共重合体をその１６重量□□□相当量
加え、室温で３０分間攪拌した。

得られた懸濁液を５００ Ｏｒ、ｐ、ｍで６０分間遠心
分離した。

分離した沈殿を棄て１．上澄液をミリポアフィルタ−（
０，３ミクロン）で滅菌濾過するか、又は凍結乾燥する
ことによってγ−グロブリンを得た。

収率は８２％、そして純度は９８．２％であった。

なお、攪拌時間はこれを１０分間まで短縮しても同様の
結果が得られた。

また、上記共重合体と同一組成比および同一分子量を有
するブロック共重合体を用いて同様の操作をおこなった
ところ、グロブリンの収率は７５□□□にとどまり、純
度も８８％であった。

実施例 ３ 分子量４０００のスチレン／無水マレイン酸共重合体１
０．１グラムをテトラヒドロフラン７５０ａに溶解し、
この溶液に架橋剤としてヘキサメチレンジアミン０．５
５グラムをテトラヒドロフラン２５０ｍ１に溶解した溶
液を徐々に加えた。

添加終了後沸点還流を２０時間おこなった。

溶液は不均一となった。

反応終了後、反応溶液を蒸発乾固し、残渣を水で一昼夜
洗浄し、溶出弁がないことを確認した後乾燥して所望の
水不溶性架橋共重合体を得た。

上記架橋共重合体を１００ないし１５０メツシユの大き
さに揃え、これを直径３ないし５ｃｒｒＬのカラムに充
填した。

このカラムにｐＨ５，６のリン酸緩衝液を充填容積の３
倍量以上流した。

ついで、このカラムに、ｐＨ５，６のリン酸緩衝液で１
０倍に希釈した血清を流した。

その後、流出液としてｐＨ７，４のリン酸緩衝液を流す
と、アルブミン、γ−グロブリン、マクログロブリン等
の順で流出液中に各蛋白質が分離した。

各流出液を分取し、これをミリポアフィルタ−（０，３
ミクロン）で滅菌濾過するか、又は凍結乾燥することに
よって各蛋白質を精製した。

架橋剤としてメチルイミノビスプロピルアミンを用いた
以外は同様に製造した架橋高分子を用いて上記と同様の
操作をおこなったところ、蛋白質の分離には７０℃以上
の加熱を要した。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 血清を蛋白質分離剤で処理することによって血清蛋
   白質を分画する方法において、蛋白質分離剤として、少
   なくとも５０％のエチレンオキシド単位を含有するエチ
   レンオキシドとプロピレンオキシドとの交互もしくはラ
   ンダム共重合体からなる水溶性高分子化合物を室温以下
   の温度下で用いることを特徴とする血清蛋白質の分画方
   法。 ２ 水溶性高分子化合物の分子量が３０００ないし５０
   ０００である特許請求の範囲第１項記載の血清蛋白質の
   分画方法。 ３ 血清をｐＨ約６．０以上に保持し、この血清に水溶
   性高分子化合物を血清の１２ないし２０重量□□□相当
   量加えることによってアルブミン以外の血清成分を沈澱
   分離し、アルブミンのみを得ることを特徴とする特許請
   求の範囲第１項又は第２項記載の血清蛋白質の分画方法
   。 ４ 血清に水溶性高分子化合物を血清の５ないし１０重
   量φ相当量加えることによって蛋白質塩列の血清成分を
   沈澱分離し、残存液をｐＨ約６．０未満ｆコ保持し、水
   溶性高分子化合物を残存液の２ないし５重量φ相当量加
   えることによってグロブリン以外の血清蛋白質を沈澱分
   離し、グロブリンのみを得ることを特徴とする特許請求
   の範囲第１項又は第２項記載の血清蛋白質の分画方法。 ５ 交互又はランダム共重合体のエチレンオキシド単位
   含有量が６０ないし９０％である特許請求の範囲第１項
   ないし第４項のいずれか（こ記載の血清蛋白質の分画方
   法。 ６ 血清を蛋白質分離剤で処理することによって血清蛋
   白質を分画する方法において、蛋白質分離剤として、カ
   ルボキシル基を有する高分子電解質をヘキサメチレンジ
   アミンを用いてアミド結合により架橋した水不溶性高分
   子化合物を室温以下の温度下で用いることを特徴とする
   血清蛋白質の分画方法。 ７ 所定の大きさの水不溶性高分子化合物よりなる吸着
   剤を充填したカラムに血清の希釈液を流すことによって
   血清蛋白質を上記吸着剤に吸着させ、ついで、流出液と
   して生理的に許容し得る媒質をカラムに流し、各血清蛋
   白質成分を順次流出させることを特徴とする特許請求の
   範囲第６項記載の血清蛋白質の分画方法。