DE2032142A1 - Stufenweises Verfahrer zur Her stellung von Mikroorganismen Kulturen - Google Patents

Description

Stufenweises Verfahren zur Herstellung von
Mikroorganismen-Kulturen,

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein wirtschaftliches Verfahren» das es erlaubt, das Wachstum aller einzelligen Organismen^von denen das Protoplasma als Nahrungsmittel oder als Ausgangsstoff für chemische Produkte verwendet werden soll, in einem wässrigen Nährmedium in Anwesenheit ei' nes Petroleum-Kohlenwasserstoffs und eines sauerstoffenthaltenden Gases, zu gewährleisten.

Es ist bereits bekannt,Mikroorganismen-Kulturen auf Kohlehydrat-Substraten herzustellen, beispielsweise auf Melassen,
Holzhydrolysaten und dem Laktoserum von Käsereien; es wurde jedoch gefunden, daß das Bedürfnis an Sauerstoff, das die
Mikroorganismen zum Wachsenkönnen besitzen, bei einem reduzierten, d.h. stark wasserstoffhaltigen chemischen Substrat wie bei den Kohlenwasserstoffen,sehr viel größer ist,als im Fall der vorerwähnten Substrate,

Die Herstellung von Mikroorganismen-Kulturen (Kultivlerverfahren für Mikroorganismen) in Anwesenheit von aus dem Erdöl stammenden KohlenwaaaerstofTen 1st an sieh bereits bekannt«. Ein solches Verfahren wurde in zahlreichen zusammenfassenden- Forscher»

009884/0247

- Blatt 2 -

arbeiten beschrieben, insbesonderejvon Just, Schnabel und UIlmann in ihrem Artikel "Tauchkultur der Hefe und der Bakterien auf Kohlenwasserstoffen" publiziert in der Zeitschrift »Di© Brauerei - Wissenschaftliche Beilage","Nr· 8, August 1-951.

Diese drei Forscher konnten Hefe und Bakterien auf verschiedenen Kohlenwasserstoffen in Anwesenheit eines wässrigen Nährmilieus und Sauerstoff mit Erfolg zum Wächsern bringen.

Die Anmelderin vorliegender Anmeldung hat bereits in der französischen, Patentanmeldung Nr₀ 15* 959 vom T5« Mal 1968 (di© dem belgischen Patent Nr« 732 065 und der USA-Patentanmeldung Nr. 824 256 entspricht) ein im industrielle© Maßstab durchzuführendes verbessertes Yerfafereia stir Herstellung won Mikroorganismen-Kulturen beschrieben, das darin bes teilt $ daß man in einer ersten -Stufe in Anwesenheit von Sauerstoff und ±n einem wässrigen Nährmiliei» auf eine« KoJslensiasserstoff^-Siabstrat,. das " zumindest zu 70 Gew,»^ aiss linearem Paraffin©» (n-Paraffinen.) besteht, kultiviert* sodann im eiaer.sweiten Stuf© die solchermaßen kultivierten Milcroorgataisaaiis. T©Ea wässrigen Nährmilleu und vom gegebenenfalls nicht Verbraisehitea Kofel entlass er stoff- Substrat abtrennt und. anschließend, in eimer dritten Stufe, die Reifung" genannt wird, eimern Kontakt der solchertaaßen abgetrennten Mikroorganismen in Anwesenheit vom Sauerstoff* mit einem wässrigen Nichtnährmilleu, durchführt·

Dieses wässrige Nich.tai.larffl±ll0ia eirarde- als sin Nährmilieu definiert, das gewisse₈ für die- Entwicklung, der Mikroorganismen unerlässliche Eleiiäenta,, beispielsweise Ionen, von "deren. Natur der Stamm der Mikroorganismen-Kulturen abhängt, beraubt ist«,

Das oben erwähnt© Verfahren -der Anm@ta©r±n gemäß französischer Patentanmeldung Wr. '151 959 besitzt eine Anzahl vom Vorteilen ü,&m Stand ύ&τ Technik, diö im diesen Pat"entanmeldung@n öind xintl swäff ±nafeQ3©niiQ2*@ -ita Vorhältnis su- dem b©°»

- 3 QQ-9884/Q2A7

2032H2

- Blatt 3 -

kannten Verfahren, das darin besteht, daß man die Mikroorganis men abgetrennt yob Fermentetor (Gärstoff)_|einer Behandlung mit Sauerstoff In Anwesenheit eines -völlig wässrigen mineralischen Milieus unterwirft. .

Demgegenüber besteht das Verfahren voziLegender Erfindung in einem neuen, lsi industriellen Maßstab anwendbaren Verfahren, das weitere wesentlich· Vorteile besitzt ι

- Schaffung von sehr reinen Proteinen, d.h. von Zellen, Gehalte an Lipiden und an Ribonucleinsäuren viel kleiner ist als dies bei den früheren Techniken der Fall war,

- ein geringerer Verbrauch an mineralischen Nährsalzen,

- gemäß einer besonderen Aueführung*form des erfindungsgemäßen Verfahrene erreicht man eine Senkung der Kosten für die Kompression des Gas··, das den molekularen Sauerstoff enthält, der für das Wachstum dieser Mikroorganismen erforderlich ist.

Diese Resultate werden erhalten indem man folgendermaßen stufenweise vorgeht ι

1.) Herstellung ein·· Kontakts zwischen einem Mikroorganismenstamm und -einem, molekularen Sauerstoff enthaltenden Gas sowie einer Kohlenwasserstoffcharge, die zumindest 70 Gew.% und vorzugsweise zumindest 85 Gew.$ an linearen Paraffinen enthält, wobei dl··· Charge zumindest zum Teil (d.h. zumindest zu IO Gew.%) aus der dritten welter unten beschriebenen Stuf· stammt, sowie mit einem wässrigen Nährmilieu, wobei der Kontakt so lange aufrechterhalten wird, bis der Gesamtgehalt an n-Paraffinen (freie und adsorbierte n-Paraffine) 0,2 - 5 £ und vorzugsweise 0,5 - 2 Gew.^t der Kohlen-

009884/0247

'-»ι..*»- ^2032U2

Wasserstoffcharge beträgt. Das wässrige Milieu enthält dabei vorzugsweiset

a) eine Quelle für assimilierbaren Stickstoff, sowie eine Quelle für assimilierbaren Phosphor·

b) Spurenelemente (Oligoelemente)

c) Wachstumsfaktoren

d) essentielle zusätzliche mineralische Elemente.

Man sieht daraus, daß die Menge an linearen paraffinischen Kohlenwasserstoffen geringer ist, als diejenige, die eine optimale Entwicklung der Mikroorganismen erlaubt.

Vorzugsweise wird das den molekularen Sauerstoff enthaltende Gas unter einem absoluten Druck zwischen 1,2 und 20 Atmosphären und vorzugsweise zwischen 1,5 und k Atmosphären eingesetzt.

2.) Die Abtrennung der an Mikroorganismen angereicherten Phase, die die adsorbierten Kohlenwasserstoffe enthält und zumindest des größeren Teils des wässrigen Nährmilieus und der nicht verbrauchten Kohlenwasserstoffe, die gegebenenfalls in Form einer separaten Phase vorhanden sind; diese Abtrennung kann man auf an sich bekannte Weise durchführen, beispielsweise durch Dekantierung, Filtrieren und/oder Zentrifugieren.

3.)Waschung (in Berührungbringen) der erhaltenen Mikroorganismen, die man am Ende der zweiten Stufe erhalten hat mit einer Kohlenwasserstoffraktion, die zumindest zu 70 Gew.^ und vorzugsweise zumindest zu 85 ^ lineare paraffinische Kohlenwasserstoffe enthält.

Man trennt sodann die konzentrierte Phase der Mikroorganismen von der Kohlenwasserstoff-Fraktion, welche anschließend als

009884/0247

- Blatt 5 -

• Beschickungscharge In den Apparat geleitet wird, in dem die erste Stufe dee Verfahrens durchgeführt wird. Diese Abtrennung wird auf an sich bekannte Art und Weise durchgeführt, wie dies beispielsweise unter Ziffer 2 oben beschrieben ist·

k.) Das Inberührungbringen der am End· der vorangegangenen Stufe erhaltenen Mikroorganismen mit einen wässrigen Nährmilieu, beispielsweise mit einem solchen, wie es unter Ziffer 1 bev schrieben ist, sowie mit einem Gas, das molekularen Sauerstoff enthält.

Stets wird ein Maximum an Vorteilen bein Verfahren dann erreicht, wenn man folgendes verwendet ι

- Zumindest einen Teil des wässrigen Nährmilieus, das man im Verlauf der Trennung in der zweiten Stufe erhalten hat,

- zumindest einen Teil dee Gases, das molekularen Sauerstoff enthält, der im Verlauf der ersten Stufe nicht verbraucht wurde.

5.) Abtrennung der solchermaßen erhaltenen Mikroorganismen, indem man beispielsweise eines der unter Ziffer 2 oben beschriebenen Verfahren anwendet.

lsi folgenden werden noch wesentlich genauer die bevorzugtermaßen durchzuführenden Verfahrensbedingungen .beschriebenι

a) Während der ersten Stufe wird die Temperatur vorzugsweise zwischen 20 und 4o°C, und insbesondere zwischen 27 und 33°C und der pH-Wert unterhalb 7 und vorzugsweise zwischen 3 und 5 gehalten. Diese letztere Bedingungen wird beispielsweise durch kontinuierliche oder periodische Zuspeisungen von alkalischen, beispielsweise ammoniakalisehen Lösungen erreicht, wenn Stoffwechseiproduktβ eine Ansäuerung der Kultur hervorrufen sollten.

■ 0 098 8A /02A7

- Blatt 6 -

2032 U-2

Die als Charge verwendete Kohlenwasserstoff-Fraktion kann man durch Deparaffinierung einer Kohlenwasserstoff-Fraktion von der Art des Gasöls» des Kerosins oder von Schmierölen, d,h„ von Kohlenwasserstoffen„ die zumindest 9 Kohlenstoffatom© pro Molekül aufweisen,, erhalten.

Die Stickstoffquelle kann beispielsweise ±n Form von Ammonium-Ionen NEL , Nitrat-Ionen NO_ oder in Fora Von Harnstoff vorliegen", die Phosphor quell® kann in Form von Phosphat- Ionen vorliegen* die Oligoelemente, (Spurenelemente) d.h. die Ionen der in sehr geringen Quantitäten notwendigen Metall® und Nichtmetalle, beispielsweise das Eisen und das Kupfer finden sich in Form von Spuren} die Wachstumsfaktoren sind Kompositionen vom Typ des Vitamins B_fdi@ man beispielsweise in Form von Hefeextrakten erhält; die anderen wesentlichem mineral!= sehen Elemente finden sieb im allgemeinen im der Form von Ionen; diese essentiellen mineraIisehen Elemente hängen von der Art der asu kultivierendem Mikroorgamlsmenstämm© ab. '

Di« Erfindung umfaßt nicht die Aisswahl der Elemente a) b) c) und d) (Paragraph 1 oben) im einzelnen. Diese Elemente sind den Fachleuten gut bekannt und raam wird zahlreich© Beisplde von wässrigen Nährgailieus In der Literatur und in früheren Patenten finden· Es iat leicht d«r©ii einen Versuch von vorrangig einfacher Kultur nachzuprüfen, da© diese Milieus vollständig der Kultur von diesen oder jenen Mikroorganismen angepaßt sind*

Zum Beispiel kann das Nährmiliou ander® wesentliche mineralisch®. ELttinente enthalten, Kalium, Schwefel,s.3. in Form von Sulfat·» L.,aon und Magnesium, auch Natrium, ICaiaiuns -und Chlor-Jonen»

i-.a Verlauf dieser ersten Stui'e entwickeln slsh die Mikroorganismen, d. h. , daß ale waehssn nsul si oh 'vermehren mach einem Rhythmus, der vorteilhaft dar oh die als Charge eingeführte Menge

0 0 9 8 8 4 / Π 2 4 7 ^BAD ORIQiNAt

2032U2

- Blatt 7 -

der linearen, paraffin!erten Kohlenwasserstoffe gesteuert dat.

Auf allgemeine Veiae liegt der Gehalt der stickstoffhaltigen Verbindung (z. B. Ammoniumsulfat) dea wässrigen Milieus vorteilhaft zwischen 0,1 g und 60 g pro Liter, vorzugsweise zwlsohen 1 g und 20 g pro Liter, ohne daß diese Werte begrenzt sind.

Der Gehalt an Phosphat ausgedruckt als P₂ ⁰K* wird gewöhnlich zwischen 0,1 und 10 g pro Liter betragen, vorzugsweise wird man in das wässrige Nährmilieu stickstoff- und phosphorhaltige Quellen in der Form von Ammoniumphosphat zugeben. Während die früheren Verfahren diese erste Stufe bei Atmoephärendruck durchführten, begünstigt ein Sauerstoff überdruck, gemäß einer bevorzugten Ausf Uhrungeform der Erfindung das Wachstum der Mikroorganismen; er erlaubt darüber hinaus die direkte Wiederbenutzung des Gases, das dieser ersten Stufe entstammt, im Verlauf der vierten Stufe.

Zur Durchführung dieser ersten Stufe kann man Jeden Apparat benutzen, der den Kontakt der genannten Phasen fördert, z.B ein Apparat wie er im französischen Patent 1 529 536 oder vorzugsweise in der französischen Patentanmeldung 1 77 77*» t eingereioht durch die Anmelderin am 11. Dezember 1968 (veröffentlicht in den Niederlanden unter der Nummer 6918576) beschrieben ist.

Diese Anmeldung beschreibt einen industriellen Apparat, der besonders einen innigen Kontakt zwischen mehreren flüssigen, nicht mischbaren Phasen zu realisieren erlaubt, z.B. eine Gasphase und eine feste Phase (z.B. Hefen)ι man führt kontinuierlich eine Erdölcharge, ein NKhrmilieu, welches alle Elemente im Überschuß beinhaltet, abgesehen von denen der Kohlenstoffquellen, die im Unterschuß zugegeben sein muß, zu, um eine Mikroben-Impfung zu bewirken, und einen Rhythmus der Vcrmeh-

.....~v..j;α ΘΘ988 4/02 4 7 - β -

rung zu gewährleisten, der der kontinuierlichem, Entnahme der Mikroorganismen entspricht*

Wie man gesehen hat, steigert der -Überdruck des Gases, welches Sauerstoff enthält, di© übertragungsgeschwindigkeit dieses Sauerstoffs in wässrigen Medien zu den sich vermehrenden Zellen der Mikroorganismen! man fängt daa Gas am Ausgang des Reaktionsgefäßes auf, um es unter Druck in der Folg© von Maßnahmen wie sie unten genau beschrieben werden nutzbar zu machen, gemäß einer bevorzugten Methode der Erfindung«

b) Die zweite Stufe kann durch einfaches Abgießen realisiert werdent dieses ist überdies nur möglich, wenn die erste Stufe naoh den oben genau beschriebenen Bedingungen eingeleitet wurde, besonders, wenn die Kohlenwasserstoff-Charge mindestens 70 i» von linearen Paraffinen beinhaltet·

Unmittelbar nach dieser zweiten Stufe sind die Mikroorganismen, die in teigiger oder cremeartiger Form mit gewöhnlich 5 $ bis 30 Gew.?» (im getrocknetem Zustand gerechnet) an Mikroorganismen vorliegen, noch mit flüssigem Medium und Kohlenwasserstoffen behaftet, die auf die Mikroorganismenzellwände adsorbiert sind· Diese Kohlenwasserstoff« sind in der Mehrzahl verzweigte Kohlenwasserstoffe, weil die linearen Kohlenwasserstoffe vorzugsweise verbraucht worden sind» Außerdem beinhalten die Mikroorganismen Oxydations-Nebenprodukte, wi· Fettsäuren, auf deren Elimination die weiteren Verfahreneschritte hinzielen, ebenso wie auf die Entfernung adsorbierter Kohlenwasserstoffe.

c) Die Waschung verait-tele einer an η-Paraffinen reichen Kohlenetoff-Charge, welche den Gegenstand der dritten Stufe darstellt, wird vorzugsweise in Gegenwart von Sauerstoff durchgeführt.

009884/0247

■ - Blatt 9 -

Diese Stufe hat das Ziel, die Kohlenwasserstoffe (zum größten Teil verzweigte Kohlenwasserstoffe, die nicht assimilierbar sind oder nur zu einem sehr geringen Teil), die die äußere Oberfläche der Mikroorganismenzellen verschmutzen, durch Kohlenwasserstoffe, die einen größeren Gehalt an paraffinischen linearen Kohlenwasserstoffen aufweisen, die Kohlenstoffquellen, die für den weiteren Schritt notwendig sind, der auoh sekundäre Fermentation genannt wird, darstellen, zu ersetzen.

Man benützt gewöhnlich ein Gewiohtsverhältnis der Kohlenwasserstoff-Charge/Zellen (Trockengewicht), das zwischen 0,5 und 5 liegt. Unter 0,5 ist der Austausch der adsorbierten Kohlen-Wasserstoffe weniger vollständig, während über 5 die zu verändernden Volumina bedeutend werden, ohne daß ein spürbares Auswachsen des Reinigungsgrades erreioht wird.

Diese Waschung wird vorzugsweise in einer Kolonne vom Typ der z. B. für die Flüssig-flüssig-Extraktion benutzten Kolonne vorgenommen t die Mikroorganismen Werden in den oberen Teil dieser Kolonne eingespeist und an deren Boden die Waschflüssigkeit zugegeben; die Mikroorganismen sinken durch die Schwerkraft auf den Boden der Kolonne herab, von wo man sie im Gegenstrom zur hinaufströmenden Waschflüssigkeit entnimmt. Die Waschflüssigkeit, die aus Kohlenwasserstoff mit starkem Gehalt an n-Pareffinen besteht, unterscheidet sich nun von den Waschflüssigkeit en, die in einigen bekannten Verfahren benutzt werden, und die aus Wasser, oberflächenaktiven Stoffen oder flüchtigen organischen Lösungsmittel bestehen«

d) Die zweite Stufe der Fermentation, die die vierte Stufe des gesamten Verfahrens ist, wird in dem gleichen Apparat durchgeführt, in dem die erste Stufe durchgeführt wurde, oder in einem anderen Apparat} diese Stufe besteht darin, daß man die Mikroorganismen, die aus der Stufe c hervorgehen mit einem Gas, welches molekularen Sauerstoff enthält und mit einen wässrigen Nährmilieu in Berührung bringt.

009884/0247

2032H2

- Blatt 10 -

Gemäß einer bevorzugten Ausfübrungefox*m der Erfindung geht wenigsten ein Teil dea bezüglieh Sauerstoff angereicherten Oases aua der ersten Stufe der Fermentation und wenigstens ein Teil des wässrigen Mährmilieue naoh der Trennung der zweiten Etappe des Verfahrene„ hervor«

Vorzugsweise wird die Gesamtheit der swei Ströme in den zweiten Fermentator geleitet« wo die Zellen der Mikroorganismen sich wieder durch Vervielfältigung und Teilung vermehren.

φ Einer der Vorteile dieser Technik rührt daher, daß das Gas, normalerweise Luft, das in der ersten Stufe der Fermentation (sxafce Etappe) zum Aufbau von Mikroorganismen geführt hat, nun auf direktem Weg ih die zweite Stufe der Fermentation (gleich der vierten Etappe des Verfahrens) ohne eine Zwlsohenkompression geleitet wird, was eine beträchtliche Erhöhung der Wirtschaftlichkeit der Kompresslonsanlaga darstellt» Man sieht gleichzeitig» dad in diesem Fall das wässrige Milieu oder wenigstens ein Teil desselben nacheinander in den zwei Stufen der Fermentation gebrauoht wird. Außerdem verbrauchen die Mikroorganismen praktisch nur adsorbierte Kohlenwasserstoffe im Verlauf dieser zweiten Fermentation, well es keine freie Kohlenwasser-Phase

.ι* - gibt» es wurde festgestellt, daß diese adsorbierten Kohlenwasser« stoffe aufgrund der Waschung der Stufe ο reich an linearen Paraffinen sind; es folgt daraus, daß dieser Verbrauch schneller und vollständiger ist, als bei Gegenwart von verzweigten Kohlenwasserstoffen und außerdem, daß die Entstehung dieser Nebenprodukte in beträchtliche«: Maße verringert, wenn nicht ganz unterdrückt wird. Die Vevweilzeit ist für jede Fermentationsetapp® - wahlweise einzustallen und beträft gewÜSmlleh 1-10 Stunden. Es sei betont, daß zu den gemäß der Erfindung benetzbaren Mikroorganismen Hefen» Bakterien und Schlme«l$il8e oder deren Mieöhun- ; gen gehören. Ee seien »le Β·Ι·ρ1®1· «li«»«r drei Kategorien von _: Mikroorganismen folgende genannte

00988 4/0247 BADORtQiNAU

- Blatt 11-

^a) Von dan Hefent

Die Familie der Endomycetaceae und in besonderen die Unterfamilie der Saccharomycetoideae, der die Art der Pichia, HanSenula, Debaryomyoes angehören« ferner die Unterfamilie der Lipomycetoideae und besondere die Art Lipomyces.

Die Familie der Cryptocoocaceae, besondere die Unterfamilie der Cryptococcoideae und besonder« davon die Arten Torulopsis und Candida, die Unterfamilie, der Rhodotoruloldeae und davon die Art Rhodotorula«

b) Von den Bakterlent

Die Ordnung der Pseudomonadalea, besonders die Familie Paeudomonadaceae, davon die Art der Pseudomonas und unter diesen folgende Speciest

- Pseudomonas fluoresoens,

- Pseudomonas ovalle,

- Pseudomonas eruciviae.

Die Ordnung der Bubaoterialee, deren Familie Aohromobaoteraoeae ^ und besondere die Art Achromobacter, die Art Flavo bacterium und davon die Speciest

- Flevobacterium aquatile,

- Flftvobacterium lutesoen·,

- Flavobaoterium marinum,

Die Familie der Miorooocoaceae, besondere die Arten der Microoocous luteua und Microoocous flavus, die Familie der Brevibacteriaoeae, davon die Art Brevibacterium.

Die Ordnung der Actinomycetales, davon die Familie Myoobaoteriaoeae und Actinomyoetaoeae. .

- 12 -

009884/0247

* »I

• ■ · t ι

* Blatt 12 -c) Von den Schimmelpilzen>

- Von der Familie der Muooracees die Art Rhizopus,

- von der Familie der Aapergillales die Arten Aapergillus und Penioillium.

Die der vorliegenden Anmeldung beigefügte Zeichnung zeigt die Aneinanderreihung der Verfahrensschritte, wie aie vorher beschrieben wurden·

If ²» 3» Ί und 5 sind die Apparate in welchen die fünf Etappen dea Verfahrene jeweils durchgeführt werden«

Vie man in der Zeichnung erkennt, wird der Fermentator 1 mit einem unter Druck stehenden Gas, das molekularen Sauerstoff enthält (Leitung 6), ferner mit einem wässrigen Nährmilieu (Leitung 7) und mit der Kohlenwasserstoff-Charge (Leitung 8), die aus dem Waschapparat 3 hervorgeht, wie oben beschrieben ist, versorgt·

Das Gasgemisch, das teilweise an Sauerstoff erschöpft ist und noch unter Druck steht, wird durch Leitung 9 abgeführt· Die aus dem Fermentator auafHeuende Flüssigkeit wird durch Leitung in den Trennapparat 2 geschickt{ dort wird die Trennung zwischen den durch die Leitung 11 abgezogenen Mikroorganismen, die in die Vaachaone 3 geleitet wurden,von dem wässrigen Milieu, das durch die Leitung 12 dem Fermentator k zugeapeiat wurde, durchgeführt .

Ea ist hier festzustellen, da0 man gegegebenfalls im Trennapparat 2 eine dritte Phase erhalten kann, die eich von den beiden anderen Phasen unterscheidet; ea handelt sich dann bei dieser dritten Phase um eine Kohlenwaaaeratoff-Phaee, die aioh aua nicht verbrauchten Kohlenwaeaeratoffen gebildet hat·

- 13 -

009884/0247

I·*- Il Ii <>||i

< I I I ι I * ι t ι ι

( « ■ I t ι ι ι ir

it t*t» ι

- Blatt 13 -

Diese gegebenenfalls vorhandene dritte Phase kann wieder der ersten Fermentationsstufe zugeführt bzw. zurückgeleitet werden.

Der Waschapparat 3 wird durch die Leitung 13 mit einer Kohlen» wasserstoff-Fraktion versorgt, die zumindest zu 70 # und vorzugsweise zu 85 i> aus linearen Paraffinen besteht·

Die Waschflüssigkeit wird durch die Leitung Ik abgeführt. Ein Teil derselben wird als Charge durch die Leitung 8 in den ersten Fermentator eingeleitet· Der übrige Teil, der durch die Leitung 15 abgezogen wird, kann anderen Verwendungszwecken zugeführt werden·

Nach einer anderen Ausführungsform wird ein Teil der frischen Kohlenwasserstoff-Charge direkt dem Fermentator t zugeleitet} nach einer weiteren Ausführungsform wird die Gesamtheit der den Apparat 3 verlassenden Waschflüssigkeit in den Fermentator 1 geleitet.

Die gewaschenen Mikroorganismen werden durch die Leitung 16 von der Waschzone in den zweiten Fermentator 4, der durch Luft gespeist wird, die aus dem ersten Fermentator duroh die Leitung 9 herbeigeführt wird·

Das aus diesem zweiten Fermentator Ausströmende wird durch die Leitung 17 in den Trennapparat 5 geführt, von wo man die gereinigten Mikroorganismen duroh die Leitung 18 und da« wässrige Milieu duroh die Leitung 19 abzieht·

Ein Teil dieses wässrigen Milieus, das durch die Leitung 19 abgeleitet wird, kann wieder der ersten oder zweiten Fermentationsstufe zugeleitet werden, d.h. wieder in die Apparate 1 und k gehen.

E· ist zu betonen, dad da· wie eben lieeohriebene Mikroorganiseen-

00988A/0247 ⁰^⁰

- Blatt It» -

• Kulturverfahren durch jede an eich bekannt Endstufe ergänzt bzw» kompletiert werden kann; beispielsweise kSnnera die der fünften Etappe entstammenden Mikroorganismen einer oder mehreren Wasohungen mit Wasser unterzogen werden, das gegebenenfalls oberflächenaktive Mittel enthält| als Waschmittel können auoh organische Lösungsmittel oder Gemische solcher Lösungsmittel verwendet werden. Die Mikroorganismen künnen ferner einem sogenannten Auflösungsverfahren (Lyse) unterworfen «erden, d.h. einer aolchen Behandlung, bei der die Zellwände aufgerissen werden. Die Trocknung der Mikroorganismen beendet im allgemeinen diese abschließenden Behandlungen·

Beispiel

Die erste Etappe wird in einem zylindrischen Reaktor eines Fassungsvermugens von 1 m durchgeführt, der mit einem Rtihrayatem ausgestattet ist} seine Luftversorgung wird durch einen Kompreseor sichergestellt,der 100 m/Stunde Luft zuführt} der Brück im Reaktor wird bei 2,5 Atmosphären, seine Temperatur bei 3O⁰C -1°C gehalten· .

Diese erste Etappe besteht in einer kontinuierlichen Kultur der Hefe Candida lipolytica einer Abwandlung von Endonycopsis lipolytica wobei das Wachstum begrenzt wird und als Waehstumgabegrenzungsmittel eine Erdfllfraktion eingesetzt wird, die reich ist an normalen Paraffinen (Haupt-Substrat)·

Die'Kohlenwasserstoff-Charge, die zum Einsatz gelangt, bat man duroh Paraffinftbspaltung aus einem Gasöl erhalten! diese Kohlen« wasserstoff-Fraktion besteht zu £0 # aus n-Baraiffinew «ad zu ; 10 % aus einem Gemisch verzweigter Paraffine, ferner von Naphtha nen und aromatischen Stoffen« Diese Charge ist am Punkt j des Reaktors in einem Verhältnis von 1 kg/Sitund* eingespeist*.

- 13 -

009084/0247

"»,'«.'■«■ 2032ΤΛ2

- Blatt 15 -

Am Punkt 7 des Reaktors wird gleichzeitig eine anorganische •Lösung (etwa I50 l/Stunde) eingespeist, die derart zusammengesetzt iet, daß gleichseitig pro Stunde kO kg Phosphor (berechnet als P₂O.), 35 e Kalium (berechnet als K₂O) und 1 g Magnesium (berechnet als MgO) sugeftthrt werden. Die Regulierung des pH-Wertes, den stan auf 4,0- 0,1 einstellt, wird durch Zugabe einer Aaunoniaklttsung durchgeführt, wodurch die Zuführung einer Menge von 100 g Stickstoff (N) pro Stunde sichergestellt wird«

Die anorganische Lesung führt ferner in ausreichender Quantität auch die für das Wachstum notwendigen anderen Mineralischen Salsa hinsu.

Aa Punkt 8 des Reaktor« führt ,Man eine Kohlenwasserstoff-Charge in einer Menge von 6OO g/Stunde hlnsu, die aus der dritten Etappe stMust.

Das as Punkt 10 aus dem Reaktor Ausströmende entspricht 1,5 pro Stunde an Hefe (Trockengewicht) 150 l/Stunde einer anorganischen US sung die 5 β Phosphor (berechnet als P₂°5^ enthält, die jedoch praktisch weder Kalium noch Magnesium aufweist 1 das Ausströmende enthält ferner 0,1 kg an Kohlenwasserstoffen pro Stunde·

Die sweite Etappe besteht aus einer einfachen Dekantierungeoperation, die es gestattet eine Hefecreme (20 l/Stunde) Von einer anorganischen Lösung (13Ο l/Stunde) su trennen.

Die Waschung, die die dritte Stufe darstellt, wird in einer Zentrifuge durchgeführt, wobei die Hefecreme und ein Waschmittel im Gegen*trom aneinander geführt werden, welch letsteree aus der gleichen Kohlenwasserstoff charge besteht, die in den

- 16 -

00-988.4/0247-"'

era ten Meaktor eingeführt wird, t7ob©£
etwa 20/1 betrügt; das K©tol®»?a©s©imfö®iT°ifcQ©li«±tt«l0 dae die Zentrifuge verläßt, wird <ämm M©akfe®r u@r ©rst©si Etappe zugeführt»

Die vierte

wird vorzugsweise in ©iaee eylimderffönaieeiä Reaktor sines Itatzv© lumens von

3 ■ ·

0,5 μ t der mit einem RtthreysteB aweg©eⁱfeatt©t ist, durchgeführt? seine Beschickung mit Luft wird dur@h die Einspeisung des gasförmigen Ausströmendem eiebergestellt, de© in ©imer Meng© von 100 m*yStunde ^aue ^®^r ersten Etappe etaneoite In diesem Reaktor herrscht Atmoaphärendruokg eeime T©Bpej?at«r wirä bei 30⁰C ί 1°C gehalten.

Dieser Reaktor wird kontinuierlich m±t einer anorganischen Lösung (13Θ l/Stunde) versorgt, €i© aue der zweiten Etappe stammt; ferner wird die Hefe@rem® augüftthrt ₀ (SO i/Sttande) die aus dem VasohproaseB stamtrt·

Dieser sekundäre Fermentator wird durch Zugabe von Ammoniak, wie dies bereite oben angegeben wurde, auf einem konstanten pH-Wert gehalten·

Das in einer Menge von etwa 15© I/Stnmd® Au@stri5m®nde enthält in diesea Volumen 1,6 kg Hefe (Trockengewicht), ein® mineralische Lösung ohne Phosphorgehalt, sowie 1 g Kohlenwasserstoffe«

Man sieht also, daß die erhaltene Hefe nur noch einen äußerst geringen Gehalt an Kohlenwasserstoffen aufweist·

Gegebenenfalls kann man einen weiteren WasohprosseJS an sich bekannter Art und Weise anschließen»

-17/Patentanfflprüche-

009884/0247

Claims (1)

1. - Blatt 17 Patentansprüche

   1») Verfahren zur stufenweisen Herstellung von Mikroorganismen-Kulturen, dadurch gekennzeichnet, daß man

   a) in einer ersten Etappe eine Lage an Mikroorganismen in einem wässrigen Nährmilieu und einer Kohlenwasserstoff-Charge, die zumindest 70 Gew.# an linear gebauten paraffinischen Kohlenwasserstoffen enthält, welche Charge von der Etappe (c) dieses Verfahrene herrührt, mit einem molekularen Sauerstoff enthaltenden Gas in Berührung bringt, wobei die Zeitdauer dieser Berührung derart eingestellt wird, daß man einen Gesamtgehalt an linear gebauten paraffin!sehen Kohlenwasserstoffen erreicht, der 0,2 - 5 Gew. ^ der Kohlenwasserstoff-Charge beträgt, daß man .

   b) in einer zweiten Etappe eine an Mikroorganismen angereicherte Phase von dem zumindest größeren Teil des wässrigen Nährmilieus trennt, daß man

   c) in einer dritten Etappe die an Mikroorganismen angereicherte Phase mit einer Kohlenwasserstoff-Charge in Berührung bringt, die zumindest zu 70 Gew.^ linear gebaute paraffinische Kohlenwasserstoffe enthält und daß man anschließend die Mikroorganismen-Phase von der Kohlenwasserstoff-Charge trennt, welch letztere der ersten Etappe dieses Verfahrens zugeleitet wird, daß man

   d) in einer vierten Etappe die Mikroorganismen-Phase di« in der Etappe (o) erhalten wird mit einem wässrigen Nährmilieu und mit einem molekularen Sauerstoff enthaltenden Gas in Berührung bringt, und daß man

   e) in einer fünften Etappe di· Mlkroorgftniaitt®»™Phase» vom wässrigen Milieu abtrennt·

   2.) Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennaeloimet, UmQdas

   .-..■■'. ■ « 18■ · ■ ·

   009884/0247

   2032U2

   aus der ©rstea Etappeabsfcröseiride ©xy«Sbs?©8id« Gas als ©xydierende Gasquelle für die vieyt® Etappe benutzt wird«,

   ti

   3·/ Vörf (aiMreH n&Cb

   das in der zweiten Etappe afegetrenmfte wässrige N&hrmilieu ala wässriges Nährailiew ftts» die fi®s"S@ Steppe wird.

   k,) Verfahren nach An®pria©li 2_B dadurcte man das im Verlauf d®r erefen Et&ppo rende Gas als oxydieresafieis Gas für die vierte Etappe verwendet«

   5» f Verfahren nach

   die Kohlenwasserstotf-Ctearg© sowohl dos· erstem-als der dritten Etappe jeweils staraimdaßf ®5 6ew.^ asu gebauten paraffinieehea Erofeleawaesors^ofiera

   6.) Verfahren nach ArasprmelE I₉ dadlus·©!! gekeranzeiehnat, daß die dritte Etappe in Anwesenheit Ψ&Λ Sjsw.erstof'f' durchgeführt wird»

   7·) Verfahren nach Afssjpnsslx I₉ dsdusreli gskeaanzeiehnet» daß die KohlenwEuaerstoff^S&arg© (SeE¹ ört^tem S-Sapp© aus einer Kohlenwaasersteff-Abspaitmnag vosa feaSl_B ICereslsi. odar Schmieröl erhalten ist®

   8«) Verfahren na Gh

   das wässrige ÄteRBlliQia öqs· Qs»«t©^ tsmct friert®sa lä-fefispp® j®= weil» eine Qaelie für aasiifeilieribsaE¹®® Stieisat®^f -und für aseimilieirbaroii k

   ren und eea®ntlelle
   enthttlt.

   203 ZH 2

   - Blatt 19 -

   §„) Verfahren nach Anspruch I₃ dadurch gekennzeichnet, da§ dl« dritte Etepp» im-Gegen·trom-Prinsip durchgefUhrt. virdf wobei die M±kr©or^ft»4eeen iron &b®n. nmoli -unten-und die Kshlenwaaeeretöff« v©m unf«n iwoli ol»@n

   009884/0247

   Leerseite