DE2107902A1 - Herstellung von Peptiden - Google Patents

Herstellung von Peptiden

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DE2107902A1 DE19712107902 DE2107902A DE2107902A1 DE 2107902 A1 DE2107902 A1 DE 2107902A1 DE 19712107902 DE19712107902 DE 19712107902 DE 2107902 A DE2107902 A DE 2107902A DE 2107902 A1 DE2107902 A1 DE 2107902A1
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Johannes Jacobus Maast rieht Boesten Wilhelmus Hubertus Joseph Sittard Dahlmans, (Niederlande) C07c 109 04
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Stamicarbon N V , Heerlen (Nieder lande)
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Description

Kennzeichen 2258
Dr. F. Zumsteln sen. · Dr. E. Assmann Dr.R.Koenigsborger - Dipl.Phys. R. Holzbauer
Dr. F. Zumstein jun. Patentanwalt·
8 München 2, Bräuhausstraß· 4/Hl
STAMICARBON N.V., HEERLEN (die Niederlande) Herstellung von Peptiden
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zu der Herstellung von Peptiden und Eiweissen, indem man eine Verbindung, welche eine Aminogruppe mit zumindest einem ersetzbaren Wasserstoffatom besitzt, mit dem Derivat einer tt-Aminocarbonsäure unter Bildung einer Peptidbindung reagieren lässt.
Unter Peptiden sind Verbindungen zu verstehen, welche aus zwei, drei oder mehr durch Amidgruppen (Peptidbindungen) mit einander verkuppelten Aminosäuren aufgebaut sind. Meistens werden die Peptide mit hohem Molekulargewicht Eiweisse genannt. Die chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften von Peptiden werden u.a. durch die Art und Menge der Aminosäuren, aus denen das Peptid zusammengesetzt ist, und durch die Reihenfolge der gegenseitigen Kupplung dieser Aminosäuren bedingt.
Die grosstechnische Herstellung von Peptiden bedingt eine zweckmässige Synthese, mit deren Hilfe es möglich ist, eine Aminosäure oder ein auf einfache Weise herzustellendes Derivat dieser Säure in hoher Ausbeute mit eim;r anderen Aminosäure oder einem bereits hergestellten Peptid zu kuppeln. Mit einer solchen Synthese kennen bekannte Peptide, wie z.B. Oxytocin, Vasopressin und Angiotensin synthetisiert werden und es ist auch die Herstellung neuer Peptide möglich, welche in der biochemischen Forschung oder bei der Herstellung von Pharmazeuten von Interesse sein k'önnen.
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Die Reaktionsteilnehmer sind so vorzubearbeiten und die Reaktion hat in der Weise stattzufinden, dass sich der eine Reaktionsteilnehmer ausschl iesslich mit nur einer Aminogruppe und der andere ausschlir..ssl ich mit nur einer, vorzugsweise aktivierten Carboxylgruppe an der Reaktion beteiligen kann.
Man hat bereits vorgeschlagen, das N-carboxy-anhydrid einer <X-Aminos8ure oder das Thiazolid-2,5-dion-derivat einer Aminosäure (auch - weniger richtig - 'N-thiocarboxy-anhydrid' genannt) mit der freien Amino-^ gruppe einer (!-Aminosäure oder eines Peptids reagieren zu lassen (siehe din niederländische Patentschrift 6609246). Diese Methoden werden nachstehend als NCA-Methode und TCA-Methode bezeichnet. Der Nachteil der NOA-Methode ist, dass die Reaktion sehr rasch verlauft, nämlich in weniger als 1 Minute, wordurch die Reaktionsbedingungen nur sehr schwer zu beherrschen sind. Infolge der starken Reaktionsfreudigkeit der N-carboxy-anhydride kann das bei der Reaktion anfallende Peptid selbst auch wieder mit dem Anhydrid reagieren. Ausserdem lassen sich die N-carboxy-anhydride der verschiedenen Aminosäuren nur in geringer Ausbeute oder Überhaupt nicht herstellen. Bei der TCA-Methode verläuft die Reaktion weitaus ruhiger, einer der Nachteile dieser Methode ist aber, dass die Thiazolid-2,5-dion-derivatrvon (!-Aminosäuren nur über eine komplizierte und kostspielige Synthese herzustellen sind.
Erfindungsgemäss lässt sich ein Peptid gewinnen, indem man die von einer <X-Aminocarbonsäure abgeleitete 2-Thion-oxazolidon-5-Verbindung in einem wässerigen Medium mit einer Aminosäure oder einem Peptid, die eine Aminogruppe aufweisen, an die zumindest ein ersetzbares Wasserstoffatom gebunden ist, oder mit einer von einer Aminosäure oder einem Peptid abgeleiteten Verbindung, wie einem Ester oder Amid, in Fieaktion versetzt. Auch eine Amino-säure oder ein Peptid, dessen Carboxyl-gruppe an einem festem Träger gebunden ist, wie zum Beispiel im sogenannten Merrifield-Peptid-.Synthese, kann als Reaktionsteilnehmer benutzt werden.
Bei dieser Reaktion bildet sich ein Dipeptid bzw. ein Polypeptid, dessen endständige Aminogruppe ein thiocarbonylsubstituent trägt. Diese N-thiocarbonylgruppe trennt sich in einem sauren wässerigen Medium leicht ab, wobei sich COS bildet und ein Peptid mit einer freien Aminogruppe übrigbleibt. Die Reaktionszeit liegt, je nach den Ausgangsstoffen und den
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Roaktionsbedingungen, zwischen 2 min und 1,5 bis 2 Stunden. Die Selektivität der Reaktion ist ausgezeichnet, d.h. dass fast nur eine Aminosäure angebaut wird.
Die Reaktion zwischen einer 2-thion-oxazolidon-5-Verbindung und einer Aminosäure ergibt z.B. ausschliesslich ein Dipeptid ohne Bildung i-incs Tripeptids. Die Ausbeute der Reaktion ist ausgezeichnet, in vielen Fällen lassen sich durch die Wahl optimaler Reaktionsbedingungen Ausbeuten von über 95 % erreichen.
Beim erfindungsgemässen Verfahren, nachstehend die TOZ-Methode genannt, ist es als ein wichtiger Vorteil zu betrachten, dass die 2-thionoxazolidon-5-Verbindungen leicht und billig herzustellen sind, auch die Vorbindungen aus Aminosäuren, welche sich mit der NCA-Methode kaum oder ■
überhaupt nicht zu den entsprechenden Oxazolid-2,5-dion-Verbindungen umsetzen lassen.
Ks versteht sich, dass die in der 2-thion-oxazolidon-5-Verbindung oder in einem anderen Reaktionsteilnehmer anwesenden Substituenten, welche· die Reaktion stören oder unter den gegebenen Reaktionsbedingungen eine ungewünsohte Gruppenbildung erfahren k'onnen, während der Reaktion geschlitzt oder entaktiviert sein müssen. Dies lässt sich dadurch erreichen, dass diese Substituenten vor Anfang der Reaktion in geschützte Gruppen verwandelt werden oder von Reaktionsteilnehmern mit geschützten Gruppen ausgegangen wird. Dieser Schutz ist erreichbar mit Hilfe von in der Peptidchemie bekannten Methoden; wie z.B. durch das Umsetzen einer Aminogruppe zu einer N-carbobenzoxy-aminogruppe, das Umsetzen von Hydroxyl- oder ,
Thiolgruppen zu Estern oder Rthern, z.B. zu Benzyläthern bzw. Thiobenzyl- "
äthorn, forner das Aufbringen eines Protons auf die Guanidiningruppon und das Beibehalten dieses Protons während der Reaktion.
Die von OL-Aminosäuren abgeleiteten 2-thion-oxazolidon-5-Verbindungon zeigen die Formel 1 des Formelblatts, in der R ein Wasserstoffatom oder einen Aminosäurerest und R' ein Wasserstoffatom oder eine ggf. auch substituierte Alkylgruppo darstellt. Unter Aminosäurerest sind hier die substituierten oder nichtsubstituierten Gruppen zu verstehen, welche an das OL-Kohlenstoffatom von in der Natur vorkommenden oder auf synthetischem Wogo hergestellten, ggf. optisch aktiven (!-Aminocarbonsäuren gebunden sein k'onnen. R" ist in den meisten Fällen ein Wasserstoff atom, es kann aber aut-h
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BAD ORIGINAL
eine Alkylgruppe oder eine Alkylengruppe, welche mit It einen Ring bildet, darstellen. So ist R « R' = R" = H für das von Glycin abgeleitete 2-thionoxazolidon-5 selbst.
. Sowohl R1 als R" stellen ein Wasserstoffatom dar; R ist ei im Isopropylgruppe, eine Propionsäuregruppe, eine N-carbobenzoxy-W-ami no-ributylgruppe, eine Benzoxymethylgruppe oder eine (ü-Guanidinin-n-propylgrtippf bei den Verbindungen, welche von bzw. Valin, Glutaminsäure, N-gesehUtziom Lysin, O-geschütztem Serin und Arginin abgeleitet sind.
Bei der von N-methylleucin abgeleiteten 2-thion-oxazolidon-5-Verbindung ist R eine Isobutylgruppe, Rr ein Wasserstoffatom und R" eine Methylgruppe. Bei den von Prolin bzw. O-geschütztem Hydroxyprolin abgeleiteten Verbindungen ist R' ein Wasserstoffatom und bilden It und R" zusammen eine Trime?thylen-, bzw. eine 1-Benzoxytrimethylengruppe.
Bei obigen Beispielen handelt es sich um nur einige der viol en möglichen 2-thion-oxazolidon-5-Verbindungen, welche bei der Peptidsynthese gemäss der TOZ-Methode möglich sind.
Die 2-thion-oxazolidon-5-Verbindungen lassen sich auf einfache Weise und in hoher Ausbeute herstellen, indem man einen tert. Alkylestor einer tt-Aminocarbonsäure mit Thiophosgen zu dem entsprechenden (X-i sot hi ocyanatcarbonsauren Ester umsetzt, und diesen mit Hilfe einer starken Säure zu hydrolysieren und zu cyclisieren (siehe die gleichzeitig eingereichten
Auch die Derivate der sogenannten 'schwierigen' Aminos'äuren, wie Glutaminsäure, Asparagin, Histidin oder Arginin, lassen sich auf diese Weise herstellen.
Bei all diesen 2-thion-oxazolidon-5-Verbindungen ist die 0,-aminogruppe der ursprünglichen Aminosäure maskiert und die Carboxylgruppe aktiviert. Die Reaktion, bei der die Peptidbindung erfolgt, und die Dethiocarboxylierungsreaktion kflnnen wahrscheinlich mit Hilfe der Reaktionsgleichungen gemäss den Figuren 2 und 3 des Formelblatts dargestellt worden, R und R' sind hierbei Aminosäurereste.
Die Peptidsynthese gemäss der TOZ-Methode wird in einem wässerigen Medium durchgeführt, dessen pH während der Reaktion geregelt wird. Diese pH-Reglung wird erreicht, indem man von einer wässerigen Pufferlösung ausgeht und das pH nach Zusatz der Reaktionsteilnehmer und während der Reaktion durch Beigabe von Lauge oder Säure dauerend nachstellt. Die
*) Gase 2259 und Case 2260 der gleichen Anmelderin
Wahl des pH, bei dem die Reaktion stattfindet, wird durch mohrora Kakloron bedingt. So vermeidet man z.B. die niedrigen pH-Werte, bei denen sich die N-thiocarboxylgruppe während der Reaktion vom gebildeten Peptid abtrennen kann. Die Wahl des pH ist weiter davon abhängig, ob vor und wahrend der Reaktion auf bestimmte Gruppen Protonen aufzubringen und aufrechtzuerhalten sind oder nicht. Welcher Wert letzten Endes den Vorzug hat, kann anhand einiger Versuche vor der Reaktion ermittelt werden. Im allgemeinen liegen bei einem pH zwischen 8 und 12 die besten Ergebnisse vor. Es kann aber nötigenfalls auch bei anderen pH-Werten gearbeitet werden.
Während der Reaktion wird das Reaktionsgemisch sehr intensiv gerührt, damit sowohl die Reaktionsteilnehmer wie die Mittel zum Regien des. pH möglichst gleichmässig verteilt werden. M
Nach Ablauf der Reaktion wird das pH auf einen Wert zwischen 1 und 5 herabgesetzt, z.B. durch Beigabe einer starken Saure. Es wird dabei die endstSndige Aminogruppe des gebildeten Peptids dethiocarboxyliert, bei welchem Vorgang COS frei wird. Die Entfernung des COS kann nötigenfalls beschleunigt werden, indem man einen Inertgasstrom durch das Reaktionsgemisch leitet.
ο ο Die Reaktionstemperatur kann zwischen -25 C und +50 C schwanken.
Um ohne Gefahr einerEisbildung in wässeriger Lösung arbeiten zu können, kann dem Reaktionsgemisch ein die Reaktion nicht störendes Salz beigegeben werden. Durch Zusatz einer grossen Menge Natriumchlorid kann die Reaktion noch bei einer Temperatur zwischen -25 und -30 C stattfinden. Vorzugsweise fuhrt man die Reaktion aber bei einer Temperatur zwischen -15 C und 0 C
durch. ■
Das Verhältnis zwischen den Reaktionsteilnehmern kann schwanken. Ks kann einer der Reaktionsteilnehmer in einem, meistens geringen, Übermass fooigfgobon worden. Hierfür wird derjenige Reaktionsteilnehmer gewählt, der sich auf dir.· billigste und/oder leichteste Weise nach Ablauf der Reaktion aus der Lösung abscheiden lässt. Vorzugsweise wird von äquimolaren Mengen dieser Reaktionsteilnehmer ausgegangen, weil auch dann die Ausbeute hoch ist.
Die Reaktion kann dadurch stattfinden, dass zuerst eine Aminosäure oder ein Peptid in einer wässerigen Pufferlösung gelöst wird, anschliessend das pH der Lösung auf den gewünschten Wert eingestellt und diese Lösung,
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ggf. nach Beigabe von Salz, auf die richtige Temperatur eingestellt wird. Darauf wird unter intensivem Rühren die 2-thion-oxazolidon-5-Verbindung zugegeben, wobei das pH der Lösung unter Beigabe von Lauge mit Hilfe eines automatischen Titriergefässes auf dem richtigen Wert gehalten wird. Nach Beendung der Kupplungsreaktion wird die Lösung durch Zusatz einer starken SSure angesäuert, wobei das gebildete Peptid eine freie Amino-Endgruppe erhalt.
Das gebildete Peptid kann mit Hilfe eines aus der Peptidchemie bekannten Verfahrens isoliert werden, es kann aber auch in der Lösung blejiben und als Ausgangsstoff zur Kupplung mit einer nächsten Aminosäure gem'äss der TOZ-Methode dienen. Auf diese Weise lassen sich jedesmal durch Verkupplung neuer Aminosäuren mit endständigen Aminogruppen auf zweckm'assige Weisf grosse Peptide herstellen.
Ein Vorteil der TOZ-Methode besteht auch darin, dass dor
Racemierungsanteil, sowohl bei der Herstellung der 2-thion-oxazoliflon-5-Verbindungen wie bei der Kupplungs- und Aufarbeitungsreaktion sehr niedrig gehalten werden kann.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird anhand der nachfolgenden Beispiele erläutert, die sich auf die Herstellung von Dipeptiden beziehen. Der tiefgreifendste Schritt ist nämlich dieser, dass eine neue Aminosäure mit Hilfe desselben Verfahrens stets wieder mit einem bereits hergestellten Peptid verkuppelt werden kann.
Beispiel 1
Die Herstellung von
In einer wässerigen Pufferlösung mit einem pH von 12 werden 0,02 Mol (2,35 g) Valin aufgelöst. Anschliessend wird das pH auf 11,5 eingestellt und werden 0,02 Mol (3,5 g) 4-Isobutyl-2-thion-oxazolidon-5 bei einer Temperatur von -2 °C bis 0 C und unter heftigem Rühren in kleinen Pqrtionen in die Lösung eingebracht. Das pH des Reaktionsgemisches wird IO Minuten lang unter Zugabe von 5 η Natronlauge mit Hilfe eines automatischen Titriergefässes auf einem Wert von 11,5 gehalten. Danach wire! das Reaktionsgemisch durch Beigabe von 6 η Salzsäure zu einem pH von 2 angesäuert. Nach Filtration und Aufarbeitung auf die in der Peptidchemio übliche Woiso erhält man eine Menge von 3,3 g reinem Leucyl-Valin.
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Beispiel 2
Die Herstellung von Phenylalanyl-Leucin
In einer Pufferlösung mit einem pH von 10 werden 0,02 Mol (2,65 g) Leucin gelost, wonach das pH der Lösung auf einen Wert von 9,5 eingestellt wird. Es werden anschliessend bei einer Temperatur von 5 C und unter heftjgem RUhren 0,02 (4,2 g) 4-Benzyl-2-thion-oxazolidon-5 in kleinen Portionen in die Lösung eingegeben. Danach wird das pH des Reaktionsgemisches 1,5 Stunden lang mit Hilfe von 2 η Natronlauge auf einem Wert von 9,5 gehalten. Durch Ansäuerung des Gemisches zu einem pH von 2 fällt eine Lösung an, in der Phenylalanyl-Leucin zu 95 Mol-% aus den in der Lösung befindlichen Mengen an Aminosäuren und Peptiden besteht, wie anhand einer Aminosäure- A
analyse berechnet werden kann. Die Ausbeute liegt, im Vergleich zu der eines einzigen Reaktionsteilnehmers, noch um einige Prozente höher als die auf diese Weise berechnete Prozentual ausbeute.
Beispiel 3
Die Herstellung von VaIy]-Leucin
In einer Pufferlösung mit einem pH von 10,0 werden 0,02 (2,G5 g) Lrnirih aufgelöst, wonach das pH der Lösung auf einen Wort von 1O,2 (eingestellt wird. Die eingehend geröhrte Lösung, die auf einer Temperatur von 0 °r gehalten wird, wird'mit 0,02 Mol (3,2 g) 4-Isopropyl-2-thionoxazolidon-5 vermischt.
Der Säuregrad des Reaktionsgemisches wird 1 Stunde lang auf einem pH-Wort von 1O,2 gehalten, wonach das Gemisch zu einem pH-Wert von 2 angesäuert wird. Auf diese Weise bildet sich das Valyl-Leucin in einer Ausbeute von 92 Mol-% der in der Lösung befindlichen Aminosäuren und Peptide, wir· mittels einer Aminosäure-analyse berechnet werden kann.
Beispiel 4
Die Herstellung von Asparagyl-Valin auf Basis von Asparaginsäure und Valin
Asparaginsäure wird mit Isobutylen zu dem Di-tert.-butyl-Ester umgesetzt. In einem Medium aus Methylenchlorid und Wasser (Verhältnis 1:1) lässt man diesen Di-tert.-butyl-Ester von Asparaginsäure bei einer
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BAD
ο
Temperatur von O C und einem pH von 4 mit Thiophosgen reagieren. Nach einsttlndiger Reaktionszeit trennt man die organische Phase von der Wasserphase und trocknet diese auf wasserfreiem Natriumsulfat, so dass eine Lösung von Di-tert.-butyl-Ester und <X-Isothiocyanatasparagins8ure in trocknem Methylenchlorid anfallt.
Durch diese Lösung wird bei einer Temperatur von -5 C zweieinhalb Stunden lang gasförmiges HCl geleitet. Anschliessend wird die Lösung filtriert und das Methylenchlorid abdestilliert. Der so erhaltene Rückstand wird aus einem Methylenchloridhexangemisch umkristallisiert,, wobei reines 4-Carboxylmethyl-2-thion-oxazolidon-5 anfällt.
In einer wässerigen Pufferlösung werden 0,02 Mol (2,35 g) Valin aufgelöst, wonach man das pH der Lösung auf einen Wert von 9,5 einstellt. Mit dieser Lösung, welche unter kräftigem Rühren auf O C gehalten wird, werden 0,02 Mol (3,5 g) des bereits hergestellten 4-Carboxylmethyl-2-thionoxazolidon-5 vermischt.
Der Säuregrad dieses Reaktionsgemisches wird 30 min lang auf einem pH von 9,5 gehalten, wonach das Gemisch zu einem pH von 2 angesäuert wird. Auf diese Weise bildet sich Asparagyl-Valin in einer Ausbeute von 90 %.
Hf!spiele 5 bis 21
Die Herstellung von Leucyl-Valin
Auf die in Beispiel 1 geschilderte Weise lässt man äquimolare Mengen Valin und 4-Isobutyl-2-thion-oxazolidon-5 bei verschiedenen Temperaturen und pH-Werten mit einander reagieren, wonach durch Ansäuerung das Leucyl-Valin erhalten wird.
In nachfolgender Tabelle sind die Reaktionsbedingungen und die diesbezüglichen Ausbeuten, ausgedrückt in Mo]-% der in der Lösung befindlichen Aminosäuren und Peptide, zusammengefasst.
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Nr
Temp, in C
pH
Reaktionszeit in min
Ausbeute in °!c
5 5 9,5
6 5 9,5
7 O 11,0
8 0 8,3
9 -8 tot 0 11
10 -4 tot 0 11
11 -2 tot 0 11
12 -2 tot 0 11
13 -2 tot 0 11,5
14 -4 tot 0 11,5
15 +25 11,5
16 -9 tot 0 12
17 -5 tot -4 11
18 -13 tot -10 11
19 -13 tot -10 10,5
20 -15 tot -13 11,0
21 -15 tot -10 10,0
75
45
60 3 8 8
45 3 6 8 8
15 30 35 30 60
93 92 78 85 86 84 83 83 68 69 44 41 78 83 87 75 93
Beispiel 22
Herstellung von Asparagyl-Phenylalanin-Methylester
In oiner wässerigen Pufferlösung werden bei einer Temperatur von -15 °C 0,Q2 Mol (4,3 g) Salzsäuresalz des Methylesters von Phenylalanin aufgelöst, wonach das pH der Lösung auf einen Wert von 9,0 eingestellt wird, Dieser Lösung werden unter kraftigem Rühren 0,02 Mol (3,5 g)
4-Carboxylmethyl-2-thion-oxazolidon-5 beigegeben. Das pH der Lösung wird
ο 30 min lang auf einem Wert von 9,0 und auf einer Temperatur von -15 C gehalten. Danach wird das Gewicht schnell zu einem pH von 2 angesäuert. Durch weitere Aufarbeitung der Lösung auf übrigens bekannte Weise erhält man den Mothylester von Asparagyl-Phenylalanin, dessen Reinheit mit Hilfe von DfinnschLchl-Chromatographie nachgewiesen werden kann. Diese» Verbindung wird als SUssstoff verwendet.
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Claims (5)

PATENTANS PRÜCHE
1. Verfahren zu der Herstellung eines Peptids durch Reaktion eines G^Aminocarbonsäurederivats mit einer Verbindung, welche eine Aminogruppc mit zumindest einem ersetzbaren Η-Atom aufweist, dadurch gekennzeichnet, dass man die von einer CL-AminosSure abgeleitete 2-thion-oxazolidon-5-Vorbindung in einem wässerigen Medium mit einer Aminosäure oder einem Peptid oder mit der von einer Aminosäure oder einem Pf?ptid abgel oiteten Verbindung reagieren lässt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man dio Reaktion so durchführt, dass zuerst ein Peptid mit einer N-thiocarboxylamino-Endgruppe gebildet und anschliessend die thiocarboxylgruppe durch Erniedrigung des pH abgetrennt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einer Temperatur zwischen -25 C und +50 C stattfindet.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einer Temperatur zwischen -15 C und O C stattfindet.
5. Verfahren nach Anspruch 1, 2, 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass man das pH des Reaktionsgemisches zuerst auf einem Wert zwischen 8 und 12 hält und danach das Reaktionsgemisch zu einem pH unter 5 ansäuert.
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