DE2425999B2 - Verfahren zum nachweis von antibiotika und vorrichtung zu seiner durchfuehrung - Google Patents

Description

zum schnellen Nachweis von Antibiotika in Flüssigkeiten zu schaffen, das die vorgenannten 5 Bedingungen erfüllt Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Die Erfindung ist mit den Ansprüchen definiert.

Die Genauigkeit der Untersuchungsergebnisse hängt von der Menge der eingesetzten zu untersuchenden Probe ab. Wenn das Verfahren standardisiert wird, liefert es auch bei Ausführung durch ungeschultes Laborpersonal zuverlässige Ergebnisse. In einigen Fällen kann sogar eine grobe quantitative Abschätzung der Menge des in der untersuchten Probe vorhandenen Antibiotikums erfolgen. Die Verfestigung des Agar-Nährmediums in senkrechter Lage des Gefäßes in Verbindung mit standardisierten Mengen der zu untersuchenden Probe und des Nährmedium-j hat den Vorieii, daß die Oberfläche des Agar-Nährmediums definiert ist, so daß nach dem Eintragen von Nährstoffen zuverlässige Ergebnisse der Inkubation erhalten werden, die sogar halbquantitativ sein können.

Dem die Sporen enthaltenden Agar-Nährmedium oder den Nährstoffen kann ein Indikator zugegeben werden. Wird der Indikator dem Agar-Nährmedium zugefügt, kann er dann vor Beginn des Verfahrens besser verteilt werden. Durch den Indikator wird die Empfindlichkeit des Verfahrens erhöht und bei manchen zu untersuchenden Flüssigkeiten deren Farbe weniger durch die Eigenfarbe von Verunreinigungen der Probe gestört. Der Indikator kann ein Säure-Base-Indikator, wie Bromkresolpurpur oder Phenolrot, oder ein Redoxinrikator, wie 2,3,5-Triphenyltetrazoliumchlorid, sein. Für den Nachweis von Penicillin ist die Verwendung von Bromkresolpurpur günstig.

Der pH-Wert des Agar-Nährmediums ist für die optimale Wachstumsgeschwindigkeit des Mikroorganismus als auch für die Wirkung des nachzuweisenden Antibiotikums und damit für die Empfindlichkeit des Mikroorganismus gegenüber dem Antibiotikum von Bedeutung. Bei Verwendung von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis soll zu Beginn des Verfahrens das Agar-Nährmedium einen pH-Wert von am besten etwa 7 haben. Bei Verwendung eines Indikators, wie Bromkresolpurpur, wird eine sehr kurze Zeit zur Durchführung des Verfahrens erreicht. Obwohl diese Zeit etwas länger ist, wenn zu Beginn des Verfahrens das Agar-Nährmedium einen pH-Wert von etwa 8 aufweist, kann damit die Empfindlichkeit des Verfahrens gegenüber gewissen Antibiotika, insbesondere Aminoglucosiden, wie Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Kanamycin und Neomycin, erhöht werden. Als Indikator eignet sich in diesem Fall beispielsweise Phenolrot. Die Empfindlichkeit des Verfahrens gegenüber anderen Antibiotika wird jedoch nicht nachteilig beeinflußt, wenn der pH-Wert während des Verfahrens in der Weise abnimmt, daß jedes vorliegende Antibiotikum bei einem ihm entsprechenden pH-Wert das Wachstum des Mikroorganismus hemmt. Der nutzbare pH-Bereich zwischen Beginn und Ende des Verfahrens kann durch Verwendung von Mischindikatoren gegebenenfalls erweitert werden.

Die Empfindlichkeit des Verfahrens gegenüber uestimmten Antibiotika kann durch Verwendung anderer Sporen oder deren Kombination eingestellt werden.

Erfindungsgemäß können Sporen aller Bakterien verwendet werden, die eine ausreichende Empfindlichkeit gegenüber den zu bestimmenden Antibiotika aufweisen. Ein geeigneter Empfindlichkeitsbereich gegenüber verschiedenen Antibiotika kann durch die Verwendung von Sporen einer einzigen Art oder eines einzigen Stammes oder einer Kombination von Sporen verschiedener Mikroorganismen erhalten werden. Geeignete Sporen erhält man von Sporenbildnern der Gattung Bacillus mit entsprechender Empfindlichkeit gegenüber den zu bestimmenden Antibiotika, beispielsweise Bacillus calidolactis (H u s s ο η g et

»ο al., J. Bact., Bd. 15 [1928], S. 179 bis 188), Baciüus subtilis, Bacillus stearothermophilus (Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage [1957], S. 613 bis 693), die von G a 1 e s 1 ο ο t et al. (Neth. Milk & Dairy J., Bd. 13 [1959], S. 155 bis 179), beschriebenen thermophilen Bacillen, Bacillus stearothermophilus var. caüdolactis (H. Mol, Neth. Milk & Dairy J., Bd. 23 [1969], S. 153 bis 162) und Bacillus calidolactis, Stamm C 953 vom Niederländischen Institut für Molkereiforschung in Ede, Nieder-

ao lande (G a 1 e s 1 ο ο t et al., Neth. Milk & Dairy J., Bd. 16 [1962], S. 89 bis 95). Am besten werden Sporen von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis verwendet, der beim Laboratorium für Mikrobiologie in Delft, Niederlande, unter der Nummer L. M. D. 74.1

as hinterlegt ist. Dieser Mikroorganismus besitzt neben einer hoher Empfindlichkeit gegenüber Penicillin-G und Penicillin-V und einer sehr hohen Wachstumsgeschwindigkeit den zusätzlichen Vorteil, daß seine optimale Wachstumsgeschwindigkeit bei relativ hoher

Temperatur liegt, bei der sich andere Mikroorganismen normalerweise nicht vermehren, so daß die Gefahr einer Infektion vermindert ist. Sporen dieses Mikroorganismus sind rieht nur gegenüber den vorgenannten und anderen natürlichen Penicillinen emp-

findlich, sondern auch gegenüber anderen Antibiotika, wie halbsynthetischen Penicillinen, beispielsweise Nafcillin, Cloxacillin, Cephalosporinen, sowie Aminoglucosiden, beispielsweise Streptomycin, Dihydrostreptomycin, Neomycin und Kanamycin, ebenso

<o Tetracycline^ wie Chlortetracyclin und Chloramphenicol, Macroliden, wie Oleandomycin und Erythromycin, und Polypeptid-Antibiotika. Das erfindungsgemäße Verfahren ist zum Nachweise vorstehend genannter Antibiotika, gegebenenfalls nach Einstellung des entsprechenden pH-Wertes der Probe, verwendbar.

Sehr günstig ist ein Gehalt von 10* bis 10⁸, insbesondere 10^e bis 10', Sporen pro ml des Agar-Nährmediums. Die Sporenkultur des Mikroorganismus wird in einer Oberflächenkultur auf einem Agar-Nährmedium oder in einer flüssigen Submerskultur, beispielsweise in einem Schüttelkolben oder in einem Fermenter (Y a ο et al., Appl. Microbiol., Bd. 15 [1967], S. 455) hergestellt. Die Sporen werden derart in das Agar-Nährmedium überimpft, daß sie zwar lebensfähig bleiben, aber nicht keimen. Dem Agar-Nährmedium können eine physiologische Salzlösung und/oder ein Indikator zugegeben werden, jedoch soll es keine Nährstoffe für den Mikroorganismus, enthalten.

Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens liegt darin, daß es den Einfluß von Hemmstoffen, beispielsweise von Leucozyten gebildeten Verbindungen, die normalerweise in Milch und anderen zu untersuchenden Flüssigkeiten vorliegen und keine Antibiotika darstellen, beträchtlich vermindert, was bei den bekannten Verfahren normalerweise nicht der Fall ist. Die Verminderung der Wirksamkeit dieser

Hemmstoffe ist darauf zurückzuführen, daß sie nicht liehen Nährstoffe, gegebenenfalls mit einem Indikator, oder nicht in wesentlichem Ausmaß in das Agar- auf die Oberfläche des die Sporen enthaltenden Agar-Nährmedium in den Gefäßen, beispielsweise den Nährmediums gegeben. Obwohl auch eine vcrgege-Teströhrchen, eindiffundieren. Dadurch wird die Zu- bene Menge an Nährstoffen in flüssiger Form zugeverlässigkeit des erfinduny>gemäßen Verfahrens er- 5 fügt werden kann, ist die Zugabe von Nährstoffen in höht und macht es zu einem leicht durchführbaren trockener Form bevorzugt, insbesondere auf runden Verfahren, das zur Inaktivierung jener Hemmstoffe Filterpapieren als Trägermaterial oder in Form von eine Vorbehandlung der Milchprobe normalerweise Tabletten, welche die getiockneten Nährstoffe entnicht erfordert, selbst dann, wenn sich die Milch- halten, die so eine bessere Lagerstabilität aufweisen, proben in ihrem Aussehen bereits etwas verändert io Die runden Filterpapiere oder Tabletten sollen kleiner haben. als die Querschnittsfläche des Gefäßes sein, damit sie

Das die Sporen enthaltende Agar-Nähnnedium beim Aufliegen auf dem Agar-Nährmedium den Luftläßt man in senkrecht aufgestellten Gefäßen fest zutritt nicht wesentlich behindern, was das Diffusionswerden. Um zuverlässige Untersuchungsergebnisse zu bild in der Agarschicht beeinflussen würde. Die vererhalten, haben diese Gefäße eine vorgegebene Größe. »5 wendeten Nährstoffe sollen wenigstens eine dem ver-Das erfindungsgemäße Verfahren ist sogar bis zu wendeten Stamm angepaßte assimilierbare Kohleneinem gewissen Grad quantitativ, wenn es unter be- stoff- und Stickstoffquelle enthalten, am besten iu stimmten Bedingungen durchgeiührt wird. Das Anti- Form von Glucose und Pepton. Der mittels den biotikum diffundiert in das Agar-Nähnnedium, in Filterpapieren oder den Tabletten zugegebene Nährdem seine Konzentration mit zunehmender Eindring- ao stoff enthält gegebenenfalls den Indikator und/oder tiefe abnimmt. In der Zone des Agar-Nährmediums, eine Puffersubstanz.

in der die Konzentration des Antibiotikums unter Nach dem Aufbringen der Nährstoffe auf die Obereinem bestimmten Wert liegt, kann sich der Mikro- fläche der Agarschicht wird eine vorgegebene Menge Organismus vermehren, so daß der gegebenenfalls im der zu untersuchenden Flüssigkeit, im allgemeinen Agar-Nährmedium anwesende Indikator seine Farbe as Milch, oder des zu untersuchenden Fleisches zum Inändert. In der Zone, in der die Konzentration des halt des Gefäßes gegeben. Dies kann unmittelbar Antibiotikums über diesem Wert liegt, wird das nach dem Einbringen der Nährstoffe auf die Ober-Wachstum des Mikroorganismus gehemmt, und der fläche des Agar-Nährmediums oder nach einer vorIndikator ändert seine Farbe nicht. Die Höhe des ausgehenden Inkubationszeit geschehen. Falls die Agar-Nährmediums im Gefäß, beispielsweise dem 30 Nährstoffe in trockener Form zugegeben wurden, Teströhrchen, in dem der Farbumschlag des Indi- kann für die vorausgehende Inkubationszeit etwas kators erfolgt, definiert die Empfindlichkeit des Ver- Wasser oder physiologische Kochsalzlösung zugegeben fahrens. So kann diese Empfindlichkeit durch Stan- werden. Dies hat den Vorteil, daß zwischen dem Zudardisieren der Höhe des im Gefäß verfestigten Agar- geben der Probe im Verfahren und dessen Beendigung Nährmediums festgelegt werden. Diese Maßnahme 35 weniger Zeit verstreicht als beim Arbeiten ohne vorbietet den Vorteil, daß das Verfahren bei einer be- ausgehende Inkubationszeit. Beispielsweise kann in stimmten Höhe des die Sporen enthaltenden Agar- einer Molkerei die Milch, die zur Verteilung an die Nährmediums durchgeführt werden kann, bei der der Verbraucher oder zur Herstellung von Butter, Käse Indikator seine Farbe ändert, wenn die Konzentration oder Joghurt vorgesehen ist, erst nach Feststellung des anwesenden Antibiotikums unter einem gewissen 4° der Abwesenheit von Penicillin oder anderen Anti-Wert liegt, jedoch seine Farbe nicht ändert, wenn die biotika weiter verarbeitet werden. Die nach AnKonzentration des Antibiotikums darüber liegt. Der lieferung der Milch vor ihrer Weiterverarbeitung erDurchmesser des Gefäßes ist am günstigsten 3 bis forderliche Wartezeit bis zum Vorliegen des Unter-20 mm, insbesondere 6 bis 14 mm. Seine Höhe ist so suchungsergebnisses kann durch Arbeiten mit einer bemessen, daß die Gesamthöhe des eingefüllten Agar- 45 vorausgehenden Inkubationszeit im Verfahren ver-Nährmediums und der zu untersuchenden Probe am kürzt werden. Die vorausgehende Inkubationszeit besten 3 bis 30 mm betragen kann. Falls das Ver- beträgt in Abhängigkeit der gegebenen Bedingungen fahren quantitativ durchgeführt wird, wobei aus der bis zu etwa 1 Stunde. Das Verfahren wird noch wirt-Höhe der Zone, in der das Wachstum des Mikro- schaftlicher, wenn während der Zeit, in der die zu Organismus gehemmt wird, quantitative Rückschlüsse 50 untersuchende Milch sich noch auf dem Transport gezogen werden, beträgt die Gesamthöhe des Agar- zur Molkerei befindet, bereits das Verfahren begonnen Nährmediums und der zu untersuchenden Probe am wird.

besten 20 bis 30 mm. Falls das Verfahren dazu dient, Die Inkubationszeit, einschließlich der vorausfestzustellen, ob eine bestimmte Konzentration eines gehenden Inkubationszeit, die vor dem Zusatz der zu Antibiotikums vorliegt oder nicht, beträgt diese Höhe 55 untersuchenden Probe abläuft, hängt von den Beam besten 5 bis 15 mm. dingungen, wie der Art der eingesetzten Sporen, den

Nach dem Beschicken der Gefäße mit einer vor- Nährstoffen und der Temperatur, ab. Bei Verwendung

gegebenen Menge an flüssigem Agar-Nährmedium von Sporen des Bacillus stearotherniophilus var. cali-

werden sie in senkrechter Lage gehalten, damit sich dolactis liegen die Temperaturen für die Inkubation

die Oberfläche des sich verfestigenden Agar->^Tähr- 60 bei etwa 55 bis 70⁰C, insbesondere 60 bis 65°C. Die

mediums senkrecht zur Gefäßinnenwand ausbildet. Inkubationszeiten, die zuverlässige Ergebnisse des

Die Gefäße mit dem verfestigten und die Sporen ent- Verfahrens bringen, betragen etwa l^l/₂ bis 4 Stunden,

haltendem Agar-Nährmedium können verschlossen insbesondere 2 bis 3 Stunden,

werden und so wenigstens mehrere Monate, gegebenen- Obwohl das Verfahren zur Anwendung bei Milch

falls gekühlt, gelagert werden, ohne daß die Sporen 65 entwickelt wurde, dient es auch zur Untersuchung

ihre Lebensfähigkeit verlieren. anderer Produkte, wie Fleisch, beispielsweise in Form

Bei der Durchführung des Verfahrens zum Nach- von kleinen Fleischstiickchen, der aus einer Fleischweis eines Antibiotikums werden zuerst die erforder- probe gepreßten Flüssigkeit oder der von tiefge-

_rorenem und anschließe! akutem Fleisch a,

itimmt werden, was beispielsweise durch Zugatt^ en
sprechender Verbindungen, wie>Jf «$**%$"
reicht wird. Störende **»*
und Seroferin, können durch

^StS^ZÄ^enMi_kroo_rganismen zumNachweis Antibiotika verwendet werden, können das Nährmedium, die Nährstoffe und die Inkubat.onsbedingungen entsprechend angepaßt werden. Die Beispiele erläutern die Erfindung.

SSSö

werden, da sich Antibiotika darin
Untersuchung von unverdünntem ^ ^,,^ _{stearothermop}hiius v.r. _caiidolactis L.M.D. 74.1 wird in ein Med.um folgender

das lOfache nötig. _rf Penicillin

^ΪΪΪΪΠώΑΪΪ vorliegt, kann das .» Verfahien mit zwei Gefäßen durchge*Dhrt werden

das erste Gefäß wird eine Ρ^£Α^35« mit Nährstoffen oder ein mit Nährstoffen getranKieb SSSEfa das zweite Gefäß werden dachen

e jedoch ohne Penicilhnase, gegeben, öei »₅

Verfahrens die gegen Penicil inase nu*» _mnase Penicilline «f»*gv ^^JSf Inaktivatoren des

Destilliertes* Wasser auf 1000 ml

_{20 Minuten ω 12}0°C sterilis.eren _{Nach dem überimpfen wird} das Medium 48 Stunden

bei 60⁰C inkubiert, bis eine gute Sporenbildung be-

_{werden gesamme}i_{tj m},t otagg^ud.^ P^^ ^ ^ ^

q» lebensfähigen Sporen wird durch

u2SÄ.«f einem Medium folgender Zusammen_setzung bestimmt:

_Agar-Nährmedium Difco 0140 ... 20 g

SSS Si

msbesondere 6 bis

₂₀ Minuten bei 120⁰C stenlisieren

3 bis 30 mm.

<_{tetilliertm W}as«r w„d eine ft-.ion der

Btek eine» durchscbetaento hd A™^'

Btek ein e

einen entsprechenden A™^' ™"> _Λ mehrere zugefügt:

e *.

_werden die ^jS^^lSlfä. ₅₅ werden die Teströhrchen bei 4° C gelagert.

is Agar-Nährmedium dazu, sich Herstellung der Nährstoff-getränkten Filterpapiere _zu lösen. Dem kann dmch Zu- _Nährstoffkombination folgender Zusammen

g^bVemes klebrigen »J« tooS^itaι Ä setzung wird hergestellt: oder Hemmstoff 8g|» _{Zusätze gind 6o} Bromkresolpurpur werden in

begegnet «etoWP"«_{w nnd teilweise} ^_{4 Fett}. W ^ ^ _n._NaOH ^₆St und mit

Sorbitan- de*stilUertem Wasser, auf gefüllt auf 25 ml

50 g

50ml

.... 34 g

: 6g

100 ml

609508/4

S31

Die Gemische (a) und (b) werden über ein Seitz-Filter, das Gemisch (c) durch 30minütiges Erhitzen auf 11O⁰C sterilisiert, (c) bleibt eine Suspension. Anschließend werden 5 Teile (a), 2 Teile (b) und 3 Teile (c) gemischt und jeweils 0,04 ml des erhaltenen Gemisches auf ein rundes Filterpapier von etwa 8 mm Durchmesser gebracht, das anschließend getrocknet wird.

Beispiel 2
Durchführung eines Nachweises

Es v.-erder. Proben ir.it den Konzentrationen 0,1, 0,03, 0,01, 0,003 und 0,001 IE Penici IHn-G pro ml in frischer Kuhmilch sowie eine Probe dieser Milch ohne Penicillin-G zu einem Vergleichsversuch hergestellt. Gemäß Beispiel 1 werden 6 Teströhrchen hergestellt, mit je einem nährstoffgetränkten Filterpapier oder einer Nährstoff-Tablette versehen und mit 0,2 ml einer der vorgenannten Proben versetzt. Unmittelbar darauf werden die Teströhrchen in ein Wasserbad von 65° C gebracht und nach 3 und 4 Stunden kontrolliert.

Ergebnis
Vergleichsversuch:

Gelbfärbung der Agarschicht.
Proben mit weniger als 0,01 IE/ml:

Gelbfärbung der Agarschicht.
Proben mit 0,01 und mehr IE/ml:

Violettfärbung der Agarschicht.

Beispiel 3

Vergleich des erfindungsgemäßen Verfahrens
mit bekannten Verfahren

In der nachstehenden Tabelle (Werte in y/ml) ist die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens mit den Empfindlichkeiten bekannter Ver-

fahren zum Nachweis von Antibiotika zusammengefaßt. Bei den bekannten Verfahren handelt es sich um einen Nierentest (Schothorst und P e e 1 e n-Knol, Tijdschr. v. Diergeneesk., Bd. 95 [1970], S. 438 bis 445) und ein deutsches Untersuchungs-

verfahren (Levetzow, Bundesgesundheitsblatt,
Bd. 14 [1971], S. 30 bis 42, sowie Bartels et al., Die Fleischwirtschaft, Bd. 52 [1972], S. 479 bis 482). Das erfindungsgemäße Verfahren wird auf zwei Arten durchgeführt: Zum einen wird es mit den in der nach-

ao stehenden Tabelle angegebenen Antibiotika in einer physiologischen Kochsalzlösung, zum anderen in Milch durchgefühlt, die diese Antibiotika als Verunreinigung enthält.
Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß das erfindungs-

a5 gemäße Verfahren für die meisten der angegebenen Antibiotika empfindlicher ist als der Nierentest. Auch im Vergleich mit dem deutschen Verfahren ist das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafter, da es zum Nachweis von Penicillin empfindlicher ist.

Antibiotikum	ErfindungsgemäDes Verfahren	Nierentest	Modifizierter Nierentest	Deutsches	Verfahren
		S. lutea	S. lutea, 20 ml pro Platte	B. subtilis
	obere untere und obere	40 ml pro
	Grenze in Grenz« in Milch	Platte	pH 6 pH 8	pH 6	pH 8
	physio
	logischer
	Kochsalz
	lösung

1 Natriumsalz des
Penicillins

2 Kanamycin

3 Neomycin

4 Streptomycin

5 Erythromycin

6 Oleandomycin

7 Spiramycin

8 Oxytetracyclin

9 Chlortetracyciin

10 Tetracyclin-HCl

11 Rifamycin

12 Zinkbacitracin

13 Chloramphenicol

14 Nafcillin

15 Furazolidon

16 Sulfamezathin

17 A)

18 Spectinomycin

19 Lincomycin

20 Cloxacillin

A) 200 mg Sulfadorin +

0,004 0,003 — 0,005 0,04 0,02 0,02 0,01 0,01

10 20 — 30 etwa 200 etwa 200 16 3 0,9

2 2 — 8 etwa 600 etwa 400 1 10 0,1

10 18 — 22 80 —100 40 1 1 0,2

0,8 1,5 — 3 1 — 2 0,8 — 1 0,05 20 0,8

5 5 — 10 8 — 10 7 0,05 20 0,2

>10 etwa 150 etwa 100 0,4 >200 2

0,1 0,2 — 0,5 2 — 4 2 etwa 10 0,5 8(7)

0,15 — 0,4 etwa 0,8 0,6 1 0,08 0,4

0,05 0,15 — 0,4 2 — 4 2 >10 0,5 8

0,03 — 0,04 0,03 0,01 0,02 0,02 0,04

0,1 0,2 — 0,4 1 0,6 4 etwa 300 etwa 50C

8 5 — 7,5 5 — 8 4 6 5 8

0,04 0,01—0,02 0,2 0,1 0,1 4 >10

5 7 — 8 etwa 100 etwa 60 >100 1 2

>1000 etwa 2000 etwa 1000 etwa 700 etwa 700 etwa 200

0,6 — 0,8 50S;12T 20S;4T 8S;1,2T 5S;1T 4S;0,8T

4 1 — 7 etwa 1000 etwa 600 30 70 30

0,6 7 — 0,5 etwa 2 1 0,1 500 5

0,003 — 0,004 0,4 0,2 0,4 0,2 0,4 40 mg Trimetropriin.

Claims (5)

genannte TTC-Verfahren (Verfahren mit 2,3,5-Triphertyketrazoliumchlorid), wie das Verfahren nach N e a I et al., J. Dairy Science, Bd. 38 (1955), S. 629 bis 633, und ein Verfahren nach G a 1 e π 1 ο ο t et al., Nei.h. Milk & Dairy J... Bd. 16 (1962V S. 89 bis 95, das auf einem von V i η c e η t et al., Proc. Soc. exp. Biol.. Med., Bd. 162 (1944), S. 55, beschriebenen Verfahren beruht und die Mikroorganismen Bacillus stearothermophilus oder Bacillus calidolactis verwendet, sowie das Verfahren nach J a c ο b s et al., Tijdschr. v. Diergeneesk., Bd. 79 (1972), S. 548 bis 550. Das Verfahren nach G a 1 e s 1 ο ο t et al. wird so du-chgeführt, daß man mit der zu untersuchenden Milch getränkte runde Papierstücke in Petrischalen auf Kulturen des Bacillus stearothermophilus oder Bacillus calidolactis legt, die auf einem Agar-Nährmedium gezüchtet wurden, und 21J2Stunden bei 55° C inkubiert. Das Entstehen von Hemmzonen ist ein Zeichen für die Anwesenheit von Penicillin oder anderer das Wachstum dieser Bakterien hemmenden Verbindungen in der untersuchten Milch. Das Verfahren hat eine Empfindlichkeit von etwa 0,0025 IE Penicillin pro ml, erfordert jedoch zur Durchführung besonders geschultes Fachpersonal, weil frisch gezüchtete Bacilluskulturen verwendet werden müssen. Die Untersuchungsergebnisse sind jedoch verhältnismäßig unzuverlässig, wenn das Verfahren von Laborpersonal ohne spezielle Fachkenntnisse durchgeführt wird. Um die Zuverlässigkeit des Verfahrens nach G a 1 e s 1 ο ο t et al. zu erhöhen, gibt H. Mol in der Zeitschrift Neth. Milk & Dairy J., Bd. 23 (1969), S. 153 bis 162, an, in Petrischalen erhaltene Sporen von Bacillus stearothermophilus var. calidolactis zu verwenden. Dabei wird ein scheibenförmiger Nährboden, der durch Tränken eines Stück Filterpapiers mit einer wäßrigen Lösung von 20% Pepton sowie 20% Glucose und anschließendem Trocknen erhalten wurde, mit der zu untersuchenden Milch getränkt und auf ein Agar-Nährmedium gelegt, auf das vorher die Sporen aufgebracht wurden. Nach 6stündigem Inkubieren der Petrischalen bei 630C kann man an der Bildung von Hemmzonen die Anwesenheit von Penicillin erkennen. Das Verfahren nach Mol ist zwar zuverlässiger als das nach G a 1 e s 1 ο ο t, hat jedoch noch verschiedene Nachteile. Vor allem ist für unerfahrenes Laborpersonal die Hemmzone schwierig zu erkennen. Auch ist das Volumen der untersuchten Probe schlecht reproduzierbar. Ein Nachweisverfahren muß folgende Bedingungen erfüllen:

1. Es muß in kurzer Zeit durchführbar sein.

2. Es soll für einen großen Teil der in der Praxis eingesetzten Antibiotika sehr empfindlich sein.

3. Es soll billig sein.

4. Es soll auch bei Ausführung durch ungeschultes Laborpersonal zuverlässige Ergebnisse liefern.

5. Die Gefäße, welche die für das Verfahren nötigen Substanzen enthalten, sollen mehrere Monate

oder länger lagerfähig sein.

Das Verfahren nach M ο 1 erfüllt bis zu einem

Es sind verschiedene Verfahren zum Nachweis von gewissen Grad die Bedingungen von Ziffer 1, 2, 3 und Restmengen an Antibiotika, wie Penicillin, in Milch 65 5, jedoch nicht die Bedingung von Ziffer 4 und be- und anderen Flüssigkeiten bekannt. Einige dieser Ver- nötigt deshalb zu seiner Durchführung besonders gefahren sind als Standard-Verfahren allgemein aner- schultes Fachpersonal,
kannt. Beispiele für derartige Verfahren sind das so- Aufgabe der Erfindung ist es somit, ein Verfahren

Patentansprüche:

1. Verfahren zum Nachweis von Antibiotika unter Verwendung vol. Sporen eines Mikro-Organismus, der gegenüber dem nachzuweisenden Antibiotikum empfindlich ist, und eines Agar-Nährmediums, wobei das die Sporen, die zu untersuchende Flüssigkeit und das Nährmedium enthaltende Gefäß während einer vorgegebenen Inkubationszeit auf den für das Wachstum des Mikroorganismus optimalen Temperaturbereich erwärmt und durch das Wachstum oder die Wachstumshemmung des Mikroorganismus die Ab- oder Anwesenheit eines Antibiotikums in der untersuchten Flüssigkeit entweder visuell oder durch einen dem Agar-Nährmedium beigegebenen Indikator bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man vor dem Erwärmen des die Sporen, die zu untersuchende Flüssigkeit und ao das Nährmedium enthaltenden Gefäßes während einer vorgegebenen Inkubationszeit auf den für das Wachstum des Mikroorganismus optimalen Temperaturbereich die Sporen des Mikroorganismus in ein Agar-Nährmedium in das Gefäß über- as impft, wobei das die Sporen enthaltende Agar-Nährmedium sich bei senkrechter Lage des Gefäßes verfestigt nat und die Sporen aus Mangel an Nährstoffen nicht keimen, aber noch lebensfähig bleiben, daß man auf die Oberfläche des Agar-Nährmediums die für das Wachstum des Mikroorganismus nötigen Nährstoffe bringt und hierauf, gegebenenfalls nach einer vorhergehenden Inkubationszeit, eine vorgegebene Menge der zu untersuchenden Flüssigkeit zufügt.

2. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einem Gefäß besteht, das Sporen eines Mikroorganismus, der gegenüber dem nachzuweisenden Antibiotikum empfindlich ist, in einem Agar-Nährmedium enthält, wobei das die Sporen enthaltende Agar-Nährmedium sich bei senkrechter Lage des Gefäßes verfestigt hat und die Sporen in das Agar-Nährmedium so überimpft sind, daß sie nach der Zugabe von Nährstoffen und einer Inkubationszeit bei etwa der für das Wachstum des Mikroorganismus optimalen Temperatur in kurzer Zeit so weit wachsen, daß ihr Wachstum entweder visuell oder durch einen dem Agar-Nährmedium beigegebenen Indikator nachweisbar ist, und das Gefäß einen Innendurchmesser, der so klein ist, da£ für das Verfahren möglichst wenig Agar-Nährmedium benötigt wird, aber so groß ist, daß eine Wachstumshemmung des Mikroorganismus nachweisbar ist, und eine eine ausreichende Menge des Agar-Nährmediums und der zu untersuchenden Flüssigkeit aufzunehmen gestattende Höhe aufweist.

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