DE2503627B2 - Verfahren zur analyse von antigenen oder antikoerpern - Google Patents

Verfahren zur analyse von antigenen oder antikoerpern

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DE2503627B2 DE19752503627 DE2503627A DE2503627B2 DE 2503627 B2 DE2503627 B2 DE 2503627B2 DE 19752503627 DE19752503627 DE 19752503627 DE 2503627 A DE2503627 A DE 2503627A DE 2503627 B2 DE2503627 B2 DE 2503627B2
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Description

.15
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen qualitativen Analyse und/oder quantitativen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern mit Hilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion, bei der ein Niederschlag gebildet und die Menge dieses Niederschlages durch Messung der Streuung eines im spitzen Winkel hindurchgehenden Lichtstrahls bestimmt wird.
In den letzten Jahren wurde die Bildung eines Niederschlags durch Reaktion eines Antigens mit einem Antikörper in einem geeigneten Gel ein wesentliches Mittel für die biochemische Analyse. Obwohl solche Reaktionen allgemein bereits Ende des 19. Jahrhunderts beobachtet und kurz darauf bei klinischen Untersuchungen angewandt wurden, sind durch Verfeinerung des Verfahrens in letzter Zeit drei unterschiedliche Gruppen entwickelt worden, nämlich Einzeldifl'usion, Doppeldiffusion und Immunoelektrophorese. Jede Gruppe wird hier nur kurz diskutiert, da diese Verfahren dem Fachmann bekannt sind. Vollständige Beschreibungen findet man z. B. in Veröffentlichungen wie W ο r k, T. S. und W ο r k, E., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 1, 1972, North Holland Publishing Co., Amsterdam.
Für die Einzeldiffusion wird eine Schicht aus einem to Gel hergestellt, enthaltend entweder ein Antigen oder einen spezifischen Antikörper dafür. Da üblicherweise ein Antikörper in dem Gel enthalten ist, wird diese Ausführungsform beschrieben. In dem Gel wird eine öffnung erzeugt und eine Menge des Antigens hineingegeben. Um die öffnung herum bildet sich ein Ring eines Niederschlags, der radial nach außen wandert. Nach einer bestimmten festgelegten Zeit wird der Bereich oder Durchmesser des Rings gemessen. Diese Messung ergibt Daten zur Bestimmung der Antigenkonzentration, und wenn das Antigen unbekannt ist, seine Identität
Die Doppeldiffusion kann in einem Glasrehrchen durchgeführt werden, in das ein Antigen und ein Antikörper in Teile auf gegenüberliegenden Seiten eines üblichen Gelbereichs eingebracht werden. Indem das Antigen und der Antikörper durch das Gel hindurchdiffundieren, bildet sich an der Gleichgewichtsstelle ein Niederschlag und liefert dadurch Daten zur Bestimmung der unbekannten Konzentration und/oder Substanz. Bei anderen Doppeldiffusionsverfahren wird eine Schicht aus einem üblichen Gel angewandt, die so hergestellt worden ist, daß sie öffnungen oder Vertiefungen besitzt, in die das Antigen oder der Antikörper einzeln gegeben werden. Es entsteht eine Linie oder ein Bogen in dem Gel an den Gleichgewichtspunkten der Antigen-Antikörper-Reaktion (den Punkten, an denen das Antigen und der Antikörper zusammentreffen), wodurch man Daten zur Bestimmung aer unbekannten Konzentration oder Identifizierung der unbekannten Substanz erhält.
Es ist auch bekannt, daß man bei derartigen Prä7ipitationsverfahren das Ausmaß der Präzipitation durch Messung der Streuung eines durch den Niederschlag hindurchgehenden Lichtstrahls bestimm!. Nach N. Henning, Klinische Laboratoriumsdiagnoslik, 3. Auflage. 1966. Seite 295, muß der Niederschlag in einer stark verdünnten Lösung gebildet werden, um eine Sedimentation zu vermeiden. Das Präzipitat ist in der gesamten Flüssigkeit gleichmäßig dispergiert und die Trübung der Lösung wird mit Hilfe eines Photometers gemessen. Nach der GB-PS 8 69 483 wird die zu untersuchende (antikörperhaltige) Lösung mit einer antigenhaltigen Lösung überschichtet und die in dem Grenzbereich durch die Präzipitatbildung auftretende Lichtstreuung gemessen, wobei der Lichtstrahl entweder senkrecht oder in einem spitzen Winkel zur Oberfläche der Probe hindurchgeschickt wird.
Das dritte Verfahren, die Immunoclektrophorese, umfaßt die Bewegung von Molekülen in einem elektrischen Feld. Bei diesem Verfahren wird ein elektrisches Potential quer zu der Gelschicht angelegt, um eine Bewegung einer unbekannten Substanz, die sich in einer Öffnung in dem Gel befindet, herbeizuführen. Eine Substanz, die imstande ist, mit der unbekannten Substanz einen Niederschlag zu bilden, wird dann in eine andere Öffnung in das Gel eingebracht. Das entstehende Muster des Niederschlags ergibt Daten zur Bestimmung der unbekannten Konzentration oder Substanz.
Obwohl diese Verfahren genaue Ergebnisse liefern, erfordern sie im allgemeinen verhältnismäßig lange Zeiten, um diese Ergebnisse zu erhalten. Bei der Einzeloder Doppeldiffusion sind mindestens 6 Stunden und üblicherweise Tage erforderlich, um einen Endpunkt zu erreichen. Bei der Immunoelektrophorese sind üblicherweise mindestens 18 Stunden erforderlich, bevor die Bestimmung durchgeführt weiden kann. Es ist offensichtlich, daß diese Zeiten nicht in Übereinstimmung stehen mit der modernen diagnostischen Praxis, bei der möglichst sofortige Ergebnisse erwünscht sind.
Es ist ferner bekannt, daß es bei den bekannten Verfahren, die in einem Gel arbeiten, kritisch ist, daß die Größe und Form der Öffnungen in der Gelschicht genau sind und daß die Reagenzien sorgfältig in diese öffnungen eingebracht werden.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen bzw. Antikörpern zu entwickeln, das einfach durchgeführt werden kann, innerhalb einer kurzen Zeil zuverlässige Ergebnisse liefert und nur geringe Mengen der zu untersuchenden Probe erfordert.
Diese Aufgabe wird, ausgehend von dem eingangs genannten, aus der GB-PS 8 69 483 bekannten Verfahren, dadurch gelöst, daß man die zu untersuchende Lösung, entnaltend einen Teilnehmer der Antigen-Antikörper-Reaktion, auf die Oberfläche eines Gels aufbringt, in dem der andere Teilnehmer der Reaktion in einer Konzentration enthalten ist, die größer ist, als sie dem Äquivalenzpunkt des zu bestimmenden Teilnehmers entspricht, und anschließend den Lichtstrahl durch den Oberflächenbereich des Gels hindurchleitet, in dem der Niederschlag fixiert ist.
Dadurch, daß der in dem Gel vorhandei.e Teilnehmer der Antigen-Antikörper-Reaktion in einem Überschuß gegenüber dem zugesetzter. Reaktionsteilnehmer vorhanden ist, bildet sich beim Aufbringen des zweiten Reaktionsteilnehmers sofort an der Stelle des Auftreffens ein Niederschlag, der in dem Bereich des Gels festgehalten wird, in dem er entsteht und der sich nicht weiter über das Gel ausbreitet. Dadurch erhält man in einem verhältnismäßig kleinen Bereich des Gels den Niederschlag in einer verhältnismäßig hohen Konzentration, so daß geringe Mengen der Probe ausreichen, um gut reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ist eine immunologische Bestimmung in wesentlich kürzerer Zeit abgeschlossen, als es mit Hilfe der bekannten Verfahren möglich ist. Ferner wird die Herstellung des Gels, in dem die Reaktion eintritt, vereinfacht verglichen mit der Herstellung bekannter Gele für immunologische Untersuchungen.
Vorteilhafte Weilerbildungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind in den Patentansprüchen 2 bis 4 beschrieben.
Im folgenden wird die Erfindung anhand der Zeichnung näher erläutert. In der Zeichnung zeigt
Fig. 1 eine halbschematische Ansicht einer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Vorrichtung,
F i g. 2 einen Querschnitt durch die Gelsc'.iicht und das Substrat bei der Vorrichiung nach Fig. 1 entlang der Linie 2-2,
Fig. 3 einen Teil einer halbschematischen Ansicht einer anderen Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und
F i g. 4 ein Diagramm, wie es angewandt wird hei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Bestimmung unbekannter Konzentrationen von IgM (lmmunglobulin-M). Das Diagramm besteht aus einer Gruppe von Kurven für unterschiedliche Konzentrationen von Ziegen-Antihuman-lgM in einem Gel, wobei die Abszisse in Konzentrationseinheiten für Human-IgM und die Ordinate in Mikroampere geeicht ist.
In de^ Fig. 1 und 2 ist ein Substrat 12 gezeigt, umfassend eine glatte Oberfläche 13 und eine reflektierende glatte Unterseite 15. Eine Gelschicht 17 befindet sich in unmittelbarem Kontakt mit der Oberseite 13 des Substrats 12. Die Gelschicht 17 besitzt eine freie Oberseite 21. Das Substrat 12 und die Gelschicht 17 bilden eine Einheit 18.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Einheit 18 auf eine geeignete Unterlage inicht gezeigt) in eine geeignete Stellung zu einer Lichtquelle 25 und einer Lichtmeßvorrichtung 31 gebracht Aus der Lichtquelle 25 trifft ein Lichtstrahl 26 schräg auf die reflektierende Oberfläche 15 auf und wird von dieser durch einen Schnittpunkt 27 mit der
5 Oberseite 21 als reflektierter Lichtstrahl 28 und als gestreute Strahlung 29 reflektiert. Die Lichtmeßvorrichtung 31 besteht aus einer Lichtsammeiröhre 32, einer optisch darauf ausgerichteten Photoröhre 33 und einer Strommeßvorrichtung 34. Die Lichtmeßvorrichtung 31 ίο ist so angebracht, daß die Lichtsammeiröhre 32 sich in einem Abstand von der Oberfläche 21 befindet und optisch auf den Schnittpunkt 27 ausgerichtet ist, wobei der Lichtstrahl 28 nicht stören soll. Das Strommeßgerät 34 besitzt eine geeichte Skala 35.
In Fig. 3 ist eine andere Vorrichtung dargestellt, umfassend ein transparentes Substrat 51 mit einer glatten Oberseite 53. Auf dieser Oberfläche 53 und in unmittelbarem Kontakt mit ihr befindet sich eine Gelschicht 55. Die Gelschicht 55 besitzt eine freie Oberseite 56. Das Substrat 51 und das Gel 55 bilden eine im wesentlichen transparente Einheit 57, die im wesentlichen der Einheit 18 entspricht.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit Hilfe dieser Vorrichtung wird die Einheit 57 auf einen geeigneten transparenten Träger (nicht gezeigt) so aufgelegt, daß sie sich in geeigneter wirksamer Stellung zu einer Lichtquelle 61 befindet. Von der Lichtquelle 61 wird ein Lichtstrahl 62 durch das Substrat 51 und das Gel 55 über einen Schnittpunkt 65 mit der Oberfläche 56 ausgestrahlt, der als verminderter Lichtstrahl 66 und als gestreute Lichtstrahlung 67 austritt. Eine Lichtsammeiröhre 68, die ein Teil einer Lichtmeßvorrichtung (nicht gezeigt) entsprechend der Lichtmeßvorrichtung 31 ist, befindet sich in einem Abstand von der Oberfläche 56 und ist optisch auf den Schnittpunkt 65 gerichtet, wobei der Lichtstrahl 66 nicht stören soll.
Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein erstes Reagenz, das entweder ein Antigen oder ein Antikörper ist, vorzugsweise gleichmäßig in ein geeignetes verflüssigtes Gel eingebracht bzw. darin dispergiert. Für die weitere Beschreibung wird angenommen, daß das erste Reagenz ein Antikörper ist. Es kann jedoch ebensogut ein Antigen sein. Die Art, in der das Reagenz in dem Gel verteilt wird, ist nicht kritisch. Folglich können Laborverfahren, wie sie üblicherweise angewandt werden, um derartige Suspensionen zu erhalten, auch hier angewandt werden, wie Rühren eines Gemisches des verflüssigten Gels und Antikörpers mit der Hand oder mit einem geeigneten Mischer.
Das verflüssigte Gel, in dem der Antikörper dispergiert ist, wird auf einem geeigneten Substrat abgeschieden oder aufgegossen nach bekannten Verfahren und bis zur Bildung eines festen Gels stehengelassen. Auf diese Weise wird die in den Fi g. 1 und 2 gezeigte Einheit hergestellt.
1 Tropfen einer reagierenden Substanz, die ein zweites Reagenz enthalten kann, das mit dem ersten Reagenz unter Bildung eines Niederschlags reagieren !'inn, in diesem Falle ein Antigen, wird dann auf die freie Oberfläche 21 des Gels aufgebracht. Wenn die reagierende Substanz das mit dem Antikörper reagierende Antigen enthält, bildet sich ein teilweise opaker Bereich (der Niederschlag) innerhalb von ungefähr 10 bis 15 Minuten in einem Oberflächenbereich des Gels 17 unter dem Bereich, in dem das reagierende Material das Gel berührt. Die Vorrichtung wird dann in die in F i g. 1 dargestellte Lage gebracht, so daß das Lichtsammeirohr
32 optisch auf den opaken Bereich gerichtet ist. Wenn in dem Berührungsbereich ein Niederschlag gebildet worden ist, wird der reflektierte Lichtstrahl 28 durch diesen Niederschlag gestreut und ein Ausschnitt dieses gestreuten Lichtes wird über die Lichtsammeiröhre 32 in die Photoröhre 33 geleitet, die einen elektrischen Strom erzeugt, der zu dem Licht proportional ist. Dieser elektrische Strom wird mit dem Strommeßgerät 34 gemessen und in Form von Mikroampere (μΑ) auf der Skala 35 angezeigt. Wenn in dem Berührungsbereich kein Niederschlag vorhanden ist, um den reflektierten Lichtstrahl 28 zu streuen, trifft weniger Licht auf die Sammelröhre 32 auf, und folglich zeigt die Skala geringere Werte an.
Offensichtlich werden im wesentlichen die gleichen Verfahrensstufen bei der Fig. 3 angewandt. Die Anwendung dieser Vorrichtung wird daher nicht im einzelnen beschrieben.
Das Diagramm der F i g. 4 zeigt typische Zusammenhänge zwischen den Konzentrationen an Ziegen-Antihuman-IgM (WHO Nomenklatur) in dem Gel für 0,995 mg/ml, 0,68 mg/ml und 0,405 mg/ml und die beobachtete Opazität, ausgedrückt in Mikroampere, für verschiedene bekannte Konzentrationen von Human-IgM in der reagierenden Substanz, wie sie durch das erfindungsgemäße Verfahren bestimmt wurden. Es wurde ein Arbeitsbereich mit einer großen konstanten Steigung für Human-IgM-Konzentrationen bis zu ungefähr 0,40 mg/ml beobachtet. In diesem Arbeitsbereich können unbekannte Antigen-Konzentrationen leicht aus den bekannten Opazitätswerten bestimmt werden. Aus F i g. 4 geht auch hervor, daß bei entsprechend gewählten oder eingestellten Antigen-Konzentrationen der Arbeitsbereich im wesentlichen unabhängig ist von der Antikörper-Konzentration in dem Gel. Es hat sich jedoch gezeigt, daß die Antikörper-Konzentration vermindert werden kann, so daß der Arbeitsbereich auch vermindert wird. Arbeitsbereiche mit großer konstanter Steigung, ähnlich wie sie in F i g. 4 dargestellt sind, wurden auch bei anderen Antigen-Antikörper-Reaktionen beobachtet.
Bei Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur qualitativen Analyse und quantitativen Bestimmung von Haptenen wird als erstes Reagenz ein Antiserum zu einem Hapten-Konjugat, wie Antiserum zu Östriol-Konjugat mit Rinderserumalbumin in dem Gel dispergiert bzw. verteilt. Die Oberfläche des Gels wird dann mit dem Hapten zusammengebracht. Nach einer Reaktionszeit vorzugsweise mindestens ungefähr 5 Minuten wird die Oberfläche mit dem zweiten so Reagenz in Berührung gebracht, das mit dem Antiserum unter Bildung eines Niederschlags reagieren kann. Wenn das Hapten vorhanden ist, sind die damit in Berührung gekommenen Bereiche im wesentlichen frei von Niederschlag und die Menge des gestreuten Lichts wird folglich vermindert Folglich kann die Menge des Haptens ebenfalls durch Messung der Lichtstreuung bestimmt werden.
Das Hapten und das zweite Reagenz können, wenn das gewünscht wird, gleichzeitig mit der Oberfläche des Gels in Berührung gebracht werden. Der entstehende Niederschlag und das gestreute Licht werden proportional der Menge des vorhandenen Haptens vermindert, und die vorhandene Menge kann dadurch durch diese Verminderung bestimmt werden.
Antigene, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert werden können, sind antigenische Proteine, Substanzen mit Antigen-Eigenschaften und Bakterien. Antikörper, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert werden können, umfassen Proteine, die gebildet werden, wenn Tiere mit Antigen-Proteinen immunisiert werden, Substanzen mit Antigen-Eigenschaften oder Bakterien. Solche Antigene und Antikörper umfassen insbesondere z. B. Immunoglobuline wie IgG, IgA und IgM, Haptene, Hormone wie HCG (Humanchoriongonadotropin), Hapten-Konjugate wie Dinitrophenyl-Konjugat mit Rinderserumalbumin, Östriol-Konjugate mit Rinderserumalbumin oder Östriol-Konjugate mit Thyroglobulin, Antigene von E. CoIi und Antikörper oder Antisera dazu.
Das Gel kann hergestellt werden aus einem der vielen gelbildenden Materialien, die für lmmunodiffusionsverfahren geeignet sind. Solche gelbildenden Substanzen umfassen z. B. Agar, Celluloseacetat, Stärkegel, Gelatine, Polyacrylamidgel oder Kombinationen davon. Diese Liste isl nicht erschöpfend im Hinblick auf die große Anzahl von gelbildenden Substanzen, die dem Fachmann bekannt und für das erfindungsgemäße Verfahren geeignet sind.
Mit Agar wird ein verflüssigtes Gel hergestellt mit einer Konzentration von ungefähr 0,5 bis 1 Gew.-% Agar. Geringere Konzentrationen können angewandt werden, aber sie besitzen nicht die gewünschte Festigkeit. Höhere Konzentrationen können ebenfalls angewandt werden, aber sie bilden Gelschichten mit einer höheren Untergrundstreuung des Lichtes. Die Konzentration des ersten in dem verflüssigten Gel dispergierten Reagenzes wird bestimmt mit Hilfe eines Diagramms für das spezielle Reagenz entsprechend der Fig.4. Günstigerweise wird die Konzentration des ersten Reagenzes so gewählt, daß ein sinnvoller Bereich von Konzentrationen für das zweite Reagenz in den Bereich der konstanten Steigung der Kurve fällt. Beispielsweise ist, wenn das zweite Reagenz Human-IgM ist, eine Konzentration von ungefähr 0,4 bis 0.8 mg/ml Ziegen- Antihuman-IgM bevorzugt. Obwohl höhere Konzentrationen angewandt werden können, ist das nicht bevorzugt im Hinblick auf die geringe Zunahme des Teils der konstanten Steigung bei der Kurve verglichen mit der größeren Menge an Reagenz, die erforderlich ist. Man gießt das verflüssigte Gel dann auf das Substrat und läßt es fest werden, wobei die oben beschriebene Einheit entsteht. Bei dieser Kombination kann die Agar-Dicke ungefähr 0,01 bis 2 cm oder darüber betragen und liegt vorzugsweise bei ungefähr 0.01 bis 0,15 cm.
Die auf diese Weise hergestellten Einheiten, die für das erfindungsgemäße Verfahren angewandt werden können, sind nach einem Jahr Lagerung in einer Umgebung mit hoher Feuchtigkeit bei 4 bis 100C noch stabil. Folglich können größere Mengen der Anlyseeinheiten auf einmal hergestellt werden, wobei erhebliche Einsparungen an Personal möglich sind und eine größere Gleichmäßigkeit von Einheit zu Einheit erreicht wird.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren muß das Substrat imstande sein, in physikalisch und chemisch stabiler Weise das Gel zu tragen. Vorzugsweise ist das Substrat teilweise transparent, so daß das Licht zumindest teilweise durchgehen kann. Zum Beispiel kann das Substrat eine Glasscheibe, ein Glasspiegel, eine Plastikscheibe oder ähnliches sein. Ein Substrat das an der Oberfläche, auf die das Gel aufgegossen wird, reflektiert kann - obwohl es nicht transparent ist ebenfalls verwendet werden.
Die Lichtquelle kann irgendeine leicht erhältliche
803
sein, von der bekannt ist, daß sie einen Lichtstrahl geregelter Dimension und im wesentlichen konstanter Intensität ausstrahlt. Der von einer solchen Lichtquelle ausgestrahtle Strahl kann im sichtbaren oder nicht sichtbaren Bereich liegen, je nach den Erfordernissen der Lichtmeßvorrichtung, die bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens angewandt wird.
Bevorzugt wird der Lichtstrahl auf eine reflektierende Oberfläche projeziert. Ein Einfallswinkel von ungefähr 40 bis 60° ist dabei vorteilhaft. Bei einem transparenten Substrat befindet sich die Lichtquelle auf der Seite des Substrats, die der Gelschicht gegenüberliegt und der Lichtstrahl geht durch das Substrat und das Gel hindurch. Beim Durchstrahlen durch das Gel kann ein Einfallwinkel von ungefähr 40 bis 60° für den Lichtstrahl angewandt werden. Natürlich können auch andere Winkel angewandt werden, solange der reflektierte Lichtstrahl und der hindurchgehende Lichtstrahl beim Nachweis des gestreuten Lichtstrahls mit Hilfe der Lichtmeßvorrichtung nicht stören.
Das gestreute Licht kann in bekannter Weise gemessen oder visuell beobachtet werden.
Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Volumen des Reaktionsteilnehmers, das mit der Oberfläche des Gels in Berührung kommt, nicht kritisch. Dieses Verfahren ist besonders günstig, da nur ein Tropfen der reagierenden Substanz, die das zweite Reagenz enthält, erforderlich ist, obwohl auch größere Mengen angewandt werden können. Die geringe Mengen an reagierender Substanz, die erforderlich ist, um derartige Ergebnisse zu erhalten, ist insofern vorteilhaft, da viele Bestimmungen mit einem einzigen Gelsubstrat durchgeführt werden können.
Sollte die Konzentration des zweiten Reagenzes in der reagierenden Substanz die für das erfindungsgemäße Verfahren höchstmögliche Grenze überschreiten, kann die reagierende Substanz verdünnt werden, um eine geeignete Konzentration zu erhalten. In einer üblichen physiologischen (klinischen) Umgebung ist anzunehmen, daß die normalen Immunoglobulin-Bereiche in der als Proben gewonnenen reagierenden Substanz über den geeigneten Bereich für das erfindungsgemäße Verfahren hinausgehen. Folglich ist es günstig, jede Probe mit einer vorher bestimmten festen Menge zu verdünnen, so daß man annehmen kann, daß die Konzentration in den geeigneten Bereich kommt. In der folgenden Tabelle sind geeignete Bereiche zusammen mit den vermuteten normalen klinischen Bereichen und den vorher bestimmten Verdünr ungen angegeben, um Konzentrationen innerhalb der günstigen Bereiche zu erzielen für Human-IgG, Human-Iglv: und Human-IgA.
Tabelle I
IgG
IgM
IgA
2-35
2-30
Arbeitsbereich, 2—30
mg/100 ml
Normaler physio- 600-1500 50-200 50-250 logischer Bereich,
mg/100 ml
Verdünnungs- 1/60 1/6 1/10
verhältnis
Verdünnung 10-25 8-33 5-25
normaler Bereich,
mg/100 ml
Das erfindungsgemäße Verfahren unterscheidet sich deutlich von bekannten Verfahren, indem die zweite reagierende Substanz nahezu vollständig bei der Bildung des Niederschlages verbraucht wird, der sich unerwarteter Weise bildet und in der Oberfläche des Gels verbleibt.
Bei dem erfindungsgemaßen Verfahren wird das erste Reagenz in das Gel in einer Konzentration eingebaut, die größer ist als sie dem Äquivalenzpunkt in dem
ίο Arbeitsbereich des zweiten Reagenzes entspricht. Umgekehrt wird die reagierende Substanz so verdünnt, daß die Konzentration des zweiten Reagenzes geringer ist, als es dem Äquivalenzpunkt im Arbeitsbereich des ersten Reagenzes entspricht.
Der Niederschlag ist innerhalb von ungefähr 10 bis 15 min nach dem Aufbringen des zweiten Reagenzes auf das Gel sichtbar. Reproduzierbare Messungen sind nach nur etwa 30 min möglich, und die Messungen bleiben im wesentlichen konstant innerhalb eines Zeitraumes von mindestens 60 min oder darüber. Diese Zeiten können natürlich verringert oder erhöht werden, indem man die Temperatur des Gels und der Umgebung erniedrigt oder erhöht. Folglich können mit Hilfe des erfindungsgemaßen Verfahrens Meßwerte in kürzeren Zeiten erhalten werden und mit geringeren Probemengen einschließlich des zweiten Reagenzes, als es bisher möglich war.
Die Stärke der Lichtstreuung, die von der Testeinheit herrührt bzw. die Hintergrundstreuung kann leicht bestimmt werden, indem man einen Teil der Einheit, der keine reagierende Substanz enthält, vorzugsweise einen Bereich neben dem Tesibereich, auf dem die reagierende Substanz aufgebracht worden ist, auf die Sammelröhre ausrichtet. Die erhaltenen Messungen können von den Messungen des Testbereichs abgezogen werden um einen korrigierenden Wert zu erhalten. Auf ähnliche Weise kann eine Einheit mit Hilfe von Lösungen bekannter Konzentrationen standardisiert werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der folgenden speziellen Beispiele noch näher erläutert.
Beispiel 1 Bestimmung von Human-IgA:
Eine 1%ige flüssige Agarlösung wurde hergestellt durch Lösen von 1 g Agar (Noble-Agar der Difcc Laboratories) und 0,1 g Natriumazid in 99 ml gepuffer ter Salzlösung (Michaelis' Barbital-Natriumacetat Puf fer pH 7) und Erhitzen des Gemisches unter Rühren bis unmittelbar unter den Siedepunkt.
Lösungen, enthaltend Ziegen-Anti-Human-IgA wurden hergestellt durch Zugabe von IgA-Antiserum (dei Miles Research Products Division) mit einem festge stellten Wert von 2,0 mg/ml Anti-IgA zu der l°/oiger verflüssigten Agarlösung bei 50°C. Dann wurde Pufferlösung zu dem Gemisch gegeben, wobei man eins Endkonzentration von 0,44 mg/ml Anti-IgA (15°/( Antiserum) und 0,7% Agar erhielt Volumina von 1,5 m dieser Lösung wurden dann auf einzelne Glasspiege gegossen, die 0,19 cm dick waren und eine Seitenlang« von 5,1 cm besaßen. Die Geldicke lag zwischen 0,06 unc 0,08 cm. Die Spiegel wurden in einer mit Wassei gesättigten Umgebung aufbewahrt um die Verdamp fung zu verzögern, und auf Raumtemperatur abgekühlt
t)«s Es wurden Antigenlösungen hergestellt durch Ver dünnung von IgA-Standardsera (der Hyland Division ο Travenol Laboratories). Die Sera wurden mit Michaelis Puffer auf die gewünschte Konzentration verdünnt
709 507/42
803
Die Lichtquelle für dieses Beispiel war eine NORMAIODE-H3-Lampe (12 V, 55 W). Das gestreute Licht wurde mit einer RCA-931-A-Photoröhre nachgewiesen und der Strom mit Hilfe eines Kiethley-61OC-Elektrometers.
Für jede qualitative Analyse und quantitative Bestimmung wurde das folgende Verfahren angewandt.
Sechs Tropfen Antigenlösung mit einem Volumen von jeweils 5 μΙ wurden auf die Geloberfläche in Intervallen von 5 min aufgebracht. Die Opazität wurde innerhalb von 15 min für die Lösung mit IgA beobachtet und nach 30 min Messungen durchgeführt. Die beobachteten Meßwerte sind in Tabelle II angegeben.
Tabelle
Beispiel 3 Bestimmung von Human-lgM
Es wurden Gelsubstrate entsprechend Beispiel hergestellt mit der Ausnahme, daß Zicgen-Anti-Hi man-lgM (Antiserum von der Research Division de Miles Laboratories Inc.) in einer Konzentration vo 0,54 mg/ml (20% Antiserum) verwendet wurde anstell von Ziegen-Anti-Human-lgA und IgM anstelle von IgA Man erhielt die in Tabelle IV angegebenen Ergebnisse.
Tabelle IV
Anti-lgM
mg/ml
IgM
mg/100 ml
Opazität μΑ
Anti-IgA-
Konzentration
mg/ml
IgA-Konzentration mg/100 ml
0,44
0,44
0,44
0,44
0,44
0,44
6,1
10,2
20,4
20,1
39,4
52,5
Opazität μΑ
22
38
80 125 170 188
0,54
0,54
0,54
0,54
0,54
0,54
4,0
5,6
10,0
17,0
25,2
32,0
15 20 45 60 95 100
Die beobachteten Meßwerte zeigen, daß mit zunehmender Antigenkonzentration die Opazität zunimmt, d. h. mehr Niederschlag gebildet wurde und mehr Licht gestreut wurde, was zu einer proportionalen Zunahme der gemessenen μΑ führte. Daraus folgt, daß die Menge an gestreutem Licht abhängig ist von der Antigenkonzentration und das Verfahren daher die Grundlage für die quantitative Analyse von IgA darstellen kann.
Beispiel 2 Bestimmung von IgG:
Es wurden Gelsubstrate entsprechend Beispiel 1 hergestellt mit der Ausnahme, daß Ziegen-Anti-Human-IgG (Antiserum erhalten von der Research Division der Miles Laboratories Inc.) in einer Konzentration von 1,61 mg/ml (15% Antiserum) anstelle von IgA-Antiserum und IgG anstelle von IgA verwendet wurde. Man erhielt die in Tabelle III angegebenen Ergebnisse.
Die beobachteten Meßwerte zeigen, daß die Opazität abhängt von der Antigenkonzentration und das Verfahren daher als Grundlage zur quantitativen Analyse von IgM dienen kann.
Beispiel 4
Bestimmung von IgA unter Verwendung eines durch Gelbildung hergestellten Gels
Es wurde eine Gellösung hergestellt, enthaltend 10% Gelatine (D.fco Laboratories) in einer auf einen PM-wert von 7 gepufferten Lösung (Natriumbarbitai, Natnumacetat und HCl in 0,85%iger Salzlösung). Zu je UmI dieser Lösung wurden 0,3 ml Anti-IgA-Serum Hyland) zugegeben. Einzelne Anteile der so hergestellten 20%,gen Antiserumlösung (0,46 mg/ml Antiserum) in einer 8%,gen Gelatinelösung wurden auf Glasspiegel gegossen, mit einer Seitenlange von 5,08 cm und die tinhe.ten mindestens 60 min zur Gelbildung in eine Kammer mit einer Temperatur von 4°C gegeben. Das Gel besaß eine Dicke von 0,06 bis 0 08 cm
Auf getrennte Stellen auf die Gele wurden 5 μ! Tropfen von IgA-Lösungen mit Konzentrationen von
ngl? ml;15'8 mg/10° ml und 7-2 mg/100 ml gegei-Die Abstufung der Opazität wurde beobachtet, und
Tabelle III IgG Opazität
Anti-IgG mg/100 ml uA
mg/ml 52 70
1,61 10,6 120
1,61 153 205
1,61 20,6 250
1,61 20,6 235
1,61 23,1 290
1,61
Beispiel 5
el wurde ein Gel ™t Hilfe von d™ ^ \ergestel't- Zunächst wurden die folgenden 3 Losungen hergestellt
60 Lösung A 1 n-HCI
Tris-(hydroxymethyl)aminomethan Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyläthylendiamin Wasser auf
Die Meßwerte für die beobachtete Opazität zeieen 6s daß die Opazität, d h. das gestreute LichSänglgTon der Antigenkonzentration und daher als Basis Tür d°e quantitative Analyse von IgG dienen kann.
Menge
48 ml 36,6 g 0,23 ml 100 ml
28,0 g
0,735 g 100 ml
803
Lösung C
Aminonium-persulfat
Wasser auf
Es wurde eine Gellösung hergestellt durch Vermischen der folgenden Substanzen:
Menge
Lösung A 0,2 ml
Lösung B 0,4 ml
Anti-IgA-Serum, 2,3 mg/ml 0,2 ml
Lösung C 0,8 ml
Das entstehende Gemisch wurde auf eine transparente Kunststoffplatte aufgegossen. Die Einheit wurde 30 min bei 400C gehalten. Nach dieser Zeit war das Gel fest. Das Gel besaß eine Dicke von ungefähr 0,07 cm.
Bei diesem Beispiel wurde die Lichtquelle unterhalb der Einheit angebracht, so daß der Lichtstrahl nur einmal durch das Substrat und das Gel hindurchging.
Die auf diese Weise hergestellten Einheiten ergaben Abstufungen der Opazität, die im wesentlichen den im Beispiel 4 beobachteten entsprachen, wenn sie mit IgA zusammengebracht wurden.
Menge Die beobachteten Ergebnisse zeigen die Möglichkeit
der Messung der Konzentration kleiner Haptenmolekü-0,14 g Ie (nicht ausfallende Antigenmoleküle) durch ihre
ml Fähigkeit, die normale Entwicklung eines Oberflächen
niederschlags zu verhindern.
Beispiel 6
Qualitative Analyse eines Haptens
durch Hemmwirkung
Beispiel 7
Das Verfahren des Beispiels 6 wurde angewandt mit ίο der Ausnahme, daß Kaninchen-Anti-Östriol anstelle von DNP-Antisera verwendet wurde, östriol wurde als Hapten anstelle von e-DNP-Lysin verwendet und östriol-thyroglobulin als Konjugat anstelle von DNP-BSA.
Die entstehenden Bereiche, in denen die Ausfällung gehemmt war, waren im wesentlichen die gleichen, die in Beispiel 6 beobachtet wurden.
Es wurden Einheiten hergestellt, indem man 2 ml 0,7% Agar (Noble), enthaltend 20% Ziegen-DNP-Antisera (der Miles-Yeda) auf Spiegelscheiben mit einer Kantenlänge von 5,08 χ 5,08 cm auftrug (DNP = Dinitrophenyl).
Man ließ jede Einheit in einer mit Wasser gesättigten Umgebung 30 min auf Raumtemperatur (ungefähr 23°C) abkühlen. Die Dicke des entstehenden Gels betrug 0,06 bis 0,08 cm. 5 μ! Tropfen ε-DNP-Lysin, ein Hapten (der Nutritional Biochemicals Corporation) in Konzentrationen von 0,005 bis 0,02 mg/ml wurden auf die Gele aufgebracht und 5 min stehengelassen. Die gesamte Oberfläche jedes Gels wurde dann mit 0,5 ml einer Lösung von 0,3 mg/ml DNP-BSA-Konjugat (BSA = Rinderserumalbumin) gespült und 5 min reagieren gelassen. Die Einheit wurde vorsichtig mit normaler Salzlösung (0,85%) gespült und in eine Kammer mit konstanter Feuchtigkeit gegeben. Nach 45 min langer Inkubation hatte sich ein allgemeiner Niederschlagsbereich gebildet mit klarem oder halbklarem Bereich, die den Stellen entsprachen, auf die das Hapten aufgebracht war.
Der Unterschied in der Opazität zwischen dem allgemeinen Niederschlagshintergrund und den Stellen mit dem Hapten wurde dann gemessen. μΑ-Unterschiede im Bereich von 28 ± 4 bis 96 ± 3 wurden erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle V angegeben.
Beispiel 8
Qualitative Analyse von HCG
(Human-Coriongonadotrapin)
Lyophilisiertes Antiserum zu HCG (der Nutritional Biochemicals Corporation, Cleveland, Ohio) wurde nach Anweisung der Hersteller verdünnt. Es wurde eine Lösung hergestellt, bestehend aus dem Antiserum, verflüssigtem, 2%igem Agar und mit phosphatgepufferter physiologischer Salzlösung, so daß Endkonzentrationen von 50% Aiitiserum und 0,7% Agar erhalten wurden. Die Lösung wurde auf einen Spiegel abgeschieden und zur Gelbildung gebracht.
1 h nach der Abscheidung wurden auf das Gel 5 μΐ einer Lösung, enthaltend 1 Einheit HCG/ml in gepufferter Salzlösung, aufgebracht. Es wurde ein Niederschlagsfleck in dem Berührungsbereich beobachtet, der einen schnellen und leicht sichtbaren Hinweis für eine Schwangerscnaft gibt.
Tabelle V
Hapten mg/ml
Δ Opazität
μΑ
0,005 23± 4
0,007 46±11
0,01 66±12
0,02 96±13
Beispiel 9
Bestimmung einer speziellen Bakterienart
in einer reagierenden Substanz
Es wurden Einheiten hergestellt durch Abscheiden einer 0,7%igen Agar-Lösung enthaltend 20% E. CoIi Poly A Antiserum auf Spiegel.
E. CoIi Olli : B4 wurde 18 h in 10 ml einer BHI-Nährbrühe inkubiert und die Zellen abzentrifugiert. Die Zellen wurden zweimal mit Salzlösung gewaschen, abzentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit verworfen. Die gewonnenen Zellen, von denen angenommen wurde, daß es etwa 1010 waren, wurden mit 50 μΐ einer gesättigten wäßrigen Lösung von Äthylendiamintetraessigsäure mit einem pH-Wert von 7,0 vermischt und 30 min bis 55° C inkubiert Dann wurden 50 μΐ Lysozymlösung (16 mg/ml in Wasser) zu dem Zellgemisch gegeben und weitere 30 min unter gelegentlichem Rühren inkubiert Nach dem Abkühlen wurden die Zelltrümmer abzentrifugiert Die klare überstehende Flüssigkeit wurde 30 min auf 1000C gehalten, um das Lysozym auszufällen, das abzentrifugiert wurde.
Die klare überstehende Flüssigkeit wurde 1:10, 1 :100 bzw. 1 :1000 verdünnt mit einer wäßrigen Lösung, die mit Phosphatpuffer auf einen pH-Wert von
803
gepuffert war. Anteile von 5 μΐ jeder Verdünnung wurden auf getrennte Bereiche der Geloberfläche aufgebracht und 1 h bei ungefähr 23° C in einer Kammer mit hoher Feuchtigkeit inkubiert. Es wurden Niederschlagsflecke mit abnehmender Opazität in den
Berührungsbereichen für die Verdünnungen 1 : JO bzw. 1 :100 beobachtet. Für den Bereich, der mit der 1 :1000-Verdünnung in Berührung gekommen war, konnten visuell keine Niederschlagsflecken beobachtet werden.
Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims (4)

Patentansprüche:
1. Verfahren zur schnellen qualitativen Analyse und/oder quantitativen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern mit Hilfe einer Antigen-Antikörper-Reaktion, bei der ein Niederschlag gebildet und die Menge dieses Niederschlages durch Messung der Streuung eines im spitzen Winkel hindurchgehenden Lichtstrahls bestimmt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man die zu untersuchende Lösung, enthaltend einen Teilnehmer der Antigen-Antikörper-Reaktion auf die Oberfläche eines Gels aufbringt, in dem der andere Teilnehmer der Reaktion in einer Konzentration enthalten ist, die größer ist, als sie dem Äquivalenzpunkt des zu bestimmenden Teilnehmers entspricht, und anschließend den Lichtstrahl durch den Oberflächenbereich des Gels hindurchleitet, in dem der Niederschlag fixiert ist.
2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß sich das Gel auf und in innigem Kontakt mit einem Substrat befindet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ein Spiegel ist, der auf das Gel zu reflektiert.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3. dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bestimmung der Hintergrundstreuung den Lichtstrahl durch einen zweiten Oberflächenbereich des Gels hindurchschickt, in dem der zu bestimmende Teilnehmer der Antigen-Antikörper-Reaktion nicht enthalten ist.
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