DE2938646C2

DE2938646C2 - Methode zur Bestimmung eines Liganden

Info

Publication number: DE2938646C2
Application number: DE2938646A
Authority: DE
Inventors: Harden M. Stanford Calif. McConnell
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1978-09-27
Filing date: 1979-09-25
Publication date: 1984-02-23
Also published as: GB2034886A; JPS5546189A; JPS6146783B2; DE2938646A1; US4222744A; GB2034886B

Description

Die Erfindung betrifft eine Methode zur Bestimmung eines Liganden, bei dem man einen Liganden in einem Fluid mit

a) einem mit einer fluoreszierenden Substanz markierten Binder oder

b) einem Binder und einem mit einer fluoreszierenden Substanz markierten Bezugsiiganden in Berührung bringt.

Liganderi werden im allgemeinen nach einer Radiotestmethode bestimmt, bei der die Konkurrenz zwischen dem Liganden und einer radioaktiv markierten Form des Liganden für eine begrenzte Zahl von Binderstellen ausgenutzt wird. Wenn beispielsweise eine bekannte Menge einer markierten Form des Liganden, eine bekannte Menge eines Binders für den Liganden und eine den Liganden enthaltende Probe zusammengegeben und bebrütet werden, ändert sich der Prozentsatz der radioaktiv markierten Form des an den Binder gebundenen Liganden umgekehrt mit der Menge des Liganden in der Probe. Nach Abtrennung dps Liganden und des radioaktiv markierten Liganden, die an den Binder gebunden sind, vom Liganden und radioaktiv markierten Liganden, die nicht an den Binder gebunden sind, kann die Menge des radioaktiv markierten Liganden entweder in den gebundenen oder freien Fraktionen oder beiden mit einer Standardkurve verglichen werden, um die Menge des Liganden, der in der Probe vorhander war, zu bestimmen.

Diese Bestimmungen erfordern die Verwendung von radioaktiven Stoffen. Dies ist mit offensichtlichen Nachtellen, beispielsweise Beseitigung von Abfall, Lagerung der Stoffe und Verwendung eines kostspieligen Zählers und dgl., verbunden. Darüber hinaus erfordern Bestimmungen dieser Art die Trennung der gebundenen und freien Teile und sind ferner im allgemeinen zeitraubend.

Es ist auch bereits eine Methode zur Bestimmung von Liganden durch Messung der Fluoreszenz·Polarisation beschrieben, '.vorder: (CHs. Ch^em ^vo' ^iq Nr S [19731 S. 838 bis 844). Die dort beschriebene Bestimmungsmethode erfordert eine Anzahl voneinander abhängiger Faktoren wie z. B. die Brown'sche rotierende Bewegung der fluoreszierenden Moleküle, d'e Empfindlichkeit bezüglich der Veränderung der Molekü/größf; usw. (s. S. 838, rechne Spalte und S. 839, linke Spalte).

Aufgabe der Erfindung Ist somit, el"^ Methode für verbesserte und vereinfachte Bestimmungen von Liganden zu schaffen.

Die Lösung der Aufgabe 1st dem Anspruch 1 zu entnehmen. Sie Ist dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens einen Bereich des Fluids bleicht und die zeitliche Änderung der Fluoreszenz In wenigstens einem

Bereich des Fluids mißt. Der Bestimmung liegt das Prinzip zugrunde, daß die Bewegung von Komponenten im Fluid (Binder und/oder Ligand und/oder Bezugsligand) sich dadurch ändert, daß Ligand und/oder Bezugsligand an de« Binder gebunden werden, d. h. (1) das gebundene Produkt von Ligand und Binder bewegt sich im Fluid mit einer Geschwindigkeit, die von derjenigen des ungebundenen Binders meßbar verschieden ist, oder (2) der ungebundene Bezugsligand bewegt sich im Fluid mit einer Geschwindigkeit, die von derjenigen des gebundenen Produkts von Bezugsligand und Binder mfcBbar verschieden ist, oder (3) das gebunden* Produkt von Bezugsligand und Binder bewegt sich Im Fiu: mit einer Geschwindigkeit, die von derjenigen ^rfes ^-inndenen Produktes von Ligand und Binder iP.eQL.,r ·■-.schieden ist.

Vorteilhafte Ausgestaltungen dt rilridungsgemäßen Methode sind den Ansprüche^Λ 2 ms «6 zu entnehmen. Das Fluid, In dem die Besusc-t -ng durchgeführt wird, ist vorzugsweise eine Flüssigkeit, jedoch könnte das Fluid natürlich auch ein Ge! sein. Der hier gebrauchte Ausdruck »Fluid« bezeichnet somit ein Material in dem der Ligand sowie der Binder und der gegebenenfalls verwendete Bezugsligand zur Bewegung fähig sind.

Die Bewegung des Liganden, des Binders und des Bezugsliganden im Fluid ist die Folge einer Diffusion in Gegenwart und/oder Abwesenheit einer zur Einwirkung kommenden Kraft. In Abwesenheit einer zur Einwirkung kommenden Kraft ist somit die Bewegung von Ligand, Binder und Bezugsligand die Folge einer thermischen Diffusion. Diese Bewegung durch thermische Diffusior. kann durch Einwirkung einer Kraft, beispielsweise einer elektrischen Kraft und/oder einer magnetischen Kraft und/oder einer Gravitationskraft, ergänzt werden. Die Anwendung dieser Hilfsmittel wird nachstehend ausführlicher beschrieben.

In dem Fall, in dem der ungebundene Binder sich in einem Fluid mit einer Geschwindigkeit bewegt, die von der Geschwindigkeit des an den Liganden gebundenen Binders meßbar verschieden ist, wird eine Probe, die den Liganden enthält oder in der der Ligand vermutet wird, einem Fluid zugesetzt, das einen mit einer nachweisbaren Substanz markierten Binder dafür enthält. Ein Ligand, der etwa in der Probe vorhanden ist, birdct sich an den Binder, wodurch die Bewegungsgeschwindigkeit des gesamten markierten Binders im Huid als Folge des Unterschiedes in der Bcwegungsgeschwindigkelt zwischen dem ungebundenen Binder und dem an den Liganden gebundenen Binder verändert wird. Nach Bleichung eines Bereichs des Fluids kann die Anwesenheit des ίο Liganden in der Probe entweder qualitativ oder quantitativ durch Bestimmung der zeitlichen Änderung des markierten Materials, d. h. des markierten Binders (gebunden oder ungebunden) in diesem Bereich des Fluids bestimmt werden.

in dem Fall, In dem ein ungebundener Bezugsligand sich In einem Medium mit einer Geschwindigkeit bewegt, die von derjenigen des an einen Binder gebundenen Bezugsliganden meßbar verschieden ist, wird eine Probe, die den Liganden enthält oder In der der Ligand vermutet wird. In einem Fluid mit einem Binder und einem Bezugsliganden, der mit einer nachweisbaren Substanz markiert Ist, zusammengeführt. Die Anwesenheit des Liganden in der Probe beeinflußt die relative Menge von gebundenem und ungebundenem Bezugsliganden, wodurch wiederum die Bewegungsgeschwindigkeit des gesamten markierten Bezugsliganden (gebunden und ungebunden) als Folge des Unterschiedes In der Bewegung zwischen ungebundenem markierten Bezugsliganden und markiertem BezugsIIganden, der an den Binder gebunden ist, beeinflußt wird. Die Anwesenheit eines Liganden in der Probe kann qualitativ oder quantitativ nach Blelchung eines Bereichs des Fluids durch Bestimmung der zeitlichen Änderung von markiertem Material, d. h. markiertem Bezugsliganden (gebunden und ungebunden) im gebleichten Bereich des Fluids bestimmt werden.

In dem FaIi. in dem ein an einen Binder gebundener Bezugsligand sich in einem Fluid mit einer Geschwindigkeit bewegt, die von derjenigen des an den Binder gebundenen Ligander, meßbar verschieden ist, wird eine Probe, die den Liganden enthält oder in der der Ligand vermutet wird, in einem Fluid mit einem Binder, der mit einer nachweisbaren Substanz markiert 1st, und einem Bezugsliganden zusammengeführt, der in einer Form des Liganden vorliegt, die so modifiziert worden ist, daß das gebundene Produkt von Binder und Bezugsligand sich im Fluid mit einer Geschwindigkeit bewegt, die von derjenigen des gebundenen Produkts von Γ uder urid Ligand verschieden ist. Diese Modifikation des B'zugsllganden kann beispielsweise durch Aufbringen des BezuRSÜganden am einen festen Träger erreicht werden. Die Anwesenheit des Liganden In der Probe beeinflußt die relative Menge von gebundenem und ungebundenem BezugsIIganden im Fluid, wodurch wiederum die Beweguogsgeschwindigkelt des gesamten markierten Binders (an den Bezugsliganden und an den Liganden gebunden) im Fluid als Folge des meßbaren Unterschiedes in der Bewegung zwischen dem an den Liganden gebundenen markierten Binder und dem an den Bezugsliganden gebundenen markierten Binder beeinflußt wird. Die Anwesenheit eines Liganden in der Probe kann qualitativ oder quantitativ bestimmt werden, indem die zeitliche Änderung von markiertem Material, d. h. markiertem Binder (an den Liganden und an den Bezugsliganden gebunden) im gebleichten Bereich des Fluids bestimmt wird.

Die Erfindung ist auf Bestimmungen für die veuchiedcnsten Liganden anwendbar, für die ein geeignetes Bindemittel gefunden werden kann. Beispiele solcher Liganden sind (1) Antigene, die, wenn sie in den Blutstrom eines Wirbeltiers eingeführt werden, die Plldung von Antikörpern verursachen., '2) Haptene. die. wenn sie an einen antlgenen Träger gebunden und in den Blutstrom eines Wirbeltiers eingeführt werden. Antikörper bilden, die für das Hapten spezifisch sind, oder (3) Liganden, die natürlich vorkommende Binder enthalten, die in einer für den Liganden spezifischen Form isoliert werden können, beispielsweise Serumproteine, aus verschiedenen tierischen Organen extrahierte Binder, Sera, Mllchbindemitte! und Binder bakteriellen Ursprungs, z. B. Staphylococcus aureus. der ein Binder für IgG Ist. Es ist ferner zu bemerken, daß der Ligand ein Antikörper oder ein natür-— !ich vorkommender Binder sein k^an" In riiesetn Fall wäre der Binder für den Liganden ein Antigen oder ein Antikörper für diesen Antikörper oder natürlich vorkommenden Binder.

Als repräsentative Beispiele von Liganden, die gemäß der Erfindung bestimmt werden können, selen genannt:

1) Drogen und Arzneimittel einschließlich dta Alkaloide, z. B. Morphin und Heroin, Methadon und seine Analog«, Indolalkaloide, Catechol am ine. Barbiturate, GlutethiiTild, Kokain und seine Metabollten und Analoga, Diphenyihydantoin, Marihuana, Tranquilizer, z. B. Meprobamat, Benzodlazocycloheptane und Phenothiazine.

2) Aminosäuren, Polypeptide, Nucleotide, Nucleoside und Proteine, z. B. ACTH, Oxytocln, lutenlslerendes Hormon, Insulin, Bence-Jones-Proleln, Chorion-Gonadotropln, Gonadotropin der Hypophyse, Wachstumshormon, Renin, Thyroxin bindendes Globulin. Bradyklnln, Anglotensin, den Folllkelsprung stimulierendes Hormon, cycllsches AMP, Cholylglycin, cycllsches GMP usw, 3} Steroide einschließlich der Östrogene, Gestagene, Androgene, AdrenocorUcohormcme. Gallensäuren, kardiolonische Glykoslde. Aglykone sowie Saponine. Ais spezieile Beispiele sind Testosteron. Androsteron. tquilenln. Östron. Östriol. Progesteron. Pregnenolon. H-Hydroxydioxy-cortlcosteron (Verbindung S). Desox!corticosteron. Cortison. Corticosteron. Cortisol. Aldosteron. üigoxln und Oigitoxin zu nennen.

4) Vitamine, z. B. V Hämin A. Vitamine der Gruppe B. Vitamin C. die D-Vitamlne und die Vitamine E und K sowie verschiedene biologische Substanzen, beispielsweise Antikörper, z. B. Penicillin, Tetracyclin, Antigene für virale Hepatitis A und B. Rubella, Herpes Simplex. Alphafetcprotein. T>. T₄. TSH, CEA, Anikörper für N-Gonorrhoe. Dane-Kerne. Viren, von Viren abgeleitete Proteine und Nucleinsäuren und Lipide.

Der hier gebrauchte Ausdruck »Ligand« umfaßt Antigene. Haptene. Substanzen, die natürlich vorkommende Binder aufweisen, sowie Antikörper und die natürlich vorkommenden Binder.

Der Ausdruck »Binder« bezeichnet eine Substanz, die den Liganden bindet, und umfaßt Antigene. Antikörper, natürlich vorkommende Binder und als Reaktion auf Antikörper gebildete Antikörper, z. B. igG-antl-igG.

Dar Ausdruck »Bezugsligand« bezeichnet eine Substanz, die durch den Binder für den Liganden gebunden ist. Der Bezugsligand kann der Ligand oder ein geeignetes Analogem des Liganden sein, das nicht markiert oder mit einer nachweisbaren Substanz markiert oder so modifiziert ist. daß es sich mit einer anderen Geschwindigkeit als der Ligand bewegt Der Bezugsligand kann somit ein Antikörper. Antigen. Hapten oder ein Material mit einem natürlich vorkommenden Binder sein.

Zur Durchführung der Bestimmung ist entweder der Binder oder der Be/ugsltgand mit einer fluoreszierenden Substanz markiert, die durch Licht, vorzugsweise bei Einwirkung geringer Energie bleichfähig ist. Die als Markierung verwendete Substanz darf die immunochemische Reaktion nicht stören, d h sie darf nur minimale Reaktionsfähigkeit mit anderen Stoffen aufweisen. Die Wahl eines geeigneten Materials für die Markierung ist dem Fachmann aufgrund der hier gegebenen Lehren möglich. Als repräsentative Beispiele geeigneter fluoreszierender Stoffe sird Fluoreszein. Aminofluoreszein. Rhodamin. D.A.N.S (l-Dimethylaminonaphthalin-5-suIfonsäure). Ethidiumbromid. N.BD.-Chlorid. Rosamin. Acridinorange und Laserfarbstoffe zu nennen.

Der fluoreszierende Stoff wird als Markierung verwendet, indem man diesen Stoff veranlaßt, sich an den Binder und/oder den Bezugsliganden zu binden, in vielen Fällen bindet sich, wie bekannt ist, das fluoreszierende Material direkt an den Binder oder Bezugsliganden. In anderen Fällen kann der fluoreszierende Stoff in bekannter Weise unter Verwendung eines geeigneten Kuppiungsmittels an den Bezugsliganden oder Binder gebunden werden. Als repräsentative Beispiele geeigneter Kupplungsmittel sind Dialdeh/de. z. B- Glutaraldehyd. Succinaldehyd und Malonaldehyd. Carbodiimide, Diisocyanate, Dlmethyladlpat, Isothlocyanal und Cyanurchlorid zu nennen. Es Ist zu bemerken, daß der Binder und/oder der Bezugsligand mit mehr als einem fluoreszierenden Molekül markiert werden kann, Indem mehrere Stellen beispielsweise durch Anfügen einer Polymerkette, an die eine Vielzahl von fluoreszierenden Molekülen gekuppelt ist, ausgebildet werden. Methoden dieser Art werden z. B. In der US-PS 40 18 530 beschrieben. Als weitere Aiiernative kann eine Vielzahl von fluoreszlerenden Molekülen gebildet werden, Indem solche fluoreszierenden Verbindungen in oder auf einem festen Material. Z. B. Perlen, fixiert werden und der Binder an diese Perlen gebunden wird. Diese Methode kommt besonders dann in Frage, wenn der Binder für die Verwendung bei der Bestimmung auf einen festen Träger aufgebracht ist. Hierauf wird nachstehend ausführlicher eingegangen.

Ein fluoreszierender Stoff kann an einen Binder, beispielsweise einen Antikörper, gebunden werden, indem er an einen Antikörper für den als Binder verwendeten Antikörper gebunden wird, indem man beispielsweise mit dem fluoreszierenden Stoff markiertes IgG-anli-IgG an IgG bindet.

Nach einer zweckmäßigen Methode erfolgt eine fluoreszierende Markierung für einen Binder und/oder Bezugsliganden über eine primäre Amlnogruppe des Binders und/oder Bezugsliganden, der dann mit Fluoreszein, das mit Isothiocyanat derivleri ist, umgesetzt wird. Eine Substanz mi. einer endständigen Zuckergruppe, ζ. Β Dlgoxin, kann durch Öffnen der endständigen Zuckergruppe mit Perjodat und anschließende Umsetzung mit Äthylendiamin mit einem fluorezierenden Stoff markiert werden. Die hierbei erhaltene Schiffsche Base wird mit Borhydrid reduziert, und das hierbei gebildete primäre Amin kann dann mit dem von Isohtiocyanai abgeleiteten Fluoreszein umgesetzt werden.

Nach dem Bleichen eines Bereichs des Fluids unter Einwirkung einer photobleichenden Strahlung wird anschließend die Änderung der Fluoreszenz mit der Zeit gemessen, die von der Bewegung von zusätzlichem fluoreszierendem Stoff in diesen Bereich oder einen Teil des Bereichs abhängig ist. Als Alternative kann man auch die Abnahme der Fluoreszenz mit der Zeit während des Bleichens messen, die von der Bewegung von zusätzlichem fluoreszierendem Stoff in den Bereich abhängig ist. d. h. die Fluoreszenz in dem Bereich nimmt mit einer Geschwindigkeit ab. die niedriger ist als die Zunahme der Bewegungsgeschwindigkeit des fluoreszierenden Stoffs von außerhalb des gebleichten Bereichs in den gebleichten Bereich, oder man mißt die Abnahme der Fluoreszenz in einem benachbarten Bereich, die vor der Bewegung von gebleichtem Material in den benachbarten Bereich abhängt. Wie bereits erwähnt, ist diese Bewegung von fluoreszierendem Stoff die Folge einer Diffusion in Gegenwart oder Abwesenheit einer zur Einwirkung gebrachten Kraft.

Es wurde festgestellt, daß die erneute Zunahme der Fluoreszenz mit der Zeit in dem Bereich der Bleichung mit zunehmender Menge des Liganden im Fluid schwächer wird, da das gebundene Produkt des Liganden und des mit fluoreszierendem Stoff markierten Binders sich mit einer Geschwindigkeit bewegt, die geringer ist als die Bewegungsgeschwindigkeit von ungebundenem Binder, der mit dem fluoreszierenden Stoff markiert ist. Da der Wiederanstieg der Fluoreszenz in dem Bereich mit der Zeit zur Menge des Liganden in einer Probe in Beziehung steht, kann die Anwesenheit des Liganden in der Probe quantitativ bestimmt werden. So kann man einen Standard herstellen, indem verschiedene bekannte Mengen

eines Liganden und eine feststehende Menge des mit einem fluoreszierenden Stoff markierten Binders zusammengegeben werden (die feststehende Menge ist höher als die zur Bfndung des gesamten Liganden erforderliche Menge) uiid anschließend eine Photoblelchung vorgenornmen und der Wlederanstleg der Fluoreszenz mit der Zelt für jc'e der verschiedenen bekannten Mengen des Liganden gemessen wird« Eine unbekannte Menge des Liganden in der Probe kann; dann! bestimmt werden, Indem man Im Fluid die Probe! die den Lifciinden enthält oder in der er vermutet wird, und die feststehende Menge des mit d<:m fluoreszierenden Stoff markierten Binders zusammetigibt. anschließend die Photoblelchung vornimmt und die Fluoreszenzanstieg-Zelt-Bezlehung, d. h die Zeit bis zur Erzielung eines ganz bestimmten Wiederanstiegs der Fluoreszenz oder den erneuten Anstieg der Fluoreszenz nach einer bestimmten Zelt mißt. Die in der Probe vorhandene Menge des Liganden kann dann durch Vergleich mit den vorher bestimmten Werten, d h. dem Standard, bestimmt werden. Als Alternative kann man. wie bereits beschrieben, den Standard erhalten, indem man die Photoblelchung vornimmt und die Abnahme der Fluoreszenz in dem Bereich oder benachbarten Bereich mit der Zelt mißt. Eine unbekannte Menge des Liganden In der Probe kann dann bestimmt werden, indem man die Fluoreszenzabnahme-Zelt-Beziehung, d. h. die Abnahme der Fluoreszenz nach einer bestimmten Zeit oder die Zeit, die bis zu einer bestimmten Abnahme der Fluoreszenz erforderlich lsi. mißt uiiri einen Vergleich mit den vorher bestimmten Werten, d. h. dem Standard, vornimmt.

Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung, bei der die Bewegungsgeschwindigkeit eines Bezugsliganden in einem Fluid durch Bindung des Bezugsliganden an einen Binder meßbar verändert wird, kann ein Ligand wie folgt bestimmt werden: In einem Fluid werden eine Probe, die den Liganden enthält oder in der der Ligand vermui'l wird, ein Binder und ein Bezugsligand. der mit einem fluoreszierenden Stoff markiert Ist. zusammengeführt. Ein Bereich des Fluids wird der Photobleichung unterworfen, worauf die Beziehung zwischen dem Wiederanstieg der Fluoreszenz in dem Bereich und der Zeit bestimmt wird. Die Geschwindigkeit des Wiederanstiegs der Fluoreszenz nimmt dabei mit steigender Menge des Liganden in der Probe zu, da mit steigender Menge des Liganden in der Probe die Menge des an den Binder gebundenen, mit einem fluoreszierenden Stoff markierten Liganden abnimmt. Angesichts der Tatsache, daß der an den Binder gebundene Bezugsligand sich mit niedrigerer Geschwindigkeit als der ungebundene Bezugsiigand bewegt, findet eine Zunahme der Geschwindigkeit des Wiederanstiegs der Fluoreszenz in dem Bereich mit steigender Menge des Liganden statt.

Bevorzugt wird ein Standard hergestellt, indem verschiedene bekannte Mengen eines Liganden mit feststehenden Mengen eines Binders und feststehenden Mengen eines mit einem fluoreszierenden Stoff markierten Bezugsliganden zusammengeführt werden (wobei die feststehende Menge des mit einem fluoreszierenden Stoff markierten Bezugsliganden höher ist als die Menge, die an den Binder gebunden werden kann), worauf eine Photobleichung vorgenommen und die Beziehung des Wiederanstiegs der Fluoreszenz im Bereich zur Zeit für jede der bekannten Mengen des Liganden bestimmt wird. Eine unbekannte Menge des Liganden in der Probe kann ^6ä dann bestimmt werden, indem in einem Fluid die Probe, dies den Liganden enthält oder in der der Ligand vermutet wird, die feststehende Menge des Binders und die feststehende Menge des mit dem fluoreszierenden Stoff markierten Bezugsllganden zusammengeführt werden, worauf eine Pholoblelchung vorgenommen und die Beziehung des Wiederanstiegs der Fluoreszenz Im Bereich zur Zelt bestimmt wird. Die In der Probe vorhandene Menge des Liganden kann bestimmt werden, indem der Wiederanstieg der Fluoreszenz nach einer bestimmten Zeil oder die zur Erreichung eines bestimmten Wiederanstiegs der Fluoreszenz erforderliche Zelt mit den vorher bestimmten Werten für die vorstehend genannten bekannten Mengen des Liganden verglichen wird.

Als Alternative kann, wie vorstehend beschrieben, der Standard durch Photoblelchung und Messen der Fluoreszenzabnahme-Zelt-Beziehung während der Photoblefchung für verschiedene bekannte Mengen des Liganden erhalten werden. Eine unbekannte Menge des Liganden In einer Probe kann dann durch Messen der Fluoreszenzabnahme-Zelt-Bezlehung für diese Probe und Vergleich mit den vorher erhaltenen Werten, d. h. der Fluoreszenzabnahme nach einer bestimmten Zelt oder der bis zur Erreichung einer bestimmten Fluoreszenzabnahme erforderlichen Zelt, bestimmt werden

Bei der Ausführungsform der Erfindung, bei der ein an einen Bezugsllganden gebundener Binder sich In einem Fluid mit einer Geschwindigkeit bewegt, die von der Bewegungsgeschwindigkeit des an einen Liganden gebundenen Binders meßbar verschieden Ist, kann eine Bestimmung eines Liganden vorgenommen werden. Indem man in einem Fluid den Liganden, einen mit einem fluoreszierenden Stoff markierten Binder und einen Bezugsliganden, der so modifiziert worden Ist, daß er sich Im Fluid mit einer Geschwindigkeit bewegt, die von der Bewegungsgeschwindigkeit des Liganden meßbar verschieden ist, zusammenführt, wodurch das gebundene Produkt von Binder und Bezugsligand sich im Fluid mit einer Geschwindigkeit bewegt, die von der Bewegungsgeschwindigkeit des gebundenen Produkts von Binder und Ligand verschieden Ist. Der Bezugsligand kann nach zahlreichen verschiedenen Methoden so modifiziert werden, daß er diese verschiedene Bewegungsgeschwindigkeit aufweist, beispielsweise durch Aufbringen des Bezugsliganden auf einen geeigneten Feststoff, beispielsweise eine Perle. Als Alternative kann der Bezugsligand in dem Fall, in dem die Bewegung durch Einwirkung einer Kraft, beispielsweise einer elek- . trischen Kraft, erfolgen soll, modifiziert werden, indem . auf den Bezugsliganden eine Ladung aufgebracht wird, ■ wodurch der Bezugsligand sich mit einer anderen Geschwindigkeit als der Ligand bewegt. In dem Fall, in dem die Bewegung durch Einwirkung einer magnetischen Kraft erfolgen soll, kann der Bezugsligand an ein geeignetes magnetisches Material gebunden werden, wobei er im Magnetfeld eine Bewegungsgeschwindigkeit erhält, die von derjenigen des Liganden verschieden ist. Ein Bereich des Fluids wird der Photobleichung unterworfen und die Beziehung des Wiederanstiegs der Fluoreszenz in dem Bereich zur Zeit bestimmt. Der zeitliche Verlauf des Wiederanstiegs der Fluoreszenz in dem Fall, In dem der Bezugs'.igand so modifiziert worden ist, daß er sich mit einer niedrigeren Geschwindigkeit bewegt sis der Ligand, nimmt mit steigender Menge des Liganden. »n der Probe zu, da die Menge des an den Liganden gebundenen Binders Im Vergleich zu der Menge des' an;.· den Bezugsliganden gebundenen Binders mit zunehmen- *■ der Menge des in der Probe vorhandenen _# Liganden ' zunimmt. Angesichts der Tatsache, daß der mit einem fluoreszierenden Stoff markierte Binder dann, wenn er an den Liganden gebunden ist, sich mit einer höheren

Geschwindigkeit bewegt als der an den Bezugsliganden gebundene, mit dem fluoreszierenden Stoff markierte Binder, hat eine Zunahme der Menge des Liganden in der Probe eine Zunahme des Wiederanstiegs der Fluoreszenz In dem Bereich mit der Zelt zur Folge. Wiederum kann ein Standard hergestellt werden, Indem man verschiedene bekam te Mengen eines Liganden mit feststehenden Mengen eines mit einem fluoreszierenden Stoff markierten Binders und feststehenden Mengen eines In der vorstehend beschriebenen Weise modifizierten Bezugsliganden zusammenführt, anschließend einen Bereich des Fluids der Photoblelchung unterwirft und die Beziehung zwischen Anstieg der Fluoreszenz in dem Bereich und der Zeit für jede der bekannten Mengen des Liganden bestimmt. Eine unbekannte Menge des Llganden in einer Probe kann dann bestimmt werden. Indem man in einem Fluid die Probe, die den Liganden enthält oder in der der Ligand vermutet wird, die feststehende Menge des mit einem fluoreszierenden Stoff markierten Binders und die feststehende Menge des modifizierten Bezugsliganden zusammengibt, anschließend die Photobleichung vornimmt und den Wiederanstieg der Fluoreszenz in den Bereich mit der Zeit bestimmt. Der Wiederanstieg der Fluoreszenz nach einer bestimmten Zeit oder die Zeit, die erforderlich ist, um einen bestimmten Wiederanstieg der Fluoreszenz zu erreichen, wird dann mit den Werten verglichen, die für die vorstehend genannten bekannten Mengen des Liganden erhalten worden sind, wodurch die in der Probe vorhandene Menge des Liganden bestimmt wird. Wie bereits beschrieben, können als Alternative die Standardproben hergestellt werden, indem ein Bereich des Fluids der Photobleichung unterworfen und die Beziehung zwischen Abnahme der Fluoreszer? in dem Bereich mit der Zeit bestimmt wird, wobei diese Abnahme mit steigender Menge des Liganden in der Probe mit niedriger werdender Geschwindigkeit vonstatten geht, da die Geschwindigkeit der Bewegung des fluoreszierenden Stoffs in den Bereich mit steigender Menge des Liganden zunimmt, weil das gebundene Produkt von Binder, der mit dem fluoreszierenden Stoff markiert ist, und Ligand sich mit höherer Geschwindigkeit bewegt als Jas gebundene Produkt von Binder, der mit dem fluoreszierenden Stoff markiert ist, und Bezugsligand.

Wie bereits erwähnt, kann die Bewegung im Fluid « durch Anlegen eines geeigneten Kraftfeldes, beispielsweise eines elektrischen Feldes und/oder eines Gravitationsfeldes, z. B. Absitzenlassen und Zentrifugieren, und/oder eines Magnetfeldes ausgelöst werden. Beispielsweise kann durch Einwirkung eines elektrischen Feldes auf das Fluid durch Anlegen einer Wechselspannung oder Gleichspannung die Bewegung des Liganden, Binders oder Bezugsliganden in Abhängigkeit von der Ladung, der Ionenstärke des Fluids usw. erhöht werden. Ein solcher elektrophoretischer Effekt stellt ein zusätzli- ^ä5 ches Unierscheidungsmittel zur Durchführung der Bestimmung dar. Die elektrophoretische Spannung kann somit verwendet werden, um die Bestimmungsgenauigkeit zu erhöhen. Beispielsweise wird in Abwesenheit eines jeden Spannungsimpulses eine einzelne, mit einem fluoreszierenden Stoff markierte Substanz im wesentlichen durch zwei Größen charakterisiert, die Empfindlichkeit gegen Bleichung und die Bewegungsgeschwindigkeit, insbesondere die Diffusionskonstante. In Gegenwart eines Spannungsimpulses kann eine mit einem fluoreszierenden Stoff markierte Substanz eine Abhängigkeit von einer angelegten Spannung zeigen. So kann die Bewegung der Substanz im Fluid durch Änderung der Ladung der Substanz verändert werden. Beispielsweise kann In einem Fall, in dem ein Ligand und ein Binder gleiche Dlffusionskoaitanten aufweisen, ein Unterschied in der Bewegungsgeschwindigkeit zwischen dem Liganden und dem Binder erhalten werden, indem die Ladung am Binder verändert wird, wodurch nach Anlegen einer geeigneten Spannung der Binder und der Ligand ohne Rücksicht auf gleiche Diffusionskonstanten Verschiedene Bewegungsgeschwindigkeiten Im Fluid haben. Ebenso kann die Empfindlichkeit einer Bestimmung gesteigert werden, indem der Unterschied in der Bewegungsgeschwindigkeit zwischen einem markierten Bezugsllganden und einem Binder durch Anlegen elektrophoreti scher Spannungen gesteigert wird. Beispielswelse kann sowohl die Bleichung als auch der Wiederanstieg der Fluoreszenz gemessen werden, während elektrophoretische Spannungen angelegt werden, wodurch sich eine geeignete Differenz in der Bewegungsgeschwindigkeit von Binder und markiertem Bezugsliganden ergibt.

Als Alternative könnten elektrophoretische Spannungen nur während des Bleichens angelegt werden, um beispielsweise den Unterschied zwischen Binder und markiertem Bezugsliganden zu steigern. Wenn man beispielsweise auf den Binder eine reine Ladung und auf den markierten Bezugsliganden keine reine Ladung aufdrückt und während des Bleichens ein Wechselstrom feld anlegt, wird der gebundene markierte Bezugsligand in den Bleichbereich und aus dem Bleichbereith getrieben, während dies beim ungebundenen markierten Bezugsliganden nicht der Fall ist. Als Folge der gesteigerten Bleichung des gebundenen markierten Bezugsliganden wird die Geschwindigkeit des Wiederanstiegs seiner Fluoreszenz während des Wiederansliegsleils der Bestimmung (der ohne Wechselstrom feld erfolgt) erniedrigt und die Unterscheidung zwischen gebundenem und ungebunde nem markierten Bezugsliganden gesteigert. Als Alternative könnte das Wechselstrom feld nur während des WIederanstiegstells der Fluoreszenz der Bestimmung angelegt werden, um die Geschwindigkeit des Wiederanstfegs des gebundenen markierten Bezugsliganden *u erhöhen, wodurch gleichzeitig die Unterscheidung zwischen gebundenem und ungebundenem markiertem Bezugsliganden verstärkt wird.

Elektrophoretische Spannungen können auch angewendet werden, um die Probleme störender Substanzen, die im Fluid vorhanden sein können, zu vermeiden. Dies kann durch Einstellung elektrophoretischer Beweglichkeiten, beispielsweise durch Veränderung des pH-Wertes und der Spannungsimpulse in einer solchen Weise, daß eine Unterscheidung von den störenden Substanzen erzielt wird, erreicht werden. Elektrophoretische Wechselspannungen können ebenfalls angewendet v/erden, um eine Unterscheidung gegen Faktoren wie beispielsweise fluoreszierenden Hintergrund oder »Geräusch« zu erzielen, wenn die elektrophoretische Beweglichkeit der nachzuweisenden Hintergrundsubstanz in geeigneter Weise eingestellt wird.

Gemäß einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung kann ein magnetisches Kraftfeld angelegt werden, um die Bewegung der verschiedenen Substanzen, die bei der Bestimmung verwendet werden, zu beeinflussen. Bei Anwendung eines solchen magnetischen Kraftfeldes werden eine oder mehrere der bei der Bestimmung zu vervendenden Substanzen an ein geeignetes magnetisches Material beispielsweise in Form von magnetischen Teilchen oder Perlen gebunden. Beispielsweise könnte eine Bestimmung mit dem auf magnetische Perlen aufgebrachten, mit einem fluoreszierenden Stoff markierten

Binder durchgeführt werden. Dit Anwesenheit des Liganden in der Probe bewirkt Vernetzung der Perlen. % idurch die Bewegungsgeschwindigkeit des fluoreszierenden Stoffs im Magnetfeld verändert wird. Eine Zunahme der Menge des Liganden in der Probe bewirkt einen Anstieg der Vernetzung der magnetischen Perlen, die mit dem mit dem fluoreszierenden Stoff markierten Binder überzogen sind, wodurch sich eine entsprechende Änderung der Beziehung der Fluoreszenzänderung und

In dem Fall, in dem ein Binder und ein mit dem fluoreszierenden Stoff markierter Bezugsllgatid ähnliche oder gleiche Diffusionskonstanten haben, der Binder auf einen festen Träger, ζ. Β. Perlen, aufgebracht werden, wodurch seine Diffusionskonstante verändert wird und hierdurch das gebundene Produkt von Binder und markiertem Bezugsligandeiii mit einer Geschwindigkeit, die von derjenigen des ungebundenen Bezugsliganden, der mit der fluoreszierenden Substanz markiert ISt₁ verschieden ist,

Stoff an den Perlen selbst anstatt an der auf diese Perlen aufgebrachten Substanz vorgenommen werden kann. Diese Substanz wird also auf dem Umweg über die Perlen mit dem fluoreszierenden Stoff markiert Ein magnetisches Kraftfeld kann verwendet werden um die Empfindlichkeit der Bestimmung durch Erhöhen des Unterschiedes in der Bewegungsgeschwindigkeit zwischen einem markierten Bezugsliganden und Binder in einer

Feste Stoffe, ζ. B I' -rleii. können auch verwendet werden, um die Menge des fluoreszierenden Stoffs, der verwendet wird, um eine bei der Bestimmung verwendete

der Zelt In dem gebleichten Bereich ergibt. Es Ist zu io bewegt wird Feste Träger können auch verwendet werbemerken. daß die Markierung mit dem fluoreszierenden den. um die Bestlmmungsempfindüchkeit durch Vergrößerung des I nterschiedes In den entsprechenden Dlffuslonskonsidinen zu steigern. Beispielswelse kann ein BInde·- auf einen festen Träger aufgebracht werden, um den 15 Unierschled /wischen der Diffusionskonstante eines B'nders und Bezugsliganden welter zu vergröbern. Als Alternative kann, wie vorstehend beschrieben, der Bezugsllgand auf einen festen Träger aufgebracht werden, um seine Dlffusionskonstante gegenüber dem Liganden zu

Weise ähnlich der Anwendung von elektrophoretischen 20 verändern, wobei die Bestimmung mit dem markierten Spannungen zu steigern. Beispielsweise kann ein Binder Binder durchgeführt ■■ ird auf magnetische Teilchen aufgebracht und ein Magnetfeld während des Bleichens angelegt werden, um die
Photobleichung des an den Binder gebundenen markierten Bezugsliganden zu verstärke», wobei das Magnetfeld 25 Substan. zu markieren, zu erhöhen. Beispielsweise kann nicht während des Wiederanstiegteils der Bestimmung in einem Fall, in dem ein Binder mit einem fluoreszleangelegt wird, um hierdurch die Wiederanstiegsge- renden Stoff markiert werden soll, eine Vielzahl von schwlndigkelt der Fluoreszenz dv-s gebundenen markier- fluoreszierenden Molekülen auf oder in eine Perle eingeten Bezugsliganden und die Unterscheidung zwischen führt und der BinJer aul diese Perle aufgebracht werden, ungebundenem und gebundenem Bez-igsliganden zu ver- 30 wodurch der Binder mit einer Vielzahl von Molekülen, stärken. Ais Alternative ist es möglich, das Magnetfeld die mit dem fluoreszierenden Stoff markiert sind, versenur während des Wiederanstiegsteils der Bestimmung hen wird Die Verwendung einer solchen Vielzahl von anzulegen, wie vorstehend im Zusammenhang mit der mit dem fluoreszierenden Stoff markierten Molekülen Einwirkung eines elektrischen Kraftfeldes beschrieben. kann die Empfindlichkeit der Bestimmung durch Sen-Durch Anwendung eines solchen Magnetfeldes ergibt 35 kung der Menge des bei der Bestimmung zu verwendensich eine weitere Dimension für die Unterscheidung der den Binders steigern

Bewegung der bei der Bestimmung zu verwendenden Die Bleichung eines Bereichs des Fluids wird vorzugsverschiedenen Substanzen. weise durch Lichteinwirkuvg bewirkt, jedoch ist es auch

Die Bewegung kann auch durch ein Graviationskraft- mögli'-h. die Bleichung in anderer Weise als durch Einfeld, beispielsweise Absitzenlassen, oder durch Anwen- 40 wirkung eines bleichenden Lichtimpulses vorzunehmen, dung einer Zentrifugalkraft beeinflußt werden. Beispiels- Beispielsweise könnte die Bleichung in diesem Bereich weise kann eine der bei der Bestimmung zu verwendenden Substanzen auf einen festen Träger, z. B. Perlen, aufgebracht und die aufgebrachte Substanz im Fluid einer
Gravitationskraft ausgesetzt werden. In einem solchen 45
Fall kann der mit dem fluoreszierenden Stoff markierte
Binder auf geeignete Perlen aufgebracht werden, und die
Anwesenheit des Liganden in einer Probe hat eine Vernetzung der Perlen zur Folge, wodurch ihre Absetige-

schwindigkeit erhöht wird. Die Photobleichung wird bei so Abhängigkeit vom Logarithms der Insulinkonzentraeiner Bestimmungsmethode der vorstehend beschriebe- lion.

nen Art in einem senkrecht angeordneten Probengefäß Fig. 4 ist eine graphische Darstellung des Wiederan-

durchgeführt, wobei der photogebleichte Bereich sich in stiegs der Fluoreszenz in einer bestimmten Zeit für einem unteren Teil des Gefäßes befindet. Mit steigender Gemische von Fluoreszein und mit Fluoreszein markier-Menge des Liganden in der Probe steigt der Vernetzungs- 55 _tem Antikörper.

grad der Perlen, die mit dem mit dem fluoreszierenden Fig. 5 ist eine graphische Darstellungder Zeit bis zur

Stoff markierten Binder umhüllt sind, wodurch ihre Sinkgeschwindigkeit erhöht und dadurch der Wiederanstieg der Fluoreszenz im photogebleichten Bereich mit der Zeit beschleunigt wird. Die Anwendung eines Gravitationskraftfeldes ergibt somit eine weitere Dimension zur Veränderung der Bewegung der bei der Bestimmung verwendeten Substanzen im Fluid.

Es ist ferner zu bemerken, daß die Bestimmung mit
einer der auf einen festen Träger aufgebrachten Substan- 65 rnenhang mit einer Methode beschrieben, bei der die zen durchgeführt werden kann, ohne ein Kraftfeld zur Bewegung durch thermische Diffusion verursacht und Einwirkung zu bringen, wodurch die Bewegung durch die Bestimmung unter Verwendung eines Binders una thermische Diffusion ausgelöst wird. Beispielsweise kann eines mit einem fluoreszierenden Stoff markierten

elektrisch erfolgen.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Abbildungen näher erläutert.

Fig. 1 zeigt ein vereinfachtes Schema eines Nachweissystems für die Durchführung einer Bestimmung gemäß der Erfindung.

Fig. 2 und Fig 3 sind graphische Darstellungen des Wiederanstiegs der Fluoreszenz in bestimmten Zelten in

Erreichung eines Wiederanstiegs der Fluoreszenz um 5(K für Gemische von Fluoreszein und mit Fluoreszein markiertem Antikörper.

Fig. 6 Ist eine theoretische Standardkurve für eine Bestimmung des Wiederanstiegs der Fluoreszenz nach Photobleichung für T₄ im Vergleich zu einer T₄-Radiolmmuntest-Standardkurve.

Das Bestimmungssystem wird nachstehend im Zusani-

Bezugsliganden durchgeführt wird. Bei einer solchen Bestimmung werden, kurz gesagt, der Probenligand, der mit einem fluoreszierenden Stoff mark^:erte Bezugsligand und ein Binder in Lösung gemischt, worauf während einer genügenden Zeit und mit Licht von genügender Intensität bestrahlt w*rd. um Bleichung (irreversible Photozersetzung) des fluoreszierenden Markierungsstoffs im bestrahlten Bereich /u verursachen. Dieser Bereich wird dann auf Fluoreszenz mit einem Lichtstrahl so überwacht, daß keine weitere oder nur eine zu vemachlässi- t'sade Bleichung stattfindet Die Überwachung oder Abtastung in einer solchen Weise, daß keine weitere oder nur eine unwesentliche Bleichung erfolgt (nachstehend als Nichtbleichung bezeichnet), kann mit Licht von geiingerer Intensität und/oder Licht von ähnlicher oder gleicher Intensität während einer kürzeren Zeit so erfolgen, daß keine Bleichung verursacht wird. Die Fluoreszenz steigt wieder mit der Zeit als Folge einer thermischen Diffusion des fluoreszierenden Markierungssioffs in Form des mit dem fluoreszierenden Stoff markierten Bezugsliganden, der an den Binder gebunden ist. und des mit dem fluoreszierenden Stoff markierten Bezugsliganden, der ungebunden ist. in den Lichtstrahl. Die Geschwindigkeit des Anstiegs der Fluoreszenz ist abhängig vom Verhältnis von ungebundenem Bezugsliganden zu gebundenem Bezugsliganden, weil der größere Komplex des gebundenen Bezugsliganden langsamer als der ungebundene Bezugsligand diffundiert. Daher kann die Slar'lardkurve des Wiederanstiegs der Fluoreszenz nach einer bestimmten Zeil oder die Zeil bis zu einem bestimmten Wiederanstieg der Fluoreszenz in Abhängigkeit von der Konzentration des Probenliganden konstruiert werden, und aus dieser Kurve kann die Konzentration unbekannter Ligandenproben bestimmt werden.

Jn Fig. 1 ist eine Strahlungsquelle. z.B. eine Lichtquelle zur Erregung der Wellenlänge des bei der Bestimmung verwendeten fluoreszierenden Materials in einer solchen Weise, daß das Material fluoresziert, dargestellt. Die Lichtquelle ist insbesondere als Laser, z. B. als Argonionenlaser dargestellt, der einen Lichtstrahl erzeugt. Dieser Laser ist mit der Bezugsziffer 10 bezeichnet. Im Gang des Lichtstrahls aus der Lichtquelle IO ist eine optische Baugruppe II angeordnet, die eine oder mehrere Linsen zum Bündeln des Lichts aus der Lichtquelle 10 enthalten kann, das durch den Verschluß 12 auf einen Probenhalter, z. B. eine Küvette fällt, die allgemein mit 13 bezeichnet ist. Die Vorrichtung ist so ausgebildet, daß die Lichtquelle nur einen begrenzten Bereich einer Probe im Probenhalter 13 bestrahlt.

Ein Photodelektor. beispielsweise eine Photovervielfacherröhre 14. wandelt die Amplitude des vom erregten fluoreszierenden Material im Probenhalter 13 emiltierten Lichts in ein proportionales elektrisches Signal, z. B. Ströme, um. Der Ausgang der Photovervielfacherröhre 14 ist über ein Photometer 21 und einen Signalaufbereiter fclonal rntrdltInnprl 71

^inprn Ληα1ησ-ΓΜσ11α1-ΙΙπιε/>1-Im Betrieb werden beispielsweise sin Ligand, ein mit einem fluoreszierenden Stoff markierter Bezugsligand und ein Binder in einem Fluid in den Probenhalter 13 gegeben. Der Mikroprozessor öffnet den Verschluß 12, um einen Lichümpuls zu emittieren, der ein nicht bleichender Lichtimpuls (Abtastimpuls) ist, um die Menge des fluoreszierenden Stoffs im bestrahlten Bereich vor dem Bleichen zu messen. Der Umsetzer 15 wandelt den von der Photovervielfacherröhre 14 erhaltenen Strom in eine Zahl für den Computer um. Ein zweiter Lichtimpuls, dessen Dauer genügt, um Lichtbleichung von fluoreszierendem Material im Testbereich zu bewirken, wird dann ausgelöst, um die Lichtemission in diesem Prüfbereich zu verringern. Es ist nicht notwendig, die Lichtbleichung während eines Zeitraums vorzunehmen, um die gesamte Lichtemission zu löschen. Der Lichtsl^r 'hl wird auf eine geringe Größe und hohe Intensität fokussiert, um die Lichtbleichung im Testbereich zu bewirken. Vorzugsweise wird die Bleichung mit möglichst kurzer Bleichzeit vorgenommen, um im wesentlichen keine Diffusion während des Bleichens zu erhalten. Anschließend wird der Verschluß in vorbestimmten Zeitabständen während einer vorbestimmten Dauer geöffnet, und die Photovervielfacherröhre 14 mißt die aus diesem Bereich und zu diesem Zeitpunkt emittierte Lichtmenge, die in ein proportionales elektrisches Signal umgewandelt wird. Der Umsetzer 15 wandelt diese elektrischen Impulse in Zahlen um, die in den Computer 16 eingegeben werden. Der Computer ermSglicht eine optische Anzeige des Wiederanstiegs der Fluoreszenz zu einer beliebigen Zeit t wie folgt:

R. = P> - P»

P. - P»

Hierin bedeuten

R, der Wiederanstieg der Fluoreszenz zur Zeit /,

P, ein Signal, das die Lichtmenge im Testbereich zur Zeit / darstellt,

P, ein Signal, das die Lichtmenge im Testbereich unmittelbar vor der Lichtbleichung darstellt, und

P₅ ein Signa!, das die Lichtmenge im Testbereich unmittelbar nach der Lichtbleichung darstellt.

A!s Fo!°e eier thermischen Diffusion

zer verbunden, der schematisch allgemein bei 15 dargestellt ist und die Ströme in Zahlen umwandelt, die in einen Computer eingegeben werden, der allgemein bei 16 dargestellt ist und für die Ausiesung dieser Zahlen nach Bedarf eingerichtet ist. Die PhoiovervieJfaefterröhre 14 kann als Alternative auch mit einem System für die optische Anzeige des Ausgangs, z. B. einem Kathodenstrahloszilloskop 17 vom Speichertyp verbunden sein, um eine optische Auslesung zu erhalten. Sowohl der Analog-Dlgltal-Umsetzer 15 als auch der Verschluß 12 werden durch einen Mikroprozessor, der schematisch allgemein bei iS angedeutet 1st, betätigt.

zunehmende Mengen des fluoreszierenden Stoffs in den Testbereich, wodurch jeder anschließende Abtastimpuls während der Länge des Tests zur Folge hat, daß eine zunehmende Lichtmenge zur Photovervielfacherröhre 14 emittiert wird. In dieser Weise mißt die Photovervielfacherröhre 14 die Beziehung zwischen dem Wiederanstieg der Fluoreszenz im Testbereich und der Zeit, wobei diese Beziehung von der Geschwindigkeit der thermischen Diffusion des gesamten mit dem fluoreszierenden Stoff markierten Bezugsliganden im Fluid, d. h. sowohl des fuihunyLiriert öle <nn*h Hac traten I_lö-i«/lart dar mil Ajam fluoreszierenden Stoff markiert ist, abhängt Als Folge der Konkurrenz zwischen dem mit dem fluoreszierenden Stoff markierten Liganden und dem Liganden für die begrenzten Binderstellen hat eine Steigerung der Menge des Ltganden Im Fluid eine Abnahme der Menge des an den Binder gebundenen, mit dem fluoreszierenden Stoff markierten Bezugsliganden zur Folge, wodurch die DIffusionsgeschwlndlgkelt des gesamten, mit dem fluoreszierenden Stoff markierten Gezugsllganden In der Probe erhöht wird. Dies wird als Zunahme der Geschwindigkeit des Wfederanstlegs der Fluoreszenz im Testberelch erfaßt.

Somit kann eine Bestimmung eines Liganden ausgeführt werden, indem man ein Fluid, das eine feststehende Bindermenge, eine feststehende Menge des mit fluoreszierendem Stoff markierten Bezugsliganden und eine bekannte Menge des Liganden enthält, in den Probenhalter gibt. Der Testbereich wird zunächst einem Bleichimpuls während, einer feststehenden Zeit ausgesetzt. Hierauf folgen Abtastimpulse während einer feststehenden Zeitdauer in bestimmten Zeitabständen, wobei die Fluoreszenz im Testbereich zu diesen Abtastzeitpunkten durch die Photovervielfacherröhre 14 erfaßt wird. Der Computer 16 gibt dann eine optische Anzeige der Beziehung des WiederansJiegs der Fluoreszenz im Testbereich und der Zeit. Der Verfahrensgang wird mit verschiedenen bekannten Mengen des Liganden wiederholt, wodurch Informationen über die Beziehung zwischen dem Wiederanstieg der Fluoreszenz und der Zeit für jede dieser bekannten Mengen des Liganden gewonnen werden. Diese Information kann dann als ein häufig als Standardkurve bezeichnetes Diagramm graphisch dargestellt werden, wobei diese Beziehung zweckmäßig als Wiederanstieg der Fluoreszenz, der zu einem bestimmten Zeitpunkt erreicht ist, in Abhängigkeit von der Konzentration des Probenliganden oder als Zeil, die erforderlich ist, um einen bestimmten Wiederanstieg der Fluoreszenz zu erreichen, in Abhängigkeit von der Konzentration des Probenliganden aufgetragen wird.

Beispielsweise kann die in einer Serumprobe vorhandene Menge des Liganden dann bestimmt werden, indem die Serumprobe, die in geeigneter Weise verdünnt worden ist. um etwaige Viskositätseffekte auf die thermische Diffusion stark zu verringern, mit der feststehenden Menge des mit dem fluoreszierenden Stoff markierten BezugsIigLiiden und der feststehenden Menge des Binders zusammengeführt wird, worauf die Bleichung während der feststehenden Zeit und Abtastimpulse in den feststehenden Zeiiabstänüen mit einer bestimmten Impulsdauer folgen. Der Wiederanstieg der Fluoreszenz nach einer bestimmten Zeil oder die Zeit, die erforderlich ist. um einen bestimmten Wiederanslieg der Fluoreszenz zu erreichen, wird dann bestimmt und mit der Stundardkurve verglichen, um die in der Serumprohe vorhandene Menge des Liganden zu ermitteln.

Die Methode wurde vorstehend in Verbindung mit einer Ausführungstorm beschrieben, bei der ein mit einem fluoreszierenden Stoff markierter ßezugsligand und ein nicht markierter Binder verwendet werden, jedoch ist zu bemerken, daß diese Methode auch auf die vorstehend beschriebenen anderen Ausführungsformeti anwendbar ist. bei denen beispielsweise eine Bestimmung so unter Verwendung nur eines mit dem fluoreszierenden Stoff markierten Binders durchgeführt wird, oder bei denen eine Bestimmung mil einem mit einem fluoreszierenden Stoff markierten Binder und einem Bez".gsliganden. der so modifiziert worden ist, diß er sich im Fluid mit einer anderen Geschwindigkeit als der Ligand bewegt, durchgeführt wird.

Die Methode wurde vorstehend in Verbindung mit der Verwendung von Abtastimpulsen anschließend an die Lichtbleichung in vorbestimmten Zeliabsiänden beschrieben, jedoch kann sie auch mit einem auf die Lichtblelchung folgenden einzelnen, nichlblelchenden Impuls durchgeführt werden, der während eines vorbestimmten Zeltraums aufrecht erhalten wird, d. h. die aus dem Teilbereich emittierte Lichtmenge würde ständig wahrend der Impulspertode überwacht, wodurch eine Anzeige des Wiederanstiegs der Fluoreszenz während dieses Zeltraums erhallen würde. Es ist jedoch zu bemerken, daß die Anwendung mehrerer Abtastimpulse in vorbestimmten Zeitabständen bevorzugt wird, da die Genauigkeit der Bestimmung hierdurch gesteigert wird.

Es ist auch möglich, die Abnahme der Fluoreszenz im Testbereich während der Lichtbleichung anzuzeigen. Die Lichibleichung kann dabei durch einen einzelnen Lichtbleichimpuls oder durch Verwendung mehrerer Lichtbleichimpulse in vorbestimmten Zeilabständen bewirkt werden.

Die Testmethode wurde vorstehend im Zusammenhang mit der Verwendung eines einzelnen Lichtstrahls beschrieben, jedoch können auch mehrere sicher Lichtstrahlen zur Anwendung kommen. Ferner wurde die Methode im Zusammenhang mit einem einzelnen Testbereich im Fluid beschrieben, jedoch kann die Methode auch mil mehreren Testbereichen in diesem Fluid durchgeführt werden. Beispielsweise kann eine P^.'je mit einem Gitter bedeckt und die gesamte Probe der Gleichung und den Tastimpulsen in der vorstehend beschriebenen Weise ausgesetzt werden, wobei das Gitter verhindert, daß das Licht Teile der Probe erreicht, wodurch eine Vielzahl von Testbereichen in der Probe ausgebildet wird. Beispielsweise können etwa 50".. der Probe der Strahlung ausgesetzt und etwa 50ⁿc der Probe gegen die Strahlung geschützt werden.

Als weitere Modifikation können die Bieichung und die Überwachung der Fluoreszenz in verschiedenen Bereichen vorgenommen werden. Beispielsweise können parallele benachbarte Lichtstrahlen verwendet werden, um das Bleichen und das Abtasten zu bewirken. In diesem Fall würden die abtastenden Lichtimpulse eine Abnahme der Fluoreszenz im Abtastbereich messen, die die Folge einer Bewegung von gebleichtem Material aus dem der Bleichung ausgesetzten Material in den Abtastbereich ist.

Als weitere Modifikation kann der Bereich der Probe, der der bleichenden Strahlung ausgesetzt wird, eine andere Größe haben als der Bereich der Probe, der der Taslstrahlung unterworfen wird. Beispielsweise kann der Laserstrahl zum Bleichen durch Verwendung geeigneter Optiken einen Durchmesser (D) haben, der größer ist als der Durchmesser (d) des Tastlaserstrahls, wodurch die Wiederanstiegszeit länger würde, da das markierte Material eine größere Strecke (D-d) zurücklegen muß, um dem Tasllirhilmpuls ausgesetzt zu werden. Je größer der Abstand (ü-d), um so besser ist die Unterscheidung zwischen langsamer und schneller Bewegung, wobei einem solchen Wen praktische Grenzen gesetzt sind (Energie des Lasers. Heizeffekte usw.).

Zwar wird oei der vorstehend beschriebenen Ausführungsfc-m die Flüssigkeilsprobe in einem Probenhalter, z. B. einer Küvette, verwendet, jedoch kann die Bestimmung auch in einem resten Medium, z. B. einem Gel. durchgeführt werden. Beispielsweise kann ein Gel. ι. B. ein Polyacrylamidgel oder Agar, mit einem engen Probenloch von beispielsweise 100 μηι Durchmesser versehen und eine geeignete Probe darin so angeordnet werden, daß ein Teil der Probe sich in das Gel bewegt. Bleich- und Tastimpulse können in der vorstehend beschriebenen Weise durch Verwendung eines Laserstrahls, der so gebündelt Ist, daß er durch den Probenbehälter fällt, angewendet werden, wobei Material sich vom Gel in das Probenloch bewegt. Als Alternative kann der Laserstrahl auf einen Bereich des Gels anstatt auf das Probenloch gebündelt werden, wobei die Bestimmung nach den vorstehend beschriebenen Methoden durchgeführt wird mit dem Unterschied, daß die verschiedenen Materlallen sich In einem Gel und nicht in einer Flüssig-

Jceit bewegen. Eis leuchtet ein, daß bei diesen Ausrührungsformen als Testfluid Feststoffe oder Gele verwendet werden müssen, in denen die Materialien sich bewegen können, und wenn das Abtasten und Bleichen in einem Bereich des Gels vorgenommen wird, muß das Gel lichtdurchlässig sein, damit das Bleichen und Abtasten vorgenommen werden können.

Ferner kann die Ausführungsform natürlich auch durch Anlegen eines geeigneten Kraftfeldes in der vorstehend beschriebenen Weise oder durch Aufbringen einer oder mehrerer Substanzen auf einen festen Träger modifiziert werden.

Die Bestimmung kann sehr schnell durchgeführt werden, da die Änderung der Bewegung über sehr kurze Strecken beispielsweise in der Größenordnung von 1 bis 500 pirn erfaßt werden kann. Dies wird durch Bündeln des Lichtstrahls auf einen oder mehrere enge Bereiche erreicht.

Die F.rfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter erläutert.

Beispiel 1

Herstellung von mit fluoreszierendem Stoff -

markiertem Insulin
(mit fluoreszierendem Stoff markierter Bezugsligand)

1 mg riuoreszeinisothiocyanat (FITC) (Sigma Chemical Co.) wurde unter Rühren zu einer Suspension von 100 mg Rinderinsulin in 30 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (^pBS, pH 7,4) gegeben. Die Suspension wurde auf 4° C gekühlt und die Reaktion 1.6 Stunden fortgesetzt. Nach Zentrifugierung wurde der Überstand am Ionenaustauscherharz »Sepriadex G-25« Chromatographien und mit phosphatgepuffcrLr Kochsalzlösung (PBS) eluiert. Nicht umgesetztes FITC blieb an der Säule, und das fluoreszierende Elutionsmittei wurde aufgefangen. Während der Abkühlung bildete sich eine Fällung, aber der Überstand zeigte eine Fluoreszenz-Intensität, die mit 10~* Mol Fluoreszein vergleichbar war. Diese Vorratslösung wurde dann für die immunochemische Reaktion verwendet.

Bestimmung der kompetitiven Bindung

0,2 ml der im Verhältnis von 1 : 250 verdünnten FITC-Insulinvorratslösung (markierter Bezugsligand) und 0,2 ml der entsprechenden unmarkierten Insulinverdünnungen (Ligand) wurden gemischt. Ein aliquoter Teil von Meerschweinchen-anii-RiriderinsuIin (Binder) (Cappe! Laboratories) wurde jeder Probe zugesetzt Die Lösungen wurden verwirbell und dann 2 bis 4 Stunden bei 6° C inkubiert. 10 Minuten vor der Messung überließ man jede Probe der Erwärmung auf Raumtemperatur.

Die Fluoreszenz wurde in einer 1 cm²-QuarzkQvette Wiederanstieg der Fluoreszenz nach bestimmten Zeiten in %

(Insulin)	0,50 Sek.	1,00 Sek.	2,00 Sek.
Mol/l
2.7 X 10-6	0.231	0.313	0.482
2.0 X 10-6	0.183	0.281	0.414
1.0 X ΙΟ"⁶	0.172	0.277	0.39Γ
8 X ΙΟ"⁷	0.170	0.263	0.388
6 X ΙΟ-⁷	0.179	0.244	0.367
4 X ΙΟ-⁷	0.160	0.212	0.322
2 X ΙΟ-⁷	0.148	0.230	0.360
1 X ΙΟ-⁷	0.134	0.195	0.351
5 X ΙΟ-⁸	0.148	0.198	0.301
5 XI0-⁹	0.137	0.187	0.3Gl
	Beispiel	2

Die Bestimmung gemäß der Erfindung wird durch den Fall veranschaulicht, in dem ein Antigen A (Ligand), das mit Fluoreszein markierte Antigen FA (Bezugsligand) und der Antikörper Ab (Binder) gemischt werden, wobei die immunochemische Reaktion wie folgt dargestellt werden kann:

(I) Ab+FA
(2) Ab + A

AbFA AbA

In diesem Fall wird angenommen, daß die Thermodiffusionskonstante des Anlikörpermoleküls, da es größer ist, um eine oder zwei Größenordnungen niedriger ist als die des Antigens und daß die Rückkehr von fluoreszierenden Molekülen in den lichtgebleichten Bereich durch Thermodiffusionsbewegung erfolgt. Beim Gleichgewicht enthält die erhaltene Lösung eine Gleichgewichtskonzentration von AbA, AbFA. A und FA. Tie Fraktion der FA-Moleküle, die »frei« sind, und die Fraktion der FA-Moleküle, die an Antikörper (AbFA) gebunden sind, hängt gemäß der Theorie des elementaren chemischen Gleichgewichts (elementary chemical equilibrium theory) eindeutig von den relativen Mengen von Ab, A und FA ab. Die Menge von A in der unbekannten Lösung steht somit quantitativ in Beziehung zu den Konzentrationen von FA und Ab im ursprünglichen Gemisch, und unter vorgeschriebenen Bedingungen genügt eine Bestimmung des Verhältnisses dieser Konzentrationen für die Bestimmung von A In der unbekannten Lösung. Als Alternative kann die Messung einer beliebigen Eigenschaft des Systems, die quantitativ und monoton zum Verhältnis dieser Konzentrationen in Beziehung steht, als Grundlage für eine Bestimmung von A in der unbekannten

gemessen. Ein Bandfilter ließ nur Emissionswellenlängen von mehr als 525 nm durch. Der prozentuale Wiederanstieg der Fluoreszenz nach der Lichtbleichung (0,13 Sek.-Impuls) wurde nach Verzögerungszeiten von 0.50, 1,00 und 2,00 Sek. gemessen.

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Standardkurven des Wiederanstiegs der Fluoreszenz nach bestimmten Zeiten in Abhängigkeit vom Logarithmus der Insulinkonzentration (Ligand) sind in. FIg. 2 und Fig. 3 dargestellt. Alle diese Kurven können verwendet werden, um unbekannte Insulinkonzentretionen In einer Probe zu messen.

f_M(t) sei die normalisierte Wiederanstiegsfunktion nach der Lichtbleichung für FA, und ^₄(O sei die normalisierte Funktion des Wiederanstiegs nach der Lichtbleichung für AbFA, beispielsv. eise

f(t) =

L-U

(3)

^mIn

Hierin Ist L die Fluoreszenz zum Zeitpunkt /, £„,„,· die Fluoreszenz unmittelbar vor der LSchtbleichung und /.,„,„ die Fluoreszenz unmittelbar nach der Lichtbleichung.

Wenn nun die durchschnittliche Lebensdauer der »gebundenen« und »freien« Moleküle im Vergleich zu den Zeiten der Lichtbleichung und des Wiederanstiegs der Fluoreszenz lang ist, lautet die Wiederanstlegskurve im Bestimmungssemisch

fit) = X ff,, (t) + U-X)W* it) <⁴>

worin X die Fraktion der auf diü freien Moleküle zurückzuführenden Fluc-eszenz vor der Bieichung ist.

Gemäß Gleichung (4) ist es möglich, den Wert von X durch Messen des prozentualen Wiederanstiegs der Fluoreszenz nach einer bestimmten Zeit, z. B. < (1 Sek.) und aus vorher gemessenen Werten von ΐ_ΓΛ Π Sek.), d. h. dem Wiederanstieg der Fluoreszenz eine? ProDt. ^<s- nur »freies« markiertes Antigen enthält, a;:d i»_hfA ' Sek.), d. h. dem Wiederanstieg der Fluoreszenz ejrr~· ^r >be, die nur »gebundenes« markiertes Anifg-?. -lühält, zu bestimmen.

Die Gültigkeit des linearen '„bereinanderlegens von Wiederanstiegskurven (Gleichung'; wurde experimenteil nachgewiesen, indem zwei Lösungen in verschiedenen Mengenverhältnissen gemischt wurden, wobei eine Lösung 10~⁸ Mol Natriumfluoreszein in Phosphati^iffer enthielt und FA darstellte, und die andere mit Fluoreszein markierte Antikörper (FITC-IgG> in Phosphatpuffer gelöst enthielt und AbFA darstellte (die zweite Lösung haue die doppelte Intensität der Fluoreszenz wie die erste Lösung). Neun verschiedene Gemische dieser Lösungen wurden hergestellt und die Wiederanstiegskurven nach der Lichtbieichung bestimmt (488 nm-Laserquelle, 60 mm-Fokussierungsiinse, Bleichimpuls 140 Millisekunden, Abtastinipuls 1,4 Millisekunden. Der prozentuale Wiederanstieg bei t=l Sek. wurde gemessen). Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt. Bei einem gegebenen prozentualen Wiederanstieg f (1 Sek.) kann X bestimmt und quantitativ mit der Zusammensetzung der Lösung in Beziehung gebracht weiden. Ebenso bildet eine in Fig. 5 gezeigte graphische Darstellung der für einen 50¹WgCn Wiederanstieg erforderlichen Zeit die Grundlage einer quantitativen Bestimmung. Eine Bestimmung der kompetitiven Bindung wird dann wie folgt durchgefütvt: Eine Lösung, die A in unbekannter Konzentration enthält, wird mit Lösungen gemischt, die gegen A (und FA) gerichtete geeignete Konzentrationen von FA und Ab enthalten. Die Gleichung (4) gilt noch, und X kann aus einer Kurve, wie sie in Fig. 4 oder 5 dargestellt ist, bestimmt werden. Im aligemeinen muß eine empirische Bestimmungskurve, die X und die Konzentration von A in Beziehung bringt, ermittelt werden, so daß die Konzentration von A in der unbekannten Lösung zum beobachteten Wert von X in Beziehung gebracht werden kann. Im einfachen Fall, in dem X dem Bruchteil der FA-Moleküle, die frei sind, gleich ist und 1 -X die Fraktion der FA-Moleküle ist, die als AbFA gebunden sind, ist die Konzentralion A des Antigens in der Lösung

worin F₄ die GesamtkonzentraUon von Antikörperrezeptorstellen ist, gemessen durch die maximale Konzentration von markiertem Antigen FA, das gsh'.'nden werden kann, und K die Dissoziationskonstante for FA (das markierte Antigen) und c„ die Gesamtkonzentration von markiertem Antigen FA ist.

Fig. 6 veranschaulicht die Ergebnisse einer theoretischen Stand?rdkurve für die Bestimmung des Wiederanstiegs der Fluoreszenz nach der Lichtbleichung für T₄ im Vergleich zu einer typischen Standardkurve für RIA. (Bezüglich der RIA-Kurve wird auf das Nachschlagebuch »T₄ Solid Phase Radioimmunoassay Kit (I¹²⁵)«, Becton, Dickinson and Company, März 1978, verwiesen.) Der theoretischen Kurve lagen die folgenden Annahmen zu Grunde: (a) K=IO-¹⁰ lZMol; c =5 χ 10"⁸ MoIZl; F₆ = 2,5 χ 10"⁸ MoIZi; Thermodiffusionskonstante für gebundenes T< = 4 χ 10~⁷ cmVSek. und für freies T₄ = 4x I0"⁶ cmVSek.; gleiche Fluoreszenzeigenschaften von FT₄ und AbFT₄; Laserstrahlradius 40 μτη; Bleichparameter entsprechend 7096 Bleichung.

Hierzu 5 Blatt Zeichnungen

Claims

10 Patentansprüche:

1. Methode zur Bestimmung eines Liganden, bei dem man einen Liganden in einem Fluid mit

a) einem mit einer fluoreszierenden Substanz markierten Binder oder

b) e'nem Binder und einem mit einer fluoreszierenden Substanz markierten Bezugsüganden in Berührung bringt,

dadurch gekennzeichnet, daß man wenigstens einen Bereich des Fluids bleicht und die zeitliche Änderung der Fluoreszenz in wenigstens einem Bereich des Fluids mißt.

2. Methode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Fluid eine Flüssigkeit verwendet.

3. Methode nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, laß man die Messung In einem Bereich innerhalb des gebleichten Bereichs vornimmt.

4. Methode nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bleichen und Messen in benachbarten Bereichen vornimmt.

5. Methode nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Bewegung der Reaktanten im genannten Bereich durch Einwirkung eines Kraftfeldes bewirkt

6. Methode nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet daß der Binder oder der Bezugsligand so modifiziert sind, daß sie sich im Fluid mit einer anderen Geschwindigkeit als der Lieand bewegen.

7. Methode nach Ansprach 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Li^axden mit einem auf einen festen Träger aufgebrachten markierten Binder in Berührung bringt.

8. Methode nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Liganden mit einem auf einen festen Träger aufgebrachten Binder und einem markierten Bezugsliganden in Berührung bringt.

9. Methode nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man den Liganden mit einem markierten Binder und einem auf einen festen Träger aufgebrachten Bezugsiiganden in Berührung bring!.

10. Methode nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man die Bestimmung durchführt, während ein elektrisches Kraftfeld während des Bleichens und/oder Messens angelegt ist.

11. Methode nach Anspruch 1 bis 6 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den Liganden mit einem markierten und auf ein magnetisches Material aufgebrachten Binder in Berührung bringt.

12. Methode nach Anspruch 1 bis ό und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den Liganden mit einem auf ein magneiisuhcs Iviaitiiai aufgebrachter· — Binder und einem markierten Bezugsliganden in Berührung bringt.

13. Methode nach Anspruch 1 bis 6 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß man den Liganden mit einem markierten Binder und einem auf ein magnetlsches Material aufgebrachten Bezugsiiganden in Berührung bringt.

14. Methode nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man das Bleichen mit einem gebündelten Lichtstrahl In einem schmalen Bereich vornimmt.

15. Methode nach Anspruch 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß man als bleichenden Lichtimpuls und Abtastlichtimpuls einen fokussierten Laserstrahl anwendet.

16. Methode nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß man nach dem Bleichen wenigstens einen Bereich Innerhalb des gebleichten Bereichs in zeitlichen Abständen abgegebenen nichtblelchenden Abtastllchtimpuisen aussetzt und die Emission von Fluoreszenzlicht während des Abgebens der AbtastlichHmpulse erfaßt und auf diese Weise die zeltliche Änderung der Fluorezenz innerhalb des genannten Bereichs mißt.