DE2905435C2

DE2905435C2 - Verfahren und Vorrichtung zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern

Info

Publication number: DE2905435C2
Application number: DE2905435A
Authority: DE
Inventors: Shogo Tokorozawa Saitama Enomoto; Masanobu Yamato Kanagawa Sawai; Tadamitsu Sagamihara Kanagawa Sudo
Original assignee: Mitsubishi Chemical Industries Ltd
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1978-02-14
Filing date: 1979-02-13
Publication date: 1984-11-15
Also published as: CH640353A5; GB1598490A; CA1098823A; JPS54108693A; FR2417107B2; US4224304A; NL188962C; DE2905435A1; NL188962B; FR2417107A2; NL7901136A; BE874166R

Description

a) einer Absorptionszelle mit einer Dicke von 0,5 bis 10 mm zur Aufnahme der Reaktionsmischung

b) einem Photometer mit einer Bestrahlungscinrichtung zum Bestrahlen mit Licht mit einer im Bereich von 0,6 bis 2,4 μηι liegenden Wellenlängen,

gekennzeichnet durch eine Einrichtung zur Ermittlung der Änderung der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung bei der gemessenen Wellenlänge in Abhängigkeit von der Reaktionszeit. 18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Absorptionszelle eine Dicke von 1 bis 5 mm aufweist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die das Licht durchlassenden Fenster der Zelle aus transparentem Glas oder einem transparenten synthetischen Harz bestehen, das eine Durchlässigkeit von mindestens 30% für Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μΐη aufweist.

20. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestrahlungseinrichtung monochromatisches oder polychromatisches Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,8 bis 1,8 μιη abgibt.

21. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die Absorptionszelle mit einem Rührer versehen ist.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Bestimmung von An'igenen und Antikörpern durch Umsetzen eines Antigens oder eines Antikörpers oder einer Mischung davon in einem flüssigen Medium

mit unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μίτι, die mit dem entsprechenden Antikörper bzw. Antigen sensiblisiert sind, Bestrahlen der Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2, μπι und Messung der optischen Durchlässigkeit der Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeil.

Es besteht ein ständiges Bedürfnis für ein Verfahren und eine Vorrichtung zur schnellen und genauen qualitativen und quantitativen Bestimmung von biologisch aktiven Substanzen, beispielsweise von Antigenen und Antikörpern, die in extrem geringen [ionzenirationen vorliegen. Es besteht weiterhin ein starkes Bedürfnis dafür, die Anwesenheit von Arzneimittelwirkstoffen in Kö.-perflüssigkeiten festzustellen. Weiterhin ist es für die medizinische Diagnose häufig wichtig, über die Anwesenheit von verschiedenen Substanzen Bescheid zu wissen, die auf natürlichem Wege von dem Körper synthetisiert werden oder die in den Körper eingebracht worden sind.

Bislang ist es bereits bekannt, Antikörper oder Antigene halbquantitativ dadurch nachzuweisen, daß man Latexteilchen, an die man einen Antikörper oder ein Antigen fixiert hat, mit einem entsprechenden Antigen oder Antikörper auf einer Glasplatte umzusetzen und visuell den Agglutinationszustand zu beobachten.

In den letzten Jahren ist in den nachstehend angegebenen Veröffentlichungen vorgeschlagen worden, Antigene und Antikörper unter Verwendung der oben erwähnten Latexieilchen quantitativ zu bestimmen, indem man den entsprechenden Antikörper oder das entsprechende Anigen auf den Latexteilchen fixiert, um den Latex zu sensibilisieren, den auf dem Trägermate ial vorliegenden Antikörper oder das auf dem Trägermaterial vorliegende Antigen mit dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper umsetzt, um die LatexteiJchen zu agglutinieren oder zusammenzuballen, und die Geschwindigkeit der Abnahme der Trübung der überstehenden Flüssigkeit des Latex' mit Hilfe von sichtbarem Licht zu messen, um das Antigen oder den Antikörper unter Ausnützung des Agglutinationsphänomens des als Reagens verwendeten Latex zu bestimmen:

A) CROATlCA CHEMICA ACTA,42 (1970) 457 bis 466 und

B) European Journal of Biochemistry, Vol. 20, N r. 4 (1971) 558 bis 560.

Da die Methode des obigen Vorschlags die Messung der Geschwindigkeit der Trübungsabnahme dazu benützt, das Antigen oder den Antikörper zu bestimmen, ist es erforderlich, einen mit dem Antikörper oder dem Antigen sensiblisierten Latex mit extrem geringer Konzentration, die beispielsweise im Bereich von 0,007 bis 0,028% liegt zu verwenden, die Reaktion des Latex' mit dem Antigen oder dem Antikörper in einem stationären Zustand durchzuführen, irgendwelche Verunreinigungen, die die Trübung der Probe beeinträchtigen könnten, zu entfernen und ähnliche Maßnahmen zu ergreifen. Als Ergebnis davon ist die oben erwähnte Methode nachteilig dadurch, daß die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Rcaktion unvermeidbar vermindert wird, daß sowohl die Präzision als auch die Reproduzierbarkeit der Meßmethode für die Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern ungenügend sind und daß die Abtrennung von Verunreinigungen häufig extrem komplizierte Maßnahmen erforderlich macht. Damzufolge ist es schwierig, die obige Methode zur Bestimmung von Antigenen, wie Fibrinogen (Fg), Humanchoriongonadotropin (hCG) oder ähnliche Materialien zu bestimmen, da komplizierte Maßnahmen zur Herstellung des notwendigen Reagens' erforderlich sind und es schwierig ist, eine reproduzierbare Agglutinationsreaktion der Substanz zu erreichen, wenn sie in Blut oder Urin enthalten ist, das bzw. der verschiedene andere Substanzen enthält, die die Reaktion beeinträchtigen können. In

C) Immunochemistry.Vol. 12(1975)349 bis 351

ist bereits vorgeschlagen worden, Antikörper oder Antigene quantitativ dadurch zu bestimmen, daß man die oben erwähnten agglutinierten Latexteilchen mit einem Laserstrahl bestrahlt und die Änderung der Breite der Spektrallinien des gestreuten Lichtes des Laserstrahls mißt, um die mittlere Diffusionskonstante (75) zu bestimmen, die einen Hinweis auf die Brown'sche Bewegung der agglutinierten Teilchen gibt, die ihrerseits umgekehrt proportional ist der Größe der agglutinierten Teilchen. Da bei dieser Methode der Antikörper- oder Antigensensiblisierte Latex in extrem niedriger Konzentration, die beispielsweise lediglich 0,001% beträgt, verwendet wird, wird die Geschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion vermindert, so daß sowohl die Präzision als auch die Reproduzierbarkeit dieser Methode zu wünschen übrig lassen. Weiterhin besitzt diese Methode den Nachteil, daß komplizierte Berechnungen unier Anwendung von Spektrumanalysemethoden erforderlich sind, was komplizierte Maßnahmen notwendig macht, und daß irgendwelche in der Probe vorhandenen Verunreinigungen vor der Messung entfernt werden müssen. Aus diesem Grund hat sich auch diese Methode in der Praxis so nicht durchsetzen können.

Die obige Literaturstelle C beschreibt ferner, daß die Bestimmung mit Hilfe der in der Literaturstelle A angegebenen Trübungsmeßmethode extrem ungenaue Ergebnisse liefen (siehe Fig. 2 auf Seite 350 dieser Veröffentlichung).

Das Ergebnis von früheren Untersuchungen der Anmelderin im Hinblick auf Verfahren und Vorrichtungen zur schnellen Bestimmung von Antigenen und/oder Antikörpern in Proben mit hoher Präzision und guter Reproduzierbarkeit ist Gegenstand der älteren Patentanmeldung DE-OS 27 36 805 der Anmelderin (nachfolgend als »älteren Anmeldung« bezeichnet).

Gegenstand dieser älteren Anmeldung ist ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern, das darin besteht, einen Antikörper oder ein Antigen, der bzw. das dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper entspricht, auf unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μΐη zu fixieren, den auf dem Trägermaterial vorliegenden Antikörper und/oder das auf dem Trägermaterial vorliegende Antigen mit dem zu bestimmenden Antigen, dem zu bestimmenden Antikörper oder der zu bestimmenden Mischung davon umzusetzen und die Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μιη, die um einen Faktor von mindestens 1,5 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen, zu bestrahlen, um die Extinktion der Reaktionsmischung zu bestimmen. Nach dem Beispiel 6 dieser älteren Anmeldung wird die Extinktion der Reaktionsmischung kontinuierlich überwacht, um die Zeit zu ermitteln, die erforderlich ist. bis die Rxlinktion einen bestimmten Wert erreicht.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin, die in der genannten älteren Anmeldung angegebene frühere Erfindung weiter zu verbessern und eine reproduzierbare, schnelle Bestimmung von Antigenen und Antikörpern mit hoher Präzision zu ermöglichen.

Es hat sich gezeigt, daß diese Aufgabe dadurch gelöst werden kann, daß man das durchgelassene Licht an zwei

5 oder mehreren Zeitpunkten während des Ablaufs der Reaktion mißt und die Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung während einer gegebenen Zeitdauer bestimmt.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Verfahren zur Bestimmung von Antigenen und Antikörpern durch Umsetzen eines Antigens oder eines Antikörpers oder einer Mischung davon in einem flüssigen Medium mit unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μΐη die mit dem entsprechenden Antikörper bzw. Antigen sensiblisiert sind. Bestrahlen der Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μιτι und Messung der optischen Durchlässigkeit der Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man das durchgelassene Licht an zwei oder mehreren Zeitpunkten während des Ablaufs der Reaktion mißt und die Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung während einer gegebenen Zeitdauer bestimmt.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens mit

a) einer Absorptionszelle mit einer Dicke von 0,5 bis 10 mm zur Aufnahme der Reaktionsmischung . b) einem Photometer mit einer Bestrahlungseinrichtung zum Bestrahlen mit Licht mit einer im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι liegenden Wellenlänge,

die gekennzeichnet ist durch eine Einrichtung zur Ermittlung der Änderung der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung bei der gemessenen Wellenlänge in Abhängigkeit von der Reaktionszeit. Die Unteransprüche betreffen besonders bevorzugte Ausführungsformen des Verfahrens bzw. der Vorrichtung.

Die Erfindung sei nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnungen näher erläutert. In der Zeichnung zeigt F i g. 1 das Absorptionsspektrum von Wasser, das unter Verwendung von Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μιτι in einer Absorptionszelle mit einer Dicke von 1 mm aufgenommen wurde;

F i g. 2 anhand einer Kurve die Änderung der Extinktion in Abhängigkeit von dem Teilchendurchmesser eines Polytyrollatex;

F i g. 3 anhand einer Kurve die zeitliche Änderung der Extinktion für Licht einer Wellenlänge von 950 nm, die während des Ablaufs der Reaktion aufgezeichnet wurde, welche Reaktion dadurch verursacht wird, daß man

Standardfibrinogenlösungen unterschiedlicher Konzentrationen zu einer Mischung von Polystyrollatices mit durchschnittlichen Teilchendurchmessern von 0,091 und 0,220 μπι. die mit Anti(humanfibrinogen)-Antikörpern sensibilisiert worden sind, zugibt;

F i g. 4 anhand einer Kurve die Beziehung zwischen der aus der F i g. 3 ermittelten Zunahme der Extinktion und der Konzentration der Standard-Fibrinogenlösung;

Fig.5a anhand einer Kurve die Änderung der prozentualen Absorption in Abhängigkeit von der Zeit bei

einer maximalen Emissionswellenlänge von 940 nm, die während des Ablaufs der Reaktion aufgezeichnet worden ist, welche Reaktion dadurch ausgelöst worden ist, daß man Standard-Humanchoriongonadotropin-Lö-

sungen unterschiedlicher Konzentrationen zu einem mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisiertem Latexreagens zugibt;

F i g. 5b eine von der F i g. 5a abgeleitete Kurve, bei der die prozentuale Absorption in die Extinktion umgewandelt worden ist;

F i g. 6a eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption, die aus der F i g. 5a entnommen worden ist, und der Konzentration der eingesetzten Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen wiedergibt;

F i g. 6b eine Kurve, die die Beziehung zwischen der aus der F i g. 5b gewonnenen Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion und der Konzentration der Slandard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen wiedergibt;

Fig.7 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der

Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualer. Absorption bei 950 nm wiedergibt, welch letztere bei der Reaktion eines mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen

Teilchendurchmesser von 0,220 μπι mit Standard- Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentration ermittelt worden ist;

F i g. 8 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Fibrinogenkonzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption bei 950 nm wiedergibt die bei der Umsetzung eines mit Antifibrinogen sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0312 μπι mit Standrad-Fibrinogenlösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist; Fig.9 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der

Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption für polychromatisches Licht mit Wellenlängen von

800 bis llOOnm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antihumanchroiongonadotropin sensibilisierten

Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 μιτι mit den Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

Fig. 10 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption für Licht mit einer Wellenlänge der maximalen Emission von 940 nm wiedergibt, die mit Hilfe eines Integrators bei der Umsetzung eines mit Anti-Humanchoriongonadotropin sensiblisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 μπι mit Standard-Humanchoriongonadotropiti-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

Fig. 11 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanehoriongonadotropin-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 950 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Anti-Humanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 μηι mit Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschieclicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

F i g. 12 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Fibrinogen-Konzenlration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 900 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antifibrinogen sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 um und Standard-Fibrinogenlösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

Fig. 13 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 1100 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antihumanchoriongonadotropin sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 1,09 μπι und Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist;

F i g. 14 eine Kurve, die die Beziehung zwischen der Fibrinogen-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion bei 1650 nm wiedergibt, die bei der Umsetzung eines mit Antifibrinogen sensibilisierten Latexreagens' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 μιη und Standard-Fibrinogenlösungen unterschiedlicher Konzentrationen ermittelt worden ist; und

F i g. 15 ein schematisches Diagramm, das den Grundaufbau einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung wiedergibt, in der

1 für einen Monochromator;

2 für einen halbdurchlässigen Spiegel;

3 für eine Blende;

4 für einen Kompensationsdetektor;

5 für eine Absorptionszelle;

6 für einen Probendetektor;

7 für einen Verstärker;

8 für eine Aufzeichnungsvorrichtung und

9 für einen Integrator stehen.

Mit Hilfe des Verfahrens und der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann eine extrem geringe Menge eines Antigens und/oder eines Antikörpers, die in der Praxis bislang nur mit Hilfe der Radioimmunoassay-Methode (RIA) bestimmt werden konnte, schneller und sicherer und mit einer Präzision nachgewiesen werden, die gleich oder größer ist als die Präzision der Radioimmunoassay-Methode (Radioimmuntest).

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es weiterhin möglich, nicht nur multivalente Antigene, sondern auch unvollständige Antigene, beispielsweise Haptene, mit hoher Präzision zu bestimmen, wobei die Antigene und/oder die Antikörper nicht nur über ihre Agglutinationsreaktion, sondern auch über ihre Agglutinations- Inhibierung nachgewiesen werden können.

Der in der Erfindungsdefinition verwendete Ausdruck »Reaktionsmischung« steht, wie aus der obigen Beschreibung hervorgeht, nicht für eine Reaktionsmischung, in der die Antigen-Antikörper-Reaktion bereits vollständig abgelaufen ist, sondern für eine Reaktionsmischung, in der die Reaktion noch abläuft. Somit wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Reaktionsgeschwindigkeit einer solchen Reaktionsmischung, in der eine Antigen-Antikörper-Reaktion abläuft, gemessen und zwar über die'Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung für Licht des oben angesprochenen nahen Infrarotbereiches oder eines Bereiches des sichtbaren Lichtes, der sich an den nahen Infrarotbereich anschließt.

Wie bereits erwähnt, besitzt das herkömmliche Verfahren, gemäß dem der Grad der Agglutination, die sich bei dem Kontakt eines ein Antigen oder einen Antikörper oder eine Mischung davon enthaltenden Probe mit Latexteilchen, auf denen der entsprechende Antikörper und/oder das entsprechende Antigen vorliegt bzw. fixiert ist (welche Latexteilchen nachstehend auch als »sensibilisierte Teilchen« oder »sensibilisierter Latex« bezeichnet werden) ergibt, über die Geschwindigkeit der Abnahme der Trübung der überstehenden Flüssigkeit des latex bestimmt wird, verschiedene Nachteile, wie eine geringe Genauigkeit und eine schlechte Reproduzierbarkeit, da die Reaktion in stationärem Zustand unter Verwendung eines extrem stark verdünnten Latex' durchgeführt werden muß. Weiterhin ist es bei diesem vorbekannten Verfahren erforderlich, zunächst jegliche Verunreinigungen, die die Trübung beeinträchtigen könnten, aus der Probe zu entfernen. Im Gegensatz zu dem oben angesprochenen vorbekannten Verfahren ist es erfindungsgemäß erwünscht die Reaktion eines Antigens oder eines Antikörpers in einer Probe in einem sensiblisierten Latex in einem bewegten Zustand, vorzugsweise unter Rühren, durchzuführen, und die Reaktion bei hohen Konzentrationen zu bewirken.

Wenn ein Antigen oder ein Antikörper, das bzw. der in einer Probe vorliegt, in Gegenwart mindestens eines flüssigen Mediums mit einem unlöslichen Träger, dessen Teilchen einen durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μηι aufweisen, der mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen sensibilisiert worden ist (sensibilisierter Träger), umgesetzt wird, verläuft die Agglutination des sensibilisierten Latex' zumindest im Anfangszustand der Antigen-Antikörper-Reaktion und insbesondere in einem relativ frühen Zeitpunkt dieser Reaktion, in dem Maße, in dem die Reaktion abläuft Wenn die Reaktionmischung dann mit Licht einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von etwa 0,6 bis 2,4 μιη bestrahlt oder belichtet wird, nimmt die Extraktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung mit fortschreitender Agglutination zu. Somit kann das Licht, mit dem die Reaktionsmischung belichtet wird, irgendeine Wellenlänge im Bereich von 0,6

bis 2,4 μίτι aufweisen, vorausgesetzt, daß die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung in diesem Wellenlängenbereich während des Fortschreitens der Antigen-Antikörper-Reaktion zunimmt. Mit Hilfe vorausgehender Experimente ist es ohne weiteres möglich, für ein bestimmtes Antigen oder einen bestimmten Antikörper, das bzw. der in einer Probe vorliegt, und für einen bestimmten sensiblisierten Träger ein Licht einer Wellenlänge oder Wellenlängen auszuwählen, die in diesem geeigneten Wellenlängenbereich liegen. Das erfindungsgemäß angewandte Licht kann entweder monochromatisches ode¹ polychromatisches Licht sein, das eine geeignete Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μιη aufweist.

Wie es aus den nachstehend angegebenen Beispielen hervorgeht, ist es erfindungsgemäß möglich, ein relativ schmalbandiges polychromatisches Licht mit einer Halbwertsbreite von 35 nm oder 55 nm sowie ein polychro-ίο matisches Licht mit einem relativ weiten Wellenlängenbereich anzuwenden, wie das Licht einer Wolframlampe, aus dem Strahlen mit einer Wellenlänge von nicht mehr als etwa 800 nm (0,8 μηι) ausgeblendet worden sind.

Vorzugsweise besitzt das erfindungsgemäß angewandte monochromatische oder poiychromatische Licht eine Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,8 bis 1,4 μιη.

Bislang ist die Methode der Spektrumanalyse unter Verwendung von Lichtstrahlen im Infrarotbereich mit einer Wellenlänge vor. mindestens 2,5 μπι oder Lichtstrahlen im ultravioletten Bereich mit einer Wellenlänge von nicht mehr als 0,4 μπι als Methode zur Untersuchung der Molekülstruktur und von Moleküleigenschaften bekannt. Das Licht des nahen Infrarots oder des sich daran anschließenden sichtbaren Bereiches mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μιη, das erfindungsgemäß angewandt wird und das der Einfachheit halber im folgenden als »Licht des nahen Infrarotbereiches« bezeichnet wird, ist bislang nur begrenzt angewandt worden und hat nur geringes Interesse gefunden.

Es wurde nunmehr gefunden, daß das oben erwähnte Licht des nahen Infrarotbereiches erfindungsgemäß besonders geeignet ist, da es sehr gut durch wäßrige Medien, wie Wasser, wäßrige Lösungen und dergleichen, die im allgemeinen die Grundmedien von Antigene oder Antikörper enthaltenden Proben darstellen, wie Wasser, Sera, Urin, Salzlösungen, etc. sowie die Grundmedien der oben erwähnten Latices, hindurchdringt, wobei insbesondere das Licht des nahen Infrarotbereiches mit Wellenlängen von 0,8 bis 1,4 μιη und von 1,53 bis 1,88 μιη von den wäßrigen Medien nur in geringem Ausmaß absorbiert wird.

Erfindungsgemäß kann man irgendeinen unlöslichen Träger, der Teilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 μιη umfaßt, verwenden. Die unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittüchen Durchmesser von mehr als 1,6 pm sind für die erfindungsgemäße Bestimmung ungünstig, da es schwierig ist, einen solche Teilchen enthaltenden Latex stabil zu halten. Vorzugsweise besitzen die unlöslichen Trägerteilchen einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 1,0 μπι, bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 0,8 μπι und am bevorzugtesten im Bereich von 0,2 bis 0,6 μιη.

Erfindungsgemäß wird ein Antigen oder ein Antikörper, das bzw. der in einer Probe vorliegt, in Gegenwart mindestens eines flüssigen Mediums mit unlöslichen Trägerteilchen, die einen durchschnittlichen Durchmesser innerhalb des oben angegebenen Bereiches aufweisen und die mit dem entsprechenden Antikörper oder Antigen j sensiblisiert worden sind (sensibilisierter Träger) umgesetzt, wobei die Reaktionsmischung mit dem oben crip wähnten Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μιη bestrahlt wird, nachdem

|f die Reaktion gestartet worden ist In diesen Fällen besteht eine sehr gute Korrelation zwischen der Geschwin-

ji^! digkeit der Zunahme der Extinktion oder prozentualen Absorption der Reaktionsmischung für das oben er-

U 40 wähnte Licht und der scheinbaren Reaktionsgeschwindigkeit der Antigen-Antikörper-Reaktion, insbesondere in

If einem frühen oder mittleren Stadium der Reaktion, wobei die scheinbare Reaktionsgeschwindigkeit ihrerseits

ij; mit der Konzentration des Antigens oder des Antikörpers in der Probe in Beziehung steht. Auf der Grundlage

& dieser Prinzipien ist es daher möglich, die Konzentration des Antigens oder des Antikörpers in der Probe zu

|), bestimmen.

|j 45 Der hierin verwendete Ausdruck »prozentuale Absorption« kann durch die folgende Gleichung 1

f§ _{S m} JsiZl χ ₁₀₀ (%) ₍₁₎

$ A)

H 50 wiedergegeben werden, in der

j| S für die prozentuale Absorption,

/o für die Intensität des durchgeblasenen Lichtes, wenn die Zelle das gleiche System wie die zu messende Reaktionsmischung, mit dem Unterschied, daß das System frei ist von dem Antigen und/oder dem Antikörper, enthält, und

/ für die Intensität des durchgelassenen Lichtes, wenn die Zelle die Reaktionsmischung enthält, stehen.

Wie aus der obigen Definition ersichtlich ist, kann die prozentuale Absorption auch anders herum als der Prozentsatz des durch die Reaktionsmischung nicht hindurchgegangenen Lichtes oder den Prozentsatz des absorbierten Lichtes bezeichnet werden.

Die oben definierte prozentuale Absorption steht in Korrelation zu dem Extinktionswert A, den man beispielsweise mit Hilfe eines Spektrophotomcters, wie er für die lnfrarotspektrometrie verwendet wird, bestimmen kann, so daß man diese prozentuale Absorption der Einfachheil halber auch über die Extinktion ausdrücken kann. In der lnfrarotspektrometrie ist die Extinktion A durch die folgende Gleichung 2 definiert:

65

worin k und /die für die Gleichung 1 angegebenen Bedeutungen besitzen.

Somit ist es erfindungsgemäß möglich, Antigene und Antikörper zu bestimmen, indem man entweder die durch die Gleichung 1 definierte prozentuale Absorption oder die durch die Gleichung 2 definierte Extinktion heranzieht, wobei unabhängig von dem angewandten Parameter die erhaltenen Daten innerhalb eines vernünftigen, verläßlichen Bereiches übereinstimmen, vorausgesetzt, daß die Messungen sorgfältig durchgeführt werden.

Die Messungen zur Bestimmung der oben angesprochenen Geschwindigkeite der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit erfolgen vorzugsweise zu dem frühest möglichen Zeitpunkt, zu dem die Antigen-AntikörperReaktion in der Reaktionsmischung einen stationären bzw, gleichmäßigen oder stetigen Zustand erreicht hat. In dieser Weise können bei der Messung genauere und reproduzierbarere Ergebnisse erhalten werden. ,0

Zu diesem Zweck wird der sensibilisierte Latex mit der das Antigen oder den Antikörper enthaltenden Testflüssigkeit in Kontakt gebracht und vorzugsweise unter Rühren damit vermischt, worauf die Messung der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung nicht augenblicklich, jedoch baldmöglichst, beispielsweise 2 bis 3 Sekunden und vorzugsweise etwa 5 Sekunden nach Vermischen der Reaktionsteiinehmer erfolgen sollte.

Nachdem die Reaktion des sensiblisierten Latex' mit dem in der Testflüssigkeit enthallenden Antigen oder Antikörper in Gang gebracht worden ist, erreicht die in der Reaktionsmischung ablaufende Anligen-Antikörper-Reaktion bald einen stationären Zustand oder den Zustand eines dynamischen Gleichgewichts. In diesem Zustand, insbesondere in einem frühen Stadium, wenn die Reaktion einen stationären Zustand erreicht hat, nimmt die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung praktisch gleichmäßig oder stetig zu. Daher ist es bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens von Vorteil, zuvor mit Hilfe eines vorausgehenden Experiments einen Zustand oder einen Zeitraum in dem Reaktionsablauf auszuwählen, in dem eine stetige Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption einer bestimmten Reaktionsmischung erfolgt, und anschließend innerhalb des ausgewählten Stadiums das Antigen oder den Antikörper in einer Testflüssigkeit zu bestimmen, die das Antigen, den Antikörper oder eine Mischung davon in unbekannter Konzentration enthält.

Es versteht sich, daß bei der Durchführung der Messung die Reaktion des sensibilisierten Latex' mit der Testflüssigkeit unter vorbestimmten, im wesentlichen festgelegten Bedingungen durchgeführt wird.

Es ist von Vorteil, den sensibilisierten Träger mit einem Antigen oder einem Antikörper in einer Testflüssigkeit unter im wesentlichen festgelegten Bedingungen umzusetzen und dann die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung in einem solchen Stadium zu bestimmen, in dem die Extinktion oder die prozentuale Absorption erstmais nach Beginn der Reaktion eine annähernd stetige Zunahme zeigt, wodurch es möglich wird, die quantitative Bestimmung der Antigene und Antikörper mit höherer Präzision in kürzester Zeit zu bewirken.

Es ist weiterhin von Vorteil, den sensibilisierten Latex unter im wesentlichen festgelegten Bedingungen mit einem Antigen oder einem Antikörper in einer Testflüssigkeit umzusetzen, dann die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung an zwei oder mehreren Zeitpunkten zu messen und zu speichern und ausgehend von den gespeicherten Werten der Extinktion oder der prozentualen Absorption die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit zu ermitteln bzw. zu errechnen.

Eine Bestimmung von Antigenen und Antikörpern kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden: Zunächst wird ein unlöslicher, fester Träger (Latex) mit Teilchen eines bestimmten durchschnittlichen Durchmessers mit einem bestimmten Antikörper oder Antigen, der bzw. das dem zu bestimmenden Antigen oder Antikörper entspricht, sensibilisiert. Andererseits wird unter Verwendung des gleichen Antigens oder Antikörpers (oder einer Mischung davon) das, der bzw. die in der tatsächlich zu bestimmenden Probenlösung enthalten ist, eine Reihe von Standardprobenlösungen hergestellt, die das Antigen oder den Antikörper in unterschiedlichen bekannten Konzentrationen in einem flüssigen Medium enthalten, das genau dem der tatsächlichen Probenlösung entspricht oder mit diesem annähernd identisch ist.

Anschließend werden der sensibilisierie Latex und eine der in dieser Weise gebildeten Standardprobenlösungen vermischt, worauf die Extinktion oder die prozentuale Absorption der Reaktionsmischung während der ablaufenden Antigen-Antikörper-Reaktion gemessen wird, nachdem das Fortschreiten dieser Reaktion einen stationären Zustand erreicht hat.

Beispielsweise sind in F i g. 3 und F i g. 5a und 5b der Zeichnungen die Veränderungen (die Zunahme) der Extinktion oder der prozentualen Absorption einiger Reaktionsmischungen gegen die Zeit aufgetragen, wobei die Zeit (in Minuten) auf der Abszisse und die Extinktion (im Falle der F i g. 3 und 5b) oder die prozentuale Absorption (im Fall der F i g. 5a) auf der Ordinate aufgetragen sind. Von diesen Kurven zeigen die in der F i g. 3 dargestellten Kurven A, B, C und D die tatsächlichen Aufzeichnungen des für die Bestimmung der Extinktion verwendeten Spektrophotometers, die die Änderung (die Zunahme) der Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit erkennen lassen.

Aus diesen Kurven A, B, C und D ist ersichtlich, daß wenn man einen sensiblisierten Träger und eine Standardprobenlösung umsetzt, relativ kurz nach Beginn der Reaktion ein stationärer Zustand im Ablauf der Antigen-Antikörper-Reaktion erreicht wird und daß insbesondere der Anfangsbereich dieses Zustandes eine annähernd stetige Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung erkennen läßt.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird im Fall jeder Standardprobenlösung die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung pro Zeiteinheit mit Vorteil in einem derart frühen Stadium oder Zeitraum bestimmt in dem die Extinktion oder die prozentuale Absorption annähernd stetig mit der Zeit zunimmt.

Die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption kann beispielsweise für die in der F i g. 3 dargestellten Kurven A. B. C und D ermittelt werden, indem man die Geschwindigkeit der Zunahme der Flach" zwischen der Kurve und der Grundlinie (Abszisse) während einer festgelegten Zeitdauer (beispiekweise einer Minute) in einem relativ linearen Abschnitt der Kurve ermittelt. Alternativ kann man eine gerade Linie durch die Kurven in dem realtiv linearen Abschnitt ziehen, wie es in der F i g. 3 mit A', B', Coder D' S

angegeben ist, und für jede gerade linie A', B', C" und £>'den Tangens des Neigungswinkels θ bestimmen. |ΐ

Anschließend wird beispielsweise die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen S| Absorption pro Zeiteinheit, die man mit jeder Probenlösung ermittelt hat (in logarithmischem Maßstab) auf der i| Ordinate gegen beispielsweise die Konzentration des Antigens oder des Antikörpers in der Standardprobenlö- ||

ίο sung (in logarithmischem Maßstab) auf der Abszisse aufgetragen. In dieser Weise erhält man eine Kurve (das §£

heißt eine Eichkurve), wie sie beispielsweise in den F i g. 4,6a oder 6b angegeben ist Wie aus diesen Kurven zu %

ersehen ist, weisen die Eichkurven darauf hin, daß eine annähernd lineare Beziehung zwischen der Konzentra- |s

tion des Antigens oder des Antikörpers in der Standardprobenlösung und der Geschwindigkeit der Zunahme der |

Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung pro Zeiteinheit besteht. |

!5 Somit ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die quantitative Bestimmung von Antigenen und Antikör- β

pern in Proben oder Testflüssigkeiten bzw. Testfluiden, indem man zunächst in der oben beschriebenen Weise !^H

eine Eichkurve für das zu bestimmende besondere Antigen oder den zu bestimmenden besonderen Antikörper L'

ermittelt, die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit in i;

der oben beschriebenen Weise unter Verwendung einer Probe oder einer Testflüssigkeit, die das Antigen oder £.,

den Antikörper in unbekannter Konzentration enthält, bestimmt und die in dieser Weise erhaltenen Werte mit ;

der Eichkurve vergleicht ■;■

In dieser Weise ist es möglich, die Konzentration des Antigens oder des Antikörpers in einer Testflüssigkeit mit extrem hoher Präzision in kurzer Zeit zu messen, wie es auch durch die (olgenden Beispiele belegt wird.

Bei dem Verfahren der oben angesprochenen älteren Patentanmeldung DE-OS 27 36 805 wird die Reaktionsmischung mit Licht bestrahlt, dessen Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι liegt und dessen Wellenlänge um einen Faktor von mindestens 1,5 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der unlöslichen Trägerteilchen. Nach der Lehre der vorliegenden Erfindung kann jedoch, wie es aus den obigen Ausführungen hervorgeht, Licht |

einer beliebigen Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μηι verwendet werden, vorausgesetzt, daß die Wellenlänge des Lichtes derart ausgewählt ist, daß beim Bestrahlen der Reaktionsmischung mit dem Licht sich eine Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption feststellen läßt. Demzufolge ist das verwendete Licht nicht auf Licht mit einer Wellenlänge beschränkt, das einen Faktor von mindestens 1,5 größer ist als der durchschnittliche Durchmesser der unlöslichen Trägerteilchen. In der Tat kann das erfindungsgemäße Verfahren, wie aus den Beispielen 9 und 8 hervorgeht, mit Licht einer Wellenlänge durchgeführt werden, die etwa gleich ist dem durchschnittlichen Durchmesser der Trägerteilchen (Latexteilchen) oder mit Licht mit einer Wellenlän- ^:

ge, die um einen Faktor um etwa 1,1 länger ist als der durchschnittliche Durchmesser der Trägerteilchen.

Jedoch ist es von Vorteil, Licht zu verwenden, dessen Wellenlängen um einen Faktor von mindestens 1,1, vorzugsweise von mindestens 1,5 länger sind als der durchschnittliche Durchmesser der unlöslichen Trägerteilchen, da durch die Anwendung von Licht solcher Wellenlängen die genaue Bestimmung der Antigene und Antikörper leichter erreicht werden kann.

Beispielsweise ist in der Fig. 1 durch Auftragen der Wellenlänge des Lichtes auf der Abszisse und der prozentualen Transmission des Lichtes auf der Ordinate das prozentuale Transmissionsspektrum einer Wasserschicht mit einer Dicke von 1 mm in einem Wellenlängenbereich von 0,6 bis 2,4 μιη dargestellt. Aus der F i g. 1 ist zu ersehen, daß das Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 1,4 μιη praktisch ohne merkliche Absorption durch Wasser, das das für Latices und Proben weitgehendst verwendete Grundmedium darstellt, hindurchdringt und daß Licht mit einer Wellenlänge von 1,53 bis 1,88 μιη ebenfalls im wesentlichen durch Wasser hindurchdringt, so daß man Licht mit einer Wellenlänge in diesem Bereich bei dem erfindungsgemäßen Verfahren anwenden kann. Es ist weiterhin aus der F i g. 1 ersichtlich, daß Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 2,1 bis 2,35 μπι für Wasser eine Transmission im Bereich von 20% zeigt, so daß man Licht einer solchen Wellenlänge auch in Kombination mit einem hi/chempfindlichcn Photometer anwenden kann, wenngleich dies nicht bevorzugt ist.

Die F i g. 2 zeigt die Beziehung zwischen der Extinktion eines Polystyrollatex' (mit einem Feststoffgehalt von 1 Gew.-%), die auf der Ordinate aufgetragen ist, und der Wellenlänge des Lichtes, die in μηι auf der Abszisse aufgetragen ist, wenn man die Bestimmung in einer Absorptionszelle mit einer Dicke von 2 mm durchführt. Die in der Fig.2 dargestellte Kurve A gibt die Änderung der Extinktion eines Polystyrollatex' wieder, dessen durchschnittlicher Teilchendurchrnesser 0,481 μπι beträgt, während die Kurve ßdie Extinktion eines Polystyrollatex' zeigt, dessen durchschnittlicher Teilchendurchmesser 0,804 μπι beträgt. Zur Bestimmung der Extinktion wurde der Latex aus Gründen der Vereinfachung der Messung verdünnt, wonach die Extinktion des Latex' durch Multiplizieren des tatsächlich gemessenen Wertes der Extinktion mit dem Verdünnungsfaktor errechnet wurde. Aus der F i g. 2 ist zu ersehen, daß die Extinktion des Latex' bei einer Wellenlänge von weniger als 0,6 μιη ω derart groß ist, daß es schwierig ist, die Änderung der Lichttransmission einer Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung unter Verwendung von Licht einer solchen Wellenlänge zu messen. Wenn man jedoch Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 0,8 μηι und insbesondere von mindestens 1 μηι anwendet, so ist die Extinktion des Latex' als solchem relativ gering, so daß Licht mit einer Wellenlänge von mindestens 0.8 μιη und vorzugsweise mindestesn 1 μιτι für die oben erwähnte Messung der Lichttransmission geeignet ist.

b5 Vergleicht man die in der Fi g. 2 dargestellte Kurve A, mit der dort gezeigten Kurve B, so ist festzustellen, daß die Extinktion des Latex' mit zunehmendem durchschnittlichen Durchmesser der Polystyrollatexteilchen zunimmt. Daraus ist ersichtlich, daß Latexteilchen mit einem extrem großen durchschnittlichen Durchmesser erfindungsgemäß nicht geeignet sind. F.s hat sich ferner gezeigt, daß die erfindungsgemäß geeigneten unlöslichen

Trägerteilchen einen durchschnittlichen Teilchendurchmesser von nicht mehr als 1,6 μίτι besitzen müssen und daß Latexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,1 bis Ι,μπι und insbesondere von 0,2 bis 0,8 μπΊ bevorzugt sind.

Die erfindungsgemäß geeigneten unlöslichen Trägerteilchen schließen Mikroteilchen organischer Polymerer, die im wesentlichen in dem für die ernndungsgeinäße Messung verwendeten flüssigen Medium unlöslich sind s und einen durchschnittlichen Durchmesser innerhalb des oben angegebenen Bereiches aufweisen, ein, beispielsweise Latices von organischen Polymeren, wie Polystyrol und Styrol-Butadien-Copolymeren, die man durch Emulsionspolymerisation erhält; dispergiertc Kokkenbakterien, wie Staphylokokken und Streptokoken, Bacillus prodigiosus, Rickettsia, Zellmembranfragmente etc sowie Mikroteilchen von anorganischen Oxiden, wie Siliciumdioxid, Siliciumdioxid-Aluminiumoxid und Aluminiumoxid und feinpulverisierte Mineralien, Metalle und dergleichen.

Der Antikörper oder das Antigen, das mit dem in der Probe zu bestimmenden Antigen bzw. Antikörper reagiert, wird an den unlöslichen Trägerteilchen, beispielsweise Latexteilchen, fixiert (um das Trägermateria! zu sensibilisieren). Zu diesem Zweck kann der Antikörper oder das Antigen physikalisch und/oder chemisch an dem Träger adsorbiert werden.

Bei den Antikörpern handelt es sich um Proteine, während die Antigene aus einem Vertreter einer Gruppe von verschiedenartigen Substanzen bestehen, die beispielsweise Proteine, Polypeptide, Steroide, Polysaccharide, Lipide, Pollen, Staub und dergleichen einschließt. Es wurde bereits eine Reihe von Verfahren beschrieben, um diese Antikörper oder Antigene und insbesondere Antikörper auf unlöslichen Trägerteilchen abzuscheiden oder zu fixieren.

Um ein unvollständiges Antigen, insbesondere ein Hapten, an unlöslichen Trägermaterialien zu fixieren, ist es von Vorteil, die Trägermaterialien chemisch zu modifizieren, beispielsweise mit Hilfe eines Kupplungsmittels, und anschließend das Antigen chemisch an das modifzierte Trägermaterial zu binden. Wenn der verwendete unlösliche Träger ein Latex einer hochmolekularen Substanz ist, die funktionell Gruppen, wie Sulfogruppen, Aminogruppen oder Carboxylgruppen oder davon abgeleitete reaktive Gruppen aufweist, ist es auch möglich, den Antikörper und/oder das Antigen an einem solchen Latex chemisch zu adsorbieren.

Von den erfindungsgemäßen geeigneten flüssigen Medien ist Wasser am bevorzugtesten, wenngleich man auch eine Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel verwenden kann. Beispiele für geeignete mit Wasser mischbare organische Lösungsmittel sind Alkohole, wie Methanol, Äthanol etc. Ketone, wie Aceton, und dergleichen.

Die unlöslichen Trägerteilchen, beispielsweise die Latexteilchen, die mit einem Antikörper oder einem Antigen sensiblisiert worden sind (und die hierin auch als »sensibilisierte Trägerteilchen« bezeichnet werden) kann man in Form einer Suspension verwenden, die eine Konzentration von nicht weniger als 0,05 Gew.-% und vorzugsweise eine Konzentration im Bereich von 0,1 bis 1 Gew.-% und noch bevorzugter im Bereich von 0,2 bis 0,6 Gew.-% aufweist.

Wenn die Konzentration der sensibilisierten Trägerteilchen zu hoch ist, wie es aus der F i g. 2 hervorgeht, wird die Durchlässigkeit der Suspension derart vermindert, daß die erfindungsgemäße Messung der Extinktion erschwert wird. Innerhalb des Konzentrationsbereiches, in dem die Messung der Extinktion möglich ist, sind jedoch höhere Konzentrationen der sensibilisierten Trägerteilchen in der Suspension bevorzugt, da es hierdurch möglich wird, die Empfindlichkeit der quantitativen Bestimmung der Antigene und Antikörper zu steigern.

Die sensibilisierten Trägerteilchen und die das Antigen bzw. den Antikörper enthaltende Probe werden bevorzugt unter nicht-stationären Bedingungen, das heißt nicht unter Stehenlassen, umgesetzt. Zu diesem Zweck kann man die Reaktion mit Vorteil unter Bewegung der Reaktionsmischung durchführen. Da die Reaktion im allgemeinen in einer dünnen oder schmalen Zelle durchgeführt wird, erreicht man das Bewegen der Reaktionsmischung bequemerweise zum Beispiel dadurch, daß man einen Stab vertikal oder transversal durch die Zelle bewegt. Natürlich kann man die sensibilisierten Trägerteilchen und die Probe außerhalb der Zelle unter vorbestimmten Bedingungen während einer gewissen Zeitdauer umsetzen und anschließend die Reaktionsmischung zur Bestimmung der Extinktion oder der prozentualen Absorption in die Zelle einbringen. Um die Reaktionsbedingungen jedoch reproduzierbar zu machen, insbesondere im Hinblick auf die Reaktionszeit, kann man die sensibilisierten Trägerteilchen und die Probe unter vorbestimmten, nicht-ruhenden Bedingungen direkt in einer Zelle, die in ein Spektrophotometer eingebracht ist, umsetzen, wodurch eine genauere Bestimmung der Extinktion oder der prozentualen Absorption möglich wird.

Zur Bestimmung iier Extinktion oder der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung ist eine Zelle mit einer Dicke von beispielsweise 0,5 bis 10 mm und vorzugsweise von 1 bis 5 mm geeignet.

Wenn das erfindungsgemäße Verfahren zu einer empfindlichen Bestimmung von Spurenmengen eines Antigens oder eines Antikörpers, die bislang nach der Radioimmunoassay-Methode bestimmt wurden, angewandt werden soll, ist es besonders vorteilhaft;

a) Ein Antigen oder einen Antikörper mit einer möglichst hohen Gleichgewichtskonzentration zu verwenden,

b) Latexteilchen, die insbesondere einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,2 bis 0,8 μίτι aufweisen, zu verwenden, der Teilchengrößen verteilung möglichst eng ist, und

c) die Extinktion oder die prozentuale Absorption mit Licht mit einer Wellenlänge von 0,8 bis 1,4 μίτι zu bestimmen.

Die Erfindung wurde oben bezüglich der Bestimmung eines Antigens und/oder eines Antikörpers in einer Probe beschrieben, die darauf beruht, daß man das in der Probe enthaltene Antigen und/oder den in der Probe enthaltenen Antikörper mit sensibilisierten Trägerteilchen agglutinicrt (das heißt ein I.A-System anwendet). Das

erfindungsgemäße Verfahren ist auch zur Bestimmung einer Probe geeignet bei der die inhibierende Wirkung gegen die oben erwähnte Agglutination das Prinzip der Messung ist (das heißt, daß man ein Ll-System anwendet).

Unvollständige Antigene, beispielsweise Haptene, kann man dadurch bestimmen, daß man das erfindungsgemäße Verfahren auf das Ll-System anwendet In diesem Fall kann man beispielsweise ein Antigen auf den unlöslichen Trägerteilchen, wie sie erfindungsgemäß angewandt werden, fixieren, die in dieser Weise senribilisierten Trägerteilchen nach einer kompetitiven Reaktion mit einer gegebenen Menge eines Antikörpers, der mit einem Antigen einer vorbestimmten Konzentration (beispielsweise einer Standardantigenlösung) umgesetzt worden ist reagieren lassen, und dann die Extinktion oder die prozentuale Absorption der gebildeten Reaktions-

to mischung pro Zeiteinheit bestimmen. Diese Maßnahmen werden bei unterschiedlichen Konzentrationen der Standard-Antigenlösung wiederholt, um eine Eichkurve zu ermitteln. Anschließend setzt man eine unbekannte Probe mit dem gleichen Antikörper einer bestimmten Konzentration um, wonach man die erhaltene Reaktionsmischung mit dem sensibilisierten Trägermaterial zur Reaktion bringt Diese Reaktionen sollten unter im wesentlichen den gleichen Bedingungen durchgeführt werden, wie sie für die Ermittlung der Eichkurve angewandt wurden. Dann bestimmt man die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion oder der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit der endgültigen Reaktionsmischung mit den sensibilisierten Trägerteilchen und vergleich .sie mit der Eichkurve, um in dieser Weise die Menge (Konzentration) des Antigens in der unbekannten Probe zu ermitteln.
Nach der Verfahrensweise der oben erwähnten LI-Methode kann man auch einen Antikörper in einer unbekannten Probe bestimmen, indem man einen bestimmlen Antikörper auf den unlöslichen Trägerteilchen fixiert Weiterhin ist es gewünschtenfalls möglich, gleichzeitig ein Antigen und einen Antikörper unterschiedlicher Art auf den unlöslichen Trägerteilchen zu fixieren und dann ein Antigen und einen Antikörper in einer unbekannten Probe zu bestimmen.
Somit gelingt erfindungsgemäß die quantitative Bestimmung einer großen Vielzahl von Antigenen und/oder Antikörpern, beispielsweise

1. die Blutuntersuchung von Patienten oder Blutspendern, was für Notmaßnahmen unerläßlich ist; beispielsweise kann man die Blutgruppensubstanzen, das Au- oder das HB-Antigcn oder andere Verunreinigungen Κ im Blut oder Fibrin/Fibrinogen-Abbauprodukte (FDP) bestimmen, was sich in jüngster Zeit als nützlich

ψ 30 erwiesen hat bei der Überwachung der Genesung von Patienten, denen eine Niere transplantiert worden ist

p oder die an N ieren versagen leiden;

>5; 2. die Bestimmung von Humanchoriongonadotropin (hCG), das eine wichtige Rolle spielt bei der Schwanger-

C Schaftsdiagnose oder be: der Überwachung der Genesung von Chorionepitheliomen;

jpf 3. die Bestimmung von Humanchoriongonadotropin oder von östrolgjucuronid, das ein Stoffwechselprodukt

35 des Follikelhormons darstellt, im Urin, welche Bestimmung für die Überwachung der Schwangerschaft von

|§ Bedeutung ist;

die Bestimmung von Oxytocin im Blut, von welcher Substanz man annimmt, daß sie Uteruskontraktionen verursacht;

die Bestimmung bestimmter Nebennierenrindenhormone, wie Corticoiden und Aldosteron oder von adrenocorticotropen Hormonen (ACTH);

die Bestimmung des Insulins bei Diabetikern oder die Bestimmung des Follikel-anregetiden Hormons, des luteinisierenden Hormons, von östrogenen, des Gelbkörperhormons (corpus luteum hormone) etc; die Bestimmung von Gastrin oder Sekretin, bei dem es sich um ein Magen-Darm-Hormon handelt; und der Nachweis und die Bestimmung von Antikörpern in Körperflüssigkeiten von Patienten, die an Allergien, Syphilis, hämolytischer Streptokokzidiose, Röteln, Autoimmunkrankheiten, wie Kollagenose, und anderen Infektionskrankheiten und dergleichen leiden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann natürlich auch zur qualitativen oder halbquantitativen Bestimmung dieser Antigene und/oder Antikörper angewandt werden.

In der F i g. 15 ist ein Beispiel für den Grundaufbau einer zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeigneten Vorrichtung dargestellt. Wie aus dieser Fig. 15 zu ersehen ist, umfaßt die Vorrichtung einen Monochromator 1 aus einer Lichtquelle und einem Filter oder einem Prisma, einem halbdurchlässigen Spiegel 2 zum Abteilen des Vergleichslichtstrahls, der durch eine Blende 3 einem Kompensationsdetektor 4 zugeführt wird, in dem der Vergleichslichtstrahl in ein elektrisches Signal umgewandelt wird, und dazu dient, die Änderung der Intensität des Lichtes der Lichtquelle festzustellen. Andererseits wird die die Antigen-Antikörper-Reaktionsmischung enthaltende Zelle 5 mit dem durch den halbdurchlässigen Spiegel 2 hindurchtretenden Licht belichtet und es wird die Intensität des durch die Probe geführten Lichtes mit dem Probendetektor 6 gemessen und in ein elektrisches Signal umgewandelt. Das durch den Probendetektor 6 gebildete elektrische Signal wird mit dem des Kompensationsdetektors 4 kombiniert und dann einem Verstärker 7 zugeführt. Die Gesamtänderung der

prozentualen Absorption der Reaktionsmischung, die bezüglich der Änderung der prozentualen Absorption als Folge einer Schwankung der Lichtintensität der Lichtquelle kompensiert worden ist, wird mit Hilfe der Aufzeichnungseinrichtung 8 aufgezeichnet. Alternativ kann man die Gesamtänderung der prozentualen Absorption elektrisch in die Extinktion umwandeln und mit Hilfe der Aufzeichnungseinrichtung 8 aufzeichnen. Andererseits kann man gewünschtenfalls auch das von dem Verstärker 7 abgegebene elektrische Signal mit

b5 einem Integrator 9 während einer gegebenen Zeitdauer integrieren und dann das Integral mit der Aufzeichnungseinrichtung 8 aufzeichnen.

Über die mit der Aufzcichnungseinrichiung aufgezeichnete Änderung der Extinktion oder der prozentualen Absorption mit der Zeit ist es möglich, die Geschwindigkeit der Änderung (der Zunahme) der Extinktion oder

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der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit zu ermitteln, wodurch es möglich wird, erfindungsgemäß das Antigen oder den Antikörper zu bestimmen.

Wie bereits erwähnt, ist die Absorptionszelle 5 vorzugsweise mit einer Rühreinrichtung versehen.

Als Lichtquelle für den Monochromator 1 kann man eine übliche Wolframlampe verwenden. Das von dieser Lichtquelle emittierte Licht wird durch ein Filter oder Prisma gefiltert oder monochromatisiert, so daß man die Zelle mit Licht mit Wellenlängen im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι und vorzugsweise im Bereich von 0,8 bis 1,4 μΐη bestrahlt Zu diesem Zweck wird das Filter oder das Prisma aus jenen Materialien ausgewählt, die dazu geeignet sind, in wirksamer Weise Licht der oben angegebenen Wellenlänge auszufiltern oder zu monochromatisieren. Beispielsweise kann man ein Interferenzfilter, das eine Wellenlänge von 1200 ± 50 nm ergibt, als Filter, oder man karai Prismen aus Glas oder Quarz verwenden.

Man kann aber auch als Lichtquelle eine lichtemittierende Diode, wie beispielsweise eine lichtemittierende Galliumarsenid-Diode mit einer Haibwertsbreite von 0,05 μιη und einer Spitzenemissionswellenlänge von 0,94 μιη oder dergleichen verwenden.

Die Absorptionszelle 5 kann aus transparentem Glas oder synthetischem Harz (beispielsweise einem Acrylharz) bestehen und einen schachtelartigen Aufbau mit rechteckigem Querschnitt besitzen. Die Dicke der Zelle kann im Bereich von 0,5 bis 10 mm und vorzugsweise im Bereich von 1 bis 5 mm liegen. Mit Vorteil besitzen die lichtdurchlässigen Fenster der Zelle für Licht mit Wellenlängen von 0,6 bis 2,4 μιη eine Transmission von mindestens 30% und vorzugsweise von «nehr als 80%. Als Detektoren 4 und 6 kann man irgendwelche Einrichtungen verwenden, die die Intensität des aufgefangenen Lichtes in ein elektrisches Signal umwandeln können, dessen Signalstärke der Intensität des Lichtes proportional ist. Beispielsweise kann man mit Vorteil Bleisulfid- ;ϊο Photoleiterelemente oder Silicium-Photodioden verwenden.

Die durch die Detektoren gebildeten elektrischen Signale können in üblicher Weise mit dem Verstärker 7 verstärkt und mit der Aufzeichnungseinrichtung 8 aufgezeichnet werden.

Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der Erfindung.

Beispiel 1

1. Herstellung eines mit Antifibrinogen-Anikörpern scnsibilisierten Latexreagens'
(Antifibrinogen-Latexreagens, Anti-Fg-Latexreagens,

Antifibrinogen-sensibilisiertes Latexreagens).

Zu 10 ml einer Lösung von Anti-humanfibrinogen (Fg)-Antikörpern (mit einer Konzentration von 2 mg/ml in einem Glycinpuffer gibt man 1 ml eines Polystyrollatex' mil einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,091 μιη (der einen Feststoffgehalt von 10Gew.-% aufweist und von der Firma Dow Chemical Company erhältlich ist) und 0,5 ml eines weiteren Polystyrollatex' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 μιη (dito),

rührt die Mischung 30 Minuten bei Raumtemperatur, erwärmt auf 40⁰C und rührt während weiterer 30 Minuten bei dieser Temperatur und zentrifugiert dann unter Kühlen auf 2 bis 4°C während 50 Minuten (bei 12000 min-'). Den Niederschlag trennt man durch Dekantieren ab und suspendiert die erhaltenen Latexteilchen, die mit dem Antifibrinogen-Antikörper sensibilisicrt sind, in einer Rinderserumalbuminlösung (mit einer Konzentration von 0,2 Gew.-%) unter Bildung eines Antifibrinogen-sensibilisierten Latexreagens', das die sensibilisierten Latexteilchen in einer Konzentration von 1 Gew.-% enthält.

2. Aufnahme einer Eichkurve

Man beschickt ein kleines Reagensglas mit 0,1 ml des in der Stufe 1 erhaltenen Antifibrinogen-Latexreagens', gibt 0,1 ml einer Glycinpufferlösung (mit einem pH-Wert von 9,6) und anschließend 0,2 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung mit einer in der nachstehenden Tabelle I angegebenen Konzentration, in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,2Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, zu und mischt durch Schütteln während 5 Sekunden bei Raumtemperatur gut durch. Anschließend wird die Mischung sofort in eine Acrylharzzelle mit einer Dicke von 2 mm überführt, die mit einem L-förmigen Rührstab, der auf und ab bewegt werden kann, ausgerüstet ist, und ermittelt die Extinktion der Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit, während dem man die Reaktionsmischung mit 160 Hüben pro Minute rührt. Man bestimmt die Extinktion mit Hilfe eines Spektrophotometers (Hitachi 340) bei einer Wellenlänge von 950 nm, wobei man das Photometer auf »Extinktion« einstellt. Das Licht der für die Messung herangezogenen Wellenlänge besitzt eine Schlitzbreite oder Halbwertsbreite von etwa 3 nm.

Die in dieser Weise von dem Spektrophotometer aufgezeichnete Kurve der Änderung der Extinktion mit der Zeit ist in der Fig. 3 dargestellt, in der die Kurven A, B. C und DFibrinogen-Konzentrationen von 0,0156,0,0313, 0,0625 bzw. 0,125 μg/ml entsprechen. Auf diesen Kurven wurde dann eine gerade Linie längs des geraden Abschnittseiner jeden Kurve in einem möglichst frühen Stadium nach Beginn der Aufzeichnung gezogen und es wurde die Neigung der geraden Linie berechnet. Die in dieser Weise erhaltenen Werte sind in der nachstehenden Tabelle I in der mit »Geschwindigkeit« bezeichneten Spalte angegeben, in der die Geschwindigkeit der Änderung der Extinktion als »Extinktion/min« angegeben ist. Die in dieser Weise erhaltenen Geraden sind in der Fi g. 3 als die Geraden A', B', Cund D'dargestellt. Die Korrelation zwischen der Antigenkonzentration und der in dieser Weise erhaltenen Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion als Folge der Agglutination des Latex' erfolgt graphisch, wodurch man die in der F i g. 4 dargestellte Eichkurve erhält.

29 05	Tabelle I	435
Konzentralion der Standard-
Fibrinogcn-l.ösung ^g/ml)	Geschwindigkeit der
	Zunahme der
	Kxtinklion
	bei 950 nm
0,0156	(Extinktion/min)
0,0313	0,0008
0,0625	0,00264
0,125	0.00480
0,250	0,0103
0,500	0,0256
!,00	0,0566
2,00	0.152
4,00	0,300
0.514

3. Bestimmung von Fibrinogen in unbekannten Proben

Man entnimmt einem Patienten eine Probe Blut oder Urin und trennt im Fall der Blutprobe Serum in üblicher Weise ab. Dann vermischt man einen aliquoten Anteil von 0,2 ml der unverdünnten oder verdünnten Probe (unter Anwendung des in der nachstehenden Tabelle II angegebenen Verdünnungsfaktors) mit 0,1 ml des gemäß Abschnitt 1 bereiteten Antifibrinogen-Latexreagens und 0,1 ml einer Glycinpufferlösung (pH 9,6) in der Weise, wie es in Abschnitt 2 angegeben ist, worauf man die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion in gleicher Weise, wie in Abschnitt 2 beschrieben, ermittelt. Dann liest man auf der gemäß Abschnitt 2 erstellten Eichkurve die Fibrinogen-Konzentration, die dem in dieser Weise ermittelten Wert der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion entspricht, ab. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle Il zusammengestellt.

Zu Vergleichszwecken sind in der Tabelle Il auch die Werte aufgeführt, die man mit Hilfe des üblichen Radioimmuntests (RIA-Methode) (S. M. Ratky et aL Brit.). Haematol.30 (1975) 145 bis 149) und der üblichen Objektträgermethode (Fujimaki, Tamura und Takahashi, Rinsho Kagaku, Japan (Clinical Science), 12 (1976) 507 und Fujimaki, ikematsu, Takeuchi und Kalo, Rinsho, Byori (Japanese Journal of Clinical Pathology), 21 (1973) 973) ermittelt hat.

Tabelle Il

Patient Unbekannte Probe Geschwindigkeit Fibrinogcnkonzcntration in der unbekannten

Nr. Maicrial Vcrdün- der Zunahme Probe ^g/ml)

gungs- der Extinktion Erfindungs- RIA-Methode Objektträgerfaktor (Extinktion/min χ 10²) gemäßes Verfahren methode

1	Urin	χ 16	3.7	5,28	4,892	8,0
2	Urin	χ 1	3,25	030	0,282	0,5
3	Urin	χ 1	0,087	0.015	0,020	<0,5
4	Urin	χ 1	<0,05	<0,01	0,006	0,5
5	Urin	χ 1	0,365	0,049	0.052	0,5
6	Urin	χ 1	0.088	0,015	0.011	0.5
7	Urin	χ 1	0,330	0,045	0,023	0,5
8	Urin	χ 1	<0.05	<0,01	0.006	0,5
9	Urin	χ i	0332	η /\j c V_tVTJ	0.072	0,5
10	Serum	X 10	0.671	0,810	0.789	1,0
11	Serum	XlO	0,665	0305	0,850	1.0
12	Serum	XlO	U2	1,42	U35	1,25
13	Serum	XlO	0,698	0.84	0.870	1,0

Beispiel 2

1. Herstellung eines mit Antihumanchoriongonadotropin-Antikörpern

sensibilisierten Latexreagens' (Anti-hCG-Latexreagens, Antihumanchoriongonadotropin-sensibilisiertes Latexreagens)

Nach der in Abschnitt 1 von Beispiel 1 beschriebenen Weise bereitet man ein Antihumanchoriongonadotropin-sensibilisiertes Latexreagens, mit dem Unterschied, daß man anstelle des Anti-(humanfibrinogen)-Antikörpers einen Anti-(humanchoriongonadotropin)-Antikörper (Anti-hCG)-verwendet, anstelle der Mischung aus gleichen Volumina von Polystyrollatices mit durchschnittlichen Teilchendurchmessern von 0,091 bzw. 0,220 μπι einen monodispersen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 μπι einsetzt und die Konzentration der Latexteilchen in dem fertigen Reagens auf 0.25% einstellt.

2. Aufnahme der Eichkurve

In einem kleinen Reagensglas vermischt man durch heftiges Schütteln während 5 Sekunden 0,15 ml des in dem obigen Abschnitt gebildeten Anti-hCG-Latexreagens' und 0,15 ml einer Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung, der in der in der nachstehenden Tabelle III angegebenen Konzentration in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,2 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält. Unmittelbar anschließend überführt man die Mischung in einer Acrylharzzelle mit einer Dicke von 4 mm, die mit einem kompakten Rührer mit einem Rührflügeldurchmesser von 2,4 mm ausgerüstet ist, wonach man die Änderung der prozentualen Absorption der Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit mißt, währenddem man die Mischung bei 1200 min-¹ rührt. Die Bestimmung der prozentualen Absorption erfolgt unter Verwendung einer Licht emittierenden Ga/AS-Diode (Monsanto Company, Modell ME-7124, Spitzenemissionswellenlänge: 940 nni, Halbwertsbreite 50 nm) als Lichtquelle. Das von der Lichtquelle emittierte Licht wird direkt auf die Zelle gerichtet, worauf man das durchgelassene Licht mit Hilfe einer Silicium-Photozelle (Hamamatsu TV, Modell S 874-8K) mißt. Das Ausgangssignal der Photozelle wird verstärkt und es wird die Änderung der prozentualen Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit mit Hilfe eines Schreibers aufgezeichnet. Die in dieser Weise erhaltene Kurve ist in der F i g. 5a dargestellt. Auf dieser Kurve wird dann eine gerade Linie längs des annähernd geraden Abschnitts der Kurve in einem möglichst frühen Stadium nach Beginn der Aufzeichnung gezeichnet, worauf man die Steigung der Geraden berechnet. Die in dieser Weise erhaltenen Werte sind in der nachstehenden Tabelle III in der mit »Geschwindigkeit« bezeichneten Spalte angegeben, in der die Geschwindigkeit der Änderung der prozentualen Absorption in %/min angegeben ist. Diese Bestimmung erfolgt für jede Konzentration doppelt, um die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu überprüfen. Aus den in der Tabelle III angegebenen Zahlenwerten wird die in der F i g. 6a dargestellte Eichkurve erstellt, indem man graphisch die Korrelation zwischen der Konzentration des Antigens und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption als Folge der Agglutination des Latex' ermittelt. In der F i g. 6a sind die Werte auf beiden Achsen in logarithmischem Maßstab angegeben.

Tabelle 111

Die Fig.5b zeigt die Kurven, die man erhält, wenn man die in der Fig.5a dargestellten Kurven, die tatsächlich von dem Schreiber aufgezeichnet wurden, in die Extinktion umwandelt. Mit Hilfe der in der F i g. 5b dargestellten Kurven wird die Geschwindigkeit der Änderung der Extinktion in gleicher Weise ermittelt, wozu man den ungefähr geraden Abschnitt einer jeden Extinktionskurve in einem möglichst frühen Stadium nach Beginn der Reaktion verwendet. Die F i g. 6b zeigt anhand einer Kurve die Beziehung zwischen der in dieser Weise ermittelten Geschwindigkeit der Änderung der Extinktion und der Konzentration der Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung. Die in dem nachstehenden Abschnitt 3 beschriebene Bestimmung unbekannter Proben könnte auch mit Hilfe der F i g. 6b erfolgen.

3. Bestimmung von Humanchoriongonadotropin in unbekannten Proben

Man entnimmt einem Patienten eine Probe Blut oder Urin, wobei man im Fall einer Blutprobe Serum in üblicher Weise isoliert. Die Probe wird dann in der in der nachstehenden Tabelle IV angegebenen Weise verdünnt. In gleicher Weise, wie es in dem obigen Abschnitt 2 angegeben ist, werden dann 0,15 ml der verdünnten Probe mit 0,15 ml des in dem Abschnitt 1 bereiteten Anti-hCG-Latexreagens umgesetzt und es wird die Änderung der prozentualen Absorption in Abhängigkeit von der Zeit bestimmt, um die Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption zu ermitteln. Der in dieser Weise erhaltene Wert wird mit der Eichkurve verglichen und es wird von der Eichkurve dia diesem Wert der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption entsprechende Konzentration des Humanchoriongonadotropins abgelesen. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IV zusammengestellt, die zu Vergleichszwecken auch die Zahlenwerte enthält, die man in der gleichen Probe mit Hilfe der Radioimmunoassay-Methode ermittelt hat (Radioimmunoassay Method, K. Okumura, J. of Jap. Endocrinologic Soc. 52 (1976) 105).

Konzentration	Geschwindigkeit der Änderung	2. Messung	Mittel
der Standard-hCG-Lösung (internationale	der prozentualen Absorption	1,78	1.81
Einheiten/ml)	bei 940 nm (%/min)	3,18	3.15
	I.Messung	5,50	5,50
0,078	1,84	9,40	9,51
0,156	3,12	14,8	14,85
0,312	5,50
0,625	9,62
1,25	14,9

Tabelle IV

Bestimmung einer unbekannten Probe

Probe	And.	Name des	Diagnose	Verdiinnungs-	Geschwin	H umanchoriongonadotro-	RIA-
Nr.	Probe	Patienten		faktor	digkeit	pin-	Methode
		(Geschlecht)			(%/min)
						Konzcntration in der unbe	65,16
						kannten Probe (IU/ml*)
						erfindungs	682,9
						gemäßes
1	Urin	H. M.(w)	Schwangerschaft	XlOO	9,2	Verfahren	0,484
			(10. Woche)			60
2	Urin	K.O.(w)	Traubenmole	XlOO	10,2		0,182
			(8. Woche)			690
3	Urin	R. H.(w)	Nach Entfernen	xi	7,8		0,194
			der Traubenmole			0,45
4	Urin	G. M.(m)	Rechtes Testi-	xl	3.8		0,0741
			culom			0,20	6,17
5	Urin	T.l.(w)	Teilabort	xl	3,5		0,544
			(4. Woche)			0,18	0,673
6	Serum	T.Y.(w)	Traubenmole	xl	1,7		100.3
7	Serum	E.S.(m)	Testiculom	xlO	9,6	0.075
8	Serum	S.K.(w)	Traubenmole	xl	7,7	6,4
9	Serum	H.N.(m)	Bösartiges Thymom	xl	10,0	0,48
10	Serum	R. W.(w)	Schwangerschaft	XlOO	13,2	0,69
			(6.Woche)			95
*) IU/ml — internationale Einheilen/ml
	Beispiel 3

Man setzt einen aliquoten Anteil von 0,1 ml eines gemäß Abschnitt 1 von Beispiel 2 bereiteten Antihumanchoriongonadotropin-Antikörper-sensibilisierten Latexreagens' mit einem Latexgehalt von 0,33% mit 0,1 ml einer Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung in der in Abschnitt 2 von Beispiel 1 beschriebenen Weise um und zeichnet die Änderung der prozentualen Absorption auf. Die Bestimmung der prozentualen Absorption erfolgt unter Anwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Vorrichtung, mit dem Unterschied, daß man für die Bestrahlung ein monochromatisches Licht mit einer Wellenlänge von 950 nm und einer Schlitzbreite von 30 nm (was einer mechanischen Schlitzbreite von 0,36 mm entspricht) verwendet, die man mit Hilfe eines Prismenspektrophotometers (Hitachi Modell EPU-2) als Lichtquelle bildet und wobei man eine Zelle mit einer Dicke von 3 mm einsetzt. Aus dem geraden Abschnitt der aufgezeichneten Kurve, die die Änderung der prozentualen Absorption in Abhängigkeit von der Zeit wiedergibt, ermittelt man die Geschwindigkeit der Änderung der prozentualen Absorption pro Zeiteinheit und trägt diese auf der Ordinate gegen die Konzentration der Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung auf der Abszisse auf doppelt-logarithmischem Papier auf und erhält in dieser Weise die in der Fig. 7 dargestellte Eichkurve. Unter Verwendung dieser Eichkurve kann man die Humanchoriongonadotropin-Konzentration unbekannter Proben bestimmen.

Beispiel 4

Nach der in Abschnitt 1 von Beispiel 1 beschriebenen Weise bereitet man ein Antifibrinogen-Latexreagens mit einem Latexgehalt von 0,50%, mit dem Unterschied, daß man die Mischung aus gleichem Volumina eines Polystyrollate s' mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,091 μπι und einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 μπι durch einen monodispersen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0312 μπι (Dow Chemical) ersetzt.

Dann vermischt man in einem kleinen Reagensglas 0,2 ml des Latexreagens und 0,2 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise durch Schütteln während 5 Sekunden. Unmittelbar anschließend überführt man die Reaktionsmischung in eine Zelle mit einer Dicke von 2 mm und zeichnet die Änderung der prozentualen Absorption auf, währenddem man die Mischung mit Hilfe eines auf und ab bewegten Rührstabes nach der in Beispiel 1 beschriebenen Weise bewegt Die Bestimmung der prozentualen Absorption erfolgt in der in Beispiel 3 beschriebenen Weise, mit dem Unterschied der andersartigen Rühreinrichtung. Die in dieser Weise erhaltenen Zahlenwerte werden dann nach der in Beispiel 3 angegebenen Weise aufgearbeitet, wobei man die Korrelationswerte zwischen der Konzentration der Standarad-Fibrinogen-Lösung und der Geschwindigkeit der Änderung der prozentualen Absorption erhält, die in der nachstehenden Tabelle V angegeben sind, aus denen man die in der Fi g. 8 dargestellte Eichkurve erstellt. Unter Verwendung dieser Eichkurve kann die Fibrinogenmenge in unbekannten Proben bestimmt werden.

	29 05 435	Zunahme der
Tabelle V		prozentualen Absorption
Konzentration der Standard- Geschwindigkeit der	(%/min)
Kibrinogen-	1,03
Lösung(ng/inl)	2,48
	4,95
15,6	7,70
31,3	15,15
62,5	30,0
125	48,5
250	Beispiel 5
500
1000

Unter Anwendung des in Beispiel 3 verwendeten Antihumanchoriongonadotropin-Latexreagens' bestimmt man die Änderung der prozentualen Absorption. Die für diese Messung verwendete Vorrichtung entspricht der in Beispiel 3 beschriebenen, mit dem Unterschied, daß man die Lichtquelle durch eine Kombination aus einer üblichen Wolframlampe (12 V, 8 W) und einem optischen Filter (Ditric Optics, D 800) ersetzt und die Zelle mit Licht bestrahlt, das keine Spektralkomponente mit einer Wellenlänge von weniger als 800 nm enthält. Die in dieser Weise erhaltenen Zahlenwerte werden nach der in Beispiel 3 beschriebenen Weise aufgearbeitet, wodurch man die in der nachstehenden Tabelle Vl angegebenen Ergebnisse erhält, die die Korrelation zwischen der Humanchoriongonadotropin-Konzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der prozentualen Absorption wiedergeben. Die Ergebnisse sind graphisch in der in der F i g. 9 dargestellten Eichkurve wiedergegeben, mit der die Humanchoriongonadotropin-Menge in unbekannten Proben nach der in Beispiel 2 angegebenen Weise bestimmt werden können.

Tabelle Vl

Konzentralion der Standard-Humanchoriongonadotropin- Lösung(IU/ml)*)

Geschwindigkeit der
Änderung der prozentualen
Absorption (%/min)

0,125 0,25 0,5 1.0 2,0 4,0

*) IU/ml = internationale Einheiten/ml.

Beispiele

Man ersetzt ein nach der Verfahrensweise von Beispiel 2 hergestellten Anti-(humanchoriongonadotropin)-Antikörper-sensibilisiertes Latexreagens (Antihuman-choriongonadotropin-Latexreagens) mit einer Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung der in der nachstehenden Tabelle VH angegebenen Konzentration um. Dann bestimmt man die Änderung der prozentualen Absorption unter Verwendung der in Beispiel 2 beschriebenen Lichtquelle und des dort angegebenen Detektors, mit dem Unterschied, daß man zwischen dem Detektor und der Aufzeichnungseinrichtung einen Integrator zwischenschaltet. Die Integration erfolgt zusammen mit dem Rühren, wobei eine Integration der prozentualen Absorption während Perioden von 9 Sekunden, zwischen denen Pausen von 1 Sekunde liegen, vorgenommen wird. Die Geschwindigkeit der Änderung wird aus den Integralen der fünften und sieben Periode von 9 Sekunden ermittelt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VII zusammengestellt

Tabelle VH

ίο

Konzentration der	Integral (a) der	Integral (b) der	(bHa)
Standai J- H umanchorion-	fünften Periode von	siebten Periode von
gonadotropin- Lösung	9 Sekunden	9Sekunden
(lU/mI)^#)	(Schreibe rablcsung)	(Schreiberablesung)

0,0625	03
0.125	143
0,25	223
030	39
1.0	70
2.0	96

13	1.0
163	2,0
27.0	43
47	8.0
90	20
141	45

15 20

30

40 45 50 55 60 65

*) IU/m! = internationale Einheiten/ml.

Die in der obigen Tabelle angegebenen Zahlenwerte sind in der F i g. 10 graphisch dargestellt Unter Verwendung der in der F i g. 10 angegeben Kurve als Eichkurve kann die Humanchoriongonadotropin-Konzentration unbekannter Proben in der oben beschriebenen Weise ermittelt werden.

Beispiel 7

Nach der in Beispiel 2. Abschnitt 1 beschriebenen Weise bereitet man ein Antihumanchoriongonadotropinsensibilisiertes Latexreagens, mit dem Unterschied, daß man die Konzentration der Latexteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 0,220 μίτι in dem fertigen sensibilisierten Latexreagens auf l,0Gew.-% einstellt

Die anschließende Umsetzung und Messung erfolgt nach der Verfahrensweise und unter Verwendung der Vorrichtung, die in Abschnitt 2 von Beispiel 1 beschrieben sind, mit dem Unterschied, daß man die Standard-Fifa rinogen-Lösungen durch Standard-Humanchonongonadotropin-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen, die in der nachstehenden Tabelle VIII angegeben sind, ersetzt Aus den in dieser Weise erhaltenen Daten erstellt man die in der F i g. 11 dargestellte Eichkurve, die die Beziehung zwischen der Antigenkonzentration und der Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion wiedergibt Unter Verwendung dieser Eichkurve kann die Humanchoriongonadotropin-Konzentration in unbekannten Proben nach der Verfahrensweise von Beispiel 2 bestimmt werden.

Tabelle VIII

Konzentration der Standard- Geschwindigkeit der	bei 950 nm
Humanchoriongonadoiropin- Zunahme der Extinktion	(Exlinkiion/niinx IO²)
Lösung (IU/ml)·)	0,00156
	0,016
0,078	0.0278
0,156	0,075
0,313	0,197
0,625	0.480
1,25	*) IU/ml = internationale Einhciten/ml.
2,5
Beispiel 8

Nach der Verfahrensweise von Beispiel 1, Abschnitt 1, bereitet man ein mit Antifibrinogen-Antikörpern sensibilisiertes Latexreagens (A.itifibrinogen-Latexreagens) (Latexteilchengehalt: 1 Gew.-%), mit dem Unterschied, daß man einen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 μηι (Dow Chemical, Feststoffgehalt = 10 Gew.-%) verwendet.

In einem kleinen Reagensglas vermischt man durch Schütteln während 5 Sekunden 0,1 ml des in dieser Weise erhaltenen Antifibrinogen-Latexreagens', 0,1 ml einer Glycinpufferlösung (mit einem pH-Wert von 9.6) unc 0,2 ml einer Standard-Fibrinogen-Lösung, die Fibrinogen in den in der nachstehenden Tabelle IX abgegebener Konzentrationen in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält enthalten. Anschließend bestimmt man die Änderung der Extinktion in Abhängigkeit von der Zeit mit der ii Abschnitt 2 von Beispiel 1 beschriebenen Vorrichtung bei einer Wellenlänge von 900 nm (Schlitzbreite: etwi 3 nm). Man ermittelt die Geschwindigkeit der Zunahme der Extinktion als Folge der Agglutination des Latex' ii der in Abschnitt 2 von Beispiel 2 beschriebenen Weise (welche Werte in der nachstehenden Tabelle IX angege ben sind) und ermittelt die Korrelation dieser Werte mit der Antigenkonzentration der Standardlösung gra phisch, wodurch man die in der F i g. 12 dargestellte Eichkurve erhält.

Aus diesen Zahlenwerten ist ersichtlich, daß selbst dann, wenn die Wellenlänge, bsi der die Exinktion gemessen wird, um einen Faktor von lediglich 1,13 länger ist als der durchschnittliche Teilchendurchmesser des Latex", eine zufriedenstellende Korrelation zur Bestimmung der Antigenkonzentration erreicht wird und dies bei Konzentrationen des Antigens in Standardiösungen von nicht mehr als 1 μg/mL

Tabelle IX

Konzentration der Standard- Geschwindigkeit der	Extinktion bei 900 nm
Fibrinogen-Lösung ^g/ml) Zunahme der	(Extinktion/min)
	0,0008
	0.0034
0,0625	0,0090
0,125	0,0148
0,250	0,0276
0,500	0,0296
1,00	Beispiel 9
4,00

10 15 20

Man bereitet nach der in Beispiel 2 angegebenen Verfahrensweise, jedoch mit dem Unterschied, daß man den Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,220 μηι durch einen Polystyrollatex mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 1,091 μιη (Dow Chemical, Feststoffgehalt = 10Gew.-%) ersetzt, ein Antihumanchoriongonadotropin-Latexreagens, das 0,3 Gew.-°/o Latexteilchen enthält.

Man beschickt ein kleines Reagensglas mit einem aliquoten Anteil von 0,2 ml des in dieser Weise bereiteten Antihumanchoriongonadotropin-Latexreagens' und gibt 0,2 ml einer Standard-Humanchoriongonadotropin-Lösung der in der nachstehenden Tabelle X angegebenen Konzentration in einer isotonischen Natriumchloridlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, zu. Anschließend zeichnet man die Änderung der Extinktion der Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit unter Anwendung der Verfahrensweise und der Vorrichtung von Abschnitt 2 des Beispiels 1 auf, mit dem Unterschied, daß man eine Wellenlänge von 1100 nm (Schlitzbreite: etwa 3 nm) anstelle einer Wellenlänge von 950 nm einstellt. Auf der Grundlage der in dieser Weise aufgezeichneten Änderung der Extinktion in Abhängigkeil von der Zeit ermittelt man die in der Fig. 13 dargestellte Eichkurve nach der Verfahrensweise von Beispiel 1, Abschnitt 2.

Aus der Fig. 13 ist ersichtlich, daß selbst dann, wenn das Verhältnis von Wellenlänge zu durchschnittlichem Teilchendurchmesser des Latex annähernd 1,0 beträgt, die erfindungsgemäße Verfahrensweise dazu geeignet ist Humanchoriogonadotropin-Konzentrationen von nicht mehr als 1,0 internationale Einheiten/ml zu bestimmen.

Tabelle X

45 50 55

Beispiel 10

Nach der Verfahrensweise von Beispiel 8 führt man eine Reihe von Untersuchungen durch, bei denen man einen Antifibrinogen-scnsibilisierten Latex (mit einem durchschnittlichen Teilchendurchmesser von 0,804 μιη) identisch dem in Beispiele verwendeten und Standard-Fibrinogen-Losungen unterschiedlicher Konzentrationen, die in der nachstehenden Tabelle Xl angegeben sind, in isotonischer Natriumchioridlösung, die 0,1 Gew.-% Rinderserumalbumin enthält, verwendet. Die Bestimmung der Extinktion erfolgt bei einer Wellenlänge von 1650 nm anstelle einer Wellenlänge von 900 nm bei Anwendung einer Schützbreile von etwa 3 nm. Die in dieser

Konzentration der Standard-	Geschwindigkeit der
Humanchoriongonadolropin-	Zunahme der Extinktion
Lösung	bei 1100 min
(internationale Einhcitcn/ml)	(Extinktion/min)
0,0156	0,0032
0,0313	0,0072
0,0625	0,0095
0,125	0,0169
0,250	0,025
0,500	0,033
1,00	0,050
2,00	0,066
4,00	0,066

i-t

Weise erhaltene und in der Fig. 14 dargestellte Eichkurve ist FQr die Bestimmung der Antigenkonzentration geeignet

Tabelle XI

Konzentration der Standard-	Hierzu 14 Blatt	Geschwindigkeit der
Fibrinogen-Lösung ^g/ml)	Zunahme der
	Extinktion bei 1650 nm
	(Extinktion/min)
0,0313	0.00128
0,0625	0,0020
0,250	0,0116
0,500	0,027
1,00	0.044
4,00	0.092
Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Bestimmung von Anligenen und Antikörpern durch Umsetzen eines Antigens oder eines Antikörpers oder einer Mischung davon in einem flüssigen Medium mit unlöslichen Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser von nicht mehr als 1,6 um die mit dem entsprechenden Antikörper bzw. Antigen sensibilisiert sind. Bestrahlen der Reaktionsmischung mit Licht mit einer Wellenlänge im Bereich von 0,6 bis 2,4 μπι und Messung der optischen Durchlässigkeit der Reaktionsmischung in Abhängigkeit von der Zeit, dadurch gekennzeichnet, daß man das durchgelassene Licht an zwei oder mehreren Zeitpunkten während des Ablaufs der Reaktion mißt und die Zunahme der Extinktion oder der prozentualen

ίο Absorption der Reaktionsmischung während einer gegebenen Zeitdauer bestimmt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zunahmegeschwindigkeit zu einem früheren Zeitpunkt, nachdem die Reaktion den stationären Zustand erreicht hat, ermittelt

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man unlösliche Trägerteilchen mit einem durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,1 bis 1,0 μπι verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man unlösliche Trägerteilchen mit einem

durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,2 bis 0,8 μπι verwendet 5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Trägerteilchen aus einem feinteiligen

Pulver aus einer organischen hochmolekularen Substanz oder einer anorganischen Substanz, die in dem flüssigen Medium im wesentlichen unlöslich ist, verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Trägerteilchen aus einem synthetischen Harz, Bakterien oder Zellmembranfragmenten verwendet.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man Trägerteilchen aus Polystyrollatex verwendet

8. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägerteilchen eine Substanz aus der Gruppe Metalle, anorganische Oxide und Mineralien verwendet.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man als Trägerteilchen Siliciumdioxid, Aluminiumoxid oder Siliciumdioxid-Aluminiumoxid verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktion unter Bewegen der Reaktionsmischung durchführt.

11. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Reaktionsmischung mit monochromatischem oder polychromatischem Licht mit einer Wellenlänge oder Wellenlängen im Bereich von 0,8 bis 1,4 μΐη bestrahlt.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Trägerteilchen in der Reaktionsmischung in einer Konzentration im Bereich von 0,05 bis 1 Gew.-% verwendet.

13. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet daß man die Trägerteilchen in der Reaktionsmischung in einer Konzentration im Bereich von 0,1 bis 0,6 Gew.-% verwendet.

14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als flüssiges Medium Wasser oder eine Mischung aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmittel verwendet.

15. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine ein Antigen oder einen Antikörper enthaltende Testflüssigkeit mit einer Suspension der sensibilisierten Trägerteilchen umsetzt.

16. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine einen zu bestimmenden Antikörper oder ein zu bestimmendes Antigen enthaltende Testflüssigkeit zunächst mit dem entsprechenden Antigen bzw. Antikörper umsetzt und die gebildete Reaktionsmischung dann mit einer Suspension der mit dem entsprechenden Antikörper bzw. dem entsprechenden Antigen sensibilisierten Trägerteilchen umsetzt.

17. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gcmä ß einem der vorstehenden Ansprüche mit