DE307975C

DE307975C -

Info

Publication number: DE307975C
Application number: DENDAT307975D
Authority: DE

Description

KAiSERLICHES

PATENTAMT.

I. Zum leichteren Verständnis des vorliegenden Verfahrens wird von einer Beschreibung des ihm ähnlichen bekannten Maraglianos e hen Verfahrens der Impfung gegen Tuberkulose und Herstellung von Immunmilch (Berliner Klinische Wochenschrift 1904, Nr. 23 und 24) ausgegangen. Nach dem Maraglianoschen Verfahren wird humoral mit Aufgüssen und Extrakten wasserlöslicher Bestandteile von Tuberkelbazillen - Kulturen immunisiert. Was damit erzielt werden kann, sind wiederum nur Reaktionsprodukte auf die wasserlöslichen Bestandteile, in letzter Linie, um es mit einem Schlagwort zu bezeichnen, Tuberkuli'nwirkungen oder tuberkulinähnliche Wirkungen, nicht aber der ganze Komplex der Tuberkulose-Immunität, der eben nur durch die Einbringung sämtlicher Partialantigene in den zu immunisierenden Organismus erreicht werden kann. Maragliano bedient sich besonders zweier von ihm als »Polpa bacillare« und »Liquido F.« bezeichneter Präparate.

A. Darstellung der »Polpa bacillare«.

.Man filtriert Tuberkelbazillen - Kulturen im Alter von 40 bis 60 Tagen durch das Filter und wäscht sie darauf mit sterilisiertem, destilliertem Wasser so lange, bis sie schön weiß sind und das Wasser klar abläuft. Darauf wägt man die vom Filter ohne Wasser abgehobenen Bazillen feucht und berechnet, wieviel Flüssigkeit (Polpa) man damit erhält, wenn die Polpa bacillare eine Konzentration von ι: 10 haben soll. Z. B. verwendet man zur Herstellung von 11 Polpa 100 g feuchte Bazillen und behandelt diese auf" folgeöde Weise:

1. 350 ecm sterilisiertes destillieries Wasser werden zunächst mit dieseri 100 g Bazillen vermengt und kurze Zeit geschüttelt, um die größeren Bazillenklumpen zu trennen. Darauf wird durch Papier filtriert.

2. Die auf dem Filter zurückgebliebenen Bazillen vermischt man mit feinkörnigem, sterilem Sand und verreibt diese Masse sehr gut im Mörser lange Zeit. Das vorhin verwendete Wasser (350 ecm filtriert) mischt man nach und nach zu den verriebenen Bazillen. Nach weiterem guten Verreiben fügt man noch weitere 350 ecm sterilisiertes destilliertes Wasser hinzu. ,

3. a) Hierauf bringt man die gesamte Masse in einen Erlenmeyer - Kolben und läßt sie 24 Stunden im Brutschrank stehen. Es setzen sich deutlich 3 Teile ab: Sand, Bazillen, Liquor (Flüssigkeit),

Nun gießt man das obenstehende Wasser vorsichtig ab und läßt es ein Chamberland-Filter bei normalem Druck (1 Atm.) passieren.

b) Hat man die gesamte Flüssigkeit filtriert, so setzt man 150 ecm heißes, fast kochendes sterilisiertes destilliertes Wasser in das Chamberland-Filter zum Rückstand und filtriert, so daß jetzt die Extraktion und Filtration eine ausgiebige wird. Das Filtrat ist nun die Polpa bacillare auf kaltem Wege hergestellt.

4. Vom Chamberland-Filter nimmt man nun den Rückstand (Bazillen und wenig Sand) und fügt ihn zu der noch im Erlenmeyer-Kolben vorhandenen Masse (Bazillen und Sand), fügt

3^{00 ccm} sterilisiertes destilliertes Wasser hinzu und läßt diese Flüssigkeit bis auf die Hälfte einkochen. Hierauf filtriert man wieder durch ein Chamberland - Filter. Das Filtrat ist die Polpa bacillare auf heißem Wege herge- _: stellt.

Das durch Vermischen der beiden Polpa-

präparate (Polpa bacillare i. auf kaltem, 2. auf heißem Wege bereitet) hergestellte Präparat ist die zur Immunisierung verwendete »Polpa bacillare 1:10«.

B. Darstellung des »Liquido F.«.

a) Zur Darstellung von »Toxin auf kaltem Wege« filtriert man Kulturen durch ein gehärtetes Filter und darauf durch ein Chamberland-Filter; das Filtrat ist das Toxin.
• b) Zur Bereitung des »Toxins auf warmem Wege« (dieses stärkere Toxin wird zur Immunisierung der Ochsen unter Zusatz von Kochschem Tuberkulin verwendet) läßt man die Bouillonkulturen 2 Stunden bei 120⁰C stehen und am folgenden Tage nochmals 2 Stunden bei gleicher Temperatur und filtriert hierauf wiederum durch ein gehärtetes Filter und ein Chamberland-Filter. Das Chamberland-Filtrat ist das Toxin.

Der »Liquido F.« nun wird durch Vermischen von gleichen Teilen wässerigen Tuberkulins nach Maragliano (im Gegensatz zum Koch-Sehen ohne Glycerin) und »dem auf kaltem Wege« gewonnenen Toxin dargestellt.

C. Technik der Immunisierung
der Kühe.

Man wechselt mit den-Präparaten, a) der Polpa bacillare, und b) Liquido F., beginnend mit 5 ecm Polpa subkutan; wöchentlich zwei Injektionen, vorausgesetzt, daß keine Temperatursteigerungen eintreten. Dann Pause.

Man steigert die Dosen bis 60 ecm pro Injektion. Nach etwa 3 Monaten beginnt die serologische, Kontrolle.

D. Beispiel:

Immunisierung einer Kuh zur Erzeugung von Tuberkulose - Immunmilch nach Maragliano (vom Erfinder selbst und seinem Assistenten im Frühjahr 1914 im Istituto Maragliano in Genua ausgeführt).

Zur Verwendung gelangten Polpa bacillare und Liquido F. Das Tier wurde am 3.3. 14 durch Temperaturprobe mit Tuberkulin als tuberkulosefrei befunden und zeigte an diesem Tage Temperaturen von 38,5, 38,8 und 38,7. Die Immunisierung begann am 7. 3. .mit

7-3-	P. io Temp. 38,4	38,o	gesetzt bis 26. 5.	—L
ίο. 3-	F- 5 - 38,4	38,9	Milchuntersuchung:
12. 3-	P- 10 - 38,5	—	Antigene + + +	.
17- 3-	F- 20 - 38,5	—	Antikörper + +.
20. 3-	P. 20 - ■ — "	—	F. 80 Temp. —
24- 3-	F. 40 - 38,5	38,7	P- 85 - 38,7	Jetzt Aussetzen der Immunisierung.
26. 3-	P. 40 - 38,4		P- 90 - 38,6
28.₃.	F. 40 - 38,5	■—	P. 80 - 38,1
3¹· 3-	P. 50 - 38,6	—	F. 90 - 38,1
3·4·	F. so - —	—
	Milchuntersuchung:			26.6.
	Antigene + +			Milchuntersuchung:
	Antikörper +.			Antigene + + +
8.₄.	P. 40 Temp. 38,7	38,6	Antikörper + +.
ίο. 4·	F. 60 - —	' —
14-4-	F. 60 - —	=—
I₇. 4-	P. 60 - 38,4
22.,4.	F. 60 - 38,5	—
	Milchuntersuchung:
	Antigene + + +
	Antikörper +.
28.4-	P. 60 Temp. 38,3	38,1
4-5-	F. 70 - —	—
9-5-	P. 80 - —	—
ΐΐ. 5·	F. 80
weniger Milch, Immunisierung aus-




30.5-
2. 6.
4-6.
6/6.
9-6-

Es zeigte sich bei der Untersuchung des no Milchserums, daß nach der Impfung, wie schon
des öfteren im Maraglianoschen Institut festgestellt wurde, sowohl im Blutserum als auch
hier im Milchserum die Antigene zuerst vorherrschen, während die Bildung der Antikörper na- 115 turgemäß erst in späterer Zeit zu erwarten ist.

Die quantitative Dosierung der Antikörper
und Antigene in Milchserum steht noch aus.

Zur Untersuchung des Milchserums der Kuh
werden zwei Testpräparate verwendet, welche 120 im Maraglianoschen Institut kurzweg als »Antigene« und »Anticorpo« bezeichnet > werden.

ι. Das »Antigene« ist ein wässeriges tuberkulöses Testantigen, vermittels dessen der Nachweis der humoralen Antikörper im Blut und im Milchserum ausgeführt wird.
2. Das »Anticorpo« ist 'ein antikörperreiches antituberkulöses Serum, welches für die Bestimmung des im Blut- bzw. im Milchserum befindlichen wässerigen Antigens verwendet wird und selbst ebenfalls wässerige Antikörper enthält. Diese beiden Testpräparate dienen eben nur zum Nachweis der bereits erreichten Immunisierung.

II. Von dem vorstehend beschriebenen bekannten Maraglianoschen Verfahren unterschei_fdet sich das neue Verfahren dadurch, daß nicht etwa wasserlösliche Bestandteile oder Sekretionsprodukte des Tubeikelbazillus, sondern die vorsichtig, aber vollständig abgetöteten Tuberkelbazillen bzw. deren Präparationen,

d. h. die aufgeschlossene Substanz derselben verwendet wird, wobei es an sich gleichgültig ist, ob diese Auf Schließung nach dem Verfahren

. von Deycke und Much oder nach dem vom Erfinder selbst angegebenen oder nach einem anderen, vielleicht noch zu erfindenden Verfahren erfolgt. Die Hauptsache ist, daß sämtliche Bestandteile des Tuberkelbazillus womöglich in chemisch aufgeschlossener Form den Versuchstieren (Milchkühen) einverleibt werden, was im allgemeinen durch subkutane Injektion geschieht, aber auch durch den Verdauungsweg geschehen könnte. Das Resultat der !Einführung der Gesamtheit aller

chemischen Bestandteile des Tuberkelbazillus (Partialantigene) in den Körper der Milchkuh ist die Erzeugung von Antikörpern im Blutserum auf jeden dieser festen und chemisch. wohl charakterisierten Bestandteile. Diese Antikörper lassen sich als Partialan tikörper vermittels des Bordet-Gengouschen Verfahrens im Blutserum der geimpften Tiere nachweisen.

Aus den Versuchen des Erfinders ergab sich aber nicht nur die Tatsache, daß Antikörper, und zwar Partialantikörper, überhaupt im Blutserum und, wie es selbstverständlich ist, auch im Milchserum der betreffenden Kühe vorhanden sind, sondern auch, daß diese Antikörper im Milchserum sich in einer äußerst charakteristischen Weise von den Antikörpern im Blutserum der Kuh unterscheiden. Es treten , nämlich nach der Impfung im Milchserum ganz außerordentlich große Mengen von Fettpartial antikörpern auf, wie sie im Blutserum desselben Tieres nicht nachgewiesen werden konnten. Dies wurde durch Impfversuche an einer Kuh in der Zeit vom 3; 10. 1914 bis 21. i. 1915 bewiesen. Bei diesen Versuchen wurde die trächtige Kuh mit M. Tb. R. nach Deycke und Much 1:10 000 und dann mit M. Tb. R. ι: 1000 geimpft, etwa alle 2 bis 5 Tage in einer Einzelmenge von 1,6 bis 6,5 ecm in meist wechselnden Zwischenräumen, einmal mit Unterbrechung von einer Woche, und dauernd die Körpertemperatur der Kuh kontrolliert. Die Ergebnisse sind in dem nachfolgenden Versuchsprotokoll I niedergelegt:

V'iersuchsprotokoll I.

Datum	45	3.10.	60	ecm	Temperatur	abends	Datum	ecm	. Temperatur	abends	Datum	ecm	Temperatur	abends
					.38,8				38,0
	0,2	mittags		*9^Γ4	0,5	mittags	38,3	1914 ,	1,7	mittags	—
50 4· 10.	(Vioooo)		38,4	14. io.		38,4	38,3	30. ίο.		3^6	38,7
5-10.			—■		0,6	38,5	38,5			38,2	₍ —
	0,3	38,1	38,3 ■	ϊ6. ίο.			38,6		2,0	38,3	38,4
7.10.	-=-	38,3	38,7		0,7	38,3	38,2	2. II.		38,4	38,6
		■ —	38,6	IQ.. ΙΟ.		38,4	—		2,3	38,6	38,6
55 9· ΙΟ-	0,3	38,6	39-9			38,4	38,4	4· li.		38,4	3,8,4
		38,5	38,5		0,8	38,6	38,6		—	38,4	38,5
12, 10.	0,4	—r.	38,5	32. ΙΟ.		—-	38,6	. 6. ΐΐ.		38,6	..—
		38,5	38,6		1,0	38,4	38,3			-^-	38,6
	o,5	38,4	38,6	24. ίο.		—	38,5		— '	38,0	-38,6
	38,5			-1,2 ;	38,6	38,3	9· ιι·		.38,2	38,1
	38,6		26. ΙΟ.		—	38,3		2,3	38,6	38,3
				38,3	II. II.		3:8,5
				38,3

Datum	10	19. 11.	ecm	Temperatur	abends	geimpft, was -	Datum	ecm	Temperatur	abends	Datum	ecm	Temperatur	abends	und Blutserums der	Kuh begannen
1914		2,8	mittags	38.I	1914	13,0	mittags	38,1	I9I4	2,5	mittags	38,5	3 Wochen nach dem Aufhören (	ler Injektionen.
5 13.11.	21. II.			38,3	27. 11.		38,2.	38,0	7. 12.		38,5	38,9 :
			—	38,4			38,3	—		3.0	38,0	—
	15 23. 11.	3.3	38,3	38,3		1,6	38,4	38,5	9. 12.	4,0	38,2	—
16.11.			38,4	38,1	I. 12.	( /1000)	38,3		18. 12.	4,5	—	—.
25. 11.	3,8	38,4	38,5				38,5	22. Ϊ2.	5.0	— .	. —■ ■
		38,2	38,1		1,9 -	38,0	38,1	24. 12.	5,5	—	—
	4,0	38,4	37.5	3. 12.		38,7	38,2	28. 12.	5,75	—	—
	—	38,2		2,2	38,0	38,4	31. 12.	7,65	—
7,0	38,0	38,1	5.I2.		.38,5	38,2	6. I.	6,00	—	—. ^:
	38,2	38,0			38,2		12. I.	6,25	—.	—
10,0	38,3	38,4					16. i.	6,50	—
	38,0	—					21. I.
38,4	3-.I9I5		ein Kalb. Kuh			des Milchserums der . Kuh		am 9. 6. 1915
₂₀ Die Kuh warf am 7.	und Kalb wurden weiterhin		vom 25. 5. 1915		in Frage kommt. Die Untersuchungen des
ab mit steigenden	Einzelgaben M. Tb. R.	Milch-
ι:ίοοο	nur für die Reaktion

Versuchsprotokoll II.*)

	a) Kuh	Milchserum	A.?	Blutserum	Intrakutan reaktion	bj Kalb	Intrakutan reaktion
17. 2.	A. ι: 1000	FL- 5:100	₊ _	,	Blutserum
	(sehr stark)	N. —2,5:100 000	1:1000
	Fl. 0		0
	N. ι:1000				■\
	(sehr stark)		4- schwach	— '.
			ϊ:looo
7-3-
17· 3·					Geburt des Kalbes
		A.+			A. + + — 2,5: 100
		FL?			Fl. 0 .
23· 3·			—	2,5:100 000
	N.?		—
			—
24. 3.		—
			A. + —2,5:100
			Fl. schwach +
			Verdünnung 0
			N. + bis letzte Ver
			dünnung
13.4·		—	2,5: 100 000	A. 0
		—		Fl. schwach.
				Verdünnung0
		— ,		N.+bis letzte
				Verdünnung 1:100000 000000!!

■* *) Untersuchung des Blutserums undMilchserums der Kuh, des Blutserums des Kalbes nach demBordet-Gengouschen Komplementbindungsverfahren in der im Istituto Maragliano üblichen Modifikation, die "wieder von uns modifiziert wurde. Austitriert wurde die Komplementbindung gegen die 3 Partialantigene des. 120

60 Tuberkelbazillus A = Albumin, Fl = Fettsäurelipoid und N = Tuberkulonastin. + — positiv, -\ = schwach

bzw. unbestimmt. Untersucht wurde das Blut bzw. Milchserum bis zu einer Verdünnung von 2,5 : 100 000.

a) Kuh

Milchserum

Blutserum Intrakutanreaktion

b) KaIb

' Blutserum

Intrakutanreaktion .

20. A.

27.4.

Ίο. 5·

ii. 5.

9.6.

Α.- 5: iooo

Fl. ο

N. -2,5: ΐοο οοο

A. 0
Fl. ο
N. 2,5: ΐοο οοο

A. + - IMOOOO

F1.+ + +I

2,5: ΐοοοοο
N. + + +

2,5: ΐοο οοο

+ -2,5: ΐοο

2,5·" ΐοο οοο

2,5: ΐοοο

Es geht aus diesen Untersuchungen hervor, daß mit der Impfung der trächtigen Milchkuh nicht etwa nur Antikörper in deren eigenem Blutserum erzeugt worden sind, welche nun auch in die Milch gewissermaßen durchfiltriert werden, sondern daß die Milchdrüsenzellen selbst ein Produkt ausschieden (sezernierten), dessen Konzentration und Qualität, was die Antikörpermischung betrifft, unabhängig vom Blutserum ist, welches aber auch, wie^! dias Überwiegen speziell der Nastin-Antikörper beweist, als teilweise unabhängig von der Qualität und Quantität der injizierten Antigene bezeichnet werden muß. Denn bei dem injizierten M..Tb. R. spielt selbstverständlich die Eiweißkomponente die Hauptrolle, also müßte eigentlich sowohl im Blutserum als auch bei dem vorausgesetzten Durchfiltrieren des Milchserums die Albumin- gleich Eiweißkomponente die Hauptrolle spielen.

Es steht also hiermit fest, daß bei der Produktion dieser antikörperreichen Milch die Milchdrüsenzellen, überhaupt die ganze Milchdrüse keine passive Rolle, etwa der eines Filters entsprechend, spielen, sondern daß durch die erfolgte Immunisierung die Milchdrüsen bzw. die Milchdrüsenzellen selbst einen besonderen, und zwar einen besonders hohen und vom Zustand des Blutserums auch qualitativ verschiedenen Zustand von Immunität aufweisen. Besser noch als es die Intrakutanreaktion vermöchte, welche auch ausgeführt wurde, beweist diese Qualität des Milchpro-

M. Tb. R.

A.+
FLo
N. ο

duktes den hohen Grad zellulärer Immunisierung und zellulärer Selbständigkeit der Milchproduktionszellen in den Milchdrüsen. ,

Sehr interessant ist auch die Feststellung, daß die Intrakutanreaktion bei dieser Kuh nur auf M. Tb. R. und auf A positiv ausfällt und bei den Lipoiden gleich Null ist. '

Während also die Zellen in der Haut der Kuh nach den Injektionen von M. Tb. R., welches doch zum größten Teil aus der Albuminkomponente besteht, auf M. Tb. R. bzw. A. reagieren und die Intrakutanreaktion auf Lipoide fehlt, geben die Milchzellen der Kuh ein Sekret von sich, bei dem die Antikörper ein starkes Hervortreten besonders der Neutralfettkomponente unzweifelhaft erkennen lassen.

Das von der Kuh geworfene Kalb zeigte im Blutserum vorwiegend die A.- und die N.-Komponente und bei der Intrakutanreaktion ein Fehlen der Reaktion aui A. und F. und alleiniges Vorhandensein der N.-Überempfindlichkeit. Der Genuß der an Fettantikörpern so reichen Kuhmilch hat also beim Kalb eine positive Intrakutanreaktion, also das Entstehen einer zellulären Immunität gegen Neutralfett im Gefolge; Es bedarf hiernach keines weiteren Beweises für das Bestehen zellulärer Immunität infolge der Impfung bei der Milchkuh und des Entstehens zellulärer Immunität durch den Genuß der von ihr gespendeten Immunmilch beim Kalb. Es, bedarf fernerhin keines weiteren Hinweises

darauf, daß ein solcher Zustand hochgradiger zellulärer Immunisierung der Milchdrüsenzellen nicht erzielt werden kann durch die Injektion wässeriger Sekretionsprodukte oder wasserlöslicher Bestandteile /des Tuberkelbazillus, wie das Mar a g Ii an ο in seinen Versuchen getan hat. Vielmehr ist 'es_f wie schon betont, nötig, die Gesantftheiti der im Tuberkelbazillus

ίο vorhandenen Antigene in aufgeschlossener Form zu verwenden, wobei es /prinzipiell gleichgültig erscheinen kann, ob die Aufschließung der Tuberkelbazillen nach Deycke und Much oder nach dem Verfahren

Ϊ5 des Erfinders erfolgt ist.

Hervorzuheben ist freilich noch, daß die nach dem Verfahren des Erfinders besonders gemästeten und an Fettantigenen reichen Masttuberkelbazillenvakzinen ein solches Auftreten von Fettpartialantili ör ρ er η noch begünstigen dürften.

Während also die Art der Aufschließung der Tuberkelbazillen als .unwesentlich bezeichnet werden kann, sofern nur. in dem Auf- Schließungsprodukt alle Partialantikörper des Tuberkelbazillus enthalten sind, ist nicht unwesentlich, vielmehr sehr wichtig, die technische Ausführung der Immunisierung, welche eben einen weit über die Ziele des gewöhnlichen Tuberkuloserinderschutzes hinausgehenden Zweck, nämlich die hochgradige zelluläre Immunisierung der Milchdrüsenproduktionszellen verfolgt. Dazu ist eben eine bedeutend längere Immunisierungszeit mit hohen Dosen der aufgeschlossenen Vakzinen nötig. Es muß also monatelang, mindestens drei bis vier Monate lang, besser aber länger, mit sehr hohen Dosen immunisiert werden, und diese Impfung, die. eben keine Schutzimpfung für die Rinder, sondern eine auf Immunmilchproduktion gerichtete ist, muß in angemessenen Intervallen wiederholt werden, da die Produktion der Antikörper in der Milch nach einer gewissen Zeit abnimmt.

Auf solche Weise wird es erreicht, die zelluläre Immunität in den Milchdrüsen der Kühe gegen Tuberkelbazillen so zu erzeugen und so hoch zu halten, daß ein ständiges Überschäumen, Überfließen überschüssig produzierter freier, im Milchserum aufgehäufter Partialantikörper gegen Tuberkelbazillen, besonders auch von Lipoidqualität, erzielt wird.

Claims

Patent-Anspruch:

Verfahren zur Gewinnung von Tuberkulose-Immunmilch von Kühen, dadurch gekennzeichnet, daß die. Milchsekretionsdrüsen der Kühe zur andauernden Sekretion einer mit Tuberkuloseantikörpern reich beladenen Milch dadurch angeregt werden, daß den Kühen monatelang vollkommen abgetötete Tuberkelbazillen oder besser aufgeschlossene Präparate derselben, die besonders die wasserunlöslichen Partialantigene des Tuberkelbazillus enthalten, in sehr hoher Dosis einverleibt werden, wobei der zur einfachen Immunisierung der Kühe notwendige Immunitätsgrad weit überschritten wird.