DD297331A5

DD297331A5 - Verfahren zur herstellung eines impfstoffes

Info

Publication number: DD297331A5
Application number: DD90343761A
Authority: DD
Inventors: Neill M Mackenzie; Angela M O'sullivan
Original assignee: Coopers Animal Health Limited,Gb
Priority date: 1989-09-01
Filing date: 1990-08-31
Publication date: 1992-01-09
Also published as: WO1991003256A1; PT95164B; JPH05500056A; HU214110B; HU9200666D0; EP0766967A1; PL168316B1; HUT61205A; AU6335590A; CA2064911A1; EP0415794A1; IE903161A1; PL168055B1; ZA906977B; LV10394A; LV10394B; NZ235119A; YU166790A; GB8919819D0; PL286711A1

Abstract

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes. Das Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffes zur Anwendung bei Mensch und Tier sieht 1. die Bildung einer Matrix aus einem Glykosid und einem Sterin und 2. die Vermischung dieser Matrix mit einem mit einem Bakterium oder Mykoplasma assoziierten Antigen vor.{Verfahren; Herstellung; Impfstoff; Glykosid; Sterin; Bakterium; Mykoplasma; Matrix; Mensch; Tier}

Description

Verfahren zu ν Herstellung eines Impfstoffe Anwendungsgebiet der Erfindung:

Gegenstand der Erfindung 1st ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zur Anwendung bei Tier und Mensch.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen:

Die prophylaktische Immunisierung von Tieren gegen Mikroben bzw. Mikroorganismen umfaßt die Verabreichung eines aus dem Mikroorganismus stammenden Antigens in Verbindung mit einem Material, das die Antikörper und/oder zellvermittelte Immunantwort des Antigens Im Tier erhöht. Dieses Material ist als Adjuvans bekannt. Die einzigen, In vielen Ländern bisher genehmigten Adjuvantien zur Verwendung bei Menschen und Schweinen sind das Aluminiumhydroxid und das Aluminiumphosphat. Obwohl diese Adjuvantien für viele Impfstoffe ausreichen, haben Untersuchungen gezeigt, daß das vollständige Freud'sche Adjuvans (FCA) oder Quil A (ebenfalls als Saponin bekannt) oft bessere Wirkungen hinsichtlich der Bildung der Anitkörperantwort und zellvermlttelten Immunität aufweist, diese Adjuvantien wobei allerdings leider Gegenreaktionen auf die Impfung bei den Tieren auslösen können.

In den Druckschriften EP A-O 109 942 und EP-A-O 180 564 sind immunogene, zwischen Glykoslden, wie Triterpenoidsaponlnen (insbesondere Quil A) und Antigenen, die einen hydrophoben Bereich besitzen, gebildete Komplexe beschrieben. Diesen Immunostlmullerenden Komplexen hat man den Namen "Iscom-Komplexe" gegeben. Die Menge an Quil A in einem Iscom-Komplex kann etwa das 10- bis 100-fache niedriger sein als In dem Fall, wenn QuIl A mit dem Antigen unter Bildung der gleichen antigenen Wirkung vermischt ist. Iscom-Komplexe erzeugen nicht die mit Quil A verbundenen entgegengesetzten Reaktionen.

In der Druckschrift EP-A-O 231 039 ist angegeben. daJJ die Gegenwart des Antigens für die Bildung der Iscom-Grundstruktur, nachfolgend als "Iscom-Matrix" bezeichnet, nicht notwendig 1st und es allerdings möglich 1st, die Matrix aus einem Sterin, wie Cholesterin, einem Phosphollpld, wie Phosphatidyl-Ethanolamin, und einem Glykosid, wie Quil. A, zu bilden. Jedoch enthält diese Druckschrift keine Angaben darüber, daß diese Matrices als Adjuvantien nützlich sind, sie sind nur dahingehend beschrieben worden, daß Iscom-ähnliche Strukturen ohne die Gegenwart eines Antigens gebildet werden können.

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1 Ziel der Erfindung:

Es wurde erkannt, daß solche leeren Matrices verwendet werden können, um eine Adjuvansfunktlon durch Anlagerung an bakterielle Antigene und Mykoplasmenanügene, die nicht einen Teil der Isconi-Matrix bilden, herzustellen

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Darüber hinaus wird In den drei genannten Schriften des Standes der Technik bei der Verwendung eines In Wasser unlöslichen Antigens dieses mit einem Detergens löslich gemacht, wobei dann nach dem Vermischen mit dem Glykosid usw. das Detergens wieder, beispielsweise durch Dialyse, entfernt wird, um somit die Iscom-Matrix zu bilden. Es hat sich aber nunmehr gezeigt, daß sich Iscom-Matrices in Gegenwart des Detergens bilden und daß die angesprochene Entfernung nicht notwendig 1st. Iscom-Matrices können In ähnlicher Welse gebildet werden.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zur Verwendung bei Mensch und Tier, welches darin besteht, daß man (1) einen Komplex aus einem Glykosid, einem Sterin und wahlweise einem Phosphollpid bildet und (2) den Komplex mit einem mit einem Bakterium oder Mykoplasma assoziierten Antigen vermischt.

Mit dem Begriff "Tier" sind nicht-menschliche Wirbeltiere, vorzugsweise Säugetiere, wie Kühe, Schweine, Schafe, Ziegen, Pferde, Hunde oder Katzen gemeint.

Der Impfstoff kann ein oder mehrere herkömmliche Verdünnungsmittel und Trägerstoffe enthalten. Diese werden normalerweise wälirend oder nach der Stufe (2) des erfindungsgemäßen Verfahrens zugegeben.

Mit dem Ausdruck "mit einem Bakterium oder Mykoplasma assozierten Antigen" 1st Jedes Gebilde gemeint, das einen schutzgewährenden Antikörper oder eine zellvermittelte Immunantwort gegen das Bakterium oder Mykoplasma in einem dem Antigen ausgesetzten Vertebrat bilden kann. Das Antigen kann als Ganzes oder Teil eines Proteins, Glykoproteins, Glykollplds. Polysaccharide oder Lipopolysaccharide, das mit dem Bakterium oder Mykoplasma assoziiert ist, vorliegen oder es kann als PoIypeptid oder anderes Gebilde, das dieses Protein, Glykoprotein, Glykolipid, Polysaccharid oder Lipopolysaccharid als Ganzes oder einen Teil davon nachempfindet, vorliegen. Da das Antigen während der Bildung der Iscom-Matrix nicht in dieser eingemischt 1st, braucht dieses keinen einen hydrophoben Bereich zu besitzen oder mit einer hydrophoben Gruppe verbunden zu sein, wie es bei Verfahren des Standes der Technik der Fall Ist. Das Bakterium oder Mykoplasma selbst braucht nicht Im Impfstoff vorhanden zu sein, Jedoch können die Herstellungskosten des Impfstoffs ver-

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mindert werden, wenn ganze Zellen, z.B. von Haemophtlus pleuro- pneumonlae anstelle von Extrakten verwendet werden.

Bei "Mykoplasma" sind auch nah verwandte Organismen, welche als Ureaplasmen und Acholeplasmen bekannt sind, eingeschlossen

5

Zu den bakteriellen Erkrankungen zählen solche, die durch die Bakterien Mycobacterium (z. B. M. tuberculosis & M. bovlsl. Clostridium (z. B. C. welchll). Rlckettsla, Splrochaetes (z. B. Treponema pallldum oder Leptosplra pomona). Escherichia (z. B. E. coil). Staphylococci (z. B. S. aureusl. Haemophllus (z. B. H. lnfluenzae und H. pleu ropneumonlae). Bordetella (z. B. B. pertussis). Vibrio (z. B. V. cholerae). Salmonella (ζ. B. S. typhl und S. paratyphH. Streptococci (ζ. B. S. agalactlae). Nelsserla (z. B. H* gonorrhoea). PasteureUa (z. B. P. multoclda). Legionella (z.B. L. pneumonlae). ChIamydla (z. B. C. pslttacl). Pseudomonas (z. B. P. malllae). Actlnobaclllus (z. B. A. pleuropneumonlae). Campylobacter (z. B. C. jejunl). Listeria (z. B. L. monocvtogenes). Brucella (z. B. B. abortus). Corynebacterium (z. B. C. dlphtherlae). Yerslnla (z. B. X₁ pseudotuberculosls). Pneumococcl (z. B. Streptococcus pneumonlae). Bacillus (ζ. B. B. anthracls). Klebslella (z. B. K. pneumonlae). Shlgella (z. B. S. dvsenterlae) und Actinomyces (z. B. Nocardla asteroldes) hervorgerufen werden.

Vorzugswelse 1st das Bakterium ein Mycobacterlum (z. B. M. tuberculosis). Clostridium (z. B. C. welchll). Rlckettsla. Splrochaetes (z. B. Treponema pallldum). Escherichia (z. B. E. coil). Staphylococci (z. B. S. aureus). Haemophllus (z. B. H. lnfluenzae und H. pleuropneumonlae). Bordetella (z. B. B. pertussis). Vibrio (z. B. V. cholerae). Salmonella (ζ. B. S. typhl und S. paratyphl). Streptococci (ζ. B. S. agalactlae). Neisseria (z. B. N. gonorrhoea). PasteureUa (z. B. P. multoclda). Legionelia (z.B. L. pneumonlae). Pseudomonas (z. B. P. malllae). Actlnobaclllus (z. B. A. pleuropneumonlae). Campylobacter (z. B. C. jejunl). Listeria (z. B. L. monocvtogenes). Zu besonderen Antlgenen zählen der Anhaftungsfaktor In Coil, z. B. pill K 88, das Porinproteln In beispielsweise Salmonella und die Proteine der äußeren Membran von B. pertussis und

30 Nelsserla menlgitldls.

Vorzugswelse bildet das Antigen keine herkömmliche Iscom-Matrix, wie sie In der EP-A-109 942 und EP-A-180 564 beschrieben ist.

Die Impfung von Schweinen gegen H. pleuropneumonlae 1st insbesondere bevorzugt.

Zu den Mykoplasmen von veterinärmedizinischem oder medizinischem Interesse zählen Mycoplasma bovls. M. galllseptlcum. M. agalactlae. M. hyopneumoniae. M₁ pneumoniae. M. synovlae. M. arthritldls. M. capricollum. M. dlspar. M. homlnis. M* mvcoldes subs, capri. M. orale. M. orlpneumoniae. M. pulmonls. M. cvnos. M. hvo-

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rhlnls. M. mvcoides. M. salvarlum und M. fermentans.

Obwohl das Antigen nicht wie in herkömmlicher Weise in die Iscom-Matrix, nämlich als Teil der Iscom-Struktur selbst, eingemischt ist, liegt es trotzdem an der Außenseite der Iscom-Matrix vor oder es kann nach und nach in die Iscom-Matrix integriert werden. In alternativer Weise kann es völlig separat in Lösung oder Dispersion vorliegen.

Man kann die Iscom-Matrix in der in der EP-A-O 231 039 beschriebenen Weise herstellen, nämlich durch Vermischen von löslichgemachtem Sterin, Glykosid und (wahlweise) Phospholipid und anschließende Entfernung des löslichmachenden Mittels. Die Entfernung des löslichmachenden Mittels kann auch andererseits weggelassen werden. Eine elektronenmikroskopische Aufnahme von aus Quil A, Cholesterin und Phosphatidyl-Ethanolamin erhaltenen Iscom-Matrices ist in Fig. 1 der EP-A-O 231 039 (116.000-fache Vergrößerung) wiedergegeben. Wenn man keine PhospholipJde verwendet, dann bilden sich zwei dimensional Strukturen. Ein Beispiel dieser Strukturen 1st in FIg. 2 der EP-A-O 231 039 gezeigt. Diese Figur zeigt eine elektronenmikroskopische Aufnahme (146.000-fache Vergrößerung) von aus Quil A und Cholesterin erhaltenen Strukturen. Der Ausdruck "Iscom-Matrix" wird in bezug auf die dreidimensionale und zweidimensionale Struktur verwendet.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendenden Glykoside können die gleichen wie in den EP-A-O 109 942 und EP-A-O 231 039 sein. Im allgemeinen besitzen die Glykoside doppelt angelegte Eigenschaften und enthalten hydrophobe und hydrophile Bereiche im Molekül. Vorzugsweise werden Saponine verwendet, insbesondere der Saponinextrakt aus QuWaJa saponaria Molina als erster DQ-Extrakt, hergestellt nach K. Dalsgard: Saponin Adjuvants. Bull. Off. Int. Epiz. ZZ (7-8), 1289-1295 (1972) und Quil A, ebenfalls hergestellt nach K. Delsgaard: Saponin Adjuvants ΠΙ, Archiv für die gesamte Virusforschung M. 243-254 (1974). Andere bevorzugte Saponine sind das Aescin aus Aesculus hippocastanum (T Patt und W Winkler Das therapeutisch wirksame Prinzip der Rosskastanie (Aesculus hippocastanum) Arzneimittelforschung IQ (4) 273-275 (I960) und das Sapoalbln aus Gvpsophllla struthlum (R Vochten. P. Joos und R Ruyssen: Physicochemical properties of sapoalbin and their relation to the foam stability. J. Pharm. BeIg. 42 ^13-226 (1968)). Die Verwendung von Quil A ist besonders bevorzugt.

Beim erfindungsgemäßen Verfahren werden die Glykoside in mindestens der kritischen mizellenbildenden Konzentration verwendet. Im Fall von Quil A beträgt diese Konzentration etwa 0,03 Gew.-%. Im allgemeinen beträgt das Molverhältnis von Glykosid (insbesondere von Quil A) zu Sterin (insbesondere im Fall von Cholesterin) zu

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Phosphollpld 1:1:0-1 ± 20 % (vorzugsweise nicht mehr als ±10 %) für jede Zusammensetzung. Dies 1st einem Gewichtsverhältnis von etwa 5:1 für QuU A:Cholesterin äquivalent.

Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Sterine sind als Sterine tierischen oder pflanzlichen Ursprungs bekannt, wie Cholesterin. Lanosterin, Lumlsterin. Stigmasterin und Sitosterin. Vorzugswelse verwendet man In dem erflndungsgemäßen Verfahren das Cholesterin als Sterin.

Es ist für ein zu verwendendes Phospholipld bevorzugt, daß sich dreidimensionale Iscom-Matrices bilden. Zu geeigneten Phosphollpiden zählen Phosphatidyl-chinolln und Phosphatldyl-Ethanolamin.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Komplexes aus einem in Wasser unlöslichen Antigen, welches Verfahren darin besteht, daß man das Antigen mit öinem löslichmächenden Mittel löslich macht, das löslich gemachte Antigen, ein Giykosid, ein Sterin und wahlweise ein Phospholipid vermischt und eine Iscom-Matrix ohne wesentliche Entfernung des löslichmachenden Mittels bildet.

Zur Herstellung der Iscom-Matrices ist es daher nicht notwendig, daß das löslichmachende Mittel durch Ultrafiltration, Dialyse, Ultrazentrifugatlon oder chromatographische Verfahren zu entfernen.

Das Antigen 1st das gleiche wie das bereits beschriebene Antigen mit der Ausnahme, daß es anstatt nur mit Mykoplasmen oder Bakterien auch mit Fungi, Parasiten, wie Protozoen und Helminthen oder Viren assoziiert sein kann.

Zu den krankheitserregenden Fungi zählen Candida spp., Cryptococcus spp., Aspergillus spp., Microsporum spp., Trichophyton spp., Epldermophyton spp. und Dermatophilus spp.

Zu den krankheitserregenden Parasiten zählen die in der EP-A-109 942 aufgeführten Parasiten.

Zu den krankheitserregenden Viren zählen die in der EP-A-IOP 942 aufgeführten Viren. Eine Vielzahl von diesen besitzen Hüllen, aus denen geeignete Antigene extrahiert werden können. Zu besonderen Virusen zählen der Pferdelnfluenzavirus, der Pferdeherpesvirus, der Rlnderdlarrhoevlrus. der Coronavirus. der Parvovirus. der Katzenleukämievirus. der Katzenlmmunodeflzlenzvirus und der Pferdearteritisvi-

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1 rus.

Als löslichmachendes MIttel kann man eines der In den EP-A-O 109 942 oder EP-A-O 231 039, beschriebenen MIttel, beispielsweise ein Detergens, Harnstoff oder Guanidin, verwenden.

Zu diesem Zweck kann man im allgemeinen ein nichtionisches, ionisches oder zwitterionisches Detergens oder ein Detergens auf Cholinsäurebasis, wie Natriumdesoxycholat, verwenden. Als Detergens verwendet man vorzugsweise Octylglucosid, Nonyl-N-methylglucamid oder Decanoyl-N-methylglucamid, wobei allerdings auch Alkylphenylpolyoxyethylenether geeignet sind, insbesondere ein Polyethylenglykolp-isooctylphenylether mit 9 bis 10 Oxyethylengruppen, welches unter dem Handelsnamen Triton X-IOOR erhältlich ist.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Herstellung immunogener Komplexe aus antigenen Proteinen oder Peptiden, die doppelt angelegte Eigenschaften besitzen, z. B. der Komplexe aus der EP-A-109 942, verwendet werden.

Geeignete Methoden zur Isolierung von Antigenen und Bindung an hydrophobe Gruppen sind in der EP-A-109 942 beschrieben.

Bei diesem erfindungsgemäßen Verfahren wird das gelöste oder löslichgemachte Antigen im allgemeinen mit einer Lösung, die das Glykosid in mindestens der kritischen mizellenbildenden Konzentration, ein Sterin und wahlweise ein Phospholipid enthält, in Kontakt gebracht.

Die erhaltenen Lösungen aus den immunogenen Komplexen können, falls erwünscht, lyophilisiert werden. Die lyophilisierten Präparate können dann vor der Verwendung wieder durch Zugabe von Wasser in den alten Zustand gebracht werden.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Verfahren zur Herstellung einer Iscom-Matrix, welches darin besteht, daß man ein Sterin und wahlweise ein Phospholipid mit einem löslichmachenden Mittel löslich macht und mit einer Lösung aus dem Glykosid ohne Entfernung des löslichmachenden Mittels vermischt.

Das löslichmachende Mittel, das Sterin. das Phospholipid und das Glykosid entsprechen den bereits beschriebenen Materialien.

Die Erfindung betrifft zudem eine pharmazeutische Zusammensetzung, die die nach dem ersten und zweiten Gegenstand der Erfindung hergestellten immunogenen Komplexe enthält. Man erhält sie, indem man die immunogenen Komplexe in eine für die

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parenteral Verabreichung geeignete Form, vorzugsweise In eine Injizierbare Verabreichungsform und Insbesondere In eine Injektion für subkutane oder intramuskuläre Wege überführt. Im allgemeinen enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen die Immunogenen Komplexe In einem wäßrigen, physiologisch akzeptablen Medium, welches, falls gewünscht, einen Puffer und/oder ein Salz, wie Natriumchlorid, zur Anpassung des osmotischen Drucks enthält.

Die Erfindung sei nun anhand der folgenden, die Erfindung nicht einschränkenden Beispiele erläutert

10

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Herstellung der leeren Iscom-Matrix Erforderliche Reagenzien

Phosphatpufferlösung (Dulbecco A, Oxoid) Lipld-Mischung (siehe unten)

10 gew.-%-lge Lösung aus QuIl A (Superfos) In sterilem destilliertem Wasser

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Herstellung der Lipid-Mlschung (10 ml)

Materlallen: Chloroform (rein (analar)), Cholesterin (vom Grad I aus der Schweineleber, Sigma), L-ß-Phosphatidyl-Cholin (Sigma), Mega 9 oder 10 (Sigma) oder Triton (Mega 9 bedeutet Nonyl-N-methylglucamid und Mega IO bedeutet Decanoyl-N-methylglucamid) und steriles destilliertes Wasser.

Verfahren

(a) Man stellt eine 20 gew.-%-ige Mega ΙΟ-Lösung in sterilem destilliertem Wasser her, indem man 2 g Mega 10 auswiegt und in 10 ml Wasser löst, (b) Man wiegt 50 mg Cholesterin ab und fügt es zu 50 mg Phosphatldyl-Cholin hinzu, (c) Nach dem Lösen des Cholesterins in dem Phosphatidyl-Cholln gibt man 2 ml Chloroform hinzu, (d) Dann gibt man die 10 ml der 20 gew.-%-igen Mega 10-Lösung hinzu. Die Mischung bekommt ein milchig-weißes Aussehen und das Volumen steigt auf 12 ml. Da allerdings das Chloroform während des Rührens entweicht, erreicht man das Endvolumen von 10 ml. (e) Man rührt In einem Behälter mit einem Magnetrührer in einem Raum mit einer Temperatur von 37⁰C und entfernt dabei den Deckel des Behälters. Beim Fortgang des Rührens wird die Mischung beweglicher und klarer, (f) Man bewahrt bei Raumtemperatur auf.

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Case: PC 1089

Beispiel 1

Protokoll: Man giot 20 ml PBSA in eine sterile Universalflasche. Man fügt 100 μΐ einer 10 %-lgen Löst ng aus Quil A hinzu. Dann gibt man 400 μΐ der Lipld-Mlschung hinzu. Man vermischt die Lösung heftig bei voller Geschwindigkeit während 10 Sekunden. Man sterilisiert die Lösung durch Passleren durch einen Filter mit einer PorengröJJe von 0.2 |im (Mlllipore). Man nimmt ein kleines Volumen für elektronenmikroskopJschs Untersuchungen ab. Man bewahrt bei +4⁰C auf.

Beispiel 2

Man führt das Verfahren von Beispiel 1 mit folgenden Veränderungen durch. Man gibt 20 ml PBSA In eine sterile Universalflasche. Man fügt 200 μΐ einer 10 %-lgen Lösung aus QuIl A hinzu. Man gibt dann 800 μΐ der Llpld-Mischung hinzu. Man vermischt die Lösung heftig bei voller Geschwindigkeit während 10 Sekunden. Man sterilisiert durch ein Filter mit einer PorengiöJJe von 0,2 μτη. Man nimmt ein kleines Volumen für elektronenmikroskopische Untersuchungen ab. Man bewahrt bei +4⁰C auf.

Beispiel 3

Man gibt 20 ml PBSA In eine mit Rührem versehene Amicon-Zelle mit einer Absperr- bzw. Trennmembran (30 K Mwt). Man fügt 800 ul der Llpid-Mlschung plus 200 μΐ QuIl A (10 %-lge Lösung) hinzu. Man engt die Lösung auf 5 ml ein und gibt 100 ml PBSA hinzu. Man wiederholt die obige Stufe zweimal. Man filtriert die Inhalte von 20 ml durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,2 μΐη, beschriftet und bewahrt bei +4°C auf.

30 Beispiel 4

Man gibt 20 ml PBSA In eine mit Rührem versehene Amicon-Zelle mit einer Absperrmembran (30 K Mwt). Man gibt 400 ul der Lipld-Mlschung plus 100 ul einer 10 %-igen Quil Α-Lösung hinzu. Man engt die obige Lösung auf 5 ml ein und resuspendlert in 100 ml PBSA. Man wiederholt die obige Stufe zweimal. Die Endinhalte der Zelle von 20 ml werden dann durch ein Filter mit einer PorengröJJe von 0,2 um sterilisiert, beschriftet und bei +4⁰C aufgewahrt.

Beispiel 5

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Case: PC 1089

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Ι Man fügt 20 ml PBSA In eine mit Rührern versehene Amicon-Zelle, die mit einer Absperrmembran (30 K Mwt) versehen 1st. Man gibt 200 μΐ der Llpid-Mlschung plus 50 μΐ einer 10 %-lgen QuIl Α-Lösung hinzu. Man engt die obige Lösung auf 5 ml ein und resuspendiert in 100 ml PBSA. Man wiederholt die obige Stufe zweimal. Man filtriert dann die Endpräparatlön der Zelle von 20 ml durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,2 μτη, beschriftet und bewahrt bei +4⁰C auf.

Beispiel β

Man gibt 20 ml PBSA in eine mit Rührern versehene Amlcon-Zelle (mit einer Absperrmembran (30 K Mwt). Man fügt 100 μΐ der Lipid-MJschung plus 25 μΐ einer 10 %-Igen Quil Α-Lösung hinzu. Man engt die obige Lösung auf 5 ml ein und resuspendiert mit 100 ml PBSA. Man sterilisiert die Endlnhalte der Zelle von 20 ml durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,2 pm. beschriftet und bewahrt bei +4⁰C auf.

Es hat sich bei den elektronenmikroskopischen Untersuchungen herausgestellt, daß diese Iscom-Matrice3 In geringerer Anzahl als in den anderen Beispielen vorliegen.

Beispiel 7 Studien an der Maus: Leistungsfähigkeit

Man verwendet weibliche Mäuse eines durch Inzucht erzeugtsn Stammes (Balb/C), welche zusammen das gleiche Alter haben (6 bis 8 Wochen). Man erhält die Mäuse von einer in Käfigen gehaltenen Einheit (SPF) von Harlan-Olac (Blcester). Während dieser Untersuchungen verwendet man den Stamm Mvcoplasma hvopneumonlae der National Cell Type Collection. Man läßt die Organismen In Kultur In modifiziertem Friis-Medium wachsen. Man bewahrt die Vorratskulturen bei -70⁰C auf. Man stellt die Suspension für die Impfstoff-Verabreichung her, Indem man 40 ml Fleischbrühe mit 4 ml der Vorratskultur bei einem pH-Wert /on 7,4 impft und dann bei 37°C während 3 Tagen oder bis der pH-Wert auf 6,8 abgefallen ist, inkubiert. Im Laufe dieser Zeit erreichen die Organismen die logarithmische Wachstumsphase. Man Inaktiviert die Kulturen unter Verwendung von binärem Ethylenimin, engt mit Hilfe der Tangentialfluß-Ultrafiltration ein und wäscht mit Phosphatpufferlösung (PBS).

Man stellt die Konzentration des Antigens In der Welse ein, daß alle Impfstoffe 10 μg. Gesamtproteln pro 0,1 ml der an die Maus zu verabreichenden Dosis des Impfstoffs enthalten.

Man verwendet die Iscom-Matrix-Präparate der Beispiele 3 bis 6 folgendermaßen.

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Man Immunisiert acht Gruppen mit sechs Mäusen an zwei Stellen, wobei Jede Maus 0,1 ml der folgenden Präparate erhält.

Grippe Impfstoff

A 10 Mg M. hyopneumonlae allein

B 10 μg M. hyopneumonlae mit vollständigem Freud'schem Adjuvans

C 10 Mg M. hvopneumoniae mit einer Iscom-Matrix mit 10 Mg QA/an die

Maus verabreichte Dosis

D 10 Mg M. hvopneumoniae mit einer Iscom-Matrlx mit 5 Mg QA/an die

Maus verabreichte Dosis

E 10 Mg M. hvoDneumonlae mit einer Iscom-Matrlx mit 2,5 Mg QA/an die

Maus verabreichte Dosis F 10 Mg M. hvopneumoniae mit einer Iscom-Matrlx mit 1.25 Mg QA/an die

Maus verabreichte Dosis G O Mg M. hvopneumoniae mit einer Iscom-Matrix mit 5 Mg QA/an die

Maus verabreichte Dosis

H 10 Mg M. hvopneumoniae +10^ cfu H. pleuropneumonlae mit einer

Iscom-Matrix mit 5 Mg QA/an die Maus verabreichte Dosis

QA = QuUA

Man entnimmt den Mäusegruppen bereits vor der ersten Immunisierung und 14 Tage danach Blut aus der Schwanzvene. 28 Tage nach der ersten Immunisierung erhalten die Tiere eine weitere Impfung. Man entnimmt Blut 7 Tage danach und schließlich 28 Tage nach der zweiten Immunisierung. Man trennt das Serum vom Blut an dem Tag, an dem man es entnommen hat und bewahrt bei -70⁰C für die ELISA-Anafyse auf. Man beobachtet die Mäuse nach der Impfung auf auffällige lokale und systemische Reaktionen.

Ergebnisse

Die Ergebnisse der Experimente, die die Adjuvanswlrkung von Quil A in einem Iscom-Präparat, worin das Antigen bei dessen Herstellung nicht beteiligt ist. dokumentieren, sind In den Tabellen 1 und 2 gezeigt

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Die Ergebnisse zeigen eindeutig, daß das Iscom-Präparat mit dem größten Verhältnis von Protein : Quil A von 10 Mg : 10 ug/an die Maus verabreichte Dosis die beste Antwort auf den Impfstoff hervorbringt, welche Antwort Im Hinblick auf den Impfstoff mit dem Freud'schen Adjuvans genauso gut, wenn nicht sogar besser ist.

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Die Gruppen mit Mäusen, die Iscom-Impfstoffe mit weniger als 10 μg QuIl A pro an die Maus verabreichter Dosis erhalten haben, zeigen bei der Immunantwort auf das Antigen keine bessere Antwort als das Antigen ohne Adjuvans.

Man vermerkt bei Mäusen, die den Iscom-Impfstoff oder das Antigen allein erhalten haben, keine lokalen oder systemische Impf-Reaktlonen. Bei mit dem Freud'schen Adjuvans immunisierten Mäusen bemerkt man kleine Granulome in einer Größe von ungefähr 3 mm am Punkt der Immunisierung, Jedoch beobachtet man wie bei den anderen Mäusen keine Anzeichen systemischer Störungen.

Tabelle 1

Antl-M. hyopneumonlae-Antwort bei Mäusen nach dem INDIREKTEN ELISA-TEST

Gruppen/Zeit	Vorimpfung	28DP2
A	0,023	0,184
B	0.019	0.126
C	0,019	0,203
D	0.019	0.043
E	0.019	0.083
F	0.032	0.029
G	0.042	0,052
H	0.040	0.150

Standardabweichungen sind weggelassen worden DP2° - Tage nach der zweiten Impfung

Beispiel 8

Untersuchungen mit Mäusen: Bewertung der leeren Iscom-Matrix als Adjuvans für den Haemophllus pleuropneumoniae:-Impfstoff bei Mäusen

Man Immunisiert Mäuse mit Impfstoffen, die die gesamtea inaktivierten H. pleuropneumonlae-Bakterien und die Iscom-Matrix mit verschiedenen Mengen an Quil A enthalten. Die zweimal mit einem Impfstoff mit 10 μg Quil A/Maus immunisierten Mäuse ergeben eine größere Antikörper-Antwort als die Mäuse, die mit äquivalenten Mengen an Bakterien im Freud'schen Adjuvans imn;unisiert worden sind. Niedrigere Dosen von Quil A besitzen nur eine geringere zu ' ermerkende Adjuvanswirkung. Man beobachtet keine auffälligen lokale oder system ische Wirkungen nach der Verabreichung der Impfstoffe, die die Iscom-Matrix enthalten.

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Man IaJSt den NCTC-Referenzstamm H. pleuropneumonlae vom Serotyp 3 (Stamm 1421) bis zur logarithmischen Wachstumsphase in mit B NAD angereichertem Hefeextrakt-Medium wachsen. Man inaktiviert die Kultur mit 0,2 %-igem Formalin und wäscht dreimal mit Phosphatpufferlösung (PBS) und erhält ein gewaschenes, inaktiviertes Antigen-Gesamtzellpräparat. Man standardisiert das Antigen durch Zählen der Bakterien unter Verwendung einer Neubaumer-Kammer mit modifizierter Thoma-Linierung (rulings) und bewahrt in PBS bei 4°C bis zum Verbrauch auf.

Man immunisiert Gruppen mit sechs Mäusen mit H. pleuropneumonlae allein, £L pleuropneumonlae in FIA oder H. pleuropneumonlae zusammen mit einer Iscom-Matrix mit verschiedenen Mengen an QuIl A nach dem bereits beschriebenen Schema. Die letzte Gruppe erhält sowohl H. pleuropneumonlae- und M. hyopneumonlae-Antigene zusammen mit der Iscom-Matrix, um auf diese Weise mögliche Wechselwirkungen zwischen den beiden Antigenen zu untersuchen. Die Mäuse erhalten zwei subkutane Injektionen von 0,1 ml des geeigneten Impfstoffs an zwei Stellen in einem Intervall von drei Wochen zwischen den Immunisierungen.

Immunisierung von Mäusen Gruppe Impfung

1 Keine

2 HpI allein

3 HpI in FIA

4 HpI mit Iscom-Matrix mit 10 μg QA/an die Maus verabreichte Dosis im Impfstoff ,

5 HpI mit Iscom-Matrix mit 5 μg QA/an die Maus verabreichte Dosis im Impfstoff

6 HpI mit Iscom-Matrix mit 2.5 μg QA/an die Maus verabreichte Dosis Im Impfstoff

7 HpI mit Iscom-Matrix mit 1,2 μg QA/an die Maus verabreichte

Dosis im Impfstoff

8 HpI mit Iscom-Matrix mit 5 μg QA/an die Maus verabreichte

Dosis Im Impfstoff und 10 μg an die Maus verabreichte Dosis im Impfstoff an Antigen von Mycoplasma hyopneumoniae 35

Nach der ersten Impfung ist in jeder Gruppe nur eine geringe Antikörper-Antwort zu verzeichnen. Nach der zweiten Impfung tritt ein schneller und ausgeprägter Anstieg der Mengen an Antikörper in zwei der acht immunisierten Gruppen auf. Man vermerkt die größte Antwort bei Mäusen, die mit den Bakterien zusammen mit der Iscom-Matrix, die 10 μg/Maus an Quil A enthält, immunisiert sind und bei denen

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man einen Hauptpeak OD von 1,24 (±0,17) Einheiten optischer Dichte (UOD) verzeichnet, wenn man die Messungen eine Woche nach der zweiten Immunisierung durchführt. Mäuse, die mit Bakterien und FIA immunisiert sind, geben eine ähnliche, jedoch eine etwas schwächere Antikörper-Antwort mit einem Hauptpeak OD von 1.11 (±0,08) UOD unter gleichen Bedingungen. Mäuse, die mit den Bakterien allein, mit Bakterien mit geringeren Dosen an QuIl A oder mit Bakterien zusammen mit dem Antigen von M. hvopneumonlae immunisiert sind, geben alle ähnliche schwächere Antikörper-Antworten mit Peaks mit Werten von zwischen 0,43 und 0,63 UOD, wenn man sie einen Monat nach der zweiten Immunisierung mißt.

Tabelle 2 Antl-H. pleuropneumonlae-Antwort nach indirekter ELISA-Messung

A B C D E F G H

Vorimpfung	28DP2°
0.87	0,189
0,170	0,428
0,185	1.002
0,135	1,161
0.131	0.626
0.164	0.645
0.119	0.620
0.227	0.480

25 Beispiel 9

Untersuchungen mit Schweinen

Man erhält 30 Landrace-gekreuzte Ferkel in einem Alter von 3 Wochen von einer Herde, von der man weiß, daJJ sie frei von allen klinischen und serologischen Infektionserscheinungen mit H. pleuropneumonlae und M. hvopneumonlae sind. Man hält die Feikel in Isolation von allen anderen Tieren und füttert sie ad libertum mit einer standardisierten Absetzungs-/Zuchtdlät.

Man läJ3t ein niedrig durchzogenes (passaged) (weniger als 10) Feldisolat (SVA3) von M. hvopneumonlae bis zur logarithmischen Wachstumsphase In Friis-Medium wachsen.

Man fügt zu 20 ml steriler PBSA 400 μΐ einer 10 %-lgen Quil-A-Lösung und 1600 μΐ der Lipid-Mlschung. Man vermischt dann die Mischung sehr heftig während 20 Se-

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künden bei Höchstgeschwindigkeit und filtriert dann durch ein Filter mit einer Porengröße von 0,45 μπι. Man gibt dann zu 10 ml dieser Iscom-Mlschung 10 ml von 4 mg/ml Antigen von M. hvopneumonlae und erhält eine Iscom-Mlschung, die 2 mg/ml Antigen und 1 mg/ml Quil A enthält.

Man immunisiert eine Gruppe von fünf Schweinen mit 1 ml Iscom-Matrix, die 2 mg/ ml gesamtes Zellantigen von M. hvopneumonlae enthält. Eine weitere Gruppe von fünf Schweinen erhält 1 ml von 2 mg/ml M. hvopneumonlae mit Freud'schem AdJuvans. Die restlichen fünf Schweine erhalten nur PBSA.

Die Ferkel erhalten Ihre erste Impfung In einem Alter von drei Wochen durch tiefe intramuskuläre Injektion von 1 ml des geeigneten Impfstoffs in die tiefen Muskeln der linken Seite des Nackens. Man verabreicht eine ähnliche zweite Injektion sechs Wochen später In die rechte Seite des Nackens. Zwei Wochen nach der zweiten Immunlslerung werden die Ferkel, die nun ein Alter von elf Wochen erreicht haben, experimentell herausgefordert (Antigenexposltion). Man tötet die Ferkel etwa zwei Wochen nach der Herausforderung, um sie hinsichtlich ihrer Lungenpathologie nach dem Tode (post-mortem) zu untersuchen.

a) Klinische Reaktionen auf die Impfung

Man beobachtet keine auffälligen klinischen Anzeichen bei der. Schweinen nach der ersten und zweiten Impfung. In keiner Gruppe 1st ein bedeutsamer Anstieg der Temperatur nach der ersten oder zweiten Immunisierung festgestellt worden. Man beobachtet den größten Temperaturanstieg von 1,1 ± 0,23⁰C bei Schweinen, die mit &L hyopneumonlae-Antigen In Freud'schem (unvollständigem) Adjuvans nach der zweiten Immunisierung immunisiert worden sind. Im allgemeinen steigen die Temperaturen in den Gruppen durchschnittlich um etwa 0,3⁰C. was zur Verursachung klinischer Anzeichen von Pyrexie nicht ausreichend 1st. Impfstoffe, die M. hyopneumo nlae-Antlgene enthalten, sind nicht auffällig fiebererregender als solche, die sie nicht enthalten.

Es sind keine lokalen Reaktionen sichtbar oder tastbar an den Injektionsstellen des Impfstoffs an den Jeweiligen Stellen

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Man beobachtet keine Unterschiede hinsichtlich der Gewichtszunahme der Ferkel.

b) Klinische Reaktionen auf die Injektion

Man beobachtet keine klinische Reaktionen nach der Infektion. Die experimentelle

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Herausforderung verursacht keine Pyrexle. Die Schweine bleiben klinisch normal während zwei Wochen nach der Herausforderung. Die Gewichtszunahmen während dieses Zeitraums und die Nahrungsaufnahmen zeigten keinen bedeutsamen Unterschied zwischen den Gruppen.

c) Messung der Serumantikörper

Nach der ersten Impfung zeigt nur die Gruppe, die M. hvopneumonlae mit Freud¹-schem Adjuvans erhalten hat, eine Antikörper-Antwort. Jedoch ist nach der zweiten Immunisierung ein erheblicher Anstieg der Antikörper-Mengen in allen Tieren, die M. hvopneumonlae -Impfstoffe erhalten haben, zu verzeichnen. Die M. hvopneumonlae-Serumantikörper-Antworten nach ELISA OD ( @ 492 nm)-Messung vor der Herausforderung sehen folgendermaßen aus:

Für Tiere, die den Iscom-Impfstoff erhalten haben: 0,6 ± 0,156

Für Tiere, die einen Impfstoff mit Freud'schem Adjuvans erhalten haben: 1,7 ±0,089

Man beobachtet ebenfalls eine Antl-M. hvopneumonlae-Antikörper-Antwort (OD 6 492 nm = 0,6 ± 0,156) bei Tieren, die Iscom-Matrix-Impfstoffe erhalten haben.

Es ist kein weiterer bedeutsamer Anstieg der Antikörper-Mengen in den Gruppen nach der Infektion zu verzeichnen.

d) Lokale Reaktionen auf die Impfung

Man beobachtet die schwersten Reaktionen bei Ferkeln, die mit M. hyopneumoniae-Antigen in Freud'schem Adjuvans immunisiert worden sind. Die Reaktionen bestanden aus multipel dispergierten käsigen Granuloma und sind charakteristisch für Reaktlonen auf das Freud'sche Adjuvans bei Schweinen. Man beobachtet keine Schädigungen bei Schweinen, die die Iscom-Impfstoffe erhalten haben.

Beispiel 10 Untersuchungen mit Schafen

Man erhält Blackface χ Swaledale-Mutterschafe von einer Farm, von der man weiß, daß sie während der letzten 4 Jahre frei von OEA war. Die 5 bis 6 Jahre alten Tiere wurden vor der Verwendung auf Antikörper auf Chlamvdla pslttaci und Toxoplasma gondil vorgescreent bzw. voruntersucht. Man hält die Mutterschafe in Isolation von

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anderen Tieren und füttert sie mit Heu und Konzentraten In den Mengen, die für Ihren physiologischen Zustand und Ernährungszustand geeignet sind.

1. Impfstoffe

Man läJ3t OEA-Stämme mit den Bezeichnungen A22 und S26/3 von Chlamvdla psittacl wachsen und führt dann eine Halbrelnlgung durch. Man engt das Anfangskulturvolumen jedes Stammes von 10 Liter auf 1 Liter ein und erhält das "10X-Antigen".

Man stellt einen Iscom-Impfstoff (IV) folgendermaßen her: (a) Man behandelt 50 ml des lOX-Antlgens mit 100 μΐ einer 50 %-lgen Vorratslösung Glutaraldehyd während 15 Minuten bei 4⁰C. (b) Man fügt 50 ml flltersteriHslertes 0.15M Glycin In PBS hinzu und inkubiert die Suspension während 5 Minuten bei 4⁰C. (c) Man zentrifugiert die Suspension bei 17000 g während 45 Minuten bei 4⁰C, wäscht das Pellet dann zweimal mit sterilem PBS mit einem pH-Wert von 7,2. (d) Man resuspendiert das Pellet in 50 ml PBS. (e) Man fügt 1 %-iges steril filtriertes Thiomersal hinzu und erhält eine Endkonzentration von 0,01 %.

Man gibt zu 100 ml steriler PBSA 50 μΐ einer 10 %-igen Quil Α-Lösung und 2 ml der Lipld-Mischung. Man mischt die Mischung bei einem Druck von 9 psl (62 kNm'²) und engt auf ein Volumen von 20 ml ein. Man gibt sterile PBSA hinzu und erhöht das Volumen somit auf 20 ml und vermindert dann wieder das Volumen auf 20 ml. Man wiederholt diesen Vorgang zweimal. Man filtriert das Endvolumen durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,45 μτη.

Man gibt das Antlgen-Präparat zu der Iscom-Mischung hinzu und erhält eine Antlgenkonzentratlon von 0.25X Antigen/ml.

Man stellt zu Kontrollzwecken einen Impfstoff auf ölbasis (OBV) und einen wäßrigen Alhydrogel-adsorblerten Impfstoff her und erhält IX Antigen/ml bzw. 0,25 X Antigen/ml.

Das Experiment umfaßt fünf Gruppen und insgesamt 106 Mutterschafe. Man impft die Gruppen 1, 2 und 3 mit C¹BV, AAV bzw. IV. Die Gruppen 4 und 5 stellen die Kontrollgruppen dar, worin sich infizierte/ungeimpfte und nichtinfizierte/ungeimpfte Tiere befinden.

Man verabreicht den OBV-Impfstoff nur einmal als Dosis von 1 ml, und zwar 9 Wochen vor üem Decken. Man verabreicht die anderen zwei Impfstoffe zweimal, und zwar 9 Wochen und 3 Wochen vor dem Decken, wobei jede Injektion eine Dosis von 2

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ml umfaßt (alle Impfstoffe geben eine Belastung von 4 μg Chlamydienproteln frei)

Man injiziert alle Impfstoffe subkutan an eine identifizierte, geschorene Stelle an der rechten Seite des Nackens.

Man fordert die Mutterschafe der Gruppen I₁ 2. 3 und 4 mit lebenden Chlamydlen bei 85-90 d.g. heraus. Die Gruppe 5 bleibt unbehandelt.

Beim Lammen oder beim Abort entnimmt man die Placentas, falls vorhanden, als P "ben. Man vermerkt den Zustand des Lammes zu dieser Zelt (ob es lebend, sterbend tot 1st). Kränkliche Lämmer läßt man nicht überleben, wobei man allerdings das Kolostrum noch sammelt.

Man vermerkt durch OEA hervorgerufene Schädigungen und andere Vorkommnisse in den Placentas und schätzt ihr Ausmaß etwa ab. Man untersucht die Plazenten oder Vaginalabstriche) auf Chlamydienkörper, indem man nach dem modifizierten Ziehl-Neelsen-Verfahren färbt, und kultiviert in BHK21-Zellen, die mit 5-Iododesoxyridin behandelt sind.

Ergebnisse

Die Ergebnisse zeigen, daJJ der Iscom-Impfstoff einen Schutz gegen Chlamydieninfektion schafft, der mindestens so gut ist wie der Schutz durch herkömmliche, in den Experimenten verwendete Impfstoffe.

Beispiel 11 Iscompräparat mit Pferdeinfluenzavirus

Protokoll: Man gibt 20 ml PBSA In eine r'erile Universalflasche. Man fügt 100 μΐ einer 10 %-lgen Lösung QuIl A hinzu. Man gibt weiterhin 400. μΐ der Lipid-Mlschung hinzu. Dann fügt man ERIK-14 Pferdegrippe-Antigenbestandteil bis zu einer Endkonzentration von 5 μg/ml hinzu. Man vermischt heftig bei Höchstgeschwindigkeit während 20 Sekunden. Man sterilisiert die Lösung durch Filtrieren durch einen Filter mit einer Porengröße von 0,2 um (Millipore). Man nimmt eiu kleines Volumen für elektronenmikroskopische Untersuchungen (man beobachtet Iscom-Strukturen) und die Untersuchung auf bakterielle Kontamination ab. Man bewahrt bei +4⁰C auf.

Claims

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Erfindungeanspruch

· 1. Verfahren zur Herstellung eines Impfstoffs zur Anwendung bei Mensch und Tier, dadurch gekennzeictmet. daß man (1) eine Matrix aus einem Glykosld und einem Sterin bildet und (2) diese Matrix mit einem mit einem Bakteiium oder Mykoplasma assoziierten Antigen vermischt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man In Stufe (1) zusätzlich ein Phospholipld zugibt.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipld Phosphatldylcholin 1st.
4. Verfahren nach-elsera-denAnsprüchet/l bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Glykosld QuIl A 1st.
5. Verfahren nach eteem den Ansprüche/U bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Sterin Cholesterin 1st.
6. Verfahren nach -einem den Ansprüchenl bis 5. dadurch gekennzeichnet. daß das Antigen mit einer der folgenden Spezies. Gattungen oder Massen von Organismen assoziiert ist: Mycobacterium, Clostridium, Rlckettsia, Splrochaetes, Eschertchia, Staphylococci. Haemophilus, Bordetella, Vibrio, Salmonella, Streptococci, Pasteurella, Legionella, Chlamydla, Pseudomonas, Actlnobaclllus. Campylobacter, Listeria, Mycoplasma bovls, M. galllsepticum, M. agalactlae. M. hyopneumoniae, M. pneumonlae, M. synovlae, M. arthritidis, M. capricolium, M. dispar. M. hominis, M. mycoldes subs, capri, M. orale, M. oripneumonlae, M. pulmonls, M. cynos, M. hyorhinls, M. mycoldes. M. salvarium und M. fermentans oder das Antigen den Anschaftungsfaktor in Coil, das Porln-Proteln oder Proteine der äußeren Membran von B. pertussis oder Nelsseria meningitidis umfaßt.
7. Verfahren nach -einem den.vorangegangenen AnsprücheJj₍dadurch gekennzeichnet, daß man In Stufe (1) eine Matrix aus einem Glykosld, einem Sterin, einem Phospholipld und einem löslichmachenden Mittel bildet.
8. Verfahren nach e den vorangegangenen Ansprücha^dadurch gekennzeichnet, daß man in Stufe (1) eine Matrix aus einem Glykosld, einem Sterin und einem löslichmachenden Mittel der Octylglykoside, Nonyl-N-methylglucamld. Harnstoff und Guanidin umfassenden Gruppe bildet.

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Cas« PC 1089
9. Verfahren nach ee deqvorangegangenen Ansprüchen dadurch gekennzeich net, daß das in Stufe (1) verwendete Sterin von Cholesterin verschieden ist.
10. Verfahren nach Anspruch 9. dadurch gekennzeichnet, daß das Sterln Lanosterin, Lumlsterin, Stigmasterin und Sltosterln ist.

bis
11. Verfahren nach Anspruch 8s&eaw 10, dadurch gekennzeichnet, daß man in

Stufe (1) eine Matrix aus dem Glykosid, dem Sterin und einem Phospholipld bildet.
12. Verfahren nach -einem denvorangegangenen Ansprüchen,dadurch gekennzeich net, daß das Antigen mit Mycoplasma hyopneumonlae assoziiert 1st.
13. Verfahren nach -etaem den vorangegangenen Ansprüchen dadurch gekennzeich net, daß man In Stufe (1) ein löslichmachendes Mittel verwendet, welches man vor der Bildung der Iscom-Matrix nicht entfernt.
14. Verfahren zur Herstellung eines immunogenen Komplexes mit einem in Wasser unlöslichen Antigen, dadurch gekennzeichnet, daß man das Antigen mit einem löslichmachenden Mittel löslich macht, das löslich gemachte Antigen, ein Glykosid und ein Sterin vermischt und einen Iscom-Komplex ohne wesentliche Entfernung des löslichmachenden Mittels bildet.
15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß man in der Mischstufe zusätzlich ein Phospholipld verwendet.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Iscom-Komplexe auf andfc* .. Weise als während der Ultrafiltration, Dialyse, Ultrazentrifugation oder chromatographischer Verfahren gebildet werden.
17. Verfahren nach etoem-denAnsprüchenl4 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß das löslichmachende Mittel Natriumdesoxycholat, Octylglucosid, Nonyl-N-methylglucamld, Dodecanoyl-N-methylglucamld oder ein Polyethylenglykol-p-isooctylphenylether mit 9 bis 10 Oxyethylengruppen 1st.
18. Verfahren zur Herstellung einer Iscom-Matrix, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Glykosid,' ein Sterln und ein löslichmachendes Mittel vermischt und eine Iscom-Matrix ohne wesentliche Entfernung des lösilchmachenden Mittels bildet.
19. Verwendung eines nach den Ansprüchen 1 bis 18 hergestellten Impfstoffes, dadurch gekennzeichnet, daß er für Schweine oder Schafe eingesetzt wird.