JPS5937076B2 - 醗酵法ビタミンｂ↓１↓２の製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、アースロバフタ−属に属するビタミンＢ１２
生産菌およびプロピオニバクテリウム属に属するビタミ
ンＢ１２生産菌の少なくとも一方の生産菌を、少なくと
も他方の菌の培養物の存在下に培養して得られた培養物
から、ビタミンＢ１２を採取することにより、改善され
た生産量でビタミンＢ１２を生産、取得できる醗酵法ビ
タミンＢ、２の製法に関する。

ビタミンＢ１□は、核酸、脂肪、蛋白質、炭水化物など
の生体内代謝に関与し、貧血、神経性疾患、肝臓障害な
どの防止、治療などの保健ないし医薬品として、広汎に
利用され、人間、家禽、家畜などに対する医薬或は食品
もしくは飼餌料添加剤として需要の多いビタミンである
。

従来、醗酵法によるビタミンＢ１□の製法としては多数
の提案もしくは報告が知られており、例えば、ストレプ
トマイシンなどの抗生物質生産の醗酵液からビタミンＢ
１２を抽出採取する方法、プロピオニバクテリウムの糖
質を培地炭素源とする培養物からビタミンＢ１２を取得
する方法、などが知られている。

価格、供給量などの点で不利益なこのような天然源糖質
材料に代えて、非炭水化物である炭化水素、アルコール
、ケトン等を炭素源として発酵法によりビタミンＢ１□
を生産する方法も報告されているが、培養物に含まれる
ビタミンＢ１２の量が低いため、実用化されるに至って
いない。

しかしながら、非炭水化物であるこれらの炭素源は、石
油および石油化学工業の製品として安定した供給量で且
つ安価に入手でき、なかでもアルコールやケトンは、水
混和性であるため、発酵原料として今後も大いに期待さ
れるところである。

このような炭化水素の資化性菌を利用して、改善された
ビタミンＢ１□生産量で醗酵法ビタミンＢ１２を製造し
ようとする提案として、炭化水素を主炭素源とする培地
で、炭化水素質化性のコリネバクテリウム属に属するビ
タミンＢ１２生産菌を培養することによりビタミンＢ１
□を製造する方法において、炭化水素非資化性のロドシ
ュードモナス属に属するビタミンＢ１２生産菌を混合培
養することを特徴とする方法が知られている（特公昭４
９−１５７９６号）。

本発明者等は１．醗酵法ビタミンＢ１□の生産について
研究を行ってきたが、上記提案におけるビタミンＢ１□
生産菌とは異なる属に属する公知ビタミンＢ１□生産菌
であるプロピオニバクテリウム属に属するビタミンＢ１
２生産菌と、新菌種を包含して、アース０／くフタ−属
に属するビタミンＢ１□生産菌との少なくとも一方の生
産菌を、少なくとも他方の菌の培養物の存在下に培養す
ることにより、それらを単独で培養した場合に比して、
ビタミンＢ１２生産量が飛躍的に増大するという新しい
事実を発見した。

更に、培地にアースロバフタ−属に属するビタミンＢ１
２生産菌とプロピオニバクテリウム属に属するビタミン
Ｂ１□生産菌の両者を、同時にもしくは時期をずらして
接種し培養したり、これら両者を、別々に、培地にある
期間培養したのち、両者の生きた培養物（生きた該Ｂ１
２生産菌を含有する培養物）を混合し、所望により、追
加の培地成分及び／又は菌株を添加して培養したりする
場合に限らず、いずれか一方のＢ１２生産菌を用いた得
た培養物を殺菌したのち、他方のＢ１２生産菌及び／又
は他方の生きた培養物を加えて培養した場合にも、ビタ
ミンＢ１□生産量の増大が生ずるというユニークな事実
を発見した。

又更に、上記アースロバフタ−属に属するビタミンＢ１
２生産菌は、非炭水化物のみではなく、炭水化物も広く
利用資化することができ、培地成分についての制約乃至
不利益も改善されることがわかった。

従って、本発明の目的は、アースロバフタ−属に属する
ビタミンＢ１□生産菌とプロピオニバクテリウム属に属
するビタミンＢ１２生産菌との両者を利用して改善され
た生産量で、工業的に有利に醗酵法ビタミンＢ１２を製
造できる方法を提供するにある。

本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記載から一層明らかとなるであろう。

本発明方法で利用するプロピオニバクテリウム属に属す
るビタミンＢ１□生産菌の例としては、プロピオニバク
テリウム・シャーマニー （Ｐｒｏｐｉ ｏｎ １ｂａｃｔｅｒ ｉｕｍ ｓｈｅ
ｒｍａｎｎｉ ｉ ：ＡＴＣＣ８２６２，９６１４，９
６１５，９６１６゜９６１７．１３６７３；ＩＦＯ１２
３９１゜１２４２６）、プロピオニバクテリウム・フロ
イデンライヒ（ＰｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍＦ
ｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉ ｉ： ＡＴＣＣ６２０７：
Ｉ ＦＯ１２４２４）、等の公知菌を例示することが
できる。

又、本発明方法で利用するアースロバフタ−属に属する
ビタミンＢ１２生産菌の例としては、アースロバククー
・シムプレックス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｓｉｍｐ
ｌｅＸ；ＡＴＣＣ６９４７，１３２６０゜１５７９９；
ＩＦＯ１２０６９）、アースロバフタ−・ツメセンス（
Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｕｍｅｓｃｅｎｓ：Ａ
ＴＣＣ６９４７； ＩＦＯ１２９６０）、アースロバフ
タ−・ヒアリナス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｈｙａｌ
ｉｎｕｓ：微工研菌寄受託番号第３１２５号）、等を例
示することができる。

これら例示菌株中、上記アースロバフタ−・ヒアリナス
は本発明者等により分離された新菌種であって、下記菌
学的性質を有する。

・ アースロバフタ・ヒアリナス〔微工研菌究受託番
号第３１２５号〕 ■、形態的性質ニー 画形；培養前記には、長桿菌を示し湾曲し大きさは０．
３ Ｘ ４〜５ミクロンでし字状を示すものがあり、後
期には１．２Ｘ１．５ミクロンの短桿菌に変化する。

運動性；なし。

ダラム染色；陽性または陰性。

胞子形成；なし。

２、培養的性質ニー 肉汁寒天板培養；周縁がぎざぎざ状、中心凸状、透明、
混光。

肉汁液体培養；混濁。

３、生理的性質ニー 生育温度：２５〜３５°Ｃ０ 生育ｐＨ；６〜９゜ 酸素要求；通性嫌気性。

ゼラチンの液化；行わない。

リドマスミルク；わずかにアルカリに変り、ゆっくりペ
プトン化する。

インドール；発生しない。

硫化水素；発生する。

硝酸塩還元；行わない。

カタラーゼ；生成しない。

ウレアーゼ；生成する。

抗酸性；陰性。

殿粉の分解；行ねない。

糖の醗酵性；グリセリン、アラビノース、キシロース、
フラクトース、ガラクトース、グルコース、マンニット
、ソルビット、ラクトース、マルトース、シュクロース
、ラフィノースから酸もガスも発生しない。

アスパラギン；分解しない。

くえん酸；分解しない。

本発明方法によれば、上記例示の如きアースロバフタ−
属に属するビタミンＢ１□生産菌およびプロピオニバク
テリウム属に属するビタミンＢ１２生産菌の少なくとも
一方の生産菌を、少なくとも他方の菌の培養物の存在下
に培養する。

この培養物は、生きた培養物であってよいし、或は又、
殺菌したもしくは生菌体を除去した培養物であることが
できる。

培養は、アースロバフタ−属に属するビタミンＢ１２生
産菌（以下、アースロバフタ−属菌と略記することがあ
る）及びプロピオニバクテリウム属に属するビタミンＢ
１２先産菌（以下、プロピオニバクテリウム属菌と略記
することがある）の両者もしくはそれらを各別にもしく
は混合して培養した前培養物を、同時もしくは適宜に時
期をずらして培地に接種し培養したり、これら両者を、
各別に、ある期間培地に接種培養したのち、両者の生き
た培養物或はいずれか一方の培養物中の生菌体を除去も
しくは殺菌して混合し、所望により、追加の培地成分及
び／又は菌株を添加して、培養したりすることができる
。

このような本発明方法実施の数態様について例示すると
、以下のような態様をあげることができる。

（１）アースロバフタ−属菌及びプロピオニバクテリウ
ム属菌の両菌株もしくはそれらを各別に培養した前培養
物を、同時にもしくは時期をずらして、培地に接種して
培養する。

（ＩＩ）アースロバフタ−属菌及びプロピオニバクテリ
ウム属菌の両菌株を混合培養した生きた培養物を、培地
に接種して培養する。

（ｉｌｉ）アースロバフタ−属菌の生きた培養物とプロ
ピオニバクテリウム属菌の生きた培養物を混合し、所望
により追加の培地成分及び／又は少なくともいずれか一
方の菌株を添加し、培養する。

（ｉＶ） アースロバフタ−属菌の生きた培養物とプ
ロピオニバクテリウム属菌の殺菌したもしくは生菌体を
除去した培養物を混合し、所望により追加の培地成分及
び／又はアースロバフタ−属菌株を添加し、培養する。

（Ｖ） アース０／くフタ−属菌の生きた培養物に、
プロピオニバクテリウム属の菌株を接種し、所望により
追加の培地成分を添加し、培養する。

（■１）アースロバフタ−属菌の殺菌したもしくは生菌
体を除去した培養物に、プロピオニバクテリウム属菌株
を接種し、所望により追加の培地成分を添加し、培養す
る。

（ＶｉＤプロピオニバクテリウム属菌の生きた培養物と
アースロバククー属菌の殺菌したもしくは生菌体を除去
した培養物を混合し、所望により追加の培地成分及び／
又はプロピオニバクテリウム属菌株を添加し、培養する
。

（Ｖｍ）プロピオニバクテリウム属菌の生きた培養物に
、アースロバフタ−属の菌株を接種し、所望により追加
の培地成分を添加し、培養する。

ｑ″）Ｏプロピオニバクテリウム属菌の殺菌したもしく
は生菌体を除去した培養物に、アースロバフタ−属菌株
を接種し、所望により追加の培地成分を添加し、培養す
る。

本発明方法の実施に際して、プロピオニバクテリウム属
菌株及びアースロバフタ−属菌株を、各別に或は一緒に
培養する場合のいずれの場合に於ても、液体培地の利用
が好ましい。

培養に際して、プロピオニバクテリウム属菌株の単独培
養の場合には、静置培養が好ましく、アースロバフタ−
属菌株の単独培養の場合には、好気条件下に培養を行う
のがよく、振とう培養や攪拌培養を行うのが有利である
。

両属菌株の生きた培養物を混合して培養する場合には、
静置培養か、温和な好気条件の採用が好ましい。

すなわち振とう培養の場合には、ゆるやかな振とう条件
下に行うか、培養液量を多くして振とうを行うのが有利
である。

通気攪拌培養の場合は、通気速度を減少させるか、或は
通気中の酸素濃度を減少させるか、或は攪拌回転数を減
すなどの条件、或はこれらの適宜な組み合わせによって
、好気条件を調節するのが有利である。

培地組成は適宜に選択変更可能であり、例えば、プロピ
オニバクテリウム属菌単独の場合に、炭素源としては、
たとえば炭水化物、糖質、乳酸の如き有機酸類、グリセ
リンの如きアルコール類カ利用でき、又、窒素源として
は、たとえばアンモニア塩類、硝酸塩類などの無機窒素
化合物、ペプトン、酵母エキス、カゼイン、肉エキス、
コーンスチープリカー、尿素、醸造廃液、魚かす、大豆
かす等の有機窒素化合物が利用できる。

さらに、リン酸塩、マグネシウム塩、カリウム塩、カル
シウム塩、マンガン塩、コバルト塩、鉄塩、亜鉛塩、モ
リブデン塩、銅塩などの無機塩類、および、必要に応じ
てたとえば、ビタミン類等を添加することができる。

又、アースロバフタ−属菌単独の培養の場合に、炭素源
としては、たとえば炭水化物、炭化水素、アルコール、
有機酸、エステル、ケトン等が利用でき、又、窒素源、
無機塩類、ビタミン等はプロピオニバクテリウム属菌単
独の培養の場合について上記したと同様のものを用いる
とよＧ）。

菌属の菌株の培養物を混合して用いた場合に、追加の培
地成分をとくに添加する必要はないが、炭化水素やアル
コール等の炭素源を加えてもよい。

また、ビタミンＢ１□の生産量が増加する場合には、そ
の他の培地成分を加えてもさしつかえない。

プロピオニバクテリウム属菌の単独の場合の培養温度は
、約２５〜約３７°Ｃ，ｐＨは約３．０〜約８．５の条
件で培養を行うのが望ましく、培養日数は約１〜約１０
日でよい。

又、アースロバフタ−属菌の単独の場合の培養温度は約
２０〜約４０°Ｃ，ｐＨは約４．５〜約９．５の条件で
培養を行うのが望ましく、培養日数は約１〜約８日でよ
い。

菌属の菌株の培養物を混合したときの培養温度は約２０
〜約４０℃、ｐＨは約３．０〜約９．５の条件で培養を
行うのが好ましく、培養日数は約１〜約１０日程度でよ
い。

上述のようにして、本発明方法によれば、アースロバフ
タ−属に属するビタミンＢ１゜生産菌およびプロピオニ
バクテリウム属に属するビタミンＢ１２生産菌の少なく
とも一方の生産菌を、少なくとも他方の菌の培養物の存
在下に培養して改善された生産量でビタミンＢ１２を生
産せしめることができる。

培養物中に生成したビタミンＢ１□の採取は、従来法に
おけると同様に、たとえば、特願昭５１−１０８２４号
記載の方法により行うことができる。

ビタミンＢ１２は、主として菌属の培養菌体内に蓄積す
るので、例えば培養物をまず遠心分離して菌体を得る。

シアン型ビタミンＢ１２として培養物から分離するとき
は、菌体にシアンイオンを加えて硫酸等の酸でｐＨ５に
調整し煮沸することにより抽出できる。

補酵素型ビタミンＢ１２ （５、６ジメチルベンソイミ
タソールコバミドコエンザイム）、およびヒドロキシル
型ビタミンＢ１□として培養物から分離するときは、常
法に従い、菌体を暗所でメタノール、エタノール、アセ
トン、ピリジン等の溶剤を用いて抽出することにより分
離できる。

培養物から抽出されたビタミンＢ１□の精製は、フェノ
ール抽出手段、活性炭による吸着手段、イオン交換樹脂
、セルロース等を用いたカラムクロマドラグラフィ一手
段などを適宜に組合わせて行うことができる。

以下に実施例をあげて、本願発明をさらに具体的に説明
する。

実施例 １ プロピオニバクテリウム・シャーマニー （ＩＦＯ１２４２６）を、イオン交換純水１１あたり、
グルコース１０ｙ１乳酸ナトリウム１０ｇ１サング冶ウ
ス（ウィスキー廃液粉末）３０ｇ、ペプトン４．２ｇ、
酵母エキス４．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０１，
５ｇ、 ＫＨ２ＰＯ４１，５ｇ 、 ＭｇＳＯ４・７Ｈ
２００，５ｇ、ＦｅＳＯ４・７Ｈ７Ｈ２Ｏ１０゜Ｍｎ
Ｓ ０４ ・４ Ｈ２０１０ｍｇ 、 Ｚ ｎ ＳＯ４
・７ Ｈ２０１０７Ｑ、Ｃｏ（ＮＯ３）２５■、ＣｕＳ
Ｏ４・５Ｈ２０２００μｇ１Ｍｏ０３１０ｇｇ、 Ｃａ
Ｃ０ａ １０ｇ、トマトジュース末２ｇを含有する殺菌
した培地１００Ｔｌｌを収容した５００ｒｒＬｌ容三角
フラスコに植菌し、３０℃で５日間静置培養を行った。

このときのビタミンＢ１□の生成濃度は、６６０ｇｇ／
ｌであった。

一方、アースロバフタ−・ヒアリナス〔微工研菌寄受託
番号第３１２５号〕を、イオン交換純水１１あたり、ｉ
−プロピル・アルコール１０ＴＬ１１ペプトン３ｙ１酵
母エキス１ｇ、ＮＨ４Ｎ０３３ ｇ。

Ｎａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２０１，５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４０
，４ｇ。

Ｍｇ ＳＯ４・７ Ｈ２００，５ｇ、Ｆ ｅ ＳＯ４・
７Ｈ２０１０ｍｇ、ＺｎＳＯ４−７Ｈ２０１０ｍｇ 、
Ｃｏ（ＮＯ３）２５ｍｇ、Ｃｕ５Ｑ１５Ｈ２０２００ｇ
ｌ２Ｍ００３１０ｇｇ 、ＣａＣＯ３５ｇを含有する殺
菌した培地１００ｍ１を収容した５００ＴＬｌ容三角フ
ラスコに植菌し、３０℃で２日間振とう培養を行った。

このときのビタミンＢ１２の生成濃度は、１５１ｇｇ／
ｌであった。

本発明方法に従って、アースロバフタ−・ヒアリナスの
培養物１００１ｒＬｌを無菌的にプロピオニバクテリウ
ム・シャーマニーの培養物１００ＴＬｌの入った５００
１ｎｌ容三角フラスコに移して混合し、グルコースを２
０９／ｌになるように加え、振とう培養を始めた。

混合培養４日後のビタミンＢ１２の生成濃度は３．８
ｍｇ／ｌ （３８００μｇ／ｌ）であった。

培養物からのビタミンＢ１２の単離は、次に示す方法に
より行った。

上記と同様の方法で得た培養物２１を、５０００回転、
１０分間の条件で遠心分離して菌体を分離した。

菌体を２００ｍ１のｐＨ５，０，旬Ｎの酢酸緩衝液に懸
濁し、１１０００ｐｐのシアン化カリウム液を５０ｒｕ
ｌ入れて、１５分間、１００℃に保持した。

冷却したのちこの菌体懸濁液を５０００回転、１０分間
の条件で遠心分離して菌体を除いたのち、π容の８０％
フェノールを加えて振とうし放置しフェノール層を採取
した。

このフェノール液を水洗したのち、回答の水とエーテル
の等審理合物を加えて、振とうし放置し、水層を採取し
た。

このようにして得たジアノコバラミン水溶液をイオン交
換セルロースクロマトグラフィーにかけて精製し、最後
にアセトンを加えテ再結晶を行い、４．１ｍｙのシアン
コバラミンを得ることができた。

比較のため、混合を行わずにプロピオニバクテリウム・
シャーマニーを単独で使用し、３０℃で静置培養５日目
に前述の殺菌したアースロバフタ−属用培地１００７ｒ
Ｌｌを加えるとともに、グルコースを２０ｇ／１３にな
るようにカロえて、さらに４日間、静置培養を続けたと
きのビタミンＢ１□生成濃度は７８０μｇ／ｌであった
。

また、比較のため、アースロバフタ−・ヒアリナスを単
独に振とう培養し、培養２日目に、前述の殺菌したプロ
ピオニバクテリウム馬用培地１００ｍ１を加えるととも
にグルコースを２０９７７１になるように加えて、さら
に４日間、振とう培養を続けたときのビタミンＢ１□生
成濃度は５７０μｇ／ｌであった。

実施例 ２ 実施例１の方法において、アースロバ’７ター・ヒアリ
ナスの培養物１００ｍ１を１２１℃、１０分間の条件で
湿式滅菌器にかけたものを使用する以外は、同様の方法
で振とう培養を行った場合、ビタミンＢ１２の生成濃度
は３．１ｍ、ｐ／７（３１００μＩ／ｌ）であった。

実施例 ３ 実施例１において、プロピオニバクテリウム・シャーマ
ニーを使用する代りに、プロピオニバクテリウム・フロ
イデンライヒ（ＩＦＯ１２４２４）を使用する以外、実
施例１と同様に画風の菌株の培養物を混合しグルコース
を２０９／ｌとなるように加えて、４日間振とう培養し
たときのビタミンＢ１□の生成濃度は１．５８ ｍｇ／
ｌｊ （ｔ ５ｓ ｏ μｇ／ｌ）であった。

比較のため、プロピオニバクテリウム・フロイデンライ
ヒを単独で静置培養したとき、培養５日目のビタミンＢ
１□生成濃度は２７０μｇ／／ｌであった。

この培養液に実施例１に述べた、殺菌したアースロバク
クー属用培地１００ｙｄを加えるとともに、グルコース
を２０９／ｌになるように加えて、さらに４日間、振と
う培養を続けたときのビタミンＢ１□の生成濃度は２５
０μｇ／ｌであった。

実施例 ４ 実施例３において、アースロバフタ−・ヒアリナスの代
りにアースロバフタ−・シンプレックス（ＡＴＣＣ６９
４６）を用いること、およびアースロバフタ−・シムプ
レックス用培地の炭素源をｉ−プロピル・アルコール１
０ＴＬｌの代りにグルコース１０ｇを使用すること以外
、実施例３と同様に画風の菌株の培養物を混合しグルコ
ースを２０９／１１となるように加えて４日間振とう培
養したときのビタミンＢ１□の生成濃度は１．０７ｍｇ
／１１（１０７０μｇ／ｌ ）であった。

比較のため、アースロバフタ−・シムプレックスを単独
で振とう培養したとき、培養２日目のビタミンＢ１２生
成濃度は１５８μｇ／１１であった。

この培養液に、実施例１に述べた、殺菌したプロピオニ
バクテリウム馬用培地１００ｒｎｌを加えるとともにグ
ルコースを２０ ｇ／１１になるように加えて、さらに
４日間、振とう培養したときのビタミンＢ１□の生成濃
度は２３０μｇ／ｌであった。

実施例 ５ 実施例４において、プロピオニバクテリウム・フロイデ
ンライヒの代りにプロピオニバクテリウム・シャーマニ
ー（ＩＦＯ１２４２６）を使用する以外、実施例４と同
様に画風の菌株の培養物を混合しグルコースを２０ ＆
／ｌとなるように加えて４日間振とう培養したときのビ
タミンＢ１□の生成濃度は２．７ｍｙ／ｌ（２７００ｉ
ｔｇ／１１）であった。

実施例 ６ 実施例５において、アースロバフタ−・シムプレックス
（ＡＴＣＣ６９４６）用培地の炭素源をグルコース１０
ｇの代りに、ｎ−パラフィン１０ｍ１を使用する以外、
実施例５と同様に画風の菌株の培養物を混合し、グルコ
ースを２０９／１３となるように加えて４日間振とう培
養したときのビタミンＢ１２の生成濃度は２．２ ｍｙ
／１３ （２２００ｐｇ／ｌ ）であった。

比較のため、アースロバフタ−・シムプレックスを単独
で振とう培養したとき、培養２日目のビタミンＢ１□生
成濃度は１３０μｇ／ｌであった。

この培養液に、実施例１に述べた、殺菌したプロピオニ
バクテリウム馬用培地１００ＴｒＬｌを加えるとともに
、グルコースを２０ ｇ／ｌになるように加えて、さら
に４日間、振とう培養したときのビタミンＢ１□の生成
濃度は３１０μｇ／ｌであった。

実施例 ７ 実施例５において、アース０／くフタ−・シムプレック
ス（ＡＴＣＣ６９４６）の代りにアースロバフタ−・ツ
メセンス［ＦＯ１２９６０）を使用する以外、実施例５
と同様に菌属の菌株の培養物を混合しグルコースを２０
９／１１となるように加えて４日間振とう培養したとき
のビタミンＢ１□の生成濃度は１．６４ｍｙ／Ａ（１６
４０ｔｔ ｇ／ １３ ）であった。

これに対して、実施例４で述べた、殺菌したアースロバ
フタ−・シムプレックス用培地を用いて、アースロバフ
タ−・ツメセンスを単独で振とう培養したとき、培養２
日目のビタミンＢ１□生成濃度は１７５μｇ／ｌであっ
た。

この培養液に、実施例１に述べた、殺菌したブローオニ
バクテリウム馬用培地１００１ｒＬｌを加えるとともに
、グルコースを２０９／ｌになるように加えて、さらに
４日間、振とう培養したときのビタミンＢ１□の生成濃
度は４１０μ９／ｌであった。

以上の実施例中、培養液中のビタミンＢ１□の定量は、
希釈して培養液にシアン化カリウムを入れｐＨ５に調整
したのち１５分間煮沸しジアノコバラミンに変えてから
、ラクトバチルス・ライヒマニＡＴＣＣ７８３０を用い
る微生物定量法によった。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. １ アースロバフタ−属に属するビタミンＢ１□生産菌
   およびプロピオニバクテリウム属に属するビタミンＢ１
   ２生産菌の少なくとも一方の生産菌を、少なくとも他方
   の菌の培養物の存在下に培養して得られた培養物からビ
   タミンＢ１２を採取することを特徴とする醗酵法ｅ５ｚ
   ミンＢ１□の製法。