DE3147538C2 - Verfahren zur Bestimmung von Transferrin und dazu geeignetes Mittel - Google Patents
Verfahren zur Bestimmung von Transferrin und dazu geeignetes MittelInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Transferrin bzw. der Eisenbindungsfähigkeit von Transferrin, das darin besteht, daß man zu der zu untersuchenden Probe ein Reagenz zugibt, bestehend aus einer Lösung eines Eisen-III-Salzes sowie einer Suspension eines Adsorptionsmittels, insbesondere von Magnesiumcarbonat, das so erhaltene Gemisch zentrifugiert und das an Transferrin gebundene Eisen in der überstehenden Flüssigkeit bestimmt. Das Verfahren wird vorzugsweise durchgeführt mit Hilfe eines Mittels in Form eines einheitlichen Reagenzes, bestehend aus einer Suspension, in der ein Eisen-III-Salz an einem Adsorptionsmittel adsorbiert ist, gegebenenfalls einem Medium, das im Stande ist, den pH-Wert zwischen 8 und 9 einzustellen, und gegebenenfalls einem colorimetrischen Reagenz zur Bestimmung des Eisens.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung der Eisenbindungsfähigkeit von Transferrin sowie ein
spezielles Mittel, das zur Durchführung dieses Verfahrens geeignet ist.
Transferrin ist ein Glycoprotein. das im Blut vorhanden ist und zum Transport des Eisens dient. Jedes
Proteinmolekül kann zwei Eisen(III)-ionen binden.
Der Gehalt an Transferrin im Blut kann entweder direkt mit Hilfe immunologischer Methoden oder über
die Bestimmung der Eisenbindungsfähigkeit mit Hilfe chemischer Methoden gemessen werden.
In Beziehung auf die zuletzt genannten Methoden ist aus Chim. Gin. Acta. 2. 221 (1957) sowie aus Klinische
Laboratoriumsdiagnostik. 3. Aufl., S. 150 (1966) ein Verfahren bekannt, das die folgenden Schritte umfaßt:
— Sättigung des in der Probe, üblicherweise einer
Serumprobe, enthaltenen Transferrins mit einer sauren Lösung, die einen Überschuß an Eisen(III)-ionen
enthält.
— Entfernung der überschüssigen Eisenionen nach einer Inkubationszeit durch Zusatz von festem
Magnesiumcarbonat und
— Bestimmung des an das Transferrin gebundenen Eisens, das in der überstehenden Flüssigkeit
enthalten ist, mit Hilfe eines Reagenzes, das zur Bestimmung des Eisens in dem Serum geeignet ist,
nach Zentrifugieren der so erhaltenen Aufschlämmung.
Bei anderen Verfahren wird umgekehrt unter entsprechenden Bedingungen der Oberschuß an Eisenionen
bestimmt und durch Differenz das mit Hilfe des Transferrins entfernte Eisen berechnet, aus dem
wiederum die vorhandene Menge an Transferrin berechnet werden kann.
Es ist Aufgabe der Erfindung, ein einfacheres Verfahren zur Bestimmung der Eisenbindungsfähigkeit
von Transferrin zu entwickeln.
Diese Aufgabe wird gelöst durch das im Hauptanspruch
angegebene Verfahren. Vorteilhafte Ausgestaltungen dieses Verfahrens sind in den Untf-ansprüchen
angegeben.
Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zahlreiche Vorteile gegenüber den oben angegebenen
bekannten Verfahren erreicht. Die wichtigsten dieser Vorteile sind:
— Das Verfahren ist einfacher und die Anzahl der durchzuführenden Stufen, einschließlich der Inkubation,
ist geringer.
Es sind weniger Manipulationen erforderlich, da es nicht mehr notwendig ist, das Magnesiumcarbonat
in festem Zustand zu dem Reaktionsgemisch zuzusetzen.
Die Dosierung der Reagenzien ist besser reproduzierbar, und
das Transferrin wird in der Probe mit Eisenionen bei einem basischen pH-Wert gesättigt, wobei
dieser in der Literatur als besonders geeignet zur Bindung von Eisen an Transferrin angegeben ist.
Aufgrund dieser Tatsachen wird eine Vereinfachung und Erhöhung der Genauigkeit der Bestimmung
erreicht, wie sie bisher nicht möglich war.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden im einzelnen die folgenden Stufen durchgeführt:
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden im einzelnen die folgenden Stufen durchgeführt:
— Zugabe einer Suspension des festen Substrats, an das eine Lösung des Eisen(lll)-salzes adsorbiert ist.
mit einem pH-Wert zwischen 8 und 9 zu der zu untersuchenden Probe.
— Zentrifugieren der so erhaltenen Aufschlämmung und
— Messung des in der überstehenden Flüssigkeit enthaltenen an Transferrin gebundenen Eisens.
Die Erfindung betrifft auch das in Anspruch 5 näher gekennzeichnete Mittel zur Durchführung des erfindungsgemäßen
Verfahrens.
Feste Substrate sind ausgewählt aus der Gruppe basisches Magnesiumearbonat und CaCOj, wobei
basisches Magnesiumcarbonat bevorzugt ist.
Der gegebenenfalls vorhandene Puffer, der geeignet ist, den pH-Wert konstant zu halten, ist ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus HjPO4. H2PO4-, Barbitursäure
und Barbituraten, wobei NaH2PO4 bevorzugt ist.
Wenn ein colorimetrisches Reagenz angewandt wird.
sollte dieses vorzugsweise ausgewählt werden aus den für diesen Zweck üblichen Mitteln oder es kann ein
solches angewandt werden, wie es in der IT-OS 20 177A/80 angegeben ist.
Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele näher erläutert.
Beispiel 1
Herstellung einer Reagenzsuspension
Herstellung einer Reagenzsuspension
In 100 ml Wasser wurden 828 mg NaH2PO4 - H2O
gelöst und anschließend 2^5 g basisches MgCO3
aufgeschlämmt Zu der so erhaltenen Suspension wurde unter Rühren 1 ml 0,01 n-HCi enthaltend 500 mg/dl
pe+ + + gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bis zur Stabilisierung des pH-Werts stehengelassen.
Das so erhaltene Reagenz wurde 48ma! angewandt zur Bestimmung der Eisenbindungsfähigkeit von zusammengegebenen
(pool) Humansera, wobei ein Mittelwert von 293,71 μg/d! erhalten wurde mit einem CV. von
3,48%.
Es wurden die folgenden Bedingungen eingehalten:
— Reagenzsuspension
— Humanblutserum
— Inkubation
— Zentrifugieren
1 ml
0,2 ml
5 min bei
Raumtemperatur
10 min bei 4000 UpM
0,2 ml
5 min bei
Raumtemperatur
10 min bei 4000 UpM
Das in der überstehenden Flüssigkeit enthaltene Eisen wurde abgezogen und mit Hilfe eines üblichen
Reagenzes bestimmt.
Zu fraktionierten Proben eiies Grundserums, in dem
die Eisenbindungsfähigkeit bestimr t worden
wurden zunehmende Mengen an
wurden zunehmende Mengen an
zugegeben.
Die so angereicherten Serumproben wurden nach dem in Beispiel 1 angegebenen Verfahren untersucht
sowie nach dem von Ramsay in Chimica Clinica Acta, 2,
"' 221 (1957) angegebenen Verfahren. Die Werte der Eisenbindungsfähigkeit, wie sie nach diesen beiden
Verfahren erhalten worden waren, wurden in Zusammenhang gebracht mit der Gewichtsmenge an zugesetztem
Transferrin, wobei man die folgende Regressions-
"' kurve erhielt:
χ = mg zugesetztes Transferrin
y = Eisenbindungsfähigkeit (in μg/dI gefundenem Eisen)
y = Eisenbindungsfähigkeit (in μg/dI gefundenem Eisen)
F.rfindungsgemäßes Verfahren
y = 0,90* + 277,2 mg/dl: Korrelationskoeffizient = 0,998
-" Ramsay-Verfahren
y = 031 x + 277,5 mg/dI:KorreIations-
kocffizient = 0397
,3 Der Wert für die Eisenbindungskraft des Grundserums
betrug nach dem erfindungsgemäßen Verfahren 281 μg/dl und nach dem Ramsay-Verfahren 272μg/dl.
Beide Werte stimmen zufriedenstellend überein mit den Werten der jeweiligem Sprünge in den Gleichungen der
J0 Geraden, wie oben angegeben.
Konzentrationsberpjche der Komponenten des Reagenzes:
war, Humantransferrin basisches Magnesiumcarbonat: 03—10 g/dl
Fe+ + + Ibis 100 mg/dl
H2PO4-O bis 200 mg/I
Fe+ + + Ibis 100 mg/dl
H2PO4-O bis 200 mg/I
Claims (7)
1. Verfahren zur Bestimmung von Transferrin durch Zusammenbringen der zu untersuchenden
Probe mit einem Überschuß eines Eisen(IIl)-salzes
und einem festen Substrat, Zentrifugieren des so erhaltenen Gemisches und Messung des an Transferrin
gebundenen Eisens in der überstehenden Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß
man das Eisenfjl I)-SaIz und das feste Substrat in Form einer Suspension zugibt, in der das Eisen(HI)-salz
an das feste Substrat adsorbiert ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als festes Substrat basisches
Magnesiumcarbonat und/oder Calciumcarbonat verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch
gekennzeichnet, daß das angewandte Reagenz zusätzlich einen Puffer enthält, der im Stande ist, den
pH-Wert zwischen 8 und 9 einzustellen.
4. Verfahren nach Anspruch 3. dadurch gekennzeichnet,
daß der Puffer ausgewählt ist aus der Gruppe HjPO«. H2PO4-, Barbitursäure und Barbituraten.
5. Mittel zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es
aus einer Suspension eines festen Substrats besteht, an das eine Lösung eines Eisen(III)-saIzes adsorbiert
ist, sowie gegebenenfalls einem Puffer, der den pH-Wert auf 8 bis 9 einstellen kann, und
gegebenenfalls einem colorimetrischen Reagenz zur Bestimmung von Eisen.
6. Mittel nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Adsorptionsmittel basisches Magnesiumcarbonat
und/oder Calciumcarbonat ist.
7. Mittel nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Puffer besteht aus Phosphorsäure.
Phosphaten, Barbitursäure und/oder Barbiturate^
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