DE3310665C2

DE3310665C2 - Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse

Info

Publication number: DE3310665C2
Application number: DE3310665A
Authority: DE
Inventors: Fred C. Palo Alto Calif. Unterleitner
Original assignee: Becton Dickinson and Co
Current assignee: Becton Dickinson and Co
Priority date: 1982-03-25
Filing date: 1983-03-24
Publication date: 1986-05-28
Also published as: US4498766A; DE3310665A1; JPS59643A

Abstract

Eine Strömungszytometrievorrichtung (10) für das Streulicht und die Fluoreszenz von fluoreszierenden Partikeln (41) in einer Fluidströmung (38) enthält eine Düse (40) für den Durchfluß der Partikel (41). Eine Lichtquelle, beispielsweise ein Laser (12), richtet einen Lichtstrahl (16) auf die hindurchfließenden Partikel (41). Eine Strahlfokussierlinse (30), die um eine durch ihr optisches Zentrum führende Achse unter einem Winkel im optischen Weg des Lichtstrahls (16) schräg angeordnet ist, erzeugt einen elliptischen Strahlfleck am Fluidstrom (38), um den Brennfleck des Lichtstrahls (17) zu verlängern. Mit der Meßvorrichtung werden ein oder mehrere lichtoptische Parameter der Partikel (41) in der Fluidströmung (38) auf der Basis des auf die Partikel (41) auftreffenden Lichtstrahls (16) bestimmt.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Fluoreszenzanaiyse von in einem kontinuierlichen Fluidstrom strömenden, markierten Partikeln, mit einer Lichtquelle zum Erzeugen eines Lichtbündels, einer Einrichtung zum Erzeugen eines ellipsenförmigen Querschnitts dx:s Lichtbündels im Kreuzungspunkt des Lichtbündels mit dem Fluidstrom, sowie mit einem Detektor zum Aufnehmen des Fluoreszenzsignals.

Eine Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse, wie sie aus der DE-OS 22 46 380 bekannt ist, kann die Fluoreszenz von in einem kontinuierlichen Fluidstrom strömenden, markierten Partikeln messen, indem das Lichtbündel einer Lichtquelle auf den Fluidstrom gerichtet wird und indem ein Detektor die entstehenden Fluoreszenzsignale mißt. Die Vorrichtung weist eine aus einer Kombination aus sphärischen und zylindrischen Linsen bestehende Einrichtung auf, mit der das Lichtbündel auf eine schmale Ellipse am Schnitt mit dem Fluidstrom fokussiert werden kann. Eine derartige Fokussiereinrichtung hat den Nachteil, daß sie mehrere Linsen erfordert. Zusätzliche Linsen schwächen außerdem den Lichtstrahl, so daß die Signalintensität für den Detektor geringer wird. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß die justierung der Linsen zwecks Fokussierung äußerst schwierig wird, da die Linsen untereinander eine Wechselwirkung haben. Ein wesentlicher Nachteil besteht weiterhin darin, daß die Ellipsenforni nicht variierbar ist und nicht an die Fluidstrahldimensionen anpaßbar ist. Diese können sich beispielsweise dann verändern, wenn unterschiedliche Fluide bzw. unterschiedliche Austrittsdüsen für den

Fluidstrom verwendet werden.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung der eingangs genannten Art zu schaffen, die bei apparativ einfachem Aufbau und einfacher Bedienbarkeit eine verbesserte Floureszenzempfindlichkeit aufweist

Zur Lösung dieser Aufgabe ist erfindungsgemäß vorgesehen, daß die Einrichtung zum Erzeugen eines ellipsenförmigen Querschnitts aus einer Fokussierlinse besteht, die schräg zur optischen Achse des einfallenden Lichtbündels im Strahlengang des zum Fluidstrom senkrechten Lichtbündels angeordnet und in ihrer Schrägstellung variierbar ist

Der elliptische Brennpunkt im Kreuzungspunkt des Lichtstrahls mit dem Fluidstrom wird mit den einfachsten Mitteln erzeugt, nämlich allein durch die Schrägstellung der Fokussierlinse. Die Weite des Brennpunktes kann der Fluidstromdimension angepaßt werden, indem die elliptische Form des Strahlflecks durch die variable Schrägstellung der Fokussierlinse eingestellt wird. Dieser variable elliptische Brennpunkt erlaubt die Lichtenergieverteilung in Richtung der Partikelbewegung zu optimieren, so daß die Signalstärke dadurch erhöht wird, daß die Partikel durch den optimierten vertikalen Brennfleck fließen, dessen vertikale Ausdehnung eine lange Signalimpulsdauer bewirkt Mit den einfachsten Mitteln ist alsp. eine Optimierung der Brennpunktintensität und der Brennpunktgleichförmigkeit, und damit eine verbesserte Signalimpulsgleichförmigkeit bei hoher Signalintensität möglich. Während die Energieverteilung in Riclrtung der Partikelbewegung optimiert ist, ist aufgrund der Ausdehnung des Strahlflecks in der horizontalen Ebene die Detektionsempfmdlichkeit hinsichtlich der Strömungsrate des Partikelstromes, d. h.

hinsichtlich des Strömungsdurchmessers, reduziert. Der einstellbare Schrägstellungswinkel der Fokussierlinse trägt zur Optimierung der Fluoreszenzanaiyse bei, da der optimale Brennpunkt von der zur Verfügung stehenden Lichtenergie und von der auf die Partikel aufgetragene Farbstoffmenge abhängig ist, wobei wegen der hohen Empfindlichkeit der erfindungsgemäßen Vorrichtung auch die Unterscheidung von geringfügig unterschiedlich markierten Unterpopulationen der Partikel möglich ist.

Auf diese Weise ist eine Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse geschaffen, die durch Abgleichen der Bestrahlungsgleichförmigkeit und der Laserstrahlintensität eine optimale Fluoreszenzimpulsauflösung ermöglicht, indem in deivi Laserstrahl ein Astigmatismus erzeugt wird und die Einschnürung des Laserstrahlbrennpunktes in Längsrichtung des Fluidstromes verlängert wird.

Im folgenden wird unter Bezugnahme auf die Zeichnungen ein Ausführungsbeispiel der Erfindung näher erläutert. Es zeigt

F i g. 1 eine schematische Darstellung der Anordnung der optischen Elemente und des Strahlengangs in der Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse insbesondere zur Bestimmung von Fluoreszenz- und Streulichtparametern von Partikeln in einem Fluidstrom und

Fig.2 eine vergrößerte schematische Darstellung der bevorzugten Orientierung der Strahlfokussierlinse in Draufsicht.
Die in F i g. 1 dargestellte Vorrichtung zur Fluores· zenzanalyse mit optischen Elementen und einer Durchflußeinrichtung analysiert und separiert Zellenpropulationen auf der Basis von Streulicht und Fluoreszenz für einen großen Anwendungsbereich in wissenschaftlichen

Laboratorien.

Wie in F i g. 1 dargestellt, stellen zwei Laser 12 und 14 je ein Lichtbündel 16,18 in der Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse 10 zur Verfügung. Bei diesem Ausführungsbeispiel weist die Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse 10 zwei Lichtquellen auf, so daß es möglich ist, zwei verschiedene Partikelarten mit unterschiedlichen Fluoreszenzeigenschaften zu messen und zu erkennen. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die Verwenduag von zwei Lasern in diesem Ausführungsbeispiel lediglich eine Ausführungsform darstellt und nur als ein Beispiel für die Anwendung von mehr als einem Fluoreszenzkanal mit entsprechenden Meßvorrichtungen dienen soll. Die beschriebene Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse funktioniert jedoch grundsätzlich auch, wenn nur ein Laser verwendet wird. Entsprechend können auch mehr als zwei Laser verwendet werden, wenn dies erforderlich ist.

Die Laser 12 und 14 sind hoch-energetische Argon-Ionen-Laser, die Primäremissionen auf bestimmten Wellenlängen haben. Der Laser 12 arbeitet im ultravioletten Bereich, wodurch Fluorochrome auf d:n Partikeln, die das von dem Laser 12 erzeugte Licht kreuzen, zur Lumineszenz angeregt werden. Der Laser 14 arbeitet auf einer anderen Wellenlänge als der Laser 12. Das erlaubt die zweifache Kennzeichnung spezieller Zellen oder Partikeln mit verschiedenen Fluorochromen und die Messung der Lumineszenz eines jeden Teilchens. Dadurch wird eine simultane Messung von zwe' Zellenoder Partikeleigenschaften, wie im folgenden ausführ-Hch beschrieben, ermöglicht. Laser-Lichtquellen, die kohärentes Licht erzeugen, werden für derartige Meßvorrichtungen eingesetzt, aber auch andere Lichtquellen einschließlich solcher, die inkohärentes Licht erzeugen, können in derartigen Meßvorrichtungen verwendet werden.

Jeder der aus den Lasern 12 und 14 austretenden Lichtbündel 16 und 18 weist einen Durchmesser von ca. 1,6 mm auf. Die Lichtbündel passieren einen Lichtbündeierweiterei, der schematisch mit den Bezugszeichen 20 und 22 gekennzeichnet ist und jeder jeden Strahl auf einen Durchmesser von ca. 6 mm erweitert, wobei der parallele Charakter des Lichtbündels erhalten bleibt. Die Lichtbündeierweiterer können für Ultraviolettbetrieb oder für den Betrieb mit anderem sichtbaren Licht eingerichtet sein. Nach dem Austritt eines jeden Lichtbündels aus dem Lichtbündeierweiterer tritt jedes 6 mm-Lichtbündel in die Frontfläche eines Prismes 24 bzw. 25 mit interner Totalreflektion ein, das das Lichtbündel um einen Winkel vcn 90° ablenkt. Diese Prismen sind aus vergütetem Quarzglas hergestellt, um eine maximale Transmission zu erzielen. Verschiedene Einstellmechanismen können vorgesehen sein, um die Prismen in der vertikalen und horizontalen Ebene zu drehen, um die Lichtbündel einzustellen und auszurichten. Danach treffen die Lichtbündel auf zwei Prismen 26 und 28 mit interner Totalreflektion, die die Lichtbündel auf die zuletzt angeordneten Fokussierlinsen 30,32 richten. Auch die Prismen 26 und 28 sind in der horizontalen und vertikalen Ebene zur einwandfreien Ausrichtung einstellbar.

Nachdem die Lichtbündel 16 und 18 die Prismen 26 und 28 passiert haben, werden sie auf die Fokussierlinsen 30 und 32 gerichtet, um die Lichtbündel auf den Partikelstrom zu fokussieren. Wie in Verbindung mit b5 Fig. I, deutlicher in Fig.2 zu erkennen ist, wird die Fokussierlinse 30 um eine vertikale zum Fluidstrom parallele Achse schräg gestellt, so daß die durch das optische Zentrum führende Linsenachse 31 einen in der Horizontalen liegenden Winkel θ mit der Achse des Laserlichtstrahls 16 bildet. Die Winkelstellung, die für die Aufgabe der Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse optimal ist, liegt bei einem Winkel θ zwischen 0° und 10°, wobei dieser Winkel in Abhängigkeit von Dimensionierungsfaktoren und dem Anwendungsbereich der Meßvorrichtung in einem weiten Bereich variieren kann. Wird die Fokussierlinse 30 mit einem derartigen Winkel schräggestellt, wird, wenn das Lichtbündel durch die Linse tritt, ein Astigmatismus im Lichtbündel erzeugt. Dieser hat zur Folge, daß ein erster linienförmiger, quer zum Fluidstrom und zur Lichtstrahlachse verlaufender horizontaler Brennpunkt 34 zwischen der Fokussierlinse 30 und den zweiten, vertikal verlaufenden Brennpunkt 35 entsteht Darüber hinaus wird ein elliptischer Strahlfleck 36 in Verbindung mit dem vertikalen Brennpunkt 35 erzeugt.

Beispielsweise entsteht ein elliptischer Brennfleck mit einem vertikalen Querschnitt von 13 yjri und einem horizontalen Querschnitt von 120 um a.'s Folge des Astigmatismus, der in dem einfallenden Laserstrahl von 6 mm Durchmesser gebildet wird, wenn die Fokussierlinse 30 mit einem Winkel von 8,6° um eine durch ihr optisches Zentrum führende vertikale Achse schräggestellt wird. Die Fokussierlinse 30 ist innerhalb der Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse 10 so montiert, daß sie einrichtbar ist, indem von einer Bedienungsperson der Schrägstellungswinkel variiert wird. Auf diese Weise kann der Umfang der elliptischen Form eingestellt werden, indem der Schrägstellungswinkel der Linse variiert wird. Darüber hinaus, kann, wenn erwünscht, eine Feinfokussierung der Fokussierlinse 30 durch entsprechende Weiteneinstellmechanismen in longitudinaler Richtung erfolgen.

F i g. 2 stellt als Ausschnitt die Fokussierlinse 30 und den Einfluß der Linse auf den Laserstrahl 16 dar. Die Fokussierlinse 32 funktioniert auf gleiche Weise, um die Wirkung des Laserstrahls 18 zu modifizieren.

Nachdem die Laserstrahlen durch die Linsen 30 und 32 hodurchgetreten sind, werden sie auf den Partikelstrom 38 gerichtet Eine in Fi g. 2 gezeigte Düse 40, die innerhalb der Vorrichtung zur Fluoreszenzanaiyse eingebaut ist, erleichtert das Strömen der Partikeln 41 innerhalb des Fluidstromes 38. Wie man aus Fig.2 in Verbindung mit F i g. 1 erkennt, sind die Düse 40 und die Fokussierlinse 30 (wie auch die nicht in F i g. 2 gezeigte Fokussierlinse 32) in der Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse so angeordnet, daß die Strömung 38 und die darin enthaltenen Partikeln 41 durch den optimalen vertikalen Laserstrahlbrennfleck 35, der die kürzeste Fluoreszenzpulslänge repräsentiert, fließen. (Fluidströmung 38 und die Partikeln 41 strömen in Fig.2 senkrecht in die Papierebene). Aufgrund der Breite des Laserstrahlflecks speziell in der horizontalen Ebene ist entsprechend die Empfindlichkeit bezüglich des Partikelströmungsdurchmessers reduziert.

In dieser Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse sind zwei Laserstrahl-Pjrtikelstrom-Kreuzungspunkte mit gegenseitigem Abstand von ca. 250 μπι angeordnet. Wie Fig. I zeigt, liegt der Laserstrahl 16 auf der optischen Achse des Streulichtkanals und wird für ein? Streulichtmessung an den Partikeln verwendet. Auf diese Weise ist der Laserstrahl 16 der ersten Laserstrahl, auf den eine Partikel trifft, die in der Strömung 38 fließend aus der Düse 40 auftritt. Danach trifft der Laserstrahl 16 auf eine Streulichtverdunkeiungsleiste 42 auf der optischen Achse des Streulichtkanals. Das Streulicht, das von Lin-

se 44 gesammelt wird, tritt durch eine erste Irisblende 45, die den maximal-(zulässigen) Streulichtwinkel des gesammelten Streulichtes bestimmt. Hinter der ersten Irisblende 45 ist ein Strahlenteilerspiegel 46 angeordnet, der etwa 10% des einfallenden Lichtbündels in Richtung auf einen Streulichtdetektor 48 ablenkt und etwa 90% des einfallenden Lichtes in Richtung auf einen Lichtabsorber (nicht dargestellt) hindurchlaßt. Eine zweite Irsiblende 49 arbeitet als Feldblende, um die Streulichtquelle auf den Kreuzungspunkt des Laserstrahls 16 mit der Strömung 38 zu begrenzen. Nachdem das Streulicht durch das Filter 50 hindurchgetreten ist, wird es im Detektor 48 gemessen. Der Detetktor arbeitet elektronisch, um die Partikelgröße der im Flüssigkeitsstrom fließenden Partikeln nach bekannten Meßmethoden zu ΐί bestimmen.

Der Laserstrahl 18 ist ebenfalls auf die Strömung 38 gerichtet, aber er ist entlang der vertikalen Achse der Strömung im vertikalen Abstand von ca. 250 μΓη vom Laserstrahl 16 verschoben. Das von einer Partikel gestreute Licht vom Laserstrahl 18 wird von den Optiken des Streulichtkanals erfaßt, aber für den Detektor 48 durch ein dielektrisches Filter 50, das im Streulichtkanal angeordnet ist, gespserrt. Hinsichtlich des Fluoreszenzkanals ist eine Bestrahlung für eine sequentielle Anregung von zwei verschiedenen Fluorochromen, wie z. B. Fluorescein und Rhodamin verfügbar, die durch den Laserbetrieb mit zwei unterschiedlichen Wellenlängen bereitgestellt wird. Wie in F i g. 1 dargestellt, kreuzen die beiden unabhängigen Laserstrahlen die Strömung 38 an jo Stellen, die vertikal versetzt sind, so daß eine Partikel zunächst den Laserstrahl 16 und dann den Laserstrahl 18 kreuzt. Entsprechend werden zwei optische Signale für jede Partikel erzeugt. Diese Signale sind zeitlich um den Zeitbetrag, den die Partikel benötigt, um vom ersten Laserstrahl-Kreuzungspunkt zum zweiten Laserstrahi-Kreu£ungspünki zu wandern, versetzt. Dieser Zeitversatz erlaubt die Signale getrennt zu analysieren, wobei Signale proportional zur Fluoreszenzmission der Partikel erzeugt werden, wenn diese mi: zwei verschiedenen Wellenlängen angeregt wird. Die von den Partikeln ausstrahlenden Fluoreszenzsignale werden um die Verdunklungsleiste 54 herumgeführt, die gebrochenes Licht von den getrennten Lichtbündeln absperrt. Die Fluoreszenzsignale werden von Linse 55 durch eine Serie von Filtern 56, 58 und 59 hindurch fokussiert bis sie von den Detektoren 60· und 61 aufgenommen werden. Die Detektoren können hochempfindliche Photoverstärker-Röhren sein, die die Fluoreszenzsignale in elektrische Signale umwandeln. Ein Spiegel 62, kann, wenn erforderlich, verwende;: werden, um eines der beiden Fluoreszenzsignale zwecks bestmöglicher Raumausnutzung umzulenken.

Nachdem die Partikeln 41 in der Strömung 38 die Laserstrahlen passiert haben, kann die Fluidströmung in einzelne Tropfen aufgelöst werden, so daß diese getrennt werden können und in verschiedenen Auffangbehältern gesammelt werden können. Beispielsweise können Tropfen mit einer fluoreszierenden Partikel einer gewünschten Lumineszenz, die keine anderen Partikeln enthalten, in einen speziellen Behälter umgelenkt werden. Tropfen, die andere Partikeln enthalten, wie z. B. fluoreszierende Partikel unterschiedlicher Lumineszenz, und die keine fluoreszierenden Partikeln der ersten Lumineszenz enthalten, können in einen anderen Behälter umgelenkt werden. Darüber hinaus können alle Tropfen, die Partikeln enthalten, die nicht sortiert werden sollen, in einem weiteren Behälter gesammelt werden. Diese Trennungsmethode für Partikeln und Tropfen wird erleichtert durch die Anwendung einer selektiven Aufladung des Tropfenstroms.

Alle in dieser Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse verwendeten Linsen sind aus Quarzglas hergestellt, um eine maximale Transmissionswirkung zu erzielen.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentansprüche:

1. Vorrichtung zur Fluoreszenzanalyse von in einem kontinuierlichen Fluidstrom strömenden, markierten Partikeln, mit einer Lichtquelle zum Erzeugen eines Lichtbündels, einer Einrichtung zum Erzeugen eines ellipsenförmigen Querschnitts des Lichtbündels im Kreuzungspunkt des Lichtbündels mit dem Fluidstrom, sowie mit einem Detektor zum Aufnehmen des Fluoreszenzsignals, dadurch gekennzeichnet, daß die Einrichtung zum Erzeugen eines ellipsenförmigen Querschnitts aus einer Fokussierlinse (30) besteht, die schräg zur optischen Achse des einfallenden Lichtbündels (16, 18) im Strahlengang des zum Fluidstrom senkrechten Lichtbündels (16, 18) angeordnet und in ihrer Schrägstellung variierbar ist

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Fokussierlinse (30) um eine zu ihrer optisches Achse (31) und zur Achse des Lichtbündels (16,18) vertikale Achse schwenkbar ist

3. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 oder

2, dadurch gekennzeichnet, daß der Winkel θ zwischen der optischen Achse (31) der Fokussierlinse (30) und der Achse des Lichtbündels (16,18) maximal 10° beträgt.

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 oder

3, dadurch gekennzeichnet, daß die Fokussierlinse (30) derart angeordnet ist, daß der quer zum Fluidstrom (38) und der Achse des Lichtbündels (16, 18) verlaufende Brennpunkt (34) des Lichtbündels (16, 18) zwischen der Fokyssierli'-je (30) und dem Fluidstrom (38) liegt.