DE3403256C2

DE3403256C2 -

Info

Publication number: DE3403256C2
Application number: DE3403256A
Authority: DE
Inventors: Giancarlo Sportoletti; Piergiuseppe Pagella; Pietro Mailand/Milano It Cremonesi
Original assignee: ITALFARMACO SpA MAILAND/MILANO IT
Current assignee: ITALFARMACO SpA MAILAND/MILANO IT
Priority date: 1983-10-25
Filing date: 1984-01-31
Publication date: 1990-10-31
Also published as: DK508084D0; US4717719A; DE3403256A1; IT1169888B; JPS6357407B2; IT8323422A0; DK508084A; ES537393A0; ES8602041A1; JPS60109524A; CH661439A5

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Heparinfraktion, d. h. eines modifizierten Glucosaminoglucans zur Hemmung der Bildung von Thromben.

Der Thrombus stellt ein Aggregat von Thrombozyten und poly morphkernigen Leukozyten in einem Fibrinnetz dar. Er ist vermutlich die Ursache für ernstliche vaskuläre Komplikationen, wie z. B. Herzinfarkt, Schlaganfall und venöse Thrombosen.

Ein Thrombus unterscheidet sich im Aufbau und der Art von einem als hämostatischer Pfropf bezeichneten Koagulum. Ein hämostatischer Pfropf wird im Bereich einer Gefäßläsion ge bildet, während der Thrombus sich auch im Kreislauf bildet und nicht unbedingt Folge einer Gefäßläsion ist. Lange Zeit wurden diese Aggregate miteinander verwechselt. Diese Ver wechslung führte zu der irrtürmlichen Annahme, daß eine ein fache Änderung des Gerinnungssystems infolge einer Hyper koagulierbarkeit den Thrombus bildet. Dies führte zu der An nahme, daß diese Erscheinung voraussehbar ist oder sich durch Verabfolgung von Antikoagulantien heilen läßt. Ferner ist es erforderlich, zwischen einer arteriellen und einer venösen Thrombose zu unterscheiden. Die Folgen der Bildung des Thrombus in den Arterien mit Stillstand des Blutstroms und nachfolgender Bildung des Infarkts und in den Venen mit Ab riß oder Verlängerung des Thrombus und seiner Embolisation in der Lunge sind die wesentlichen Todesursachen.

Zur Thromboseprophylaxe werden Substanzen eingesetzt, welche die Thrombozytenaggregation hemmen. Es werden Fibrinolytika verwendet, welche das Fibrin zu löslichen Peptiden abbauen. Ferner werden Mittel verwendet, die als Inhibitoren des Fak tors oder der Faktoren wirken, die zu dem Fibrinnetz führen. Unter diesen Faktoren wurden Thrombin und der Faktor Xa (aktivierter Faktor X) als Bestandteile des Mechanismus der intrinsischen Koagulation identifiziert. Einer der am meisten verwendeten Inhibitoren dieser beiden Faktoren ist He parin.

Die antithrombotische (gerinnungshemmende) Wirkung dieser Verbindung wird im allgemeinen durch ihre anti-Xa-Aktivität ausgedrückt. Je größer dieser Wert ist, umso größer ist die antithrombotische Wirkung. Die üblichen Heparinpräparate, haben eine hohe anti-Xa-Aktivität sowie eine hohe antikoagulierende Aktivität. Die antikoagulierende Aktivität wird im all gemeinen durch internationale Einheiten pro mg (I. U./mg) aus gedrückt. Die Beeinflussung der Gerinnung verusacht Neben wirkungen, die nicht unbeträchtlich sind, z. B. die Bildung von Hämatomen an der Einstichstelle und gefährliche Zustände der Hyperkoagulabilität, sollten die Präparate über einen längeren Zeitraum gegeben worden sein. Klinische Untersuchungen haben ergeben, daß sich eine venöse Thrombose verhindern läßt, während die Ergebnisse hinsichtlich arterieller Thrombosen zweideutig sind.

Die Entwicklung eines Antithrombotikums mit niedriger oder fehlender antikoagulierender und anti-Xa-Aktivität sowie gegebenenfalls einer bestimmten fibrinolytischen Wirkung wäre sehr erwünscht, um sowohl eine venöse als auch eine arterielle Thrombose sowie ihre Folgen zu verhindern.

Nach E. Holmer et al., Thrombos. Res. , Bd. V (1982) 25, 475, sind Bemühungen zur Herstellung von Heparinfraktionen be kannt, die aus Heparin gewonnen werden, und die eine be trächtliche Molekulargewichtsverteilung mit oder ohne struk turelle Änderungen aufweisen. Diese Fraktionen zeigen eine hohe anti-Xa-Aktivität und verminderte antikoagulierende Aktivität.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Arzneimittel zu entwickeln, die eine sehr niedrige oder keine antikoagulierende Aktivität und eine verminderte oder keine anti-Xa- Aktivität aufweisen, jedoch immer noch eine befriedigende Lipase-freisetzende Wirkung zeigen und die weiterhin in vivo die Bildung von Thromben hemmen. Die Lösung dieser Aufgabe beruht auf dem überraschenden Befund, daß dazu Heparin-Deri vate in der Lage sind, die aus Heparin durch N-Desulfatierung und Umsetzung mit Bernsteinsäure erhältlich sind. Das Verfahren zur Herstellung dieser Derivate ist in der italie nischen Patentanmeldung 22 851 A/80 beschrieben.

Die Erfindung betrifft somit die Verwendung einer mit Bern steinsäure umgesetzten N-desulfatierten Heparinfraktion, die weniger als 10% der N-Sulfatgruppen des Heparin-Ausgangs materials und mehr als 0,6 Bernsteinsäurereste pro Disaccharid- Einheit enthält, zur Hemmung der Bildung von Thromben.

Vorzugsweise enthält die Heparinfraktion 1,2 Bernsteinsäure reste pro Disaccharid-Einheit.

Für die günstige gerinnungshemmende Wirkung der erfindungsgemäßen ver wendeten Heparinfraktion der Erfindung gibt es keine Erklärung. Die üblichen Testverfahren - Messung der antikoagulierenden und der Anti-Xa-Akti vität - versagen. Die Eigenschaft des Arnzeistoffs, trotzdem eine gerinnungshemmende Wirkung zu zeigen, steht im Gegensatz zu allem bisher Bekannten. Die antikoagulierende Aktivität einer erfindungsgemäß verwendten Heparinfraktion beträgt 0,2 I. U./mg und die anti-Xa-Aktivität 2 U/mg.

Succinyl-Derivate von N-desulfatiertem, Heparin sind in der DE-PS 12 01 322 beschrieben. In dieser Patenschrift ist bei den beschrieben Derivaten nur von einer antilipämischen sowie einer niedrigen antikoagulierenden Aktivität die Rede.

Neben der hemmenden Wirkung auf die Bildung von Thromben zeigen die erfindungsgemäß verwendeten Derivate eine eine bestimmte fibrinolytische Aktivität, wie nachstehend anhand von Tierver suchen (Auswertung von F. D. P., Fibrin-Abbauprodukte) und Zeit der Lysis der Globuline nachgewiesen wird. Auch bei Versuchen an Menschen wurde die Zeit der Lysis der Globuline (Fibrino lyse) bestimmt.

Die erfindungsgemäß verwendeten N-desulfatierten und succi nylierten Glucosaminoglucan-Derivate werden nach dem in der vorstehend genannten Italienischen Patentanmeldung 22 851 A/80 beschriebenen Verfahren durch Hydrolyse von Heparin bei einer Temperatur von vorzugsweise 70 bis 100°C während eines Zeitraums von mindestens 3 Stunden mittels einer starken Säure einer Normalität von mindestens 0,1 und vorzugsweise mindestens 0,5 N und anschließende Umsetzung des Hydrolyse produkte mit Bernsteinsäure bzw. Bernsteinsäureanhydrid bei einem pH-Wert von oberhalb 7 hergestellt. Bernsteinsäure anhydrid und hydrolysiertes Heparin werden in einem Gewichts verhältnis von 1 : 1 bis 5 : 1 eingesetzt. Die erhaltenen succi nylierten Glucosaminoglucan-Derivate werden nachstehend als Heparinfraktion bezeichnet. Erfindungsgemäß werden Heparin fraktionen verwendet, die weniger als 10% N-Sulfatgruppen des Heparin-Ausgangsmaterials und mehr als 0,6 Bernstein säurereste, vorzugsweise etwa 1,2 Bernsteinsäurereste pro Disaccharid-Einheit enthalten.

Nachstehend wird die Herstellung einer erfindungsgemäß ver wendbaren Heparinfraktion erläutert.

In einen 3 Liter fassenden Dreihalskolben, der mit einem Küh ler, Rührwerk sowie einem Stickstoffeinleitungsrohr versehen ist, werden 2 Liter destilliertes Wasser und 200 g Hepa rin-Natriumsalz vorgelegt. Das Gemisch wird bei Raumtempera tur gerührt, bis alles in Lösung gegangen ist. Sodann werden 400 ml 2 n Salzsäure zugegeben. Die klare Lösung wird mittels Stickstoff entlüftet. Sodann wird die Lösung unter Stickstoff als Schutzgas auf einem siedenden Wasserbad 6 Stunden er hitzt. Hierauf wird die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt und unter Eiskühlung mit kalter gesättigter Natronlauge auf eine pH-Wert von 8,5 eingestellt. Hierauf wird die Lösung im Temperaturbereich von 5 bis 10°C und bei einem pH-Wert von 8, der durch Zugabe von Natronlauge eingestellt wird, mit 400 g Bernsteinsäureanhydrid in Anteilen versetzt. Nach Zugabe des letzten Anteils beträgt der pH-Wert etwa 7,4 bis 7,5. Die kalte Lösung wird 30 Minuten gerührt und danach mit dem dreifachen Volumen 95prozentigem Äthanol versetzt. Die erhaltene, anfänglich ölige Fällung verfestigt sich nach dem Stehen und wird auf einer Nutsche abfiltriert und an der Luft getrocknet. Das Präparat wird erneut in 3 Liter destilliertem Wasser gelöst und in einem Dialysator mit einer nominalen Ausschlußgrenze von 600 Daltons gegen destil liertes Wasser dialysiert, um das Natriumsalz der Bernstein säure abzutrennen. Sodann wird das Retentat gefriergetrocknet. Es werden 200 g Produkt in Form von Nadeln erhalten.

¹³C NMR-Spektroskopie der Heparinfraktion
Die Messung erfolgt bei 25,2 mHz in einem Gemisch aus Dioxan und D₂O. Als interner Standard dient Dioxan (ppm 67,4). Die Werte sind in ppm angegeben. Die Bestimmung erfolgt nach der Methode von G. Gatti, B. Casu, G. K. Hamer und A. S. Perlin, Macromolecules, Bd. 12 (1979), 1001.

Das Spektrum gibt im Vergleich zum Spektrum des Heparin- Natriumsalzes folgende Signale und Unterschiede:

1) Ein neues Signal tritt bei 181,8 auf, das der COO^--Gruppe des Bernsteinsäurerestes zugeordnet werden kann;
2) ein neues Signal tritt bei 177 auf, das der -CONH-Gruppe des Bernsteinsäurerestes zugeordnet werden kann;
3) ein Signal bei 176,7 kann der COOH-Gruppe des Iduronsäure restes zugeordnet werden. Das gleiche Signal tritt beim Heparin auf;
4) ein kleines Signal bei 102 kann dem C₁ geringer Mengen des Restes der Glucuronsäure zugeordnet werden. Das Signal ist das gleiche wie bei Heparin;
5) ein Signal bei 100 kann dem C₁ des Iduronsäurerestes zu geordnet werden. Das Signal ist das gleiche wie bei Hepa rin;
6) ein neues Signal bei 95,3 kann dem C₁ der Einheit von N-Succinylglucosamin zugeordnet werden.

Ferner verschwindet das Signal bei 97,7. Dieses Signal kann dem C₁ des Restes von Glucosamin-N-sulfat zugeordnet werden. Dieses Signal ist charakteristisch für das Heparin-Ausgangs material;

7) eine neue Reihe von Signalen zwischen 72 und 76 tritt auf, die dem C2 und C4 des N-Succinylglucosamin-Restes und dem C2 des Iduronsäurerestes zugeordnet werden können. Diese Signale sind im Spektrum des Heparin als einziges intensives Signal bei 76 zu finden;
8) ein Paar von Signalen bei 70 bis 71 kann dem C3 und C5 des N-Succinylglucosamin-Restes und dem C3 und C5 des Iduronsäurerestes zugeordnet werden. Im Heparin treten die gleichen Signale auf;
9) ein Signal bei 67 kann dem C6 des N-Succinylglucosamin- Restes zugeordnet werden. Dieses Signal entspricht dem Signal des C6 des N-Sulfinylrestes von Heparin;
10) ein neues Signal bei 54,5 kann dem C2 des N-Succinyl glucosamin-Restes zugeordnet werden. Gleichzeitig ver schwindet das Signal bei 58,8, das dem C2 des N-Sulfonyl glucosamin-Restes im Heparin-Spektrum entspricht;
11) zwei neue Signale bei 33,0 und 33,5 können der -CH₂COO^- und -CH₂-CO-NH-Gruppe des Bernsteinsäurerestes im N- Succinylheparin zugeordnet werden.

1. Bestimmung der antithrombotischen oder gerinnungshemmenden Wirkung 1.1 Aktivitätsbestimmung

Als Modell wird das übliche Modell von T. Umetzo et al., Thrombosis and Haemostasis, Stuttgart, Bd. 39 (1978), 74, verwendet. Bei diesem Modell wird an der Ratte ein Shunt zwischen der rechten Carotis und der linken Jugularvene mit tels eines Siliconschlauches operativ angelegt. Im Inneren des Schlauches wird ein aufgewickelter chirugischer Seiden faden (Ethicon) angeordnet. Durch diesen Seidenfaden wird im Blutstrom des Shunts ein Thrombus erzeugt. Bei Fehlen einer antithrombotisch wirksamen Substanz erreicht dieser Thrombus ein maximales Gewicht. Das Gewicht des Thrombus ist mehr oder weniger verringert oder seine Bildung wird unterdrückt in Gegenwart einer antithrombotisch wirkenden Verbindung in Abhängigkeit von der jeweiligen Aktivität und Dosis.

Als Standard wird Heparin (Interner Standard 155 I. U./mg Anti koagulanz und 168 U/mg Anti-Xa-Aktivität, kolorimetrisch be stimmt mittels des Hepachrom X Stago-Diagnostik Stago-Test) verwendet.

Die erfindungsgemäß verwendete Verbindung wird nachstehend abgekürzt mit GGM bezeichnet. Es handelt sich um das Natrium salz eines partiell N-desulfatierten Succinylglucosamioglucans mit einer antikoagulierenden Aktivität von 0,2 I. U./mg und einer anti-Xa-Aktivität von 2 U/mg. Die Herstellung des Prä parats erfolgt auf die vorstehend beschriebene Weise aus dem gleichen Standard-Heparin.

Für die Versuche wurden männliche Albino-Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von etwa 350 g verwendet. Die Ratten wurden mit Urethan (1,25 g/kg i. p.) betäubt. Für den Shunt wird ein Polyäthylenschlauch mit einem Innendurchmesser von 2,5 mm und ein silanisierter Silikonschlauch verwendet. Als Fremdmaterial im extrakorporalen Kreislauf werden 6 mg aufgewickelter chirurgischer Seidenfaden verwendet.

Das zu untersuchende Präparat bzw. das Standard-Präparat wurde durch den Shunt unmittelbar vor dem Beginn des extrakor poralen Kreislaufs in einer Menge von 1 mg/kg Körpergewicht in physiologischer Kochsalzlösung injiziert. Die Dauer des extrakorporalen Kreislaufs betrug 15 Minuten.

Der Thrombus wurde unmittelbar nach Entnahme des Seidenfadens aus dem Shunt gewonnen, das richtige Gewicht des Thrombus wurde durch Subtraktion des Gewichts des Seidenfadens vom Gesamt gewicht bestimmt.

Eine Gruppe der Versuchstiere wurde lediglich mit physiolo gischer Kochsalzlösung behandelt. Es wurde der Durchschnitts wert des Thrombusgewichts in Abwesenheit der antithrombotisch wirkenden Verbindungen bestimmt. Bei jedem Tier wurde die Gerinnungszeit bestimmt. Diese ist ein Maß für die Wirkung der antithrombisch wirkenden Verbindung auf das Gerinnungs system.

Die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle I

Gerinnungszeit: Die Zeit zur Gerinnung (Koagulation) nach Verabfolgung der physiologischen Kochsalzlösung beträgt im Durchschnitt 144,14±6,21 Sek. Nach Behandlung mit Heparin verändert sie sich dosisabhängig und erreicht einen Wert von 521,40±41,06 Sek. bei einer Dosis von 1 mg/kg. Nach Verabfol gung von GGM in einer Dosis bis zu 200 mg/kg bleibt die Ge rinnungszeit beim Ausgangswert und erreicht erst bei einer Do sis von 400 mg/kg einen Wert von 228,50±17,55 Sek.

Die vorstehend wiedergegebenen Werte zeigen folgendes: Die antithrombotische Wirkung von GGM steht nicht im Zusammen hang mit der antikoagulierenden Aktivität, ausgedrückt durch die Aktivierung von Antithrombin. Bei der geringen anti-Xa- Aktivität kann die antithrombotische Wirkung von GGM einer direkten Hemmung der Aktivität des Xa-Faktors nicht zuge schrieben werden.

1.2 Dauer der Aktivität

Unter den gleichen Bedingungen wie im Beispiel 1.1 werden Ratten in Gruppen von jeweils sechs Tieren Heparin in einer Dosis von 77,5 I. U/kg und GGM in einer Dosis von 115 mg/kg in Dosen gegeben, die gleich aktiv sind im Hinblick auf anti thrombotische Aktivität zu Beginn des Versuchs und sodann in unregelmäßigen Zeitabständen vor Beginn des extrakorpo ralen Kreislaufs. Dies ist in Tabelle II angegeben. In der gleichen Tabelle ist die prozentuale Hemmung nach verschiedenen Zeiten zusammengefaßt.

Tabelle II

2. Fibrinolytische Aktivität 2.1. bei Ratten. 2.1.1. F. D. P. bei Ratten in vivo, nach intravenöser Gabe

Männliche Wistar-Ratten mit einem durchschnittlichen Körper gewicht von etwa 220 g wurden für die Versuche verwendet. Die zu untersuchenden Präparate wurden den wachen Tieren in travenös in Zeitabständen von 30 Minuten, 60 Minuten, 120 Mi nuten und 240 Minuten vor dem Opfern der Tiere gegeben. Als Träger wurde destilliertes Wasser in einer Menge von 1 ml/kg verwendet. Die Fibrin-Abbauprodukte wurden im Plasma mit einem Analysensatz von Boehringer, Mannheim, Staphylococcen- Verklumpungstest, bestimmt. Der Grundwert wurde nach Verab folgung der physiologischen Kochsalzlösung in einer Menge von 1 ml/kg bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle III zusam mengefaßt.

Tabelle III

2.1.2. Zeitraum der Lysis der Globuline

Die Globulinfraktion des Plasmas enthält den Aktivator für Plasminogen, das Plasminogen und Fibrinogen. Die die Euglo buline enthaltende Fraktion wird mittels Thrombin koaguliert, und der Zeitraum zur anschließenden Lysis des Koagulums wird in Gegenwart oder Abwesenheit von GGM bestimmt. Drei verschiedene Dosen im Plasma von Wistar-Ratten wurden mit dem Analysensatz Euglobulin Lysis Reagents-Dade-Diagostics- Aguada, Puerto Rico, bestimmt. Die untersuchten Dosen waren 25,0 und 100 µg GGM mit den gleichen Eigenschaften wie das vorstehend verwendete Produkt. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengefaßt.

Tabelle IV

3. Versuche an Menschen 3.1 Zeitraum der Lysis der Globuline

Es wurde Plasma von gesunden Freiwilligen verwendet. Der Versuch wurde an Plasma mit dem Euglobuline Lysis Reagenz- Analysensatz von Dade Diagnostic-Aguada, Puerto Rico, durch geführt. Dosen von 25, 50 und 100 µg GGM mit den gleichen Eigenschaften wie das Produkt in den vorhergehenden Beispielen wurden untersucht. Die Ergebnisse sind in Tabelle V zu sammengefaßt.

Tabelle V

Die Arzneimittel der Erfindung können in üblichen Darrei chungsformen zur oralen, intramuskulären oder intravenösen Gabe, sowie beispielsweise als Kompressen, Tabletten oder Kapseln, konfektioniert sein.

Claims

1. Verwendung einer mit Bernsteinsäure umgesetzten N-desulfatierten Heparinfraktion, die weniger als 10% der N-Sulfatgruppen des Heparin-Ausgangsmaterials und mehr als 0,6 Bernsteinsäurereste pro Disaccharid- Einheit enthält, zur Hemmung der Bildung von Thromben.

2. Verwendung einer Fraktion mit 1,2 Bernsteinsäureresten pro Disaccharid- Einheit nach Anspruch 1.