Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betrifft die Konstruktion und die
Verwendung gentechnologisch erzeugter, das aspC-Gen
enthaltender Plasmide. Diese Plasmide werden unter Einsatz von
Restriktions-Endonucleasen so hergestellt, daß sie das für
die genannten Aminotransferase-Enzyme, die bei der Synthese
verwendet werden, codierende Gen enthalten. Diese Plasmide
fördern die Synthese von Aminotransferase in
Bakterienzellen. Diese Synthese ermöglicht höhere Ausbeuten der
Aminotransferase-Enzyme und die Eliminierung der
Aminotransferase-Reaktion als geschwindigkeitsbestimmenden
Schritt in der Aminosäure-Biosynthese.
Beschreibung des Standes der Technik
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Die Transaminierung von Aminosäure-Vorstufen-Molekülen durch
Aminotransferase-Enzyme wird von Umbarger besprochen {Ann.
Rev. Biochemistry 47: 533-606 (1978)}. Umbarger gibt auf
Seite 534 an, daß er im Prinzip über die gramnegativen
Bakterien Escherichia coli und Salmonella typhimurium
berichtet, daß jedoch deren Muster der Aminosäure-Synthese und
Regulierung nicht immer das universelle Muster ist.
Aminotransferase und Transaminase werden in diesem Dokument als
äquivalente Begriffe benutzt. Die gegenwärtige
Aminotransferase-Nomenklatur, die die Transaminasen A, B und C
definiert, und die Entwicklung dieser Nomenklatur wird von
Umbarger auf den Seiten 550-552 und 581-582 diskutiert. Zur
Vermeidung einer potentiellen Verwirrung der Bezeichnungen
Transaminase A, B und C verwenden wir die genetische
Terminologie der Gen-Produkte aspC, tyrB und ilvE, wie sie von
Umbarger Seite 582 definiert ist. Das aspC-Gen-Produkt
katalysiert die Transaminierung der Aminosäure-Vorstufen zur
Erzeugung von Aspartat, Glutamat, Phenylalanin und Tyrosin.
Das tyrB-Gen-Produkt katalysiert die Transaminierung der
Aminosäure-Vorstufen zur Erzeugung von Phenylalanin,
Tyrosin, Glutamat, Aspartat und Leucin. Das ilvE-Gen-Produkt
katalysiert die Transaminierung der Aminosäure-Vorstufen zur
Erzeugung von Isoleucin, Valin, Leucin, Phenylalanin,
Glutamat und Alanin.
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Der Ort der aspC-, tyrB- und ilvE-Gene auf der genetischen
Karte von E. coli Stamm K12 ist offenbart und wird
diskutiert von Bachmann et al. (Microbiological Reviews 44: 1-56,
März 1980). Das in der E. coli K12-Karten-Position 20
Minuten lokalisierte aspC-Gen codiert für ein Enzym, das hier
Aspartat-Aminotransferase genannt wird und dem die Enzyme
Commission Number E.C. 2.6.1.1 gegeben wurde (Bachmann et
al., Seite 4).
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Das in der E. coli K12-Karten-Position 91 Minuten
lokalisierte tyrB-Gen codiert für ein Enzym, das Tyrosin- oder
aromatische Aminotransferase genannt wird und dem die Enzyme
Commission Number E.C. 2.6.1.5 gegeben wurde (Bachmann et
al., Seite 21). Das in der E. coli K12-Karten-Position
84 Minuten lokalisierte ilvE-Gen codiert für ein Enzym, das
hier kettenverzweigte-Aminosäure-Aminotransferase genannt
wird und dem die Enzyme Commission Number E.C. 2.6.1.42
gegeben wurde (Bachmann et al., Seite 10).
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Auf diese beiden Veröffentlichungen von Umbarger und von
Bachmann et al. wird hier ausdrücklich Bezug genommen.
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Von Gelfand et al. (J. Bacteriology 130: 429-440, April
1977) ist offenbart, daß Produkte der
Aminosäure-Transaminierung durch aspC- und tyrB-Gene im wesentlichen für die
gesamte Aminotransferase-Aktivität verantwortlich sind, die
für die de novo-Biosynthese von Tyrosin, Phenylalanin und
Aspartat in E. coli K12 erforderlich ist. Die Anwesenheit
des ilvE-Gen-Produkts allein vermag jedoch ein Phenylalanin-
Erfordernis umzukehren, was anzeigt, daß es die Fähigkeit
hat, eine Vorstufe des Phenylalanins zu transaminieren.
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Der transduzierende Phage lambda ist dazu benutzt worden,
DNA-Fragmente für E. coli in die aspC-Region zu tragen
{Christensen und Pedersen, Mol. Gen Genet. 181: 548-551
(1981)}. Die aspC-Region in dem Bakteriophagen lambda wurde
als eine Quelle des Gens für das ribosomale Protein S1
verwendet. Deren S1-Gen wurde zu Forschungszwecken auf Plasmide
kloniert. Das aspC-Gen wurde jedoch nicht in ein Plasmid zur
Erzeugung von Transaminasen kloniert. Die aspC-Region wurde
als Marker benutzt, um die Isolierung eines transduzierenden
Phagen in einem Tyrosin-Auxotroph zu erleichtern, dem die
aspC- und tyrB-Gene fehlen. Dieser transduzierende
Bakteriophage war nicht geeignet, hohe Gehalte an Aminotransferase
zu produzieren.
Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfindung des Anmelders beschreibt die Klonierung des
aspC-Gens aus E. coli und die Verwendung der resultierenden
Plasmide in einem Verfahren zur Erhöhung der
Transaminierungs-Geschwindigkeit eines Substrats und dadurch zur
Herstellung einer Aminosäure.
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Die Plasmide des Anmelders enthalten eine oder mehrere
Kopien des aspC-Gens. Die Erfindung des Anmelders beschreibt
die Verwendung dieses Aminotransferase-Gens bei der Synthese
erhöhter Enzym-Konzentrationen der Aminotransferase in
Bakterienzellen. Die Erfindung des Anmelders beschreibt ein
Verfahren zur Erzeugung erhöhter Mengen von
Aminotransferasen. Die Erfindung des Anmelders beschreibt ein Verfahren
zur verbesserten Aminosäure-Synthese, bei der die durch
Aminotransferase katalysierte Reaktion
geschwindigkeitsbestimmend ist. Die Erfindung des Anmelders beschreibt ein
Verfahren zur gesteigerten Synthese von L-Phenylalanin,
worin die durch Aminotransferase katalysierte
Transaminierung der Phenylbrenztraubensäure zu Phenylalanin
geschwindigkeitsbestimmend ist.
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Das Aminotransferase-Gen aspC codiert für die Synthese der
Aminotransferase, die die Transaminierung der
Carbonyl-Vorstufen von Aminosäuren katalysiert. Das aspC-Gen codiert für
die Transaminase A (Aspartat-Aminotransferase) (EC 2.6.1.1)
und ist während der Synthese von Aspartat, Glutamat,
Phenylalanin und Tyrosin katalytisch aktiv. Wenn die
Transaminierungs-Reaktion in der bakteriellen Aminosäure-Synthese
geschwindigkeitsbestimmend wird, ermöglicht die Anwesenheit
dieses Plasmid-getragenen Aminotransferase-Gens die Synthese
zusätzlicher Aminotransferase. Ausreichende
Aminotransferase-Synthese, um die Geschwindigkeitsbegrenzung zu
überwinden, führt zu einer erhöhten Geschwindigkeit der
Aminosäure-Biosynthese.
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Diese Plasmide werden verwendet, um die Gesamtmenge der in
einer Zelle anwesenden Aminotransferase zu erhöhen, und sie
können wie folgt verwendet werden. Die Transaminierungs-
Reaktion kann innerhalb der Zelle oder in einem Zellextrakt
verwendet werden, oder der Extrakt kann zur weiteren
Reinigung der spezifischen Aminotransferase benutzt und dann im
gereinigten Zustand verwendet werden.
Ziele der Erfindung
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Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein
extrachromosomales Element zu konstruieren, das ein das aspC-
Aminotransferase-Gen enthaltendes Plasmid ist.
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Noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist ein
Verfahren zur Erhöhung der Transaminierungs-Geschwindigkeit
eines empfänglichen Substrats durch das aspC-Gen-Produkt,
umfassend
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a) das Einfügen eines das aspC-Gen enthaltenden Plasmids
in einen Mikroorganismus,
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b) das Exprimieren des aspC-Gens in dem Mikroorganismus,
was zur Synthese einer aktiven Aminotransferase führt,
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c) das Katalysieren der Transaminierung des empfänglichen
Substrats durch die Aminotransferase.
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Ein anderes Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur
Erhöhung der Transaminierungs-Geschwindigkeit aufnahmefähiger
Aminosäure-Vorstufen-Moleküle, die durch das Einfügen eines
das aspC-Gen enthaltenden Plasmids in einen Mikroorganismus
bewerkstelligt wird, und zur nachfolgenden Synthese einer
physiologisch wirksamen Konzentration an Aminotransferase,
was zu einer höheren Geschwindigkeit der Aminosäure-Synthese
führt.
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Noch ein anderes Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur
Erhöhung der Transaminierung von Phenylbrenztraubensäure
durch die Aminotransferase, für die das in Plasmiden
enthaltene und in einem Mikroorganismus exprimierte aspC-Gen
codiert.
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Ein weiteres Ziel der Erfindung ist ein Verfahren zur
Steigerung der Synthese einer Aminosäure in einer Zelle,
worin die Aminotransferase das geschwindigkeitsbestimmende
Enzym ist, was durch Einführen eines das
aspC-Aminotransferase-Gen enthaltenden Plasmids und die Expression des Gens
bewerkstelligt wird.
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Noch ein anderes Ziel der Erfindung ist die gesteigerte
Synthese von Phenylalanin aus Phenylbrenztraubensäure durch
Einführen eines das aspC-Aminotransferase-Gen enthaltenden
Plasmids in einen Mikroorganismus und die Expression des
Gens in demselben, bei dem die Wildtyp-Transaminierung der
Phenylbrenztraubensäure ein geschwindigkeitsbestimmender
Schritt bei der Synthese des Phenylalanins ist.
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Noch ein Ziel der Erfindung ist die gesteigerte Synthese von
Tyrosin aus p-Hydroxyphenylpyruvat durch Einführen eines das
aspC-Aminotransferase-Gen enthaltenden Plasmids in einen
Mikroorganismus und die Expression des Gens in demselben,
bei dem die Wildtyp-Transaminierung der
p-Hydroxyphenylbrenztraubensäure ein geschwindigkeitsbestimmender Schritt
bei der Synthese des Tyrosins ist.
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Noch ein weiteres Ziel der Erfindung ist das Einführen eines
das aspC-Aminotransferase-Gen enthaltenden Plasmids in einen
enterischen Mikroorganismus und die Expression des Gens in
demselben, bei dem Escherichia coli ein derartiger
Mikroorganismus ist.
Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 beschreibt den biosynthetischen Weg der Synthese der
aromatischen Aminosäuren Tyrosin, Phenylalanin und
Tryptophan.
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Fig. 2 zeigt ein Gel-Elektropherogramm von nativem Protein,
das die Anwesenheit oder Abwesenheit der durch die Gene
aspC, tyrB und ilvE codierten Aminotransferasen in
verschiedenen Bakterienstämmen demonstriert.
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Fig. 3 veranschaulicht ein E. coli-Ablaufschema, das als
Zwischenprodukte auftretende Stämme und die Verfahren
darstellt, die zu dem hinterlegten Stamm HW159 führen.
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Fig. 4 veranschaulicht die Restriktions-Karte des das
aspC-Gen tragenden Plasmids.
Ausführliche Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen
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Die Aminotransferasen oder Transaminasen sind eine Familie
von Enzymen, die kovalent eine Amino-Gruppe von einem Donor-
Molekül wie Aspartat oder Glutamat auf eine
Acceptor-α-Ketosäure-Vorstufe einer Aminosäure wie Oxalessigsäure
übertragen. Die Reaktion ist frei reversibel. Infolgedessen
können die Aminotransferasen sowohl bei der Synthese als
auch beim Abbau von Aminosäuren genutzt werden.
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Die Aminosäure-Biosynthese erfordert oft die Transaminierung
als abschließenden Schritt in der Biosynthese. Ein Beispiel
eines solchen Verfahrens ist die Transaminierung der
Phenylbrenztraubensäure zur Erzeugung von Phenylalanin mit
gleichzeitiger Überführung von Glutamat in α-Ketoglutarat. Dies
ist als Schritt 10 in Fig. 1 dargestellt. Die Biosynthese
der aromatischen Aminosäuren Phenylalanin und Tyrosin
erfordert für beide die Wirkung einer Aminotransferase als
abschließenden Schritt. Phenylpyruvat wird in Phenylalanin
durch eine Aminotransferase umgewandelt, die eine Amino-
Gruppe aus Glutamat (Fig. 1, Schritt 10) überträgt. In
ähnlicher Weise wird eine Amino-Gruppe aus Glutamat auf
4-Hydroxyphenylpyruvat übertragen, um Tyrosin zu erzeugen
(Fig. 1, Schritt 12). Jede Aminotransferase hat bevorzugte
Substrate für die Transaminierungs-Reaktion. Eine Rest-
Aktivität ist jedoch in bezug auf andere Substrate
vorhanden, die erlaubt, daß jede Aminotransferase an der
Biosynthese mehr als einer Aminosäure beteiligt ist. Die durch
das aspC-Gen codierte E. coli-Transaminase ist auf Aspartat,
Glutamat, Phenylalanin und Tyrosin aktiv.
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Man hat erkannt, daß für die Synthese von Tyrosin und
Phenylalanin in anderen Mikroorganismen andere Wege
existieren. Ein solcher Weg wird in Cyanobakterien und in P.
aeruginosa gefunden kund beinhaltet die direkte Umwandlung von
Prephenat in Pretyrosin. Pretyrosin ist dann ein Substrat
für eine direkte Umwandlung in Tyrosin oder in Phenylalanin.
Man hat erkannt, daß analog klonierte Transaminase-Gene für
die geeignete Transaminase in ähnlicher Weise bei der
Verstärkung der Pretyrosin synthetisierenden Reaktion brauchbar
sind, wenn überschüssige Prephenat-Gehalte vorhanden sind.
Diese Transaminase würde zu einer Erhöhung der Synthese-
Geschwindigkeit von Tyrosin und Phenylalanin führen.
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Die enzymatischen Schritte in der Synthese der aromatischen
Aminosäuren sind in der Fig. 1, Schritte 1 bis 20,
dargestellt. Normalerweise wird jeder enzymatische Schritt
reguliert durch Kontrolle der Synthese des Enzyms und/oder durch
allosterische Regulierung der Geschwindigkeit der
enzymatischen Katalyse. Organismen vom Wildtyp produzieren aufgrund
dieser Steuerungen nicht irgendeine Aminosäure im Überschuß.
Mutanten-Stämme, bei denen die steuernden Einflüsse auf die
Synthese einer speziellen Aminosäure inaktiviert oder
umgangen werden, können isoliert werden, und im allgemeinen
neigen diese Stämme dazu, diese spezielle Aminosäure im
Übermaß zu produzieren. Im Falle von L-phe ist die
Regulierung notwendigerweise komplex, da es einen Teil seines
Syntheseweges mit den anderen aromatischen Aminosäuren
L-Tyrosin (L-tyr) und L-Tryptophan (L-trp) teilt (siehe Fig. 1
der beigefügten Zeichnungen).
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In E. coli wird, wie in vielen anderen Mikroorganismen, der
erste Schritt auf diesem Weg durch die drei DAHP-Synthetase-
Isozyme katalysiert, von denen jedes für eines der drei
Endprodukte empfindlich ist. Außerdem sind die ersten Schritte
auf dem Weg hinter der Verzweigungsstelle bei Chorismat auch
empfindlich gegen eine Rückkopplungs-Hemmung. Anthranilat-
Synthetase wird durch L-trp gehemmt, und die zwei
Chorismatmutase-Isozyme werden durch L-phe und L-tyr gehemmt. Die
Synthese einer Anzahl der betroffenen Enzyme ist ebenfalls
Gegenstand der Regulierung. Der Tyrosin-Repressor, das
Produkt des tyrR-Gens, steuert die Expression der DAHP-
Synthetase (L-tyr) und der Chorismat-Mutase (L-tyr). Die
Gene für diese letzten zwei Enzyme zusammen bilden das
Tyrosin-Operon. Der Tryptophan-Repressor, das Produkt des
trpR-Gens, steuert die Expression sämtlicher Enzyme des
trp-Operons, die Chorismat in L-trp umwandeln. Dieses
Regulator-Molekül steuert auch die Expression von DAHP-
Synthetase (L-trp). Außerdem werden die Expression des
PheA-Gens, das für die Chorismat-Mutase (L-phe) codiert, und
die Expression des trp-Operons für den L-phe-Gehalt
empfindlich gemacht. Das trp-Operon wird mittels eines
Attenuator/Leader-Peptid-Steuerungssystems für den L-trp-Gehalt
empfindlich gemacht.
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Mutanten-Stämme, die Aminosäuren im Übermaß produzieren,
werden oft wegen ihrer Resistenz gegen geeignete
Aminosäure-Analoge ausgewählt. Im Fall der L-phe-Produktion kann
man Stämme, die für die Expression von DAHP (L-tyr) und DAHP
(L-trp) dereprimiert sind, durch die Auswahl von
3-Fluortyrosin- und 5-Methyltryptophan-resistenten Mutanten
isolieren, die im allgemeinen inaktive tyrR- und MprR-Repressoren
sind. Mutanten, in denen die Chorismat-Mutase (L-phe) gegen
L-phe resistent ist, können durch Auswahl auf
2-Thienylalanin-Resistenz isoliert werden. Eine DAHP-Synthetase
(L-phe), die gegen eine Rückkopplungs-Hemmung resistent
ist, kann dadurch isoliert werden, daß man zuerst einen
Mutanten-Stamm konstruiert, dem die anderen zwei DAHP-
Synthetase-Isozyme fehlen. In einem solchen Stamm ist die
Synthese von L-tyr und L-trp anfällig gegen die Menge L-phe
in dem Medium. Mutanten, die fähig sind, in einem Medium zu
wachsen, das L-phe enthält, dem jedoch L-tyr oder L-trp
fehlen, enthalten gewöhnlich Rückkopplungs-resistente Formen
der DAHP-Synthetase (L-phe).
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Nun ergibt eine Kombination dieser Wege Stämme, die L-phe im
Übermaß produzieren. Da der synthetische Weg zu einem großen
Teil gemeinsam mit dem für L-tyr und L-trp verläuft, muß man
darauf achten, eine Anreicherung an L-tyr und L-trp zu
verhindern, wenn man an der Optimierung der L-phe-Synthese
interessiert ist. Ein einfaches Mittel besteht darin, eine
tyrA-Mutation in einen L-phe im Übermaß produzierenden Stamm
einzubauen, um eine L-tyr-Anreicherung zu verhindern und die
unerwünschte Abzweigung von Vorstufen zu L-phe zu vermeiden.
In ähnlicher Weise würde eine Zerstörung des gesamten trp-
Operons eine Anreicherung von L-trp verhindern. Solche
Mutanten müßten naturgemäß in Medien kultiviert werden, die
diese zwei Aminosäuren enthalten, um ein Wachstum zu
ermöglichen.
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Die oben umrissene Kombination der Ansätze führt zu einem
für die Synthese von L-phe deregulierten Stamm, der die
Aminosäure in signifikanten Mengen anreichert. Nun sind die
geschwindigkeitsbestimmenden Schritte in einem
biosynthetischen Weg im allgemeinen diejenigen, bei denen eine
Steuerung ausgeübt wird. In einem deregulierten Stamm ist es
wahrscheinlich, daß ein neuer Schritt
geschwindigkeitsbestimmend wird. Somit ist es zu einer Erhöhung der
Produktion von L-phe noch weiterhin nötig, den neuen
geschwindigkeitsbestimmenden Schritt zu identifizieren und die
Aktivität des relevanten Enzyms zu erhöhen. Dies kann auf eine von
drei Weisen geschehen:
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(a) Durch Isolieren von Mutanten-Stämmen, in denen das
relevante Enzym in größeren Mengen vorliegt;
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(b) durch Isolieren von Mutanten-Stämmen, in denen das
relevante Enzym eine höhere spezifische Aktivität hat;
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(c) durch Erreichen des gleichen Ziels wie in (a), jedoch
durch Klonieren des Gens für das interessierende Enzym
auf ein geeignetes Mehrfach-Kopie-Plasmid und Einführen
desselben in den L-phe im Übermaß produzierenden Stamm.
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Wenn ein solches Enzym normalerweise nicht einer Regulierung
unterliegt, kann die Isolierung von Mutanten der ersten zwei
Klassen schwierig sein. Der beste Weg, um eine Erhöhung der
Aktivität zu erzielen, besteht darin, das Gen für das
relevante Enzym zu klonieren.
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Dies wird dadurch erreicht, daß man DNA von einem geeigneten
Donor-Stamm, der das Gen für das Enzym trägt, das man zu
klonieren wünscht, mit einer geeignet präparierten DNA von
einem geeigneten Vektor kloniert. Man kann dann einen
Mutanten-Stamm transformieren, dem die Aktivität des neuen
klonierten Gens fehlt. Das Problem besteht darin, das Gen
experimentell zu isolieren. Wenn das Fehlen dieser Aktivität
diesem empfangenden Stamm einen erkennbaren Phänotyp
verleiht, etwa Auxotrophie für eine bestimmte Aminosäure, kann
man am einfachsten auf Klone, die das interessierende Gen
tragen, aufgrund der Fähigkeit solcher Klone selektieren,
die Verletzung in dem empfangenden Stamm zu komplementieren.
Als Alternative könnte das Gen zuerst in ein Plasmid
niedriger Kopien-Zahl oder in einen geeigneten Bakteriophagen-
Vektor kloniert und anschließend in das gewünschte Mehrfach-
Kopie-Plasmid subkloniert werden. Alternativ kann ein Stamm,
der geeignete Prophagen in der Nähe des interessierenden
Gens trägt, konstruiert werden, und ein spezialisierter
transduzierender Phage, der das gewünschte Gen trägt, kann
dadurch isoliert werden, daß der lysogene Donor-Stamm
induziert wird und das resultierende Lysat zum Transduzieren des
Empfängers zu Prototrophie benutzt wird. Das interessierende
Gen kann dann von der DNA dieses spezialisierten Phagen,
etwa lambda, subkloniert werden.
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Sofern die Mutation des interessierenden Gens keinen leicht
identifizierbaren Phänotyp, etwa Auxotrophie, verleiht, kann
das Klonieren eines solchen Gens dadurch bewirkt werden, daß
in der Nähe liegende Gene kloniert werden, für die eine
Selektion existiert, und danach diese Klone auf die
Anwesenheit des interessierenden Gens in der Weise durchgemustert
werden, daß man sie nach dem Einführen der Klone in einen
Empfänger, dem das betreffende Enzym fehlt, auf das Produkt
des gewünschten Gens analysiert. Ein solcher Ansatz wird
durch die Anwendung von Methoden erleichtert, die die
Klonierung großer DNA-Fragmente ermöglichen, etwa solche
unter Beteiligung von Bakteriophagen oder Cosmiden. Falls
kein leicht auswählbarer Marker in der Nachbarschaft des
gewünschten Gens bekannt ist, kann es möglich sein, einen
Stamm zu isolieren, der die Einfügung eines leicht
auswählbaren Transposons in der Nähe des interessierenden Gens
trägt, etwa Tn 10, das Tetracyclin-Resistenz codiert. Große
DNA-Fragmente, die diesen Marker enthalten, können dann
kloniert werden, und die resultierenden Phagen oder Cosmide
können auf die Anwesenheit des interessierenden Gens
durchgemustert werden. Das Gen könnte dann in ein geeignetes
Plasmid hoher Kopien-Zahl subkloniert werden.
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Nachstehend aufgeführt sind die Stämme von E. coli, die in
den Beispielen verwendet wurden. Neben jeder
Stamm-Bezeichnung sind eine Zusammenfassung des Bakterien-Genotyps und
die Quelle angegeben. Der Zusammenhang zwischen den
intermediären Stämmen von E. coli, die zur Produktion des
Auxotrophs HW159 führen, der sowohl aspC&supmin; als auch tyrB&supmin; ist,
ist in Fig. 3 dargestellt. Die Verfahren, mit denen ein
Stamm in einen anderen überführt wurde, sind ebenfalls in
dem Ablaufschema der Fig. 3 zusammengefaßt.
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Der Stamm HW159, die aspC&supmin; und die tyrB&supmin; Mutante, wurden bei
The American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, MD 20852, U.S.A., hinterlegt und hat die
Hinterlegungs-Nr. ATCC 39260.
Tabelle 1 Liste der Stämme
Stamm Genotyp Quelle M. Edwards J. Burke B. Bachmann M. Casadaban diese Arbeit (hinterlegt) im Handel erhältlich
BEISPIELE
Konstruktion und Verwendung von Transaminase-Plasmiden
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Zum Zweck der Exemplifizierung wurde ein neuer Stamm von E.
coli konstruiert, der L-phe im Übermaß produziert. Dies
wurde mittels eines mehrstufigen Verfahrens erreicht, das
die systematische Deregulierung des L-phe-Syntheseweges
umfaßte. In solchen deregulierten Stämmen wurde gefunden,
daß der abschließende Schritt, nämlich die Transaminierung
von PPA zu L-phe, während der Fermentation
geschwindigkeitsbestimmend wird und das PPA sich anreichert, mit
nachteiliger Wirkung. Als weiteres Beispiel wurde deshalb das
Gen für die Tyrosin-(aromatische) Aminotransferase aus E.
coli auf ein Mehrfach-Kopie-Plasmid kloniert. Die Einführung
dieses Plasmids in den L-phe im Übermaß produzierenden Stamm
reduziert diese Anreicherung von PPA und erhöht die
Effizienz der Fermentation. Als zusätzliches Beispiel wurde das
Gen für die Aspartat-Aminotransferase aus E. coli auf ein
Mehrfach-Kopie-Plasmid kloniert. Dieses Enzym hat ebenfalls
L-phe-Aminotransferase-Aktivität, und der Einbau dieses
Plasmids in den L-phe im Übermaß produzierenden Stamm
verstärkt ebenfalls die Effizienz des Verfahrens.
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Stämme, die Plasmide mit tyrB oder aspC tragen, haben zum
Gebrauchsnutzwert beigetragen, in dem sie das relevante
Enzym in beträchtlichem Maße überproduzieren. Sie sind aus
diesem Grunde eine neue und wertvolle Quelle dieser Enzyme.
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Die tyrB- oder aspC-Gene sind ebenfalls auf einem Plasmid,
bei einem geeigneten genetischen Hintergrund, dadurch
wirksam, daß sie einen Selektions-Druck zur Erhaltung des
Plasmids schaffen. Dieser Selektions-Druck hat Vorteile
gegenüber konventionellen antibiotischen
Selektionsverfahren.
Beispiel 1
Herstellung von Plasmid-DNA
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Plasmid-DNA wurde wie folgt hergestellt {unter Adaption der
Verfahrensweise von J. Burke und D. Ish-Horowitz, Nucleic
Acids Research 9: 2989-2998 (1981)]. Der gewünschte
Bakterien-Stamm wurde bis zur Sättigung in 5 ml L-Brühe plus
geeigneten Antibiotika kultiviert. Die Kultur wurde in ein
15 ml-Corex-Röhrchen überführt, und die Zellen wurden durch
1 min Zentrifugieren bei 10 000 UpM abgeschieden. Der
Überstand wurde dekantiert, und das Pellet wurde in 500 ul der
frischen Lösung I (50 mM D-Glucose, 25 mM Tris pH 8,0, 10 mM
EDTA und 2 mg Lysozym m1-1) resuspendiert und dann bei
Raumtemperatur 5 min inkubiert. Die Zellen wurden durch Zusatz
von 1 ml der frischen Lösung II (die 0,2 M NaOH und 1 % SDS
enthielt) lysiert. Diese wurde sanft zugemischt und dann
5 min auf Eis inkubiert. 750 ul der kalten Lösung III (zu
29 ml Eisessig fügt man Wasser auf etwa 60 ml hinzu, stellt
den pH-Wert mit 10 M KOH auf 4,8 ein und füllt auf 100 ml
auf) wurden dann zugesetzt und gründlich untergemischt. Nach
5 min auf Eis wurde die ausgefällte chromosomale DNA durch
10 min Zentrifugieren bei 10 000 UpM pelletiert. Der
Überstand wurde in ein frisches 15 ml-Corex-Röhrchen dekantiert,
und 3,75 ml Ethanol wurden zugesetzt. Das Röhrchen wurde
15 min auf Eis gehalten. Die DNA wurde durch 10 min
Zentrifugieren bei 10 000 UpM pelletiert. Der Überstand wurde dann
abgegossen, und das Pellet wurde gründlich in 10 mM Tris
(pH 8,0), 1 mM EDTA resuspendiert, 20 ul 3 M Natriumacetat
(pH 7,0) wurden zugesetzt, und die DNA wurde in ein
Eppendorf-Mikro-Teströhrchen überführt. Die DNA wurde zweimal mit
200 ul ultrareinem Phenol extrahiert, das 0,1 %
8-Hydroxychinolin enthielt und zweimal gegen 1 in Tris pH 8,0 und
einmal gegen 100 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0,
prä-äquilibriert worden war. Das restliche Phenol wurde durch vier
Extraktionen mit 1 ml Diethylether entfernt. Die DNA wurde
dann durch den Zusatz von 500 ul Ethanol und 10 min
Inkubation in einem Trockeneis/Ethanol-Bad ausgefällt. Die DNA
wurde durch 10 min Zentrifugieren bei 10 000 UpM pelletiert.
Der Überstand wurde verworfen, und das Pellet wurde in
500 ul 70-proz. Ethanol in Wasser (Vol./Vol.) resuspendiert.
Die DNA wurde durch 10 min Zentrifugieren bei 10 000 UpM
erneut pelletiert, der Überstand wurde verworfen, und das
die DNA enthaltende Pellet wurde in einem Vakuum-Exsiccator
30 min getrocknet. Die DNA wurde schließlich erneut in 50 ul
10 mM Tris, 1 mM EDTA gelöst und bei -20ºC aufbewahrt.
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Dieses Präparat ergibt allgemein etwa 5 ug Plasmid-DNA, wenn
die verwendeten Stämme von MC1061 abgeleitet sind. Die
Präparate enthalten auch beträchtliche Mengen RNA, und so
schließen sämtliche in diesem Patent beschriebenen
Restriktions-Digests auch 100 ug m1-1 RNAse A ein, die 15 min bei
90º vorbehandelt worden war, um DNAsen zu zerstören. Die
Präparation kann auch in größerem Maßstab durchgeführt
werden, so daß mit 50 ml-Kulturen gearbeitet wird.
Beispiel 2 (Bezug)
a) Klonierung des tyrB-Gens
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Die Isolierung von tyrB und DNA tragenden Cosmid-Klonen aus
dem E. coli-Stamm HW22 (metE) erfolgte nach der
Verfahrensweise von Marmur PNAS 46: 453 (1960)}. Aliquote Anteile
dieser DNA wurden mit der Endonuclease Sau3A partiell
verdaut, wie folgt: Die DNA (80 ug) wurde in Sau3A-Puffer, der
50 mM NaCI, 6 mM Tris-HCl
{Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochlorid} pH 7,5, 5 mM MgCI&sub2;, 100 ug/ml Gelatine
enthielt, auf 400 ul aufgefüllt. Die DNA-Lösung wurde dann in
8 · 50 ul aliquote Anteile aufgeteilt. Dann wurde Sau3A (New
England Biolabs) seriell (schrittweise zweifach) mit
Sau3A-Verdünnungs-Puffer, der 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl
pH 7,4, 0,1 mM EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure,
Dinatrium-Salz), 1, mM Dithiothreit (DTT), 200 ug/ml
Rinderserumalbumin (BSA) und 50 Vol./Vol.-% Glycerin enthielt,
verdünnt. 5 ul jeder der sieben seriellen Verdünnungen
zusammen mit 5 ul des unverdünnten Enzyms wurden dann zu der
DNA-Lösung hinzugefügt. Die zugegebene Enzym-Menge lag im
Bereich von 2,5 bis 0,02 u. Die Digestion wurde 1 h
fortgesetzt, und nach dieser Zeit wurden die Röhrchen durch 5 min
Inkubation bei 65º C gestoppt. Die Röhrchen wurden dann auf
Eis gekühlt.
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Aliquote Anteile von jeweils 2 ul der Digestionen wurden
abgenommen und zusammen mit geeigneten Markern der
Elektrophorese auf einem 0,7 Gew./Vol.-% Agarose-Gel in TBE
{50 mMol Tris-HCl pH 8,3, 50 mM Borsäure und 1 mM EDTA}
unterworfen. Nach 15 min Anfärben mit Ethidiumbromid
(1 ug/ml) wurde das Gel unter Bestrahlung mit 254 nm
betrachtet, um die DNA sichtbar zu machen. Auf diese Weise
konnte die Probe, die die größte Menge Material im Größen-
Bereich von 45 kb liefert, abgeschätzt werden.
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Die DNA aus dieser Probe wurde dann mit DNA aus dem Cosmid-
Vektor pHC79 ligiert, die hergestellt worden war, wie
nachstehend beschrieben ist:
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Zwei aliquote Anteile von 25 ul der pHC 79-DNA wurden
vollständig verdaut, einer mit der Restriktions-Endonuclease
Hind III (E.C. 3.2.12.21), und die andere mit der
Restriktions-Endonuclease SalI (E.C. 3.1.23.37). Die Hind III-
Digestion wurde in 100 ul Hind III-Digestions-Puffer
durchgeführt, der 60 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2;, 7 mM Tris-HCl pH 7,4,
100 ug/ml Gelatine und 15 Einheiten Hind III (New England
Biolabs) enthielt. Die Inkubation erfolgte 1 h bei 37 ºC.
Das Enzym wurde dann durch 5 min Erhitzen auf 65 ºC
inaktiviert. Die SalI-Digestion wurde in 100 ul Sall-Digestions-
Puffer durchgeführt, der 150 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7,9,
6 mM MgCl&sub2;, 6 mM 2-Mercaptoethanol, 100 ug/ml Gelatine und
25 Einheiten Sal1 (New England Biolabs) enthielt. Die
Inkubation erfolgte 1 h bei 37º C. Das Enzym wurde dann durch
5 min Erhitzen auf 65 ºC inaktiviert.
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Die beiden aliquoten Anteile wurden vereinigt und 2 h bei
37º C mit 10 Einheiten Kalbs-Darmphosphatase (PL Labs)
verdaut, um die 5'-Phosphate zu entfernen. Das vereinigte
pHC 79 wurde dann auf 0,3 M Natriumacetat pH 7,0 eingestellt
und zweimal mit Phenol extrahiert; darauf folgten vier
Extraktionen mit Ether. Die DNA wurde mit 2,5 Volumina Ethanol
ausgefällt, mit 70 Vol./Vol.-% Ethanol gewaschen, getrocknet
und schließlich in 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA zu einer End-
Konzentration von 500 ug/ml erneut suspendiert. Die
Ligierungs-Reaktionen enthielten 1 ug des präparierten pHC 79 und
1 ug der Sau3A-verdauten E. coli-DNA in 8 ul Ligierungs-
Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7,9, 10 mM MgCl&sub2;, 20 mM
Dithiothreit, 25 ug/ml Gelatine und 1 mM ATP). Die
Reaktionsmischung wurde 5 min bei 37 ºC inkubiert, gekühlt, und die
Ligierung wurde durch Zusatz der T4 DNA-Ligase (EC 6.5.1.1)
initiiert.
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Diese Reaktionen wurden 4 h bei 15 ºC fortgesetzt. Aliquote
Anteile von 4 ul der Ligierungs-Mischungen wurden dann der
in vitro-Verpackung in Bakteriophagen-k-Teilchen unterzogen.
Die Stämme BHB 2688 und BHB 2690 wurden von NZY-Agar-Platten
in 50 ml NZY-Brühe {die 10 g NZ-amin (von Humko Sheffield),
5 g Hefe-Extrakt und 2,5 g NaCl pro 1 Liter enthielt}
inokuliert und unter Belüftung bei 30 ºC inkubiert, bis der
Wert von E&sub6;&sub0;&sub0; 0,3 erreichte. Die Kulturen wurden dann durch
Eintauchen in ein Wasserbad von 60 ºC auf 45 ºC erwärmt und
ohne Belüftung 20 min bei 45 ºC inkubiert. Die beiden
Kulturen wurden dann 3 h bei 37 ºC kräftig belüftet. Die beiden
Kulturen wurden vereinigt, auf 4 ºC abgekühlt und durch
2 min Zentrifugieren bei 7000 UpM geerntet. Das Pellet wurde
einmal in 100 ml kaltem M9-Minimalmedium (pro Liter: 6 g
Na&sub2;HPO&sub4;, 3 g KH&sub2;PO&sub4;, 0,5 g NaCl, 1,0 g NH&sub4;Cl; mit 8 N NaOH
auf pH 7 eingestellt, nach dem Autoklavieren, sterile
Glucose auf 0,2 Gew./Vol.-% zugesetzt, CaCI&sub2; auf 0,1 mM
zugesetzt und MgSO&sub4; auf 1 mM zugesetzt). Das Pellet wurde
dann in 5 ml kaltem Komplementations-Puffer {40 mM Tris-HCl
pH 8,0, 10 mMol Spermidin-HCl, 10 mM Putrescin-HCl,
0,1 Vol./Vol.-% 2-Mercaptoethanol und 7 Vol./Vol.-%
Dimethylsulfoxid} gewaschen und 30 s bei 5000 UpM pelletiert.
Die Zellen wurden schließlich in 0,25 ml kaltem
Komplementationspuffer erneut suspendiert und in aliquoten 20 ul-
Anteile in Mikro-Proberöhrchen abgefüllt. Diese wurden
sofort in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80ºC
aufbewahrt.
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Für die Verpackungs-Reaktion wurde eine 20
ul-Verpackungsmischung dem flüssigen Stickstoff entnommen, und ihr wurde
sofort 1 ul 30 mM ATP zugesetzt. Die Mischung wurde dann
2 min auf Eis gestellt. Die aliquoten 4 ul-Anteile der
ligierten DNA wurden dann hinzugefügt und gründlich
untergemischt. Das Gemisch wurde dann 30 min bei 37 C inkubiert.
Nach 30 min wurde 1 ug 1 mg/ml DNAse (Worthington) zugesetzt
und untergemischt, bis die Probe ihre Viskosität eingebüßt
hatte. Zu diesem verpackten DNA-Präparat wurden dann 200 ul
des Stammes E 107 hinzugefügt, der bis zu einem E&sub6;&sub0;&sub0;-Wert
von 1,0 in Trypton-Maltose-Brühe wachsen gelassen worden
war. MgSO&sub4; wurde ebenfalls bis zu einer End-Konzentration
von 10 mM hinzugefügt. Die verpackten Cosmide wurden dann
30 min bei 30ºC absorbiert; nach dieser Zeit wurden 500 ul
L-Brühe (Luria-Brühe: 1 Gew./Vol. % Bacto-Trypton,
0,5 Gew./Vol.-% Bacto-Hefeextrakt, 0,5 Gew./Vol.-% NaCl,
1,2 Gew./Vol.-% Glucose, pH 7) hinzugefügt, und die
Inkubation wurde weitere 30 min bei 30ºC fortgesetzt. Die Zellen
wurden dann auf L-Agar, der 100 ug/ml Carbenicillin
(α-Carboxybenzylpenicillin) enthielt, ausplattiert und 24 h bei
30ºC inkubiert.
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Dann wurden Carbenicillin-resistente Kolonien herausgesucht,
auf L-Agar-Carbenicillin-Platten überführt und über Nacht
bei 42ºC inkubiert. Stamm E107 (3) trägt die Mutation dnaB,
die ihn unfähig macht, bei 42ºC zu wachsen. Somit sollten
nur diejenigen Kolonien, die einen dnaB&spplus; tragenden Cosmid-
Klon aus dem Donor des Wildtyps angenommen hatten, zum
Wachsen bei dieser Temperatur befähigt sein. Auf diese Weise
wurden 8 dnaB tragende Cosmid-Klone isoliert. Da dnaB nahe
bei tyrB, dem Gen für die aromatische Transaminase, kartiert
und da das Cosmid-Klonieren Plasmide ergibt, die große
Einfügungen (Inserts) von Donor-DNA enthalten, war es
vernünftig anzunehmen, daß einige der Cosmid-Klone ebenfalls tyrB
tragen würden. Daß einige der Klone in der Tat tyrB tragen,
wurde auf folgende Weise gezeigt.
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Cosmid-DNA aus jedem der dnaB-Klone wurde gereinigt und in
Bakteriophagen-λ-Teilchen verpackt, wie oben beschrieben
ist. Die verpackten Cosmide wurden dann in den
Transaminasedefizienten Stamm DG 44 eingeführt, der die Mutationen tyrB
und aspC trägt. Diese zwei Mutationen zusammen verleihen dem
DG 44 einen Tyr&supmin; Asp&supmin;-Phänotyp. Es war zu erwarten, daß die
Einführung eines intakten tyrB-Gens die Fähigkeit dieses
Stammes, in Abwesenheit von Tyrosin und Aspartat zu wachsen,
wiederherstellen würde. Eine direkte Durchmusterung von
Klonen auf tyrB ist in diesem Stamm nicht einfach, da sie
keine Plasmide beibehält, die aus colE1 abgeleitet sind, wie
pHC 79. Aus diesem Grunde ließ man nach dem Einführen der
Cosmid-Klone in DG 44 zwei Stunden Zeit für die
Rekombination zwischen dem tyrB-Gen auf dem Cosmid und dem Mutanten-
Allel auf dem Bakterien-Chromosom. Die Zellen wurden dann
gewaschen und auf Minimalmedium ohne Tyrosin und Aspartat
ausplattiert und auf die Anwesenheit von tyrB&spplus;-Rekombinanten
durchgemustert. Vier der ursprünglichen dnaB-Klone ergaben
tyrB&spplus;-Rekombinanten bei dieser Durchmusterung und müssen
infolgedessen wenigstens etwas von dem tyrB-Gen tragen.
(b) Subklonierung von Restriktions-Fragmenten aus
CosmiddnaB-Klon
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Die tyrB-Cosmid-Klone waren wegen der hohen Größe derselben,
die eine niedrige Kopie-Zahl ergab, von begrenztem Nutzen.
Aus diesem Grunde wurden das tyrB-Gen tragende Restriktions-
Fragmente in das Mehrfach-Kopie-Plasmid pAT153
folgendermaßen {siehe, beispielsweise, Twigg, A.J und Shenatt, D.,
Nature 283 216-218 (1980) subkloniert}: Aliquote Anteile von
2 ug des dnaB-Cosmids Nr. 5, das tyrB trägt, wurden verdaut
in 20 ul-Reaktion mit den folgenden
Restriktions-Endonucleasen: BamHI, HindIII, SalI, SphI, ClaI, EcoRI und BglII.
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In jedem Fall fand die Inkubation 1 h bei 37ºC statt, und
das Enzym wurde durch 5 min Erhitzen auf 65ºC inaktiviert.
Für die BamH-Digestion enthielt das Reaktionsmedium 150 mM
NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7,9, 6 mM MgCl&sub2;, 100 ug/ml Gelatine
und 4 Einheiten BamHI (New England Biolabs). Drei (3)
Einheiten HindIII (New England Biolabs) wurden verwendet in
60 mM NaCl, 7 mM MgCl&sub2;, 7 mM Tris-HCl pH 7,4 und 100 ug/ml
Gelatine. Im Falle des SalI wurden 5 Einheiten des von New
England Biolabs erhaltenen Enzyms in 150 mM NaCl, 6 mM
Tris-HCl pH 7,9, 6 mM MgCl&sub2;, 7 mM 2-Mercaptoethanol und
100 ug/ml Gelatine verwendet. Für SphI enthielt die Reaktion
50 mM NaCl, 6 mM Tris-HCl pH 7,4, 6 mM MgCl&sub2;, 10 mM
2-Mercaptoethanol, 100 ug/ml Gelatine und 1 Einheit des SphI-
Enzyms (New England Biolabs). Die Reaktionsmischung für die
ClaI-Digestion entsprach derjenigen für die
HindIII-Digestion, außer daß das verwendete Enzym aus 3 Einheiten ClaI
bestand, die von Boehringer Biochemicals erhalten worden
waren. Im Falle von EcoRI wurden 4,5 Einheiten EcoRI (New
England Biolabs) verwendet in 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM
Nacl, 5 mM MgCl&sub2; und 100 ug/ml Gelatine. Letztlich enthielt
das Reaktionsmedium für die BglII-Digestion 60 mM NaCl,
10 mM Tris-HCl pH 7,6, 10 mM MgCl&sub2;, 10 mM 2-Mercaptoethanol
und 100 ug/ml Gelatine.
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Diese verdauten DNA-Präparate der Elektrophorese wurden 6 h
bei 5 V/cm auf einem horizontalen 1 Gew./Vol.-% Agarose-Gel
mit niedriger Geliertemperatur (LGT) in TBE unterzogen. Die
DNA-Fragmente wurden durch 15 min Anfärben des Gels in einer
Lösung von 1 ug/ml Ethidiumbromid sichtbar gemacht, und
danach erfolgte die Beobachtung unter einer 366
nm-UV-Lichtquelle. Die einzelnen Banden wurden herausgeschnitten und
bei 4ºC aufbewahrt.
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Aliquote Anteile von einem (1) ug pAT153 DNA wurden mit dem
gleichen Satz Restriktions-Endonucleasen in 20 ul Reaktionen
verdaut, mit Ausnahme von BglII (das pAT153 nicht
schneidet). Cosmid BglII-Fragmente wurden in BamHI-geschnittenes
pAT153 subkloniert (BamHI und BglII geben die gleichen 5'-
Überhänge). Nach der Digestion wurde der linearisierte
Vektor mit 1 Einheit Kalbs-Darmphosphatase (PL Labs)
verdaut, um die 5'-Phosphate zu entfernen und eine
Rezirkularisierung zu verhindern, 10 min bei 70ºC inkubiert, um das
Enzym zu inaktivieren und dann ebenfalls auf einem
1 Gew./Vol.-% LGT-Agarose-Gel laufen gelassen, wie für die
Cosmid-Fragmente beschrieben wurde. Die dem durch jedes der
Enzyme linearisierten Plasmid entsprechende Bande wurde dann
aus dem Gel herausgeschnitten, wie oben beschrieben ist.
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Die Cosmid-Fragmente wurden dann an den geeignet
geschnittenen Vektor wie folgt ligiert. Die Gel-Scheiben wurden durch
10 min Inkubation bei 65ºC geschmolzen und dann auf 37ºC
gekühlt. Die geschmolzenen Gel-Scheiben umfaßten alle etwa
100 ul. 2 ul des Vektor-Fragments und 8 ul eines speziellen
Cosmid-Fragments wurden dann zu 40 ul vorgewärmten 1,25 ·
Ligasierungs-Puffer (62,5 mM Tris-HCl pH 7,8, 12,5 mM MgCl&sub2;,
25 mM Dithiothreit, 1,25 mM ATP und 62,5 mg/ml Gelatine)
hinzugefügt, und das Ganze wurde gründlich vermischt. Ligase
wurde hinzugefügt, und die Reaktion wurde bei 15ºC über
Nacht fortgesetzt. Die ligasierten Proben wurden dann 5 min
bei 65ºC erneut aufgeschmolzen, auf Raumtemperatur
abgekühlt und dann zu 200 ul kompetenter Zellen des E. coli-
Stammes HW 87 hinzugefügt, die wie folgt hergestellt worden
waren. Eine über Nacht erhaltene Kultur von HW 87 in L-Brühe
wurde 1 : 50 in 50 ml frische vorgewärmte L-Brühe verdünnt
und bei 37ºC unter guter Belüftung inkubiert, bis der
E&sub6;&sub0;&sub0;-Wert 0,6 erreichte. Die Zellen wurden dann durch 5 s
Zentrifugieren bei 10 000 UpM pelletiert und in 25 ml kaltem
50 mM CaCl&sub2; resuspendiert. Die Zellen wurden 10 min auf Eis
stehen gelassen und danach wie oben erneut pelletiert und in
2 ml kaltem 50 mM CaCl&sub2; resuspendiert. Nach weiteren 10 min
der Inkubation bei 0ºC waren die Zellen für die
Transformation kompetent.
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Nach dem Zusatz der ligierten DNA wurden die Zellen weitere
10 min bei 0ºC inkubiert, 2 min einem Wärmeschock bei 37 ºC
ausgesetzt und schließlich mit 750 ul vorgewärmter L-Brühe
vermischt. Die Zellen wurden 30 min bei 37 ºC inkubiert, um
die phänotypische Expression des in das Plasmid codierten
β-Lactamase-Gens zu ermöglichen, bevor geeignete aliquote
Anteile auf L-Agar-Platten ausplattiert wurden, die 200 ug/ml
Carbenicillin enthielten. Die Platten wurden bei 37 ºC über
Nacht inkubiert. Rekombinierte Plasmide enthaltende Kolonien
wurden im Fall der an den HindIII-, SalI-, SphI-, BamHI- und
ClaI-Stellen von pAT 153 klonierten Fragmente aufgrund ihrer
Empfindlichkeit gegen Tetracyclin identifiziert.
-
Rekombinanten, die unter Verwendung der
Restriktions-Endonuclease EcoRI isoliert wurden, wurden durch Untersuchung
der Größe der Plasmide in den einzelnen Kolonien
identifiziert. Dies wurde folgendermaßen durchgeführt. Potentielle
Rekombinanten-Kolonien wurden als Flecken auf 200 ug/ml
Carbenicillin enthaltende L-Agar-Platten aufgetragen. Diese
wurden bei 37ºC über Nacht inkubiert. Die Bakterien von
etwa 1 cm² jedes Fleckens wurden in lytischer Mischung
resuspendiert, die 10 mM Tris-HCI pH 8, 1 mM EDTA,
1 Gew./Vol.-% Natriumdodecylsulfat (SDS), 2 Gew./Vol.-%
Ficoll und 0,5 Gew./Vol.-% Bromphenolblau (Sigma Chemicals)
100 ug/ml RNAse enthielt. Dieses Gemisch wurde dann 30 min
bei 65 ºC inkubiert. Jede Probe wurde dann 30 s kräftig
durch Verwirbeln vermischt. Aliquote Anteile von 50 ul jedes
Präparats wurden dann auf 1 Gew./Vol.-% Agarose-Gel
aufgetragen und 4 h bei 10 V/cm der Elektrophorese unterzogen.
Die Plasmid-Banden wurden, wie oben beschrieben ist, mit
Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Beleuchtung von 254 nm
sichtbar gemacht. Rekombinierte Plasmide wurden durch ihre
im Vergleich zu nicht rekombinierten Kontrollen verminderte
Beweglichkeit identifiziert. Mit Hilfe dieser Arbeitsweisen
wurde eine Anzahl rekombinierter Plasmide isoliert, die
verschiedene Fragmente des ursprünglichen Cosmid dnaB-Klons
tragen. Zur Erleichterung der Durchmusterung dieser Plasmide
auf diejenigen, die das intakte tyrB-Gen trugen, wurde ein
neuer Stamm konstruiert, der tyrB&supmin; und aspC&supmin; Mutationen
trägt.
Beispiel 3
Konstruktion eines Transaminase-defizitären Stammes
-
Es wurde beschlossen, die bereits charakterisierten
Mutationen in DG 44 in einen Hintergrund zu verlegen, von dem
bekannt ist, daß er die Erhaltung der Plasmide (derjenigen des
Stammes MC 1061) erlaubt. Der Bakteriophage P1 wurde
kultiviert auf einer Mischkultur des Stammes HW 22, der
statistische Einfügungen des tetracyclin-resistenten Transposons
Tn 10 trägt und der wie folgt hergestellt ist: Eine
gesättigte Kultur von HW 22 wurde über Nacht in lambda YM-Brühe
(10 g Bacto-Trypton, 2,5 g NaCl und 0,2 Gew./Vol.-% Maltose
pro Liter) kultiviert. Diese wurde 1 zu 100 in 100 ml
frische vorgewärmte lambda YM-Brühe verdünnt und bei 37ºC
inkubiert, bis der OD&sub6;&sub0;&sub0;-Wert 0,6 erreichte. Die Zellen
wurden durch 5 s Zentrifugation mit 10 000 UpM abgeschieden
und in 5 ml lambda YM-Brühe resuspendiert. NK 55, ein das
Tetracyclin-Transposon Tn 10 tragendes Derivat des
Bakteriophagen lambda, wurde dann zu einer Multiplizität der
Infektion von 0,2 hinzugefügt. Der Bakteriophage wurde 45 min bei
37 ºC absorbiert. Dann wurden aliquote Anteile von 200 ml
auf L-Agar-Platten ausgebreitet, die Tetracyclin (20 ug/ml)
und Natriumpyrophosphat (2,5 mM) enthielten. Die Platten
wurden 24 h bei 37ºC inkubiert. Etwa 5 000 Tet®-Kolonien
wurden durch Abwaschen der Kolonien von den Platten unter
Verwendung von insgesamt 5 ml L-Brühe vereinigt. Diese
Mischung wurde dann in 50 ml L-Brühe verdünnt, die 20 ug/ml
Tetracyclin enthielten, und über Nacht bei 37 ºC kultiviert.
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Die Tn 10-Flüssigkeit wurde, nachdem steriles Glycerin
hinzugefügt worden war, um die Konzentration auf 20 Gew./Vol.-%
zu bringen, bei -20ºC aufbewahrt.
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Um den Bakteriophagen P1 auf der Tn 10-Flüssigkeit zu
kultivieren, wurde ein aliquoter Anteil von 200 ml dieses
Glycerin-Vorrats mit 5 ml L-Brühe, die 10 ug/ml Tetracylin
enthielt, verdünnt und über Nacht bei 37ºC unter Schütteln
inkubiert. Zu 0,2 ml dieser Übernacht-Kultur wurden 2 · 10&sup6;
Plaque-bildende Einheiten (pfu) des Phagen P1 clear und
10 ul 50 mM CaCl&sub2; hinzugefügt. Die Zellen wurden 5 min bei
37ºC inkubiert und dann zu 5 ml L-Brühe + 2,5 mM CaCl&sub2;,
vorgewärmt auf 37ºC, hinzugefügt. Die Zellen wurden dann
unter kräftiger Belüftung 4 h bei 37ºC inkubiert. Die
Zelltrümmer wurden durch 5 min Zentrifugation bei 10 000 UpM
entfernt, und der phagenhaltige Überstand wurde über
Chloroform bei 4ºC aufbewahrt.
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Dieser Überstand wurde verwendet, um DG 30 zu transduzieren,
um ein Wachsen auf Minimalmedium ohne Tyrosin und Aspartat
zu ermöglichen. (Das verwendete Minimalmedium war das von
Vogel und Bonner: 0,2 g/l MgSO&sub4; · 7 H&sub2;O, 2 g/l
Citronensäure, 10 g/l K&sub2;HPO&sub4;, 3,5 g/l NaH&sub2;PO&sub4;4 H&sub2;O und 10 mM FeCl&sub2;).
Nach dem Autoklavieren wurde Glucose zu einer
End-Konzentration von 0,2 Gew./Vol.-% zusammen mit notwendigen
Aminosäure-Ergänzungen von 50 ug/ml hinzugefügt. Die Tyr&spplus; Asp&spplus;
Transduktanten wurden dann in das gleiche Medium, das
10 mg/ml Tetracyclin enthielt, replik-plattiert, um
diejenigen Transduktanten zu entdecken, die gleichzeitig Tet®
geworden waren. Eine Anzahl dieser Tet® Tyr&spplus; Asp&spplus;
Rekombinanten wurde gereinigt und zur Herstellung neuer P1-Lysate
verwendet. Jedes dieser 8 P1-Präparate wurde dann verwendet,
um DG 30 in Tet® zu transduzieren. Aus jedem Versuch wurden
50 Tet®-Transduktanten in das Minimalmedium ohne Tyrosin und
Aspartat gepickt, um auf eine Verknüpfung zwischen der
Stelle der beteiligten Tn 10-Einfügung und aspC oder tyrB zu
prüfen. Aus jedem dieser Versuche wurde eine Tet®-Kolonie,
die tyrB aspC gereinigt und wieder zur Herstellung eines P1-
Lysats verwendet. Diese Lysate wurden verwendet, um MC 1061
zu Tet® zu transduzieren. Zell-Extrakte aus diesen
Transduktanten wurden dann auf nativen Polyacrylamid-Gelen laufen
gelassen und auf L-phe-Transaminase gefärbt, wie von Gelfand
beschrieben ist.
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Die Zell-Extrakte wurden dadurch hergestellt, daß die
gewünschten Transduktanten über Nacht in 10 ml L-Brühe bei
37ºC kultiviert wurden. Die Zellen wurden durch 15 s
Zentrifugation bei 10 000 UpM geerntet und in 0,5 bis 1,0 ml
Schallbehandlungs-Puffer resuspendiert, je nach der Größe
des Pellets. Der eingesetzte Schallbehandlungs-Puffer
bestand aus 25 mM Tris-HCl, 25 mM KH&sub2;PO&sub4; pH 6,9, 0,2 mM
Pyridoxalphosphat, 0,5 mM Dithiothreit, 0,2 mM EDTA und
10 Vol./Vol.-% Glycerin. Die Zell-Suspensionen wurden in
Eppendorf-Mikroteströhrchen überführt und auf Eis gehalten.
Jede Suspension wurde der Schallbehandlung mit einem Davis-
Schallgerät unter Anwendung von 4 Ausbrüchen von 5 s bei
der Einstellung 2 unterworfen. Die schallbehandelten
Suspensionen wurden dann 5 min mit 15 000 UpM bei 4ºC
zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und die Überstände
wurden in ein frisches Mikroteströhrchen überführt. Die
Zell-Extrakte wurden dann auf Eis gehalten, bis sie auf ein
Gel geladen werden konnten, oder bei -20ºC aufbewahrt.
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Die native Gelelektrophorese wurde wie folgt durchgeführt.
Das Gel bestand aus 8,5 Gew./Vol.-% Acrylamid,
0,227 Gew./Vol.-% Bisacrylamid in 375 mM Tris-HCl pH 8,3.
Dieses Acrylamid-Vorratsmaterial wurde entgast und durch
Zusatz von 0,05 Gew./Vol.-% Ammoniumpersulfat und
0,016 Gew./Vol.-% TEMED polymerisiert. Nach der
Polymerisation wurden die Gele wenigstens 1 h bei 4ºC in 37,5 mM
Tris-HCl pH 8,3 vorlaufen gelassen. Vor dem Auftragen wurde
der Puffer gegen den Lauf-Puffer ausgewechselt, der aus
76,7 mM Glycin, 1 mM Tris-HCl pH 8,3 bestand. Etwa 50 ug
Protein aus jedem Zell-Extrakt wurde dann aufgetragen und
der Elektrophorese 4 bis 6 h mit 10 V/cm bei 4ºC
unterzogen.
Die Protein-Konzentration der Zell-Extrakte wurde
unter Anwendung der Bio-Rad-Protein-Reagens-Methode
bestimmt. Die Gele wurden auf L-phe-Transaminase-Aktivität wie
folgt angefärbt. Das Gel wurde kurz in 100 mM Phosphat-
Puffer pH 7,5 gewaschen und dann in 500 ml frische
Färbelösung eingetaucht, die aus 12,5 mM α-Ketoglutarat, 0,2 mM
Pyridoxalphosphat, 0,6 mM Nitroblautetrazolium, 0,2 mM
Phenazinmethosulfat, 30 mM L-phe und 100 mM K&sub2;HPO&sub4; pH 7,5
bestand und die auf 37 ºC vorgewärmt worden war. Das Gel
wurde in der Färbelösung 1 h bei 37 ºC im Dunklen sanft
geschüttelt. Das Gel wurde dann in destilliertem Wasser
gewaschen und in destilliertem Wasser belassen, bis es
fotografiert werden konnte (siehe Fig. 2). Diese
veranschaulicht die Anwesenheit oder Abwesenheit nachweisbarer
Aminotransferasen in verschiedenen E. coli-Stämmen.
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Auf diese Weise hergestellte MC 1061-Extrakte gaben drei
anzufärbende Banden, die für die Aktivitäten von ilvE, aspC
und tyrB charakteristisch waren. Durch Vergleichen des
Transaminase-Musters von Extrakten, die aus den
Transduktanten hergestellt worden waren, mit denjenigen von MC 1061 war
es möglich, MC 1061-Rekombinanten nachzuweisen, denen die
charakteristische aspC-Aktivität fehlte.
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Eine Mutante, die frei von aspC-Aktivität war, wurde
gereinigt und HW109 genannt. Dieser Stamm wurde dann durch die
Methode von Bochner et al. (J. Bact. 143: 926) von dem
Tn10 Transposon geheilt. HW109 wurde über Nacht in L-Brühe
kultiviert. Etwa 10&sup6; Zellen pro Platte wurden auf Bochner-
Selektiv-Medium ausgebreitet, das wie folgt hergestellt
wurde: Lösung A (Bacto-Trypton 10 g, Bacto-Hefeextrakt 5 g,
Chlortetracyclin-HCl 50 mg, Agar 15 g, Wasser 500 ml) und
Lösung B (Nacl 10 g, NaH&sub2;PO&sub4;·H&sub2;O 10 g, Glucose 2 g, Wasser
500 ml) wurden getrennt 20 min bei 15 psi autoklaviert. Die
Lösungen wurden vermischt und auf Gießtemperatur abgekühlt.
5 ml ZnCl&sub2; (20 mM) und 6 ml (2 mg·ml&supmin;¹) Fusarsäure wurden
dann vor dem Gießen hinzugefügt. Die Platten wurden 24 h bei
37ºC
inkubiert, und die gegen Fusarsäure resistenten
Kolonien wurden isoliert und durch erneutes Aufstreichen auf
dem gleichen Medium gereinigt. Diese Isolate wurden dann auf
Empfindlichkeit gegen Tetracyclin getestet. Ein
tetracyclinempfindliches Derivat von HW109 wurde gewählt und HW157
genannt.
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Dieser Weg lieferte jedoch keine tyrB-Derivate von HW 22.
Die Arbeitsweise zur Isolierung eines Stammes mit an tyrB
geknüpftem Tn 10 war die folgende. Der Stamm ES430 trägt
eine Mutation in malB, die ihn unfähig macht, Maltose als
Kohlenstoff-Quelle zu verwenden. Das malB ist vernünftig
dicht mit dem tyrB verknüpft. Aus diesem Grunde wurde ES430
mit P1 transduziert, das auf dem statistischen Tn 10-
Gemisch, das bei HW 22 oben beschrieben wurde, kultiviert
worden war, wobei für Tet® auf Maltose Maconkey-Agar-
Platten, die mit 10 ug/ml Tetracyclin ergänzt waren,
selektiert wurden.
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Die P1-Transduktionen wurden wie folgt durchgeführt. Der
Empfänger-Stamm wurde in L-Brühe bis zu einem OD&sub6;&sub0;&sub0; von etwa
1,0 kultviert. CaCl&sub2; wurde bis zu einer End-Konzentration
von 2,5 mM hinzugefügt. Der auf dem gewünschten Donor
kultivierte Phage P1 clear wurde dann mit einer Multiplizität der
Einfügung von 0,2 bis 1, (gewöhnlich 10&sup8; pfu P1 clear pro
1 ml Rezipient) hinzugefügt. Die Zellen wurden bei 37ºC
15 min inkubiert, 5 s mit 10 000 UpM zentrifguiert, in dem
ursprünglichen Volumen 0,1 M Citrat-Puffer pH 7,0 gewaschen
und schließlich in Citrat-Puffer resuspendiert. Geeignete
aliquote Anteile wurden dann auf dem Selektions-Medium
ausplattiert.
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Transduktanten, die gleichzeitig Tet® und Mal&spplus; geworden
waren, wurden herausgepickt und gereinigt. P1-Lysate wurden
dann von diesen Stämmen hergestellt und verwendet, um DG 44
auf Tet® zu transduzieren. Die von jedem dieser acht P1-
Lysate abgeleiteten Tet®-Kolonien wurden dann als Flecken
auf Minimal-Agar-Platten ohne Aspartat und Tyrosin
aufgetragen. In einem dieser Versuche wurde eine gute Verknüpfung
zwischen Tn 10 und tyrB erhalten. Aus diesem Grunde wurde
eine Tet® tyrB-Rekombinante aus diesem Versuch isoliert, ein
P1-Lysat von dieser Rekombinante hergestellt und verwendet,
um das oben beschriebene HW157 zu Tet® zu transduzieren. 50
dieser Transduktanten wurden dann als Flecken auf Minimal-
Agar aufgetragen, das mit Leucin ergänzt worden war, dem
jedoch L-Aspartat und L-Phenylalanin fehlten. Auf diese
Weise wurde ein tyrB&supmin; aspC&supmin; Derivat von MC 1061 nachgewiesen.
Dieser Stamm wurde als HW158 bezeichnet. Schließlich wurde
HW159, ein tetracyclin-empfindliches Derivat von HW158,
isoliert, wie oben für die Isolierung von HW157 beschrieben
ist. HW159 wächst nicht auf mit Leucin ergänztem
Minimalmedium, da es Aspartat und Tyrosin zum Wachstum benötigt,
anders als der Parental-Stamm MC1061, der nur Leucin
benötigt.
Beispiel 4 (Bezug)
Reihen-Durchmusterung der Sub-Klone auf die Fähigkeit, die
tyrB-Läsion in HW 159 zu komplementieren
-
Sämtliche rekombinierten Plasmide, die durch Subklonieren
von DNA-Fragmenten aus dem dnaB-Cosmid-Klon (der oben
beschrieben ist) erhalten wurden, wurden in den Stamm HW159
eingeführt durch Transformations-Selektieren auf L-Agar, der
mit 200 ug/ml Carbenicillin ergänzt worden war. Diese
Transformanten wurden dann auf nur mit Leucin ergänztes
Minimalmedium aufgestrichen, um auf die Fähigkeit der
Anwesenheit von Genen, die von dem Plasmid getragen werden, zu
testen, die tyrB-Läsion in HW 159 zu komplementieren. Es
wurde gefunden, daß ein das ClaI-Fragment aus dem Cosmid
dnaB-Klon Nr. 5 tragender Sub-Klon die Fähigkeit von HW 159
wiederherstellte, auf mit Leucin ergänztem Minimalmedium zu
wachsen, und damit das tyrB-Gen zu tragen.
-
Die Sequenzierung des tyrB-Gens wurde nach der Methode von
Maxam und Gilbert durchgeführt. Die Sequenz des tyrB-Gens
ist in der Fig. 3 dargestellt. Auf der Basis dieser DNA-
Sequenz konnte die Aminosäure-Sequenz für die Aminosäure-
Transferase, für die tyrB codiert, unter Verwendung der
genetischen Triplet-Codons bestimmt werden.
Beispiel 5
Klonierung des aspC-Gens:
-
Als Ausgangspunkt für die Klonierung des aspC-Gens wurde
beschlossen, den von M. Ono erhaltenen, spezialisierten
transduzierenden Phagen lambda aspC2 zu verwenden. Der Phage
wurde wie folgt präpariert: Eine Kultur von HW76, das ein
doppeltes Lysogen ist, das lambda aspC und lambda CI 857
Sam 7 trägt, wurde bei 30ºC bis zu einem OD&sub6;&sub0;&sub0; von 0,6
kultiviert. Die Kultur wurde dann 15 min bei 45ºC
inkubiert, um den Prophagen zu induzieren, und dann 3 h kräftig
bei 37ºC geschüttelt. Die Zell-Lyse wurde durch Zusatz von
0,5 ml CHCl&sub3; beendet, und die Zelltrümmer wurden durch
10 min Zentrifugieren mit 10 000 UpM entfernt. Der Phage
wurde ausgefällt durch Zusatz von NaCl zu 2,4 Gew./Vol.-%
und von Polyethylenglycol (mittleres Molekulargewicht 6000)
zu 10 Gew./Vol.-%. Der Phage wurde über Nacht bei 4ºC
ausgefällt und dann durch 10 min Zentrifugation bei
5 000 UpM pelletiert. Das Phagen-Pellet wurde sanft
resuspendiert in 10 ml Phagen-Puffer, bestehend aus 10 mM
Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgSO&sub4;. Der Phage wurde durch 1 h
Zentrifugation mit 40 000 UpM pelletiert und schließlich in
1 ml Phagen-Puffer resuspendiert.
-
Der Phage wurde durch Laufenlassen auf einem CsCl-Block-
Gradienten wie folgt weiter gereinigt. 1 ml Phage wurde
auf einen Zwei-Stufen-Block-Gradienten in Cellulosenitrat-
Röhrchen aufgetragen. Der Gradient enthielt 1 ml 5M CsCl,
10 mM MgSO&sub4;, 10 mM Tris-HCI pH 8,0 und 0,1 mM EDTA,
überschichtet mit 3 ml 3M CsCl, 10 mM MgSO&sub4;, 10 mM Tris-HCl
pH 8,0 und 0,1 mM EDTA. Der Gradient wurde in einem Beckman
SW 65 Rotor 1 h mit 30 000 UpM bei 20ºC zentrifugiert. Die
Phagen-Bande wurde in 0,5 ml von der Seite des Röhrchens mit
Hilfe einer Spritze mit einer 5/8 inch (1,6 cm) Nadel der
Dicke 25 gauge entfernt. Die 0,5 ml des Phagen wurden dann
mit 0,5 ml gesättigter CsCl-Lösung (25ºC) in 10 mM MgSO&sub4;,
10 mM Tris-HCl pH 8,0 und 0,1 mM EDTA gemischt und in einem
Cellulosenitrat-Zentrifugenröhrchen gut durchgemischt.
Dieses Gemisch wurde dann überschichtet mit 3 ml 5M CsCl in
10 mM MgSO&sub4;, 10 mM Tris-HCl pH 8,0 und 0,1 mM EDTA und dann
mit 1 ml 3M CsCl in 10 mM MgSO&sub4;, 10 mM Tris-HCl pH 8,0 und
0,1 mM EDTA. Das Ganze wurde erneut 1 h mit 30 000 UpM bei
20 ºC zentrifugiert. Der Phage wurde wiederum von der Seite
des Röhrchens in 0,5 ml wie zuvor entfernt.
-
Die DNA wurde aus den Phagen-Teilchen wie folgt extrahiert.
Zu den 0,5 ml des Phagen in einem 15 ml
Corex-Zentrifugenröhrchen wurden 50 ul 2M Tris-HCl pH 8,5, 0,2 M EDTA und
0,5 ml Formamid hinzugefügt. Nach 30 min wurden 0,5 ml
Wasser zugesetzt, und die DNA wurde durch Zusatz von 3 ml
Ethanol ausgefällt. Die DNA wurde durch 5 min Zentrifugieren
mit 10 000 UpM pelletiert. Der Überstand wurde verworfen,
und das Pellet wurde mit 70 Vol./Vol.-% Ethanol gespült. Die
DNA wurde im Vakuum getrocknet und schließlich in TE (10 mM
Tris-HCl und 1 mM EDTA pH 8,0) gelöst, wodurch eine
DNA-Konzentration von 500 ug/ml erhalten wurde. Die lambda aspC-DNA
wurde mit der Restriktions-Endonuclease Sau3A partiell
verdaut, wie oben für die E. Coli-DNA beschrieben ist. Die DNA
aus sämtlichen Digests wurde vereinigt und auf einem
1 Gew./Vol.-% Agarose-Gel mit niedriger Gelier-Temperatur in
TBE laufen gelassen. Ebenfalls hergestellt und auf dem
gleichen Gel laufen gelassen wurde 1 ug pAT153 DNA, die mit
der Restriktions-Endonuclease BamHI und
Kalbs-Darmphosphatase vollständig verdaut worden war, wie oben beschrieben ist.
Die DNA wurde wie oben beschrieben unter UV-Licht von 366 nm
sichtbar gemacht.
-
Die dem linearisierten pAT153 und der partiell
restriktierten lambda aspC-DNA zwischen 2,5 und 6 kb entsprechenden
Banden wurden herausgeschnitten. Die DNA wurde aus dem Gel
wie folgt extrahiert. Die Gel-Scheiben wurden 15 min bei
65ºC in konvexen 15 ml Röhrchen geschmolzen, auf 37ºC
gekühlt und mit 2 Volumina Wasser bei 37ºC verdünnt. Die
Agarose wurde dann durch Hinzufügen eines gleichen Volumens
Phenol bei 37 ºC und 3 min Wirbelvermischen entfernt. Die
Phasen wurden durch 5 min Zentrifugation mit 10 000 UpM
getrennt, und die obere wäßrige Phase wurde in saubere
Röhrchen entfernt. Drei Phenol-Extraktionen wurden
durchgeführt. Der danach erhaltene Überstand wurde dann viermal
durch Verwirbeln mit der gleichen Menge Diethylether,
Abwarten der Phasentrennung und danach Entfernen der oberen
Ether-Schicht extrahiert. Das Volumen der verbliebenen
wäßrigen Phase wurde bestimmt, und 3M Natriumacetat wurde
hinzugefügt, um die Salz-Konzentration auf 0,3 M zu bringen.
Hefe-Transfer-RNA wurde zu einer End-Konzentration von
5 ug/ml als Träger hinzugefügt. Die DNA wurde durch Zusatz
von 2,5 Volumina Ethanol, Inkubation über Nacht bei -20ºC
und 30 min Zentrifugation mit 10 000 UpM ausgefällt. Das
Pellet wurde in 70 Vol./Vol.-% Ethanol gewaschen, erneut
30 min mit 10 000 UpM zentrifugiert und im Vakuum
getrocknet. Die DNA wurde dann zu einer Konzentration von etwa
100 ug/ml in TE aufgelöst. Die partiell restriktierte
lambda aspC-DNA wurde dann mit durch BamHI geschnittenem
pAT153 durch Hinzufügen der präparierten lambda aspC DNA zu
2 ul präparierter pAT153 DNA in 4 ul 2x-Ligierungs-Puffer
(oben beschrieben) ligiert. Diese Mischung wurde 5 min bei
37ºC inkubiert, auf Raumtemperatur gekühlt, und die
Ligierung wurde durch Hinzufügen von 1 ul T4 DNA-Ligase (New
England Biolabs) gestartet. Die Ligierung wurde 4 h bei
15ºC fortgeführt. Die gesamte Ligierungs-Reaktionsmischung
wurde dann auf Eis gekühlt und zu 200 ul kompetenter Zellen
hinzugefügt, die wie oben beschrieben aus den aus dem Stamm
HW 159 präpariert wurden. Die Transformation wurde wie oben
durchgeführt, und die Zellen wurden auf L-Agar ausplattiert,
der 200 ug/ml Carbenicillin enthielt. Die Platten wurden
über Nacht bei 37ºC inkubiert. Etwa 5 000 Kolonien
wurden erhalten. Diese wurden dann vereinigt, zweimal in
10 ml 0,85 Gew./Vol.-% NaCl gewaschen und auf Minimal-Agar
ausplattiert, der Leucin und Carbenicillin, jedoch kein Tyrosin
und Aspartat enthielt. Nur HW 159-Zellen, die ein aspC
enthaltendes rekombiniertes Plasmid trugen, vermochten auf
diesem Medium zu wachsen.
-
Nach 24 h Inkubation bei 37ºC wurden etwa 100 Kolonien
erhalten. Einige von diesen wurden durch
Vereinzelungs-Ausstriche auf dem gleichen Medium gereinigt. Daß diese ein
rekombiniertes Plasmid enthielten, wurde dadurch bestätigt,
daß Einzel-Kolonie-Agarose Gele wie oben beschrieben laufen
gelassen wurden. Daß die rekombinierten Plasmide in diesen
Stämmen tatsächlich den Asp&spplus; Tyr&spplus; -Phänotyp verliehen, wurde
bestätigt durch Isolieren der Plasmide, Rücktransformieren
in HW 159 und Zeigen, daß diese Transformanten Asp&spplus; Tyr&spplus;
geworden waren. Daß diese Transformanten durch die
Anwesenheit von kloniertem aspC, im Gegensatz zu tyrB, verändert
worden waren, wurde durch Laufenlassen nativer Acrylamid-
Gele auf zellfreien Extrakten und Anfärben auf Transaminase-
Aktivität wie oben beschrieben gezeigt. Diese Versuche
bestätigten, daß die Plasmide in der Tat ein intaktes aspC-Gen
trugen.
-
Der tatsächliche Wert der Aminotransferase-Aktivität wird in
willkürlichen Einheiten gemessen, die die relative Aktivität
angeben. Die relative Aminotransferase-Aktivität auf
verschiedenen, die Gene tyrB und aspC enthaltenden Stämmen auf
Plasmid pAT153 ist in Tabelle 2 gezeigt. Der Assay wurde
unter Verwendung eines sigma R Aspartat-Transaminase-Assay-
Kits durchgeführt (Sigma Technical Bulletin No. 56-UV,
revidiert August 1980).
Tabelle 2 Unter Verwendung von Aspartat als Substrat gemessene
Transaminase-Werte (Sigma Aspartat-Transaminase-Assay-Kit)
mg Protein Einheiten/min Relative Aktivität
Beispiel 6 (Bezug)
Weitere Analyse des tyrB-Klons
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Das tyrB tragende ClaI-Insert umfaßt etwa 4,5 kb. Eine
vorläufige Restriktionskarte wurde mit Hilfe der allgemeinen
Technik der doppelten Restriktions-Endonuclease-Digestion
und nachfolgenden Gel-Elektrophorese zum Analysieren der
erhaltenen Restriktionsfragmente konstruiert. In einer
Orientierung hatte das ClaI-Insert EcoRI-, BamHI- und NruI-
Stellen in Positionen, die die Reduktion der Plasmid-Größe
durch eine Deletion in vitro erleichterten.
Beispielsweise wurde das kleine EcoRI-Fragment wie folgt entfernt.
1 ug ptyrB-DNA wurde bis zur Vollständigkeit mit EcoRI in
einem Endvolumen von 20 ul verdaut. Das Enzym wurde durch
5 min Inkubation bei 65ºC inaktiviert. Ein aliquoter Anteil
von 2 ul dieses Digests wurde dann in 50 ul Ligase-Puffer
verdünnt, 1 ul wurde hinzugefügt, und die DNA wurde 16 h
bei 15ºC ligiert. Die Ligierung bei dieser niedrigen DNA-
Konzentration führt überwiegend zu der Re-Zirkularisierung
des Plasmids ohne das kleine EcoRI-Fragment. Die DNA wurde
dann in HW87 transformiert, wobei wie oben beschrieben auf
Carbenicillin-Resistenz selektiert wurde. Einzelne
Transformanten wurden herausgepickt, gereinigt und auf Einzel-
Kolonie-Lysat-Gelen wie oben beschrieben analysiert. Die
meisten der Transformanten enthielten Plasmide, die eine
höhere Mobilität als das parentale Plasmid zeigten. Plasmid-
DNA aus mehreren dieser Klone wurde isoliert, und der
Verlust des kleinen EcoRI-Fragments wurde durch EcoRI-Digestion
und Analyse dieser Digests durch Elektrophorese auf einem
1 % Agarose-Gel bestätigt. Alle der deletierten Plasmide
ergaben nur eine Bande, die dem großen EcoRI-Fragment des
ptyrB entsprach. Das parentale Plasmid ergab die erwarteten
zwei Banden.
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Das durch EcoRI deletierte ptyrB wurde dann einer ähnlichen
Serie von Manipulationen unterworfen, um das BamHI-Fragment
zu entfernen, und dieses durch EcoRI-BamHI-deletierte
Fragment wurde dann der Deletion unter Verwendung des Enzyms
NruI in dem folgenden Puffer unterworfen (100 mM NaCl, 6 mM
Tris pH 7,4, 6 mM MgCl&sub2;, 5 mM β-Mercaptoethanol, 100 ug/ml
Gelatine). Alle drei Plasmide wurden gereinigt und dazu
verwendet, HW225 (tyrB aspC recA) auf Carbencillin-Resistenz
zu transformieren. Alle Transformanten erwarben gleichzeitig
die Fähigkeit, auf Minimal-Medium in Abwesenheit von
L-Tyrosin und L-Aspartat zu wachsen. Dies demonstriert, daß
das tyrB-Gen auf allen drei deletierten Plasmiden noch
intakt ist.
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Das BamHI-EcoRI-Fragment aus dem doppelt deletierten ptyrB
wurde dann der Sequenz-Analyse unterworfen, wobei den von
Maxam und Gilbert beschriebenen Protokollen gefolgt wurde
(Maxam, A.M., und W. Gilbert, 1977, PNAS 51: 382-389; Maxam,
A.M., und W. Gilbert, 1977, MIE 65: CH 57 499-559 Teil I).
Ein im wesentlichen offener Leserahmen wurde entdeckt, der
für ein Protein mit einer Länge von 380 oder 396 Aminosäure-
Einheiten zu codieren vermochte. Der genaue Start-Punkt für
die Translation ist nicht bekannt. Es gibt eine typische
Ribosomen-Bindungsstelle etwa 10 Nucleotide stromaufwärts
von einem In-Phase-GTG (Valin-Codon). Alternativ gibt es ein
In-Phase-ATG (Methionin), aber diesem geht keine typische
Ribosomen-Bindungsstelle voraus.
Beispiel 7
Karte von paspC
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Die Restriktionskarte des kleinsten aspC Sub-Klons (paspC
3-4) wurde durch eine Kombination aus einzelnen und
doppelten Restriktions-Digests wie oben beschrieben aufgeklärt;
siehe Fig. 4. Die asp-C-Sub-Klone besitzen keine
Restriktionsstellen, die ermöglichen, daß das Insert sauber
herausgeschnitten werden kann, da sie durch Ligieren von Sau3A-
Fragmenten in den BamHI-Ort von pAt 153 hergestellt wurden,
eine Arbeitsweise, die den BamHI-Ort nicht regeneriert.
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Das paspC3-4 (pME98) wurde zum Transformieren des E. coli-
Prototrophs HW519 verwendet und produzierte bei der
Fermentation Transaminase-Gehalte, die denjenigen von paspCl-1
äquivalent oder besser als diese waren. Der pME98 tragende
E. coli HW519 hat die Hinterlegungsnummer ATCC 39501.
Beispiel 8
Erhöhte Ausbeute an Aminosäuren
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In den Aminotransferase-Enzyme benötigenden Reaktionen in
der Fig. 1, den Reaktionen Nr. 10 und Nr. 13, erleichtert
die Anwesenheit zusätzlicher Aminotransferase-Enzyme die
Aminosäure-Synthese. Dieser erhöhte Gehalt an durch das
aspC-Gen synthetisierten Aminotransferase-Enzymen befähigt
eine Zelle, eine geschwindigkeitsbegrenzte Reaktion bei dem
Schritt der Transaminierung zu überwinden.
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Ein das aspC-Gen tragendes Plasmid der vorliegenden
Erfindung wird mittels Techniken, die in der Biochemie
wohlbekannt sind, in eine Bakterienzelle eingefügt. Dieses
eingefügte Gen produziert eine Boten-RNA, die die Synthese
höherer Gehalte an Aminotransferasen katalysiert, wenn die
Bakterienzelle in einem geeigneten Medium kultiviert wird. Die
Anwesenheit dieser erhöhten Gehalte an Aminotransferasen
katalysiert erhöhte Gehalte an Aminosäuren. Die Aminosäuren
werden dann aus den Zellen und Medien mit Hilfe von
Reinigungsprozeduren geerntet, die in der Gärungswissenschaft
wohlbekannt sind.