JPS59192090A - アミノトランスフエラ−ゼ合成をコ−ドする遺伝子を含有するプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分封 本発明は、迫転子工孝的手法によるプラスばドの４＋’
Ｉ）染および使用に関する。これらのテラスミドは、ア
ミノ酸合成の除に用いられるアミノ基転林１腎素をコー
ドするホ仏子を貧有するように、ＩＩＩＩＪ限エンドヌ
クレアーゼを用いてｍ　ｒｊｙされる。これらのプラス
ミドは、六、１ＪＩＵ！４紺施中のアミノ基転移ｈｒ索
の合成を併進づ−る。この合成により、アミノ基転移酵
素の生成層か増加し、アミノ酸生合成において、アεノ
基駄柊廓素は律速扱階ではな（なる。

アミノ基転移酵素によるアミ７１波プリカーサ−分子に
おけるアミノ基類移反応は、Ｕｍｂａｒｇｅｒ（Ａｎｎ
。

ｕｅｕ、Ｂｉｏｃｈｅ＋ｎ１ｓｔｒｙ、　４７’　：　
５３３−６　Ｑ　６　。

１９７８）にｉｆ己ソ」さされて℃・る。５６４頁に、
Ｕｍｂａｒｇｅｒは、仮か王として、グラム隘性細ヒで
ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍの場合を記述していることを示
唆している。しかし、それらのアミノ酸合成の株式おま
ひ調舶は、必ずしも晋：ｉＪ＋ｎ　［Ｊ’Ｊなもの　で
ない。この瀾文中で、アミントランスフエラーセゝとト
ランスアミナーゼは、同犠胎として仏イつれてい句。ト
ランスフェラーゼ゛Ａ、ＢおよびＣを定にす１−る６ｒ
、名およびこの命名の成立について、Ｕｍｂａｒｇｅｒ
は５５０からｂ５２貞およυ・５８１から５８２負に紬
；にている。トランスアばナー七″’Ａ　、　Ｂ　、　
Ｃθ）后す名におこりうる遊札ｔメｊけるために、それ
らに代えて、Ｕｍｂａｒｇｅｒかｂ８２貞に矩馴して℃
゛イよ５う、ホ伝学的用詔を用いる。ａｓｐ　Ｃ止プ転
子生成物はアスパラギン酸、グルタモノ淑、フェニルア
ラニンおよびチロシンを生ルにするような、アミノ畝プ
リカーサ−におけるアミノ基転林ノヌ応を触峙１−る。

ｔｙｒ　Ｂ　ｉｊ＝、　ｆ５　子は、フェニルアラニン
、チロシン、グルタメート、アスパルテートおよびロイ
シンを生成１−゛るよ５な、アミ７１波プリカーサ−に
おけるアミン基転移反応をハリ・妹する。ｉｌｖ　Ｅ迎
転子生成物はインロイシン、バ）リン、ロイン７、フェ
ニルアラニン、グルタメートおよびアラニンを生成づ−
るような、アミノ酸プリカーサ−におけるアミノ基転移
ノ支応を触媒する。

Ｅ、ｃｏｌｉに１２株の退伝学的地図上でのａｓｐ　ｃ
　。

ｔｙｒ　Ｂおよび１ｌｖＥ、ｉ１ｑ伝子の位Ｗ％まＢａ
ｃｈｍａｎｎ等によｒ、＋ｇａｉｒｇされ−８６されて
いる。（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉ−ｃａｌ　Ｒｅｕｉ
ｅｗｓ、　４４　；　１−５６．３月、１９８１゜ｇ、
ｃｏｌｌＫ　１２地図の２０マイニユートに位置してい
るａｓｐｃ−Ａ、、広子は、ここでアスパラギン酸アミ
ノトランスフェラーゼと称されている酵素をコードし、
Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　
Ｅ、０．２　、６゜１、１（Ｂａｃｈｍａｎｎ　等、４
頁）を与えられている。

Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ　１２地図’ｙ’１マイニュートの
位置にあるｔｙｒＢｉ伝子は、転子シン寸たは芳香族ア
ミントランスフエラーセ゛と称する酵素をコーードし、
Ｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｍ１ｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　
Ｅ、Ｃ，２、ｔ５　、　ｉ　、　５（ＢａＣｈｍａｎｎ
　＊−、２１頁）を与えられている。

Ｅ、ｃｏｌｉ　　Ｋ　１２地図８４マイニュートに位′
置スる１１ｖＪｉ’ｉ）ｙ仏子、ここで枝分れ佃アミノ
酸のアミノドランスフェラーゼと称される酬すヲコード
しＥｎｚｙｍｅ　Ｃｏｍｍｓｓｉｏｎ　Ｎｕｍｂｅｒ　
ｐ’、ｃ、　２．６．１．４２（Ｂａｃｈｍａｎｎ等、
１０頁）を与えられている。

上記のＵｍｂａｒｇｅｒの”ｔｚ”ＦおよびＥａｃｈｍ
ａｎｎの著真を本明細書で参照文献として用いる。

反応はＧｅ１ｆａｎｃＬ寺により明らかにされ（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ７．１３０　：　４２９−４４
０．４月、１９７７　）　、］ｆ１．ｃｏｌｉ　　Ｋ　
１２甲の、チロシン、フェニルアラニン、およびアスパ
ラギン酸（アスパルテートノのｄθｎｏｖｏ生合成に必
安なアミノ基私林酔素活性の本買的にすへてに関与して
いるとされた。しかし、１ｌｖＲｉ退伝子生爪物か存′
＆−，′１−るのみでも、フェニルアラニン要求ひは市
失し、その生成物がフェニルアラニンプリカーサ−にお
けるアミノ基転ｓ戊応を＃ｉ　ａ、する能力を示唆する
。

形質導入用のファージラムダが用いられた（　０ｈｒｉ
ｅｔｅｎｓｅｎ　ａｎｄ　Ｐｅｄｅｒｓｅｎ　Ｍｏ１．
Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ。

１８１：５４８−５５１．１９８１）。バクリテジオフ
ァージラムダ中のａｓｐｏｊ＋［域はりボゾーム蛋白′
Ｊ！、Ｓ１のス上、転子の惧袷加に用いられた。佑Ｆ死
の目的では、それらのＳ１退伝子は）０ラスミド上に組
み込贅れた。しかし、トランスアミナーゼ生産の目的で
、Ｆ３．Ｂｐ　Ｃｊｌ伝転子プラスばド中にクローン化
されたことはノよい。ａｓｐ　Ｃ鋼環は、ａｓｐ。

およびｔｙｒ　Ｂ　；ｌｉ伝千を欠如しているナロシン
栄養要求体甲の形買専入ファージを分離づることを容易
とするためのマーカーとして用いられた。この形ＪＡη
φ人ファージば、商レベルのアミノトランスフェラーセ
゛２勺＝　＃−Ｊ−るＱ）にオ、当でンよかった。

本発明の°政杓 本願発明は、アミノ酸の細困による合成馨コ用じて用い
られるアミントランスフエラー−ビｆ’Ｊ〜ドづ−るｉ
１３伝子θ）単随およびこれらのアミントランスノエラ
ーセ゛遺転子乞鬼−有するフ０ラスεドの４４条に関１
−ろ。

くのコピーを含有１−る。本願発明は、細困祷胞中で増
加した幾度のアミントランスフェラーゼ酔索を合成′１
−るのに、これら先アミントランスフェラーゼ退転子・
を用いることを記載する。木ノ乃」児すコ（・工、−ｒ
ミノトランスフエラーセゝの生詐扇？　Ｊ’ｆｌ　）、
１１・さゼる方法馨８己載する。本願発明Ｑ４、アミノ
トランスフェラーゼ゛Ｍ！ｉ・媒反応が律速段１ｙｋで
あるアミノ惜合欣の改良方法を４が一体する。本願４Ｇ
明は、フェニルビルビア　ｕｋのフェニルアラニンへの
アミントランスフエラ−セ’／又応が律速Ｊ我１編であ
るＬ−７工ニルアラニン合成を増加させる方法を提供す
る。本ＪＪｔ１１梶明は、′ｈ査族アミントランスフェ
ラーゼ１１？索をコードづ−るｔｙｒ　Ｂ氷転子のニュ
クレメチド配タ１］ヲ記載する。本＆ｕ　＝　Ｉｑは着
仏子ｔｙｒ　ＢによりコードされるＳ香〃矢ア、ミノト
ランスフェラーセ′のアミノＩ狭自己列を記載する。

アεノトランスフェラーセ゛ｉＷＩ転子のａθ丁〕ｃ。

ｔｙｒ　Ｂ　、　ｉｌｖ　Ｅは、アミノ酸のカルボニル
フ０リカ〜サーのアミ７基転朴故応を触媒するアミノト
ランスフェラーゼの合成をコードブるｔ、Ａｓｐ　Ｃｊ
　ｈ転子はトランスアミナーゼＡ（アスバルテートアミ
ノトランスフエラーセ゛）　（ＥＣ２，６，１，１）を
コードし、アスパルテート、グルタメート、フェニルア
ラニンおよびチロシンの合成の際の触媒としての活性な
有づ−る。ｔｙｒ　Ｂ遺伝子をまチロシンまたは方査族
アミントランスンエラーセゞ（ＥＣ２，６，１，５）を
・コートシ、フェニルアラニン、ラーロシン、グルタメ
ート、アスパルテートおよびロイシン合成の除の触媒と
し−この活性を有する。ｉｌｖ　Ｅ遺伝子はトランス７
　ｉナーセ゛Ｂｇコードし、インロイシン、バリン、ロ
イシン、フェニルアラニンおよびグルタメート＠成の除
０ノ凧媒とじ１の活性を＋ｌづ゛る。

ａｉｌｌｌ　ｍ４でのアミノ酸合成においてこのアミノ
基転移ノ！応か４４１列・ｌ；’、Ｊ　Ｋなろ時、これ
らのプラスミドに存在するアミントランスフエラーセ゛
蜘仏子は、天白加してアミノトランスフェラーゼ゛の合
成ケ”’Ｊ　能とすく）。イ１′速イど克力１＜−（会
に十分のγミノトランスフエラーセ゛σ）合ＪＪｖｆ−
工−γミノ酸牛合成の迷朋乞増力１させろ。

こ牙＋　ｆ：ｌ　（／１）′ラスミド＆工泊１月ｌｄ中
ｆ（’存在するアｉノド°ノンス′７エシ〜セの全２１
４″？Ｊ冑力１１さすのに）Ｉいらね、つぎのように使
用しうる。アミ７基転朴故応は廁加ｌ内、細／ｌ１１１
俗出９勿内で用いう、るし、鷲たは、１′ｌＩシ出脅ｌ
を特定のアミノトランスフェラーゼの和製に用い、そし
て、オη弐した状Ｊ甜のもσ）を１９・用しつる。

本発明の目的（工、アミノトランスフェラーゼ゛の合成
？コードしつる、ひとっ葦たはひとつより多くの水仏子
を含有する、プラスミドのＪ５な、知色体外の安素を琳
榮１−ることである。

本発明の別の目的は、アミントランスフエラヨとつｆた
はひとつより多（を含有１ろプラスミドを構築″１１４
−ろことである。

本発明りさらに別の目的は、アミノトランスフェラーゼ
゛の合成方法である。

本発明のさらに別の目的は、ａｓｐ　Ｏ、ｔｙｒ　Ｂ’
またはｉｌｖ　Ｅ　ｉｔ伝転子生成９夕ｌであろアミノ
トランスフェラーゼゞの合成方法である。

ｉｌｖ　Ｗル転子を含有するシラスミドを微生物中に挿
入し、生理的に有効な濃度σ）アミントランスフェラー
ゼを合ルνさせ、アミノ酸の合成速度を増加さづ−こと
による、アミン敵のプリカーサ−分子におＵ′るアミノ
基肋２く移走、度を増力［１さゼ°ることである。

たはｌｌｖ　Ｅ遺伝子−を宮有し、微生物中で発決され
るプラスだドによりコードされるアミントランスフェラ
ーゼ゛によりフェニルピルビン酸におけるアは）基転移
を増力ＩＩさゼる方法である。

本発明のさらに別の百〇′ジは、ひとつまたはひとつよ
り多くのアミントランスフェラーゼ遺伝子を含＋１′１
−ろフ０ラスミドｗ　４人しそして発胡さ１−ことによ
り、アミントランスフェラーゼが伸透酔素である、ｊｌ
＋１１］施中のアミノ職合欣を増力ｐさせる方法である
。

木ツレ１シ」のさらに別の目的は、フェニルピルビン酸
におけるアミノ基Ｑ＋ｔ＝　；Ｋ　）又応がフェニルア
ラニンのｆｉ成において神速段階と７ｆつている野生型
の微生物において、アミノドランスフェラーゼ遺伝子乞
含有するシラスミドを導入しそして兜増させることによ
り、フェニルピルビン酸よりフェニルアラニンの合成を
増力１１さ七−ることである。

本発明の別の目的は、ｐ−ヒドロキシフェニルピルビン
酸のトランスアミナーセ゛かチロシン合成において律速
段階である野性型倣生物において、アεノトランスフエ
ラーセ゛退転子を含＋Ｊ１゛るシラスミドを導入しそし
て発伊させることにより、ｐ−ヒドロキシフェニルビル
ビ７ｍよりチロシンの合成を工胃力１さゼることである
。

本発明のさらに別の目的は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
ｃｏｌｉのような腸内細餉にアミノトランスフエラーセ
゛迫仏子含有プラスミドを尋人しそして光紗させること
である。

図囲についての記載 第１図は、芳合族アミノ酸であるチロシン、フェニルア
ラニン捷たはトリプトファンσ）合成のための生合成肘
路を示す。

汀，２図は、種々のｍｌ影株において、ｔｙｒ　Ｂ　。

ミノトランスフエラーセ゛の存在寸たは欠如を示す、生
のままの蛋白質のケ８ル市気泳動図である。

フラグメントのＤＮＡニュクレオチド配列を記載づーる
。

第４図はｔｙｒ　Ｂ遺伝子によりコードされるアミント
ランスフェラーゼ゛のアミノ酸配列を記載する。

第５図は、中間株および奇託株Ｈ　’Ｗ　１　５　９を
与える課程ン示づ一Ｅ．ｃｏｌｉ流れ図を示づ。

第６図は、ｔｙｒＢ＋プラスミドの変型を示す。

第７図は、ａＳｐＣコ真伝子を転子プラスミドの匍」１
羽地図？示−づ−。

具体例の詳細ｙ；ｃ　ｉ＋５？明 アミントランスフェラーゼ゛またはトランスアミナーセ
ば、アスパ゛ルテートまたはグルタメートσ）ような仙
乃坏分子より、オギザロ酢酸のようなアミノ酸のα−ケ
ト−ｅプリカーサ−受容体にアミン基な共勺結合的に転
移さセーる酪素の一族である。

このＪ又応は国中−１’Ｊ　ｉｌＷ的で、アεノドラン
スフエラー−ｔ！″′はアミノ１（の＠ｈｖおよび分解
に用いつる。

アミノ酸生合成は、生合成の最ｆ：段階として、アξ）
基転移をしはしは必翅と１−る。このような７０ロセス
のひとつの例は、グルタメートのα−ケトグルタレート
への同時的笈振を伴ンよう、フェニルピルビン酸におい
てアミノ基転移ヲおこないフェニルアラニンを生成させ
ることである。これは第１図に段１者１υとして示され
ている。芳有族アミノ酸であるフェニルアラニンおよび
チロシンの合成共にＪに終段１塙においてアミントラン
スフェラーゼの作用を必袈と′１−る。グルタメートよ
りアミノ４を転移させるアミントランスフェラーゼ゛に
よリフェニルビルベー）Ｙフェニルアラニンに変よる（
第１図、段１若１０）。同様に、グルタメートよりのア
ミノ基は４−ヒドロキシフェニルピルベートに移されチ
ロシンを生ずる（第１図、Ｊｔｌ有１２）。それぞれの
アミントランスフェラーゼ゛はアミノ基転移故応に有オ
リな基質を有１−る。しかし、仙の基質に対する油性も
残存しており、各アミントランスフェラーゼ゛は、ひと
つより多くのアミノ虚の合成に関与しうる。ａｓｐ　Ｏ
遺伝子によりコ−ドされるｇ、ｃｏｌｉ　トランスアミ
ナーゼは、アスパルテート、グルタメート、フェニルア
ラニン、チロシンに活性を有するｔｙｒ　Ｂ遺伝子によ
りコードされるＥ、ｃｏｌｉ　トランスアばナーゼはフ
ェニルアラニン、チロシングルタメート、アスパルテー
トおよびロイシンに活性を有づ−る、１ｌｖＦｉにより
コードされるＥ、ｃｏｌｉ　トランスアミナーゼはイン
ロイシン、バリン、ロイシン、フェニルアラニンおよび
グルタミン酸に油性を有する（　Ｕｍｂａｒｇｅｒ５８
２頁）。

他の微生物においてチロシンおよびフェニルアラニンを
合成するための弛の経路か存在することが仰られている
。そのようなひとつの経路はシアンバクテリアおよびＰ
、ａｅｒｕｇｉｎｏθａＶｃ見出だされ１プレフエネー
トを直接にテレチロシンに変える。

フ０レチロシン＆よ、チロシンまたはフェニルアラニン
に直接ｇ撲するための基質となる。相応するトランスア
ミナーゼに対する類縁のクローン化されたトランスアば
ナーゼ遺伝子は、ゾレフエネ〜トが溝刺レベルに存在す
る時に、プレチロシンを合成するＩり応を増大させるの
に同様に有用である。

このトランスアミナーゼは、チロシンおよびフェニルア
ラニンの合成速度を増力Ｖさぜるσ）であろう。

芳香族アミノ酸の合成におけるｍ素的或（堝は、第１図
に、段１％　１−２０として示しである。ふつう、それ
ぞれの肘素反応のル１若は、酵素の合成を調節すること
によりおよび（！たは）計索廁、媒紋応速度をアロステ
リンクＫ　’＋１ｊｌＪ　（ｔｉｔ）することで調加」
されている。野生Ｍ微生物は、ふつう、これらの１ｌｊ
ｌｊ御により、とのアミノｎりも廻刺住座することほな
い。特定のアミノ酸の合成について面１全１・か不Ｂ化
されているかなたはパイ−バスされている；！ｉ−異株
を分離しつる。それらはふつうｑラタのアミノ段を鍋剰
生狸１−る仰向を示１−０Ｌ　−ｐｈｅの→合には、調
節は必然的に初雑である。つまり、それの合成経路の１
部は他の芳香族アばノ敞であるＬ−チロシン（Ｌ　−Ｔ
ｙｒ　）およびＬ−）リプトファン（Ｌ　−、ｔｒｐ　
）の合成゛経路と共通しているからである（第１１ヌ１
をみよ）。

他のイ凌生物におけると同様に、Ｅ、ｃｏｌｉにおいて
も、この経路・における兜１段階は６個のＤＡＨＰシン
セターゼアインずイムにより触媒される。それぞれが３
個の最終生成物のひとつに感受性である。さらに、コリ
スメートにおける枝分れ点のあとの経路中の第１０段１
宿も、フィー艮バック１狙害を受けやすい。アンスラニ
レートシンセターセゝ′はＬ　−ｔｒｐによりＩＳｌ：
ｌ書されそして２榎のコリスメートムターゼアイソザ゛
イムはＬ　−ｐｈｅおよびＬ−ｔｙｒにより阻害される
。関連する酵素の一足畝もまた１１ｉ１　ｍ　’＜受け
る。ｔｙｒ　Ｒ遺伝子の生成物であるチロシンレプレッ
サーは、ＤＡＨＰシンセターゼ（Ｌ−ｔｙｒ）およびコ
リスメートムターゼ（Ｌ　−ｔｙｒ　）の発珈ｋ　１ｊ
ｌＪ　１１１：する。これらの２つの酵素に対する遺伝
子はあわせてチロシンオペロン？栴取する。ｔｒｐ　Ｒ
遺伝子の生産物であるトリフ０トフアンレデレツサーは
、コリスメートｆ　Ｌ　−ｔｒｐにＫｍするｔｒｐ　オ
ペロンのｔＩｌイ素のすべての兜均を制御する。このレ
ギュレーター分子はまたＤＡＨＰシンセターゼ（Ｌ　−
ｔｒｐ　）の光物ン市り徊Ｊする。さらにコリスメート
ムターセ゛（Ｌ　−ｐｈｅ　）　をコードするｐｈｅ　
Ａの発功およびｔｒｐオペロンの発刊はＬ　”　ｐｈｅ
　ｏ）一度に感受性となっている。ｔｒｐオペロンは、
アテニュエ〜ター／リーダーペブ′チドコントロールシ
ステムによりＬ　−ｔｒｐのレベルに感受性とされてい
る。

アミノ酸を逼刺生＃イーる変異株は、しはしは相応する
アミノ酸類蘇体に幻づ−る抵抗性に関して選抜すること
で分離される。Ｌ　−ｐｈｅ生座の場合には、不油性の
ｔｙｒ　Ｒおよびｔｒｐ　１（レプレッサーを−Ｗ日ソ
に有する。３−フルオル−ナロシンおよび５−メチル−
トリフ９トフアン也おＬ性の変異株を選択′１−ること
により、ＤＡＨＰ　（Ｌ　−ｔｙｒ　）　ｉよひＤＡＨ
Ｐ　（Ｌ　−ｔｒｐ　）の光坊について脱レフ０レスさ
れた株を分離しつる。コリスメートムターセ゛（Ｌ　−
ｐｈｅ　）がＬ　−ｐｈｅに抵抗性の変異株は、２−チ
ェニル−アラニン抵抗性に関し選抜１−ることで分離し
つる。フィードバック１５目筈に抵抗性のＤＡＥＰシン
セターセ（Ｌ　−ｐｈｅ　）は、他２種のＤＡＨＰシン
セターセゞアインずイムを欠如する変異ａＹます構築づ
−ることにより分離しつる。このよう’ｉ’ｘ　株では
、Ｌ　−ｔｙｒおよびり、　−ｔｒｐσ）合成か、培地
中のＩＪ−ｐｈｅの蛍に感受性である。Ｌ　−、ｐｈｅ
を含有づ−ろ培地中で発青しつるが、Ｌ　−ｔｙｒまた
はＴＪ　−ｔｒｐを欠如する変異株は、ふつつ、ＤＡ月
Ｐシンセターセ゛（Ｌ　−ｐｈｅ　）のフィードバック
抵抗性型を含有する。

ところで、これらのアプローテヲ岨合わせると、Ｌ　−
ｐｈｅを過剰生性１−る菌株を与えるであろう。

それの合成紺・路は、Ｌ−ｔｙｒおよびＬ　−ｔｒｐの
合成経路と共通ずるところが太ぎいので、Ｌ−ｐｈｅ合
成について序助とづ−るにはＬ　−ｔｙｒおよびＬ　−
ｔｒｐの生成を防かねはならない。ひとつの単純な便法
は、ＴＪ　−ｐｈｅ過剰生産株にｔｙｒ　Ａ変異を導入
し、Ｌ　−ｔｙｒ　ｔ）’＞　蓄積’＆防き゛そしてＬ
　−ｐｈｅ　ヘのブリカーザーの望寸ぬ方向へのかたま
りを防ぐことである。同様にｔｒｐオペロン全体を除け
はＴＪ　−ｔｒｐ　（７）　４槓を防ぐであろう。もち
ろん、そのような変異株は、発有できるよう、これら２
つのアばノ厳を含有′１−る培地中で培養せねはならな
い。

上記に＆賛ヲ示したアプローチの組合わせで、Ｌ　−ｐ
ｈｅの合成に関して調節の、はづれた菌株を生シ、ツレ
は有為な量のＬ　−ｐｈｅアミノ酸を蓄積する。ところ
で、生合成経路での律速段階は、ふつう開側］の及はさ
れている部分である。１４　’ｆａｎのはづれた菌株で
は、新しい段階か律速性となりつる。

それで、Ｌ−ｐｈｅ生産をさらに升′大さすには、新規
律速段階を見出だし、対応づ−る酵素の油性を増力０さ
せることが必要である。それにば、つぎに示ｊ６方法の
ひとつを用いうる。

（、ａｌ　　対応する酵素かより大量に存在する変異株
を分離づ−る。

（ｂｌ　　対応する酵素がより高い比活性を有する変異
株を分離する。

（ｃｌ　　ｔａｌのようにするが、ただし、対応する酵
素に対する遺伝子を適当なマルチイーコピープラスミド
上へクローン化し、それｋ　Ｌ　−ｐｈｅ　Ｍ９Ｎ＋生
前性の菌株に導入する。

そのような酵素が、ふつうの状態で調節を受けているも
のでなければ、最初の２つの肝の変異株を分離するのは
困難であろう。γ古注を瑠大きせる最善の方法は対応す
る酵素に対する遺伝子をクローン化することで、ｂる。

それには、クローン化しようと欲する酵素に対する遺伝
子を担う適当なドナー株の遺伝子を、廓当なベクターに
中米する、適当に調製されたＤＮＡにリケゞ−ト１−６
゜ついで、新らたにクローン化された遺伝子の活性を欠
如する変異株を形買転侠する。実験上の問題はその遺伝
子を分離することである。このような活性の欠如か、爵
だのアミノ酸に対する栄養Ｊ、！に求株のように、受は
入れる菌株に認陣しつる表切型を与えるならば、受は入
れる凶株中σ）そのような欠偵を補完しつるようなりロ
ーンの能力なオＩＩ用して、対応′１−る遺伝子を和う
クローンをＩＹ１１単に選択しつる。別法として、コピ
ー数の低いフ０ラスミドかずたは１当なバクテリオファ
ージベクターにまず屑転子をクローン化し、ついで、望
ムマルテイーコビープラスミドにサブ−クローン化しう
ろ。別件には、対応する遺伝子の近くに過当なブロファ
ーゾを和う菌株を栴成し、清涼性のドナー株を誘発して
生ずる溶解物を用いて受答様に形質導入して原栄養体と
づ−ることにより、望むか転子を有゛する、特殊化され
た形負転俳用ファージを分離しうる。対応する遺伝子は
ついで、ラムダのような、そのように笹妹化された形′
！を尋人用ファージのＤＮＡよりサブ−クローンしうろ
。

対応する遺伝子の変異か采養要求株のよつ７’ｃｚ答易
に同定しうる衣胡型を与えないなら、そσ）よう１．ｃ
遺伝子のクローン化は、妬択する手段の矛）る近りｊの
ノｈ転子をクローン化し、その−クローンを、その目イ
索を欠如する受答株中に導入したあと、望む忠云子の生
成物についてアンセイして、ノ１応１−る遺伝子の存在
に関して、クローンをスクリーニングしうる。パクテ１
１オファージまたはコスミド（ｃｏθｍ１ｄｅ　）　’
７含有するもののような大磨々ＤＮＡフラグメントのク
ローン化ヲｎＪ能にする方法を用いて、そのようなアプ
ローチは容易となる。望む遺伝子の近傍に′＠−易に選
択しつるマーカーか知られないなら、対応１−る遺伝子
の仙１＋／？−１’３易に選び出しつるトランスポゾン
弾入物たとえは、テトラサイクリン払抗性をコードする
Ｔｎ　１Ｑ仲入物を４月う１株を分離することも可能で
ありうる。このマーカーを含有才る大型ＤＮＡフラグメ
ントｖついでクローン化し、失するンアージ芽たはコス
ミドを対応する】％＋伝転子存在に関してフン殖択して
ゆく。そして、そのｉｉ仏子は、ついで、コピー叡の商
い適当なプラスミド中にザブ−クローンし５る。

つき゛に、ブ＝　Ｍへ例１で用いるＥ、ｃｏ１１０株を
示す。

各様とあわせて昶Ｉ　Ｐｌ、ｌ性ゲッタイブ（九・転子
型）および由来を示す。栄養要求型ＨＷ　１５９　（ａ
ｓｐ　ｃ−およびｔｙｒＢ）に至る、Ｅ、００１ｉの中
７ｆ＋、ｌ　８１（のＩ’ＡＩ達ケ第５図に示１−ｏひ
とつの株’！　（ｔｉｌに変長：ｊる方法も第５図に示
してお（。

菌株ＨＷ　１５９、ａｓｐ　Ｏ−およびｔｙｒ　Ｂ　＄
ｌｌ＝休け　Ｔｈｅ　　Ａｍｅｒｉｃａｎ　　Ｔｙｐｅ
　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　。

１２３　Ｄ　Ｉ　　Ｐａｒｈｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ、Ｒ
ｏｃｋｖｉｌｌｅ、　ＭＤ２０−８５２　、　Ｕ、Ｓ、
Ａ、　Ｋ寄託され甫号ＡＴＣＣ６’１２６０を受けてい
る。

トランスアミナーゼプラスミドの構築および使用例とし
て、Ｌ　１　ｐｈｅを過剰生産するＰｉ、　０ｏｌｉの
新菌株を構築した。Ｌ　−ｐｈｅ合成経路より系統的に
除調節することを包含する多段階方法でこれを達成した
。このような除調節された菌株では、最終段階、つまり
ＰＰＡのＬ　−ｐｈｅへのアミン基転移が発酵中の速度
制限となることが分った。そしてＰＰＡが蓄積して障害
効果を与えた。それで、さらに別の例として、Ｅ、　０
ｏｌｉよりのチロシン（芳香族）アミノトランスフェラ
ーゼ遺伝子をマルテイーフピープラスミドにクローン化
した。Ｌ　−ｐｈｅ過剰性産株にこのプラスミドを導入
するとＰＰＡの生成が減少し発酵の効￥が上昇する。さ
らに追加の例として、Ｅ、　０ｏｌｉのアスパルテート
アミノトランスフェラーゼに対する遺伝子を高コピー数
プラスミド上にクローン化した。この酵素はまたＬ−ｐ
ｈθアミノトランスフェラーゼ活性を有し、このプラス
ミドをＬ　−ｐｈｅ過剰生産株に導入してもやはりこの
方法の効率を上昇させる。

ｔｙｒ　Ｂまたはａｓｐ　ａを有するプラスミｐを担う
株は、対応する酵素を著しく過剰生産する点で追加の用
途を有する。それで、それらは、これらの酵素の新規で
有用な供給源となる。

上においた場合に、適当な遺伝的背景において、そのプ
ラスミドを維持するための選択圧となる点でも有用であ
る。この選択圧は、抗生物質で選択してゆ〈従来の方法
より有利である。

例１ プラスミードＤＮＡはつぎのように調製した（　Ｎｕｃ
ｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　９　：　２９
８９−２９９８　（１９８１）のＪ。

Ｂｕｒｋｅおよびり、工ｓｈ−Ｈｏｒｏｗｉｔｚの方法
を適用）。

望む細菌株は、適当な抗生物質を加えたＬ−ブロス（Ｌ
　−Ｂｒｏｔｈ　）の５−中に飽和するまで培養した。

培養物は１５１ｄのＣＯｒ、ｅＸチューブに移し、１０
．０００１１’Ｍで１分間遠心して細胞を沈層させた。

上清をけいしやし、ペレットは５００μｍの新鮮な清液
ノ（５０ｍＭ１７）：ｏ−グルコース、２５ｍＭのＴｒ
ｉｓ　ｐｉ２８−０．１０　ｍＭのＥＤＴＡおよび２■
のりゾチーム−ｍ１−１）に懸濁させ、室温で５分イン
キュベートした。新鮮な溶液ＩＩ’　（０，２ＭのＮａ
ＯＨおよび１％のＳＤＳ含有）の１ｍｌを加えて細胞を
溶解した。これをおだやかに混合し、ついで氷上で５分
インキュベートした。ついで冷溶液■（２９ｍｌの氷酢
酸に水を加えて約６０ｍ１とし、１０ｍ１のＫＯＨでＰ
Ｈを４．８に調整し、全体を１０　［］ｍｌとする）を
加え、十分に混合した。氷上にさらに５分おいてから沈
殿したクロモシームＤＮＡを、ｉｏ、ｏｏ。

ｒｐｍで１０分遠心してペレット状とした。上清を新し
い１５ｍコ、のｃｏｒｅｘチューブにけいしゃし６．７
５ｍ１のエタノールを加えた。チューブは氷上に１５分
放贈した。ＤＮＡは１０，０００　ｒｐｍで１０分遠心
してペレットとした。上清を流し出し、ペレットを１［
１ｍＭのＴｒｉ８　（ｐＨ８，０）　１　ｍＭのｍＤＴ
Ａ、２０μｍ０６Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７，０）を加
えて十分に懸濁させ、ＤＮＡ　′ｆ：Ｅｐｐｅｎｄｏｒ
ｆミクロ試験管に移した。ＤＮＡは、０．１％の８−ヒ
ドロキシギノリンを含有する超純粋のフェノールの２０
ｏｐｌで２度抽出した。なお、このフェノールは、１ｍ
ｌのＴｒｉｓ　ｐＨ８，０に対して２度そして１Ｑ　［
］　ｍＭ　ＴｒｉｓｌＱ　ｍＭ　、ＫＤＴＡ　ｐＨ８，
Ｑに１度予備平衡させたものである。残存フェノールは
ｉ　ｍｌのジエチルエーテルで４度抽出して除いた。つ
いでＤＮＡは５００　ｐｌのエタノールを加え、ドライ
アイス／エタノール洛中で１０分インキュベートして沈
殿させた。

ＤＮＡは１０，０００　ｒｐｍで１０分間遠心してペレ
ットとした。上清をすて、ペレットはｉｏ％エタノール
水（Ｖ／Ｖ　）　ＯＪ　５００　ｐＥ−ｉｏ再）Ｍ　Ｆ
ｕ　シタ。ＤＮＡＧ１１０，０００　ｒｐｍで１Ｄ分遠
心して再ペレット化し、上清をすて、ＤＮＡ含有ペレッ
トを減圧デシケータ−中で６Ｄ分間乾燥した。最後Ｋ　
１０　’ｍＭのＴｒｉｓ　、　１ｍＭのＫＤ’ｌ’Ａの
５ｏμｍ中に再溶隋し、−２０℃で保存した。

この調製物は一般に使用菌株がＭＯ１０６１に由来１−
る時に約５μｇのプラスミドＤＮＡを与えた。この調製
物は著量のＲＮＡを含有し、それで、この特許に記載の
制限消化物はすべて、ＤＮＡ５ｅｓ　を分解するために
９０’Ｑで１５分前処理した、１００ｐｇｍｌ−ｉ　Ｒ
ＮＡ５ｅ　Ａを含有した。この調製法は、５０ｍ力培養
物からプラスミドを分離するようにスケールアップしつ
る。

例２ （ａ）　ｔｙｒ　Ｂ遺伝子のクローン化ｔｙｒＢを担う
コスミドベクーンおよびＤＮＡの、Ｍａｒｍｕｒ　の方
法（ＰＮＡＳ４６：４５３．１９６０）に準して実１ｉ
１１Ｘ　ｔ、た。このＤＮＡの１ＷＳを、つぎのように
して制限エンドメクレアーゼＳａｕ　３　Ａで部分的如
消化した。ＤＮＡ　（８０μｇ）を５０　ｍＭのＮａＣ
！ｌ。

６ｍＭの’Ｌｌ’ｒｉｓ　−ＨＣＩ　（）す（ヒドロキ
シメチル）アミ／メタン塩酸堪）、ｐＨ７，５，５ｍＭ
のＭｇＯ１２，１００μｇ／　ｍ　ｌのゲラチンを含有
するＳａｕろＡ緩衝液中で４１１０μｍにフィルアップ
した。このＤＮＡ溶液Ｇｔ８Ｘ５０μｌに分けた。５０
　ｍＭのＫＣＩ、ｉ　Ｑ　ｍＭのＴｒｉｓ　−ＨＯＩ、
ＰＨ７，４，３，１ｍＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン
テトラ酢酸、ジナトリウム塩）、１ｍＭ（７）シチ、ｔ
スレ（）−ル（ＤＴＴ　）、２００　ｐｇ／ｍ　ｌの牛
血清アルブミン（ＢＳＡ　）および５０％Ｖ／Ｖ　　グ
リセロールを含有するＳａｕ　３　Ａ希釈緩衝液中で、
Ｓａｕ　３　Ａ　（Ｎｅｗ　ＩＤｎｇｌａｎｄ　Ｅｉｏ
ｌａｂｓ）を２段階希釈した。７個の段階希釈液のそれ
ぞれの５μｍおよび未希釈酵素溶液の５μｍをＤＮＡ俗
液に加えた。添加酵素の飯は２．５から０．０２μまで
の範囲となった。１時間消化を続けて力）ら、６５℃で
５分インキュベーションして反応を止めた。

消化物のそれぞれの２μｍ宛を取り、０．７％Ｗｌアガ
ロースデルーＴＢＩＨｉ（５ＱｍＭのトリス−Ｈ０Ｉｐ
Ｈ８，３，５９ｍＭのホウ酸および１ｍＭのＥＤＴＡ　
）上で適当なマーカーとあわぜて電気泳動に処した。

エチジウムブロマイド（１μｇ／ｍ１）で１５分間染色
してから、ケゞルは、２５４ｎｍの照射下にＤＮＡを肉
眼で観察した。このようにして、４５ｋｂサイズの範旺
に最大量の物を与える試料を判定しえた。

この試料よりのＤＮＡを、下記のように詩編したコスミ
ドベクターｐＨａ　７９よりのＤＮＡにりヶ８−トした
。

ＰＨ０７９ＤＮＡの２５μｍ試料２個のうち１個を制限
エンドヌクレアーゼＨ１ｎｄ　ｍ　（Ｅ　Ｏ３，２，１
２−２１）で完全に消化し、他は制限エンドヌクレアー
ゼＳａｌ　Ｉ　（ＥＯ３，１，２３，３７）で完全に消
化した。６゜ｍＭのＮａ１ｌ、７　ｍＭのＭｇＯ１２，
７ｍＭのＴｒｉｓ　−Ｈ０ＩｐＨ７，４，１００ｐｇ／
ｍｌの１”５チンおよび１５単位のＨｌｎｄ　Ｉ！［（
Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｅｉｏｌａｂｓ　）を含有す
る１　００　ｐｌのＨｌｎｄ　ｌ［消化緩衝液中でＨｌ
ｎｄ　ｍ消化を行なった。６７℃で１時間インキュベー
ションした。ついで酵素は６５℃に５分間加熱不活化し
た。１５０　ｍＭのＮａ　Ｏ］−１６ｍＭのＴｒｉｓ　
−ＨＯＩ　ｐＨ７，９，６ｍＭのＭｇＯ１２，６ｍＭの
２−メルカプトエタノール、１００μｇ／ｍ　１のゲラ
チンおよび２５単位のＳａｌ　Ｉ　（Ｎｅｗ　Ｅｍｇｌ
、ａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ　）を含有する１０口μｍの
Ｓａｌ　Ｉ消化緩衝液中でシ去Ｉを消化をした。６７℃
で１時間インキュベートした。ついで酵素は６５°Ｃに
５分間加熱して不活化した。

これら２つの試料はあわせ、１０単位の牛腸ホスファタ
ーゼ（ＰＬ　Ｌａｂｓ　）でろ７℃で２時間消化して５
′ホスフエートを除いた。ｐＨａ　７９のあわせた試料
は０．３　Ｍ酢酸ナトリウムでｐＨ７，０とし１．２度
フェノール抽出し、ついで４度エーテル抽出した。２．
５倍容量のエタノールでＤＮＡを沈Ｄｔｌすせ、７０％
■／ｖエタノールで洗い、乾燥し、最終的に、１Ｑ　ｍ
Ｍ　Ｔｒｉｓ　−ＨＯＩ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ中に再懸濁
させて最終濃度５００μｇ／ｍｌとした。リヶゝ−ジョ
ン反応物は、１μｇの調ＷｐＨ０７９および１μｇの緩
衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ７，９、ｉ
　Ｑ　ｍＭのＭｇＯ１２，２０ｍＭのジチオスレイトー
ル、２５　ｐｇ／ｍ　１のゲラチンおよび１ｍＭのＡＴ
Ｐ　）中に含有した。反応混合物は３７℃で５分インキ
ュベートした。冷却し、Ｔ　４　ＤＮＡ　！Ｊガーゼ（
ｒａａ　６．５．１．１）を加えてリゲーションを開始
させた。

これらの反応は１５℃で４時曲続けた。リヶゞ−ジョン
混合物の４μｌ試料を、バクプリオーファージλ粒子中
にインビトローパーケージンクシタ。

両様ＢＨＥ　２６８８オヨ１ＪｎＨＢ２６９０ｉｊ、Ｎ
ｚｙ寒入プレートがら５　ＱｍｌのＮＺＹブｏ　ス（１
［］　ｆｌ　ノＮＺアミン（ＨｕｍＲｏ　５ｂｅｆｆｉ
ｅｌａ）、５Ｉの酵母エキスおよび２−５　ｇＭａｉｌ
　／リットル）に接神し、３０℃で通気インキュベート
し、Ｅ６ｏｏを０．３とした。培養物は、６０°Ｃの水
浴中につけて４５°Ｃとし、通気なしに４５℃で２０分
インキュベートした。ついで、２つの培養物を６７℃で
６時間激しく通気した。２つの培養物をあわせ、４℃に
冷却し、７０００ｒｐｍで２分遠心して採取した。ペレ
ットは、冷Ｍ９ミニマル培地（１リツトル中、６ＪのＮ
　ａ　２　ＨＰＯ４，３！ｊのＫＨ２ＰＯ４，０，５１
１のＮａ１ｌ。

１．０ｇのＮＨ，０１、オートクレーブ後８ＮのＮａＯ
ＨでｐＨ７に調整、無菌グルコースを０．２％Ｖ■に、
０ａＯ１２を［］、１１ｍにＭｇＳＯ４を１　ｍＭに添
加）の１００ｍ１で１度洗った。ペレットは５ｍｌの冷
コンプリメンテ−ジョン緩衝液（４０ｍＭのＴｒｉｓ　
−ＨＯＩ、ＰＨ８，０、Ｉ　Ｑ　ｍＭのスペルミジン−
Ｍｏｌ’、　　１Ｑ　ｒｉｒＭのプトレシン−ＨｏＩ、
０．１％Ｖ／Ｖ　２−メルカプトエタノールおよび７％
Ｖ／　Ｖジメチルスルホキサイド）で洗い、５０００ｒ
ｐｍで６０秒ペレット化した。

細胞は最後にｏ、２５ｍ１の冷コンプリメンテ−ジョン
緩衝液中に再懸濁させ、ミクロ試験管中に２０μｍ宛分
注した。数体窒素中ですぐに凍結させ、マイナス８０℃
に貯蔵した。

パッケージング反応のためには、２０μｍパッケージン
グミックスの１個を液体窒素より取り出し、それにすぐ
に１μｍの３　Ｑ　ｍＭのＡＴＰを加えた。

混合物は２分間氷上においた。ＩＪデートさせたＤＮＡ
の４’　ｐｌを加え、十分に混合した。３７℃で６０分
インキュベートした。３０分してから１μｍ０１ｍｇ　
／　ｍｌのＤＮＡａｓｅ　（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ）
を加え、試料が粘性を失なうまで混合した。このパッケ
ージされたＤＮＡ調製物にトリプトンマルトースブロス
中で約１．０のＥ６００まで発育させてＥ１０７株の２
００μｍを加えた。ＭｇＳＯ４も加えて最初濃度１０ｍ
Ｍとした。パッケージされたコスミドを６０℃で３０分
間吸収させ、そのあとで５００μｍのＬ”ブロス（Ｌｕ
ｒｉａｂｒｏｔｈ　：　’Ｉ％ＷＡバクトートリプトン
、０．５％Ｗ／Ｖバクトー酵母レキス、し、５％Ｗ／Ｖ
ＮａＯ１，１，２％ｗ／　ｖ−／”　ル：ｒ−ス、ｐＨ
７）を加え、さらに６０分６０°Ｃでインキュベートし
た。

細胞は６００μｇ／ｍｌのカルベニシリン（α−カルボ
キシベンジルペニシリン）を含有するＬ−寒天上におき
６０℃で２４時間インキュベートした。

カルベニシリン抵抗性コロニーを釣菌しＬ−寒天カルペ
ニシリンプレートに移し、４２°Ｃで１夜インキユベー
トした。菌株Ｅ１０７（３）はｄ、ｎａＢ変異を担い、
それで４２℃では発育不能である。

それで、野生型のドナーからのｄｎａ　Ｂ＋を担うコス
ミドクローンを獲得したコロニーのみがこの温度で発育
すべきはづである。このように、ｄｎａ　Ｂを有するニ
スミドクロー２８個が分離された。

ｄｎａＥマツプは、芳香族トランスアミナーゼの遺伝子
ｔｙｒ　Ｂに近く、そして、コスミドクローン化でドナ
ーＤＮＡの大きな挿入物を含有するプラスミドが得られ
るので、コスミドクローンのいくつががｔｙｒＢをも担
うと仮定することは合理的であった。クローンのいくつ
がかまさにｔｙｒ　Ｂを担うということはつぎのように
示された。

ｄｎａ　ＢクローンのそれぞれよりのフスミドＤＮＡは
、上記のように精製しそしてバクテリオファージλ中に
パッケージした。パッケージされたコスアミナーセ゛欠
如株ＤＧ４４に導入された。これら２つの変異はあわせ
てＤＧ　４４にＴ　ｙｒ　−Ａｓｐ−表現型を与える。

インタクトのｔｙｒＢ遺伝子を導入すれば、この株はチ
ロシンおよびアスパルテートの不在で発育するｎａ力を
快復すると期待される。この株で、ｔｙｒＢを有するク
ローンを直接的え選択してゆくことは容易でない。理由
は、ｐＨ０７９のような、ｃｏｌＥｌに由来プラスミド
を、この株に維持しないだろうから。ぞれで、コスミド
クロンをＤＧ　４４に導入したあと、ゴスミド上のｔｙ
ｒ　Ｂ遺伝子と細菌クロモシーム上の変只苅立遺伝子と
のあいだの組換えをおこさすために２時間放置した。つ
いで細胞を洗い、ｔｙｒＥ十組換えのおこったものを選
択するために、チロシンおよびアスパルテートを不含の
ミニマル培地に塗布した。もとのｄｎａＢクローンのう
ち４個が、この選ｆＲにおいてｔｙｒ　Ｂ＋組換え生成
物を与えた。それで、ｔｙｒＢ遺伝子の少なくともいく
らがを担っているに違いない。

のサブ−クローニング ｔｙｒＢコスミドクローンは、サイズが大でコピー数が
低く、用途に限界がある。それで、ｔｙｒＢ遺伝子を担
う制限フラグメントを、マルテイーコざ−プラスミド１
）ＡＴ　１５５　（たとえはＴｗｉｇｇ　、Ａ　、、ｒ
・。

および５ｈｅｎａｔｔ、　Ｄ、１（１９８［］）　Ｎａ
ｔｕｒｅ、　２８乙、　２１６−２１８）Ｂコスミドナ
ンパー５の２μｇ分を、制限エンドした。

それぞれに、インキュベーションは３７℃で１時間、酵
素は６５°Ｃで５分間加熱不活化した。

ＢａｍＨ’）消化では、反応培地は１５０１１１ＭのＭ
ａｉｌ。

６ｍＭのＴｒｉ、ｓ　−ＨＯｌ　ｐＨ７，９，６ｍＭの
ＭｇＯ１２、（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂ
ｓ）を含有した。１（４ｎｄ　ｍｌ（Ｎｅｗ　Ｋｎｇｌ
ａｎ４　Ｂｉｏｌａｂ、ｓ）の３単位をＸ６０ｍＭのＮ
ａＯｌ、７　ｒｒ、ＭのＭｇＯ１２，７ｍＭのＴｒｉｓ
　−ＨＯＩ　ｐＨ７，４および１００　ｐｇ／ｍ１のケ
ゞラチン中で用いた。

Ｓａｌ’ｉの場合、Ｎｅｗ　］１３ｎｇｌａｎａ　Ｂｉ
ｏｌａｂｓよりの酵素の５単位を、１５　Ｄ　ｍＭのＮ
ａ１ｌ、６　ｍＭのＴｒｉＳ　−ＨｏＩ　ＰＨ７，９，
６ｍＭのＭｇＯ１２，７ｍＭの２−メチルカプトエタノ
ールおよび１［）０μｇ／ｒｒ　１ケゝラチン中化のそ
れと同じであった。ただし、ＢＯθｈｒｉｎｇθｒＥｉ
ｏｃｈｅｍｉｃ　ａｌｓ社より得たＣ１ａ　ｌの６単位
を酵素Ｅｎｇｌａｎｃｌ　Ｂｉｏｌａｂｓ）を、１００
　ｍＭ　（７）　Ｔｒｉｓ　−ＨＯＩ。

ＰＨ７，５，５Ｑ　ｍＭのＮａＯｌ、５　ｍＭ　Ｏ）Ｍ
ｇ０１２および１００μｇ／ｍｌのゼラチン中で用いた
。最後に、Ｂｇｌ　ｌ消化のための反応培地は、６　Ｑ
　ｍＭのＮａＣ１、ｉ　［］　ｍＭのＴｒｉｓ、−Ｈ（
！ｌｐＨ７，６，１０ｍＭのＭｇ（ｉ１２．１Ｑ　ｍＭ
の２−メルカプトエタノールおよび１００μｇ／ｍｌの
ゼラチンを用いた。

これらの消化されたＤＮＡ調製物はＴＥＥ中１％ｗ　７
ｖ低モ 向ゲル上で５Ｖ／ｃｒ＋＋でろ時間電気泳動に処した。

臭化エチジウムの１μｇ　７ｍ　ｌ溶液中で１５分間染
色してＤＮＡフラグメントを可視化ついで３６６　ｎｍ
ＵＶ光線下で観察した。それぞれのバンドを切り取り４
℃に貯蔵した。

ｐＡＴ　１５３　ＤＮＡの１μｇ分を、２０μ１反応液
中で同じセットの制限エンドヌクレアーゼで消化した。

ただし、ｐＡＴ　１５３を切らないＢｇｌｌは別とした
。コスミドＢｇｌｌフラグメントはＢａｎ　Ｈ１−切断
ｐＡＴ　ｌ　５ろ（Ｂａｎ　）ＩＩおよびＢｇｌ　■は
同じ５′オーバハングを与える）にサブクローンした。

消化したあと直線状ベクターは、牛の腸ホスファターゼ
（ＰＬ　Ｄ＆ｂｓ　）の１単位で１時間消化した。

こうして、５′ホスフエートを除き再環化を防いだ。

７０℃で１０分インキユベートシ、酵素を不活化し、コ
スミドフラグメントと同様に１％Ｗ／ＶＬＧＴアガロー
スケゞル上の泳動に処した。各酵素により直線状とされ
たプラスミドに相当するバンドは、上記のようにゲルよ
り切り取った。

コスミドフラグメントはついで、適切に切られたベクタ
ーに、つぎのようにリケゝ−トした。デル切片を６５°
Ｃに１０分インキュベートして融解し、ついで３７°Ｃ
に冷却した。融解ゲル切片はすべて約１００μｍであっ
た。２μｍのベクターフラグメントおよび８μｍの特定
のコスミドフラグメントを、４０μｍのあらかじめ加温
した１、２’５　Ｘリケゞ−ジョン緩衝液（６２，５ｍ
ＭのＴｒｉｓ　−ＨＯＩ　ｐ）ｌ　７．８１ム５　ｍＭ
のＭｇＯ１２，２５ｍＭのジチオスレイトール、１．２
５　ｍＭのＡＴＰおよび６２．５ｍｇ／ｍｌゼラチン）
に添加し、十分に混合した。リガーゼを加え１５℃で１
夜反応させた。リゲートさせた試料は６５℃で５分間再
融解させ、室温に冷却し、つぎのように製造したＥ、ａ
ｏｌｉ　ＨＷ　８７株のコンピテント細胞の２０（］μ
ｍに加えた。なは、この細胞はつぎのように調製した。

Ｌ−ブロス中ＨＷ８７の一夜培養物を５３ｍ１の新鮮な
予備加温Ｌ−プロスの５０ｍ１中に一夜希釈した。良く
通気して３７°ＣでインキュベートしＥ　６００を０．
６とした。５秒間１０、［］　Ｄ　Ｄ　ｒｐｍで遠心し
てペレットとした。２５ｍ１の冷５０　ｍＭ　０ａＯ１
ｚ中に再懸濁させた。細胞は、１０分間氷上に放置しそ
れから上記のように再ぺし・ット化し５０　ｍＭのＯａ
　Ｏ１２の２ｍＬ中に再Ｆｔｌｉ濁させた。０℃でさら
に１０分インキュベーションしたあとで、細胞は形質転
換にコンピテントとなった。

リケゞ−トされたＤＮＡを添加したあと、細胞は０℃で
さらに１０分間インキュベートし、６７℃で２分間ヒー
トショックし、最後に７５０μｍの予備加Ｂ、ｈ−ブロ
スと混合した。細胞は３７℃で３０分インキユベートシ
、プラスミドにコードされたβ−ラクタマーゼ遺伝子の
表現型発現をさせてから、２００　ｐｇ／　ｍｌのカル
ベニシリンを含有するＬ−寒天プレート上に適当量を塗
床した。プレートは６７°Ｃで１夜インキユベートした
。ＰＡＴ　１５３Ｉサイトにおいてクローン化されたフ
ラグメントの場合は、組換えプラスミドを含有するコロ
ニーは、それらのテトラサイクリンに対する感受性で同
定した。

制限エンドヌクレアーゼ］１ｃｃｏＲ，Ｉを用いて分離
された組換え体は、それぞれのコロニー中のプラスミド
の大きさを調べることにより同定された。それはつぎの
ように実施した。組換え生成物の可能性あるコロニーを
２０　Ｄ　ｐ　ｇ／ｍ１カルベニシリン含有り一寒天プ
レート上に塗床した。６７°Ｃで１夜インキユベートし
た。各塗床の約１Ｃｒｎ２ようの細菌を、１Ｑ　ｍＭの
Ｔｒｉｓ　−Ｈ（！ｌ　ｐＨ３、ｉ　ｍＭのＪｔ；ＤＴ
Ａ１％Ｗ／Ｖのナトリウムドデシルスルフェート（ＳＤ
Ｓ）、２％Ｗ／ＶのＦｉｃｏ　１１および０．５％Ｗ／
Ｖブロムフェノールブルー（Ｓｉｇｍａ　Ｃｈｅｍｉｃ
ａｌｓ）、１００μｇ／ｍｌのＲＮＡ　ｓθを含有する
溶菌混合物中に再懸濁させた。６５℃で６０分インギュ
ベートした。各試料は６０秒間激しく、渦流混合した。

それぞれの、調製物の５０μｍ苑を１％Ｗ／Ｖアガｐ−
スケ９ルにつけ１０　Ｖ／　ｃｍで４時間′亀気泳動に
処した。プラスミドのバンドを臭化エチジウムで上記の
ように染め２５４’ｎｍＵＶ照射で可視化した。

組換えプラスミドは、非組換えの対照に比して移動性の
減少していることから同定された。これらの方法で、も
とのコスミドｄｎａＢクローンからの種々のフラグメン
トを担う組換えプラスミドのいくつかを分離した。これ
らのプラスミドより、インタクトのｔｙｒＢ遺伝子を担
うプラスミドを選択することを容易にするために、ｔ７
ｒＢ−およびｓａｓ　Ｏ−変異を担う新株を構築した。

例　　６ トランスアミナーゼ欠損株の構築 すでに特徴づけられたＬ”ｌ　（）　４４における変異
をプラスミドの保持を可能とすることの知られているバ
ックグラウンド（菌株ＭＣ１０６１のバックグラウンド
）に移すこととした。っぎのように調製したテトラサイ
クリン抵抗性トランスボゾンのランダム挿入を受けたＨ
Ｗ２２株の混合培養物上にバクテリオファージＰＩを発
育さぜた。ＨＷ　２２の飽和培養物をラムダＹＭプロス
（１０ｇバクトドリプトン、２．５　ｇＮａＣｌおよび
Ｃ１，２％ｗ　／　Ｖ　フルドース／リットル）に１佼
発育させた。あらかじめ加温しである、新鮮なラムダ−
ＹＭグロスの１００ｍ１に加えて１００倍に希釈した。

６７℃でインキュベートして０Ｄ６００を０．６とした
。１０　、００Ｏｒ’ｆＪｍで５秒遠心して細胞を沈降
させ、５ｍｌのラムダ−ＹＭゾロスに再蒜濁させた。テ
トラサイクリントランスボゾンＴｎ　１０を担うバクテ
リオファーシラムダ−尋物ＮＫ５５を加えて感染フルテ
イプリシティ０．２とした。バクテリオファージは６７
℃で４５分吸収させた。２００ａ４を、テトラサイクリ
ン（２０μｇ　／　ｍｌ　）およびビロリン酸ナトリウ
ム（２，５ｍＭ　）を含有するＬ−寒天プレートに塗布
した。プレートは６７°Ｃで２４時間インキュベートし
た。全体で５ｍｌのＬ−プロスを用いてプレートを洗い
約５０００のＴｅｔＲコロニーをプールした。２０　ｌ
ｔｇ　／　ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬ−プロ
スの５０ｍ１中に希釈し、６７°Ｃで１夜発育させた。

無菌グリセロールを加え２０％Ｗ　／　Ｖの濃度として
からＴｎ　１０プールを−２Ｄ　’Ｃに貯蔵した。

Ｔｎ　１０プール上にバクテリオファージＰＬを発育さ
すために、このグリセロールストックの２００ｍ１分を
１０μｇ　／　ｍｌのテトラサイクリンを含有するＬ−
プロスの５ｍｌで希釈し、６７°Ｃて１夜振とりインキ
ュベートした。この１夜養養物の０．２ｍ１ζこ、ファ
ーゾＰＬクリアーの２ＸＴ０６プラ一ク形成単位（ｐｆ
ｕ　）および１０μｌの５０ｍＭのＣａＣ，ｈ２を加え
た。細胞は６７℃で５分インキュベートし、あらかじめ
６７℃に加温したＬ−プロス＋２．５　ｍＭのＣａＣｌ
２の５ｍｌに加えた。細胞は激しく通気しなから４時間
６７°Ｃで培養した。細胞残渣は１０．０００　ｒｐｍ
で５分間遠心し、ファージ含有上清は４℃でクロロホル
ム上に貯蔵した。

この上清を用いてＤＣ）３０に形質導入し、チロシンお
よびアスパルテート不台の最小培地上での発育を可能と
した。（最小培地はＶｏｇｅｌおよびＢｏｎｎｅｒの培
地で、０．２　ｇ／　ｌのＭｇＳＯ４Ｈ７Ｈ２Ｏ，２９
／ｌのくえん酸、１ｏｇ／１１のに２ＨＰＯ２，６，５
ｇ／ｌのＮａＨ２ＰＯ４・４　Ｈ２Ｏおよび１０ｍＭの
Ｊ’ｅＣ１２゜オートクレーブ処理してから、５０μｇ
　／ｍｌのアミノ酸の必要量を補充し、グルコースを０
．２％Ｗ　／　Ｖの最終濃度まで加えた。ついで、Ｔｙ
ｒ　Ａｓｐ形質導入体を、１０μｇ　／　１１１１　ｊ
　トラサイクリンを含有する同じ培地にレプリカ−プレ
ートし、ＴｅｔＲに同時になった形質導入体を検出した
。これらＴｅｔＲＴｙｒ”Ａｓｐ＋組換え物のいくつか
のものを、消製。

し、ｄ）「規Ｐ１ｍｉＮ物を用いた。これらの８個のＰ
１調製物のそれぞれはＤＧ３０を転換して′ｔ・ｅｔ　
　とするのに用いた。それぞれの笑鳥灸で、５０イ同の
Ｔｅｔ”形質導入体を動画し、チロシンおよびアスパル
テートを欠く最小培地に移し、含すれるＴｎの連結を試
験した。これらの実験のそれぞれより、ｔｙｒＢ　ａｓ
ｐＣに留まったＴｅｔＲコロニーのひとつを精製してそ
してＰ１溶解物を調製するのにふたたび用いた。これら
の溶ノ眸物を用いてＭＣ１０６１に形質導入しＴｅｔ　
　にした。これらの形質導入体よりのｊｌｌ　）Ｐａ抽
出物は、（）ｅｌｆａｎｄにより記載されたように、生
のポリアクリルアミドゲル主で泳動させＬ　−ｐｈｅ　
トランスアミナーゼ活性をみるために染色した。

望む形質４ｆ−人体を１０ｍ］−のＬ−プロスの中で６
７℃で一夜発′げさせｉ商施抽出物を調製した。細胞は
、Ｉ　Ｏ，００Ｄ　ｒｐｍで１５秒遠心して採取し、ペ
レットのサイズに応じて０．５から１．０ｍｌまでの超
音波処理緩イ」ｉＩＪ液中に再懸７蜀させた。用いた緩
衝ン＆は、２５　ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ、２５　ｍＭ
のＫＨ２Ｐ’　４　ｐＨ６，９，０，２ｍ１ｖｉピリド
キサールホスフエート、０．５鯛のジチオスレイトール
、［１，２ｍＭのＥＤＴＡおよび１０％Ｖ　／　Ｖグリ
セロールである。細胞恋濁液はＥｐｐｅｎｄｏｒｆ　ミ
クロ試験管に移し、氷上に放置した。各懸濁液は、セツ
ティング２で５秒バースト４回を用いてＤａｕ：ｅｓソ
ニケーターで処理した。

超音波処理懸７蜀液は４°Ｃで５分間１５．０　［１０
ｒｐｍで遠心し、細胞残渣を除き、上清を新しいミクロ
試験管に移した。細胞抽出物は、デルｔこ移しうるまで
氷上に放置するかまたは一２０℃ｌこ貯蔵した。

生のままのデル出：気泳動はつぎのように実施した。ゲ
ルは８．５％Ｗ／Ｖアクリルアミド、０．２２７％ｗ　
／　ｖビス−アクリルアミドを６７５　ｍＭのＴｒｉｓ
−ＭＣＩ　ｐＨ８，３に含有した。このアクリルアミド
材料は、除ガスし０．０５％Ｗ／■過硫岐アンモニウム
および０．０１６％Ｗ　／　Ｖ　ＴＥＭＥＬｌを加えて
重合させたものである。重合後、デルは、３７．５ｍＭ
のＴｒｉｓ　−ＨＣＩ　ｐＨ８，３の中で少なくとも１
時間４℃で予備処理した。試料を移すより前に、緩ｉ＃
　Ｍは、７６．６　ｍＭのグリシン、１］１１ＭのＴｒ
ｉｓ　−ＨＣＩ　、　ｐＨ８，６より成立つ実施用の緩
衝液に変えた。各セル抽出物よりの約５０μｇの蛋白質
を移し、４℃て４から６時間１０Ｖ／ｃｒＩｌで′１気
泳動に処した。セル抽出物中の蛋白質の濃度はＢｌｏ−
ＲａＣ１蛋白質試薬法を用いて測定した。Ｌ　−ｐｈｅ
　？ランスアミナーゼ活性測定のためにデルはつぎのよ
うに染色した。デルは１００　ｍＭ　！Ｊン酸緩衝液ｐ
Ｈ７，５中で短時間洗い、１２．５ｍＭのα−ケトグル
タレート、０．２　ｍｌ＼４のピリドキサールポスフェ
ート、０．６　ｍＭニトロブルーテトラゾリウム、０．
２ｍＭフエナゾンメトスルフエート、６０ｍ１φＬ　−
ｐｈｅおよび１００　ｍＭ　Ｋ２ＨＰＯ４ｐＨ７，５を
含有する、５７℃ニ予備加温した新しい染色溶液の５　
Ｑ　Ｑ　ｍｌ中に浸漬した。ケゞルは、暗所で６７°Ｇ
で１時間染色浴液中でおだやかに、ｉ辰った。ついでゲ
ルは蒸留水中で洗う蒸留水中に放１，１．．ｆシ、写真
ζこ取りうる状態とした。

（第２図をみよ）。これは、オ］１々のＢ、　ｃｏｌ　
ｉ　の体中に検出しうるアミノトランスフェラーゼの存
在するか存在しないかを示す。

の活性に特徴的な６個の染色バンドを与えた。これらの
形質転換物より調製した抽出物のトランスアミナーゼパ
ターンをＭＣ１０６１のそれと比較して、特徴的な４す
Ｃ活性を欠如するＭＣ１０６１組換え物を検出すること
が可能であった。

ａｓｐ　Ｃ活性を欠如するひさつの変異株を精製（ＨＷ
１０９）と称した。この株より、Ｂｏｃｈｎｅｒ　”Ｊ
＝の方法（Ｊ、Ｂａｃｔ１４３：９２６）によりＴｎ　
トランスボゾンを１余いた。Ｈｗ１０９はＬ−ブロス中
に一佼発育させた。約１０６（ｔｄ／プレートの卸１施
を、つぎのように調製したＢｏｃｈｎｅｒ選択培地上に
拡けた。浴液Ａ　（Ｂａｃｔｏ−ｔｒｙｐｔｏｎｅ　１
０　ｊｉ　Ｘ’　Ｂａｃｔ。

酵母エキス５９．クロルテトラサイクリンＨＣＩ　５０
ｍｇ、　’ｊＪ＜’天１５Ｉ８水５０口ｍ１）および浴
液Ｂ（ＮａＣ１１０ｇ、ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ１０ｇ
　ｚグルコース２Ｆｌ。

水５［１０ｍ１）を別々に１５　ｐｓｉで２０分オート
クレーブした。溶液を混合し、注入温度に冷却した。

注入するより前に５ｍｌのＺｎＣｌ２　（２０ｍＭ　）
および６ｍｌの２ｍｇ／ｌのフサ゛−ルばを加えた。６
７°Ｃで２４時間プレートをインキュベートした。フず
一ル酸抵抗性コロニーを分離し、同じ培地に再画線して
精製した。これらの分離１吻をテトラ→ノ゛イクリンに
対する感受性について試験した。ＩＦ（Ｗ　１０９のひ
とつのテトラサイクリン感受性の誘導体を選択し、ＨＷ
１５７と命名した。

しかし、このアプローチはＨＷ２２のｔｙｒ　Ｂ誘導体
は与えなかった。ｔｙｒ　Ｂに連結されたＴｎｌｏを有
する株を分離するためにつぎの操作を冥施した。株ｇｓ
４３Ｄはｍａｌ　Ｂに変異を有し、それがマルトースを
炭素原に用いることを不可能とする。

ｍａｌ　Ｂはｔｙｒ　Ｂとかなり密接に連結している。

それで、上記のＨ　ｗ　２２中ランダムＴｎプール上に
発育さぜたＰＩでＥＳ４３０に形質誘入し、１０ｇｇ　
／　ｎｌｌのテトラサイクリンを加えたマルトースＭａ
ＣＯｎｋｅｙ寒天プレート上でＴｅｔ、Ｒについて選択
した。

Ｐ１形質導入はつぎのように実施した。受は入れる株は
Ｌ−プロス中に発育させ０Ｄ６００を約１．ｐとした。

ＣａＣｌ２を離別して、最終濃度２．５　ｍＭとした。

望むドナー上に発育させたファージＰ１浴ｊ９＊物（ｃ
ｌ、ｅａｒ　）を加え、挿入フルテイプリシティを０．
２かう１．［］のあいたとした。ふつう、受は側のｍ１
蟲たり１０”　ｐｆｕＰ１俗解物である。細胞は６７“
Ｃで１５分インキュベートＬ　１　［Ｊ、ＯＯＯｒｐｍ
で１０秒忠心し、０．１Ｍぐえん虚緩耐液ｐＨ７，０の
もとの容石中で洗い、最後にくえん厳緩衝液中に再懸濁
させた。適当な割合を選択培地に嘔布した。

Ｔｅｔ　　ＥよびＭａｌ＋に同時に変った形質導入法を
釣菌し精製した。これらの株よりＰＩ浴）’Ｊイ吻を調
製し、Ｄ（）、４４に形質導入してＴｅｔＲとした。８
個のＰｌ済ｔｆｆｌｌ物のそれぞれよりＴｅｔＲコロニ
ーは、アスパルテートおよびチロシンを欠くミニフル寒
天プレート上に塗抹した。これらの央恢のうぢのひとつ
でＴｎ　１０とｔｙｒ　Ｂとの良好な連結が得られた。

それで、この実験よりのひきつのＴｅ伊ｔｙｒ　Ｂ−組
換え体を分離し、この組換え体よりＰＬ浴Ｂイ１勿をｊ
ｊｔｉＪ　ｄしそして上記のＨＷ１５７に形質導入して
Ｔｅｔ”とした。これらの形質導入体のうちの５０個を
、ロイシンを補給するか、Ｌ−アスパルテートおよびＬ
−フェニルアラニンを欠如するよＬｔ小寒天に顔沫した
。このようにしてＭＣＩＤ６１のｔｙｒＢ　ａｓｐＣ−
誘導体を検出した。この株はＨＷ１５８と称した。最後
に、ＨＷ１５８のテトラサイクリンＩｃｅｄ受性誘導物
でＨＷ１５９を、ＨＷ１５７の分離について上記したよ
うに分離した。ＨＷ１５９は、ロイシンのみを、要求す
る親株ＭＣ１０６１と異なり、発育のためのアスパルテ
ートおよびロイシンを要求するので、ロイシンを補給し
た最小培地には発育しない。

例　　４ ＨＷ１５９中の一δ区Ｂ欠損を補完する能力に関しての
→ノーシークローンの選択 ｄｎａ　Ｂコスミドクローン（上記）よりのＤＮＡフラ
グメントをサブクローンして得られる組換えプラスミド
のすべてを、２００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを補給
１−たＬ−寒天上で形質転換について選択する方法によ
り、株ＨＷ１５９中に導入した。

これらの形質転換株はロイシンのみを補給した最小培地
上に画線し、シラスミドにより担われる遺伝子の存在が
ＨＷ１５９中のｔｙｒ　Ｂ欠損補完しうる能力について
試験した。コスミドーｄｎａ　Ｂクローン扁５よりの、
二す１を担うひとつのサブ−クローンは、ロイシンを補
給した。最小培地に発付する能力をＨＷ１５９に恢榎し
た。それで、ｔｙｒＢ遺伝子を担うことになる。

腔より遺伝子の配列の決定はＭａｘａｍおよびＣ）ｉｌ
ｂｅｒｔの方法で決定した。ｔｙｒＢ遺伝子の配列は第
６図に示す。このＤＮＡ配列をもとにして、ｔｙｒ　Ｂ
によりコードされるアミノトランスフェラーゼのアミノ
酸配列は、送伝トリプレットコドンを用いて決定された
。このアミノ酸配列は第４図に示す。

例　　５ ａｓｐ　Ｃ遺伝子のクローニングのための出光点として
、特殊化された形質尋人用ファージラムダａｓｐＣ２（
Ｍ、Ｏｎｏより供与）を用いることとした。

このファージはつぎのように調製された。ラムダ±Ｃお
よびラムダＣ１８５７Ｓａｍ　７を担うダブル溶原歯で
あるＨＷ７６の培養物を６０℃で０Ｄ６ｏｏ　Ｏ−６ま
で発育させた。培養は４５°Ｃで１５分インキユベート
シ、グロファージを誘導し、６７°Ｃで６時間激しく振
とうした。３．５ｍｌのＣＨＣｌ、を加えて細胞溶解を
完結させ細胞残渣は１０．００　Ｏｒｐｍで１０分遠心
して除いた。ＮａＣｌヲ２．４％Ｗ／Ｖ才で、そしてポ
リエチレングリコール（平均分子量６，０００　）を１
０％ｗ　／　ｖまで加えてファージを沈殿させた。４℃
で１夜放置してファージを沈殿させ、５，０００　ｒｐ
ｍで１０分遠心して々レットとした。ファージペレット
は、１０吐のＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ７−５，１０ｍＭ
のＭｇ５Ｏ，より成立つファージ緩衝液中に静かに再懸
濁させた。ファージは４　［１，０００ｒｐｍで１時間
遠心してペレットとし、最後に１ｒｎ１のファージ緩衝
液に再ｐｉ４５７蜀させた。

ＣｓＣ１ブロックグラジェントにつきのように処して、
ファージをさらに精製した。ファージの１ｄｌを、硝ば
セルロースチューブ中の２段階ブロックグラジェントに
加えた。グラジェントは、５ＭＣｓＣ１，１０ｍＭのＭ
ｇ５Ｏａ、１０　ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０
および０．１　ｍＭ　（７）　ＥＬＩＴＡの１ｍｌに６
Ｍ　ＣｓＣ１。

１０ｍＭのＭｇＳＯ４，１Ｑ　ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　ｐＨ８，０および０．１　ｍＭ　ＥＤＴＡの３ｍｌを
Ｍネｆ、：−モ０’：）でアル。グラジェントは２０℃
で３０，０００　ｒｐｍで１時間ＢｅｃＲｍａｎｎ　Ｓ
　Ｗ　６５０−ター中で雇心した。５／８インチ（１，
６ｃｒｒｔ　）　２５／７９−ゾの針を有する１ｍｌの
シリンジを用い、チューブの側面より、Ｑ、５ｍｌ中に
ファージのバンドをＪｉり出した。Ｑ、５ｍｌのファー
ジを、１ＯｍＭのＭｇＳＯ４，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ＣＩ　ｐＨ８，０およびＱｙ１ｍＭＥＤＴＡ中ＣｓＣ１
紀オｌ浴液（２５°Ｃ）の０．５ｍｌと混合した。硝酸
セルロース培心チューブ中でよく混合した。ついでこれ
に１０ｍＭのＭｇＳＯ４，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ
　ｐｉ（３，３および０．１ｍＭのＥＤＴＡ中５　Ｍ　
ＣｓＣ１の３ｍｌを軍ね、そして１０ｍＭのＭｇ５Ｏ，
，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０および０．
１ｍＭのＥＤＴＡ中６ＭのＣｓＣ１の１ｍｌを重ねた。

ふたたび２０°Ｃで１時間で６０＋０００　ｒｐｍでふ
たたび遠心した。前記のように、チューブの側面より、
０．５ｍｌ中にファージを取り出した。

ＤＮＡは、つぎのように、ファージ粒子より抽出した。

１５　ｍ１ｃｏｒｅｘ遠心チューブ中９．５ｍｌのファ
ージに、５０μｍの２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，
５，０，２Ｍ　ノＥＤＴＡおよびＱ、５ｍｌのホルムア
ミドを加えた。

３０分後、３．５　ｍｌＱ九ｋを刀口え、３ｍｌのエタ
ノールを加えてＤＮＡを沈殿させた。１０．００　Ｏｒ
ｐｍで５分遠心してＤＮＡをペレットとした。上清をす
て、ペレットは７０％■／■エタノールで洗った。

ＤＮＡは減圧下に乾燥し、最後にＴＥ（１［］ｍＭＴｒ
ｉｓ−ＨＣＩおよび１ｍ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８，０）に溶
５１イし、５００μｇ　／ｍｌのＩ）ＮＡ　幾度とした
。ラムダａｓｐ　ＣＤＮＡは、Ｅ、ｃｏｌ　：　ＤＮＡ
について上記したように、制限エンドヌクレアーゼ担３
　Ａで部分的に消化した。消化物のすべてよりのＤＮＡ
をプールし、ＴＢＥ中１％Ｗ／■低ゲル化温度アガロー
スゲルに処した。才だ、上記のように、制限エンドヌク
レアーゼＢａｍＨ１および牛小腸ホスファターセテ完全
に消化したＰＡＴ　１５３　ＤＮＡの１μｇを調製し、
同じデルに処した。ＤＮＡは上記のように３６６　ｎｍ
Ｕ、Ｖ、光で可視化した。

直線状化したｐＡＴ　１５３および２．５からＯＫｂの
あいだの部分的に制限されたラムダａｓｐＣＤＮＡに相
当するバンドを切り出した。ＤＮＡはタルよりつぎのよ
うに抽出した。ゲル片を１５ｍ１凸状チユーブ中で６５
°Ｃで５分融解させ、３７’Ｃに冷却し、６７℃で２容
量倍の水で希釈した。等容量のフェノールを加え（６７
°Ｃ）そして６分間渦流に処することによりアがロース
を除いた。ｉ　ｏ、ｏ　ｏ　。

ｒｐｍで５分間遠心して相を分け、上方の水性相をきれ
いなチューブに移した。フェノール抽出は６反芙施した
。最後の上清は等量のジエチルエーテルと渦流処理し、
放置し相を分離さぜ、上層のエーテル相を除くことによ
り６度抽出した。残存する水相の容量を測定し、３Ｍの
酢酸ナトリウムをへ 加え塩赫度を０．６Ｍとした。酵母の転移ＲＮＡを担体
として加え、最終良度５μｇ／’ｍｌとした。２．５容
量倍のエタノール添加、−２０℃で１夜インキユベーシ
ヨン、１０’、０００　ｒｐｍで６０分遠心してＤＮＡ
を沈殿させた。ペレットは７０％Ｖ　／　Ｖエタノール
中で洗い、１０，０００　ｒｐｍで再遠心し、（１１文
圧乾燥した。Ｌ’）ＮＡはＴＥに溶解（約１００μｇ／
ｍｌの倹度とした。部分的に制限されたラムダ−μｌの
２Ｘ　ＩＩ　）ｙ”−ジョン緩衝液（上記）中調製ｐＴ
Ａ１５６ＤＮＡの２μｍに添加することにより、Ｂａｍ
Ｈ１切断ｐＡＴ　１５３にリゲートした。混合物は６７
°Ｃで５分インキュベートし、室温に′冷却し、Ｔ　４
　ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ　ｇｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌ
ａｂｓ　）の１μｍを加えてリケゝ−ジョンを開始させ
た。１５°Ｃで４時間ＩＪ　ｒ−ジョンを続けた。リゾ
−ジョン反応混合物全体は氷上で冷却し、上記のよつに
製造のＨＷ１５９株よりのコンピテント細胞の２００μ
ｍに加えた。上記のように形質転換し、ＭＢ胞は２００
μｇ／ｍｌのカルベニシリン含有Ｌ−寒天上に塗布した
。６７°Ｃで１夜インキユベートした。

約５，０００のコロニーを得た。これらをあわせ、１０
ｍ１の０．８５％Ｗ　／　Ｖ　ＮａＣ１中で２反洗い、
ロイシンおよびカルベニシリンを含有するがチロシンお
よびアスパルテートそ欠く最小基天に塗布した。と」−
Ｃを含有する組換えフ０ラスミドを担うＨＷ１５９ｒ１
ζ：１１服のみがこの培地上で発育しえた。

６７°Ｃで２４時間インキュベートしてから、約１００
１固のコロニーを得た。これらのあるものは、同じ培地
に継代画線して精製した。これらが組換えプラスミドを
含有することは、上記のように単一コロニーをアがロー
スケゞルに処することでイ１正がめられた。これらの体
中の組換えプラスミドがまさにＡｓｐ＋Ｔｙｒ＋表現型
を与えるこさは、プラスミトヲ分ｔ’４　Ｌ、ＨＷ　−
１５９を再転換し、これらの転侯物がＡｓｐ”Ｔｙｒ＋
となったことでたしかめられた。形質転換物がｔｙｒ　
Ｂでなくクローン化されたμ３ｐ　Ｃの存仕で改変され
たことは、細胞不含抽出物を生のアクリルアミドゲルに
処し染色してトランスアミナーゼ活性を求める上記方法
で示された。

これらの実験は、プラスミドがまさにインタクトのａｓ
ｐｃｄ伝子を有することを示した。

アミノトランスフェラーゼ活性の実靜の１７ベルは、相
対活性を示す任意の単位で測定した。プラスミドｐＴＡ
　１５３上のｔｙｒ　Ｂおよびａｓｐ　、Ｃｉｉ伝子を
含有する種々の採土の相対的アミントランスフェラーゼ
活性は表２に示す。シグマＲアスパルテートトランスア
ミナーゼアッセイキット（ＳｉｇｍａＴｅｃｈｎｉｃａ
ｌ　ＢｕｌｌｅｔｉｎＡ５６−　ＪＪ　Ｖ、　１９８０
年改訂）を用いてアッセイした。

表２ アスパルテートを基質に用いて測定したトランスアミナ
ーゼレベル（シグマアスパルテートトランスアミナーゼ
アッセイキット） ｍｇ蛋白質 ＭＣ１０６１４０１ ＨＷ１５７　　　　　　２５　　　０．６ＨＷ１５８ｐ
ａｓｐＣ１−１１７３８４３，５例　　６ ｔｙｒ　Ｂを担うＣ１ａＩ挿入物は約４．５　ｋｂであ
る。

ダブル制限エンドヌクレアーゼ消化に続くゲル電気泳動
による得られた制限フラグメントの分析という、ふつう
に用いられる技術により予備的制限マツプを構成した。

ひとつの配置（第６図をみよ）において、Ｃ１ａＩ挿入
物は、歪！　　ビトローヂリーションによりプラスミド
のサイドを減少さすことを容易にするような位置に、Ｅ
ｃｏＲＩ、ＢａｍＥＩおよびＮｒｕ　Ｉサイドを有して
いた。たとへは、小〃ＥＣＯＲＩフラグメントはつぎの
ように除いた。ｐ　ｔｙｒＢ　ＤＮＡの１μｇを、最終
谷風２０μｍ中でＥｃｏＲｆで完全に消化した。６５゛
Ｃで５分インキュベートして醇紫は不活性化した。この
消化物の２μｍ分を５０μｌのリガーゼ緩衝液中に希釈
し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの１μｍを添加し、１５℃で１
６時間をかけてＤＮＡをリゾートした。この低Ｌ”）、
ＮＡ　外ｉ’　Ｋでのリゾ−ジョンは、はとんどを、小
型ｇｃｏＢ　Ｉフラグメントを有しないプラスミドの丙
壊化にみちびいた。上記のようにカルベニシリン抵抗性
に関し姻択して、Ｉ）ＮＡでＨＮ８７を形質転換した。

個々の形質転換物を釣菌精製し、単一コロニーの濱）ヂ
繭勿をゲル泳動で分析したことは、上記のよってある。

大部分の形質転換物は、親シラスミドｐｔｙｒ　Ｂより
より高い移動度のプラスミドを官有した。これらのクロ
ーンのいくつかよりプラスミドＤＮＡを分離し小型Ｅｃ
ｏＲｆフラグメントの消失は、ＥｃｏＲＩ消化およびこ
れらの消化物の１％アがロースデル上電気泳動分析でた
しかめた。デリートされたシラスミドはすべて大型ｐｔ
ｙｒ　ＢのＥｃｏＲ■フラグメントに相肖するひとつだ
けのバンドを与えた。親プラスミドは予期される２つの
バンドを与えた。

ＥｃｏＲＪをデリートしたｐｔｙｒ　Ｂは、類似の一連
の操作に処して、ＢａｍＨｉフラグメントを除き、ｇｃ
ｏＲＩ　ＢＲｍＨＩをデリートしたプラスミドは、緩衝
液（ＩＤＯｍＭのＮａＣ１ｚ　６　ｍＭのＴｒｉｓ　ｐ
ｉ−１７，４，６ｍＭのＭｇＣｌ２．５　ｍＭのβ−メ
ルカゾトエタノー／Ｌ／、１００　ｔｔｇ　／ｍｌｍｌ
テラ）中ＮｒｕＩ酸素を用い、さらにヂリーションに処
した。これらの３つのプラスミドのすべてを精製して使
用し、ＨＮ３２５　（ｔｙｒＢ　ａｓｐＣｒｅｃＡ　）
をカルベニシリン抵抗性に形質転換した。これら形質転
換物はすべて、Ｌ−チロシンおよびＬ−アスパルテート
の不存在で最小培地に発育する能力を同時に獲得した。

このことはこれらデリートされたプラスミド６種〜のす
べてにおいてｔｙｒ　Ｂ遺伝子がなおインタクトである
ことを示している。

ダブルデリートされたｐｔｙｒＢよりのＢａｍＨＩ　−
ＥｃｏＲＩフラグメントは、Ｍａｘａｍおよび・１ｌｂ
ｅｒｔ（Ｍａｘａｍ、　Ａ、Ｍ、　ａｎｄ　Ｗ、（）ｉ
ｌｂｅｒｔ　）　　１９７７　、ＰＮＡｓ５１：６８２
−３８９、Ｍａｘａｍ　ＸＡ　、　Ｍ、、　ａｎｄＷ、
（）ｉｌｂｅｒｔ、　　１９７７、ＭＩＥ６５：ＣＨ３
７４９９−５５９、ＰａｒｔＩ）に使い、配列分析に処
した。６８０または６９６アミノ酸長の蛋白質をコード
しうる、ひさつの実質的なオープンの読み枠が見出た゛
された。ＩＩＩＪｌ訳のための１．Ｅ確な出発点は知ら
れない。インフェースのＧＴ（）　（バリンコドン）よ
り約１０ヌクレオチド上流に典型的なりボゾーム結合サ
イトがある。別のＪ易合、インフェースＡＴＧ（メチオ
ニン）があるが、典型的リボゾーム結合サイトに先行さ
れない。Ｅｃ　ｏＲＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントのＤ
ＮＡ配列およびそれより推測さ八るアミ／順配列を第６
および４図に示す。

もつとも小型のａｓｐＣサブ−クローン（ｐａｓｐＣ６
−４）の制限マツプは、上記のようなシングルおよびダ
ブル制限消化の組合わせにより明らかにされた。＝７図
をみよ。ａｓｐ　Ｃサブ−クローンは、挿入物をきれい
に切るための制限サイトを有しない。というのは、それ
らがＳａｕ　３　ＡフラグメントをｐＡＴ　１５３のＢ
ａｍＨＩサイトにリゾートさせて出来たもので、この操
作はＢａｍＨＩサイトを再生しない０ ｐａｓｐＣ６−４（ｐＭＥ　９８　）をに、ｃｏｌｉ　
　原栄養体Ｈｗ５１９を形質転換にするのに用いられた
。

そして、発酵中にｐａｓｐｃｌ−１のそれに等しいかそ
れよりも良いトランスアミナーゼを生産した。

Ｅ、ｃｏｌｉ　　ＨＷ　５１９のｐＭＥ９８を担う株は
寄託番号ＡＴＣＣ３９５０１である。

例　７ 第１図におけるアミノトランスフェラーゼ酵素を必要と
する反応１６１０および／ｉ６．１６において、追加の
アミノトランスフェラーゼ酵素の存在がアミノ［駿合成
を容易とする。壓ヱ”％　ｔｙｒＢまたはｉ　１ｖＫ　
Ｍ　４ｊ−に子により合成されるアミノトランスフェラ
ーゼ醇累レベルの増加で、７罰）胞は、アミノ基転移段
階における律速反応を克服することを可能とする。

”ｌ”’ｚ　　ｔｙｒＢまたは史Ｅン堕伝子を世５本発
明のプラスミドは、生化学でよく知られている細閉ｉｉ
：ｌｌ胞に挿入する。この挿入された遺伝子は、戯画Ｋ
Ｉ＋１胞を適当な培地に発育させた時にアミントランス
フェラーゼレベルを増加合成することを触媒するメツセ
ンシャー器八を生産する。アミントランスフェラーゼレ
ベルの増加中座は、それの触媒によるアミノ酸レベルを
増加させる。アミノ酸は、発酵科学においてよく知られ
ている操作でｉ′し旧１ｉＭおよび培地より採取する。

ｔｙｒ　Ｂ含有プラスミドをＥ、ｃｏｌｉ　　１３２８
１ｆこ加えること（Ｕ、Ｓ、特許２，９７３，５　［Ｊ
　４　）は、茨乙に示すようにＬ−フェニルアラニン中
流を１１％瑠加増加る。

表６ （ぼ４株１３２８１） プラスミド不含　プラスｔｙｒＢプラスミド生７ｉＬ−
Ｐｈｅ　　　　１００　％　　　　　　　　１１１％６
２°Ｃで４８時間培養

【図面の簡単な説明】

第１図は芳香族アミノ酸であるチロシン、フェニルアラ
ニンまたはトリプトファンの合ｊ′Ｊｙ：のための生合
成経路を示す。 ４３２図は、イ山々の１１＋１１１　ｗ＋株において、
ｔｙｒ　Ｂ、、　ａｓｐＣ才たは１ｌｖＥ　ｆｆｉ伝子
によりコードされるアミントランスフェラーゼの存在ま
たは欠如を示す生のま韮の蛋白π１のケゞル電気泳動図
である。 第６図は、ｔｙｒ　Ｂ　３１伝子を有するＥｃｏＲＩ−
ＢａｍＨＩフラグメントのＤＮＡニュクレオチド配列を
示す。 第４図はｔｙｒ　Ｂ遺伝子によりコードされるアミノト
ランスフェラーゼのアミノ酸ｉ記列を示す。 第５図は、中間体およびを託株ＨＷｊ５９を与える過程
を示すＥ、ｃｏｌｉ　流れ図を示す。 第６図は、ｔｙｒＢ＋プラスミドの変型を示す。 第７図は、ａｓｐｃ遺伝子を担うプラスミドの匍ｊ限地
図を示す。 代理人　浅　村　　　晧 Ｕ２Ｕ面の浄書（内容に変更なし） ｔ ＦＩＧ、　　２ ＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡ丁丁丁ＴＡ丁ＧＧＧＧＣＧＡ
ＡＧＧＴＴ　３０ＴＧＣＣＣＧＴＡＧＡＡＣＧＴＡＴＣ
ＧＣＴＧＡＡＡＴＧＡＣＴＡ　　６０ＡＡＧＴＡＡＧＣ
ＧＣＴ丁ＡＣＧＡＡＣＴＴＡＴ下ＡＣＧＣＧＣＣつ０Ｔ
ＧＡＣＴ丁ＣＡＡＧＧＧＴＣＧＣＧＡＴＧＡＡＡＴＡＣ
ＧＴＧＧ　　（２Ｃ）ＡＴＴＡＡ丁ＣＧＴＴＣＴＧＴＡ
ＡＴＡ丁ＴＴＧＡＴ丁ＧＴＣＴＧ　　１５：□ＴＧＣＣ
ＧＧＡ下ＧＣＧＧＣＧＴＧＡＡＴＧＣＣ丁ＴＡ丁ＣＣＧ
Ｇ　　１８０ＣＣＡＡ丁ＡＡＡＡＴＣＣ’丁ＡＡＡＡＡ
丁ＴＣＡＡＴＡＡＧＴＴＧ　２．１０Ａ丁Ｇ丁ＴＣ丁Ｔ
ＴｃＡＴＧｃ丁Ｃ丁ＴＡＴＡＡＡＧＧＴＣ：ＧＴＧ　　
２４０ＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＡＴＧＴＡＣＧ丁丁ＴＧ丁
ＣＡＴＧＡＧＴＣＺ７０ＴＣＡＣ：ＴＣＴＧＴＴＧＣＴ
ＡＡＴＴＧＣＣＧＴＴＣＧＣＴＣＣＴ　３００ＦＩＧ、
　３Ａ ＧＡＡＣＡＴＣＣＡＣＴＣＧＡ丁ＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣ
ＴＴＣＣＧ　３３０ＧＴＴＴＡＴＴＧＴＧＴＴＴＴＡＡ
ＣＣＡＣＣＴＧＣＣＣＧＴＡＡ　　％Ｑ　ＦＱＫ ＡＣＧＴＧＧＡＧＡＡＣＣＡＮＣＧＣＧＴＧＴＴＴＣＡ
ＡＡＡＡＧ　３９０■ Ｔ ＣＣ。 ＣＣ Ｇ へハ ＣＣ １ ＦＩＧ、　３Ｂ ＹＲＩ−ＩＡＩＡＰＬＬＦ ＡＴＣＧＣＣＡＴＧＣＣＡＴＴＧＣＧＣＣＧＣＴＧＣ：
ＴＧＴＴＴＧ、ｒｙ３゜ＣＣＧＧＧＧＣＡＴＴＧＡＡＡ
ＧＴＧＧＧＣＧＣＧＧＡＴＴＴＣＣ７２０ＬＫＲＹＦＰ
Ｅ５ＧＶ 丁ＧＡＡＡＣＧＣＴＡＣＴＴＣＣＣＧＧＡＡＴＣＡＧＧ
ＣＧＴＣＴ　７５０ＷＶＳＤＰＴＷＥ″ＮＶ−１ ＧＧＧＴＣＡＧＣＧＡＴＣＣＴＡＣＣＴＧＧＧＡＡＡＡ
ＣＣＡＣＧ　’７８０Ｖ　　Ａ　　　Ｉ　　　　ＦＡＧ
ＡＧＦ　　　Ｆ：ＴＡＧＣＡＡＴＡＴＴＣＧＣＣＧＧＧ
ＧＣＴＧＧＡＴＴＣ’ＧＡＡＧ　８１０Ｖ　　ＳＴＹ　
　ＰＷＹ　　　Ｄ　　′Ｅ　ＡＴＧＡＧＴＡＣＴＴＡＣ
ＣＣＣＴＧＧＴＡＴＧＡＧ：ＧＡＡＧＣＧＡ　８４０Ｃ
ＧＡＣＧＣＴＧＡＡＡＡＣＡＴＴＡＣＣＴＧＣＣＣＧＣ
ＡＧＴＡ　９００１ＶＬＬ、）（ＰＣＣ）−ＩＮ ゴーＴＧＴＧＴＴＧＣＴＧＣＡＴＣ：ＣＡＴＧＴＴＧＣ
ＣＡＣＡＡＣＣ９３０ＰＴＧＡＤＬＴＮ　　　ＤＱ ＣＡＡＣＧＧＧＴＧＣＣＧＡＴＣＴＣＡＣＴＡＡＴＧＡ
ＴＣＡＧＴ　９６０ＣＴＧＧＡ丁ＴＡＣＣＣＧＣＴＣＴ
ＧＧＴＧＡＧＣＡＡＴＴＧＧＴ　　ｆｌｌＱＱＬｌ’Ｃ
ＡＴＶＲＲ１４Ｙ ＡＡＴＴＧＡＡＡＧＣＡＡＣＡＧＴＴＣＧＣＣＧＣＡＡ
ＣＴＡＣ丁１２３０ＳＳＰＰＮＦＧＡＱ’、／ ＣＣＡＧＣＣＣＧＣＣＧＡＡＴＴＴＴＧＧＴＧＣにＣＡ
ＧＧＴＧＧ　７２６０ＶＡＡＶＬＮ　　　ＤＥＡＬ ＴＧＧＣＴＧＣＡＧＴＧＣＴＧＡＡＴＧＡＣＧＡＧＧＣ
ＡＴＴＧＡ　ＩＺ美ＫＡＳＷ　　ＬＡ　　ＥＹ　　ｒＥ ＡＡＧＣＣＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＧＧ’ＡＡＧＴＡＧ
ＡＡＧＡＧＡ　１３２０ＭＲＴ　　ＲＩ　　　ＬＡＭＲ
Ｑ 丁ＧＣＧＴＡＣＴＣＧＣＡＴＴＣＴＧＧＣＡＡＴＧＣＧ
ＴＣＡＧＧ　　ＩりηＣＡＧＡＡＣＧＣＡＡＴＴＴＣＧ
ＡＴＴＡＴＣＴＧＣＴＴＡＡＴＣ１４１０ＡＡＴＴＴＧ
ＧＴＧＴＣＴＡＴＣＴＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＧＧＴＣ（
５００ＦＩＧ、　３Ｅ ＣＧＧＴＧＡＴＧＴＡＡＴＧＣＡＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧ
ＣＴＧＧＡ　ｔ５９゜（、ＣＴＡＣ’ＣＣＡＧＣＣ丁Ｇ
ＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＡＡＡＣＴＣＪ　　１６ＺＯＣＧ
ＴＣＧＣＴＴＴＣＡＣＴＣＴＴＴＣ丁丁ＴＡＴＡＧＡＴ
ＧＡＴ　７６５０ＴＴＴＴＴＴＧＡＴＧＣＣＡＴＣＧＴ
ＴＣＴＡＣＧＴＧＡＧＡＧＡ　　１６８０ＴＡＡＴＡＡ
ＡＣＧＴＴＧＴＴＡＧＴＴＣＴＴ丁丁ＡＴＴＧＴ丁、Ａ
　１７１０ＡＧＣＴＴＡＴＣＣＣＡＡＴＴＡＴＣＴＧ　
　＋７？９蛋白貿の分子量−４３７５５，９３９８（囚
のアミノ酸ＦＩＧ、　３Ｆ Ｎ　−ＶＡＬ−ＰＨＥ−ＧＬＮ　−ＬＹ、Ｓ　−ＶＡ　
Ｌ−ＡＳ　Ｐ−ＡＬＡ　−ＴＹＲ−ＡＬＡ−ＧＬＹ−ハ
５Ｐ−ＰＲＯ−（ＬＥ−ＬＥＬＪ−１’−月Ｒ−ＬＥＬ
Ｉ−ＭＥＴ−Ｇ印−ＡＲＧ−Ｐ）−１Ｅ−ＬＹ５−にＬ
ＬＪ＝Ａ３Ｐ−ＰＲＯ−ＡＲＧ−３ＫＲ−ＡＳＰ−ＬＹ
５−ＶＡＬ−ＡＳＮ−ＬＥＵ−５ＥＰ、−Ｉ　Ｌｒ−Ｇ
ＬＹ−ＬＥｔＪ−ＴＹＲ−丁ＹＲ−Ａ３Ｎ−ＧＬＩＪ−
Ａ３Ｐ−ＧＬＹ−ＩＬＩニーｒＬｒ−ＰＲＯ−ＧＬＮ−
眠（Ｊ−ＧＬＮ−ＡｍＡ−ＶＡＬ−△ＬＡ−ＧＬυ−、
ＡＬバーＧＬＬＪ−ＡＬＡ−ＡＲＧ−Ｌｌｔ）−ＡＳＨ
−ＡＬＡ−ＧＬＪ−ＰＲＯ−１−１，＋５−ＧＬＹ−Ａ
ＬＡ−５Ｅ代−Ｌ［Ｕ−ＴＹＲ七Ｅ（Ｊ−ＰＲ□−Ｍ［
Ｔ−ＧＬＵ−ＧＬＹ−ＬＥ（Ｊ−ハ５ｙ−ｃＹ５−ｒｙ
Ｒ−ＡｐＧ−ｈ＋ｓ−ハしＡ−（Ｌｌ；、ＡＬ、Ａ−Ｐ
ｌ’（０−Ｌｌｌ−υ−ＬＥＬＪ−ＰＬ４Ｅ″−ＧＬＹ
−ＡＩ−Ａ−ＡＳＰ−Ｈ／、５−ＰＲＯ−ＶＡｔ−ｂｃ
ｖ−Ｌ′Ｙｓ−ｃ、ｂｕ−ｃ、Ｌｕ−ＡＲＧ−ｖＡｒ−
＊ｔｐ−ｒｔ−ｔｇ−ＦＩＧ、　　４Ａ ＩＬＥ−ＧＬＮ−ＴＨＲ−ＬＦｔＪ−ＧＬＹ−ＧＬＹ−
５ＥＲ−ＧＬＹ−ＡＬＡ−ｕ：Ｕ−ＬＹＳ−ＶＡＬ−Ｇ
ＬＹ−ＡＬＡ−ＡＳ１：５−ＰＨＥ−ＬｊＵ−ＬＹＳ−
ＡＲＧ−ＴＹＲ−ＰＩ−Ｉ　Ｅ″−ＰＲＯ−ＧＬＬＪ−
３Ｅ’Ｒ−ＧＬＹ−ＶＡＬ−ＴＲＰ−ＶＡＬ４Ｒ−ＡＳ
Ｆ−ＰＲＯ−ＴＨＲ−ＴＲＰ−ＧＬＬ）−ＡＳＮ−Ｈ２
Ｓ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＩＬｒ−Ｐ１４Ｆ−ＡＬＡ−ＧＬ
’ｌ’−ＡＬＡ−ＧＬＹ−Ｐｌ−ＩＥ−ＧＬ（Ｊ−ＶＡ
Ｌ−５ＥＦＱ−ｎ−（Ｒ−ＴＹＲ−ＰＲＯ−ＴＲＰ−Ｔ
ＹＲ−ＡＳＰ−ＧＬ（Ｊ−ＡＬＡ−ＴＩ−ＩＲ−ＡＳＮ
−ＧＬＹ−ＶＡＬ−ＡＲＧ−Ｐ龍−ＡＳＨ−ＡＳＦ−Ｌ
ＥＩＪ−ＬＥＵ−ＡＬＡ−丁１−ＩＲ−ＬＥ　ＩＪ　−
Ｌ’／Ｓ　−ＴＦ−（Ｐ−Ｌｒ（Ｊ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−
ＡＲＧ−，５ＥＲ−ＩＬＨ−ＶＡＬ−ＬＥ（１）−ＬＥ
ＩＪ−１−１１３−ρＲＯ７ＣＹ５−ＣＹ５−１−１＋
５−．４５Ｍ−ＰＲＱ−ＴＩ−ＩＲ−Ｃ，ＬＹ−ハＬＡ
−Ａ５Ｐ−口ＥＵ−ＴＨＲ−ＡＳＨ−ＡＳＦ−Ｇ’ＬＮ
−ＴＲＰ−ＡＳＦ−ＡＬＡ−ＶＡＬ−ｔＬｌｒ−Ｇｌｔ
）−１Ｌｌｒ−ＬＥＵ−ＬＹＳ−ＡＬＡ−ＡＲら−Ｃ，
ＬｔＪ−ＬＥＵ−ｆＬｒ−ＰＲＯ−ＰＨＪＴ−ＬＥＬ）
−ＡＳＦ−Ｉ　ＬＥ’−ＡＬＡ−ＴＹｆｉ−ＧＩＪＪ−
ＧＬＹ−ＰＨｒ−ＧＬＹ−ＡＬＡ−にＬＹ−ＭＥ’Ｔ−
ＧＬＬＩ−にＬＩＪ−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＴＹＲ−ＡＬＡ
−ＩＬＥ−ＭＧ−ＡＬＡ　−ＩＬｒ−ＡＬＡ−５ＥＲ−
ｋＬＡ−ＧＬＹ−ＬＥ（Ｊ−ＰＲＯ−ＡＬＡ−ＩＪＪＪ
−ｖＡＬ−３ＵＰ！、−ＡＳＨ−８ＫＲ−Ｐ匹−５ＥＲ
−ＬＹ５−　＋Ｌｒ−ＰｕＵ−５Ｅ？−ＬｇｌＪ−ＴＹ
Ｒ−ＧＬＹ−にＬＬＩ−ハＲＧ−ＶＡＬ−ＣＬＹ−にＬ
ＩＪ−ＬＥ（Ｊ一部Ｒ９ＶＡＬ−１ｖ′ＩＥＴ−ＣＹ５
−Ｃ，＋９−ＡＳＰ−ＡＬＡ−ＧＬＵ−ＡＬＡ−ＡＬＡ
−ＧＬＹ−ＡＲＧ−ＶＡＬ−ｔｌυ−ＧＬＹ−ＧＩＪＪ
−ＬＵＵ−ＬＹＳ−ＡＬＡ　−Ｔｌ−ＩＲ−ＶＡＬ−Ａ
ＢＣ，−ＡＨ：Ｃ，−ＡＳＨＴＹＦ２．−５ＥＲ−３Ｆ
：Ｒ−ＰＲＯ−ＰＲＯ−４ＳＮ−Ｐｌｍ−ＧＬＹ−ＡＬ
Ａ−ＧＬＮ−Ｖｉ−ＶＡＬ−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＶＡＬ−
ＬＥ（Ｊ−ＡＳＨ−ＡＳＰ−ＧＬＣＪ−ＡＬＡ−Ｌｌ：
リ−ＬＹＳ−ＡＬ４−．Ｓ［２−’ｍＰ−ＬＥυ−ハＬ
Ａ−ＧＬリーＶＡＬ−にＩＪＪ−ＧＬ（、／−ＦＩＧ、
　４Ｃ 間ＥＴ−ＡＲＧ−ＴＨＲ−ＡＲＧ−／ＬＣ’−ＬａＪ−
ＡＬＡ−１，［ＴＴ−ＡＲＧ−ＧＬＩＪ−ＧＬ（、ｌ−
圧（Ｊ−ＶＡＬ−Ｌ■−ＶＡＬ−ＬＣ（Ｊ−３ＦＲ−丁
１４Ｒ−ＣｙＬ（Ｊ−ＭＩＪ−ＰＲＯ−ＧＬＵ−ＡＲＧ
−ＡＳに／　−’Ｐｌ−ＩＦ−Ａ３Ｐ−ＴＹＲ−ヒＫＵ
−１−ＣＣＪ−ＡＳＨ−ＧＬＪ−ＡＲＧ−ＧＬＹ−Ｗ：
Ｔ−口−１ｒ−３ｒＲ−ＴＹＲ−”ｎ４Ｒ−ＧＬＹ−１
５（Ｊ−３ＥＰ、−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＧＩＪ４−ＶＡＬ
−ＡＳＦ−ＡＲＧ−ＬＦｌｖ−Ａ　ＲＧ−ＧＬｃｊ　−
ＧＬＣＪ−ｐｌ−１ｒ−にＬＹ−ｖＡ　Ｌ−ＴＹＲ−Ｌ
［：Ｕ−ＩＬｒ−ハＬＡ−３Ｅ田ＧＬＹ−ＡＲＧ−匹Ｔ
−ＬＹ５−ＶＡＬ−ＡＬＡ−Ｃ，ＬＹ−Ｌ［：Ｕ−、Ａ
ＳＭ−丁ＬＩＲ−ＡＬＡ−ＡＳＭ−ＶＡＬ−ＧＩＪ／−
八Ｒ（、−ＶＡＬ−八ＬＡ−ＬＹ、Ｓ−ＡＬＡ−Ｐ）−
１Ｕ４−ＡＬＡ−ＡＬＡ−ＶＡＬ−ＭＥ下−丁ＦＲ−Ｃ ＦＩＧ、　４Ｄ ＭＣ１０ら士 目Ｗ１０’３　（Ａ？）ＰＣＴＲ＋ａｏ　Ｍｃｔｏｅｔ
）目Ｗ　ｉ５３　（ＡＳＰＣ郭らＴＮｔｏ　ＭＣイＯ磁
）■Ｗ１５９　（Ａ二５ｐｃ　　Ｔ＞り３６　んイ０ａ
ｏｂユフＦＩＧ、　５ ［ｃｏＲＩ ズ イギリス国パツキンガムシャー ・ハイ・ライコウム・ブラッド ストン・ライズ６ 手続補正書（方式） 昭和Ｊり年ご月／Ｃ日 特許庁長官殿 １、事件の表示 昭和、≦う２年特許願第　　／Ｓ♂９　号３、補正をす
る者 事件との関係　特１１′［出願人 住　　所 ４代理人 ５、補正命令の日付　　　　　　　　　　　　　　　　
□（１−１１（１１’；−“−り昭和ｑ年φ月Ｑφ日 ６、補正により増加する発明の数 ４９９

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　アミノトランスフェラーゼの合成をコードす
   る遺伝子を含有する、複製性の、染色体の外部に存在す
   る要素を包含するプラスミド。 （２）　　アミントランスフェラーゼをコードする該遺
   伝子がａｓｐｏである上記（１）項記載のプラスミド。 （３）　　アミントランスフェラーゼをコードする該遺
   伝子がｔｙｒ　Ｂである上記（１）項記載のプラスミド
   。 （４）　　アミントランスフェラーゼをコードする該遺
   伝子がｉｌｖ　Ｅである上記（１）項記載のプラスミド
   。 （５）細胞内のプラスミド上のアミノトランスフェラー
   ゼ遺伝子を発現させ活性アミノトランスフェラーゼの合
   成にみちびくことを包含する、アミ７基転移酵素の合成
   方法。 （６）　　該アミントランスフェラーゼがＢｓｐ　Ｏ遺
   伝子の生成物である、上記（５）項記載の方法。 （力、該アミントランスフエシーゼがｔｙｒ　Ｂ遺伝子
   の生成物である上記（５）項記載の方法。 （８）該アミントランスフェラーゼがｉｌｖ　Ｂ遺伝子
   の生成物である上記（５）項記載の方法。 （９）　　ａ）ａｓｐ　Ｏ、ｔｙｒ　Ｂまたはｉｌｖ　
   Ｅ遺伝子を含有するプラスミドを微生物に挿入し、ｂ）
   ａｓｐｏ、ｔｙｒ　Ｂまたはｉ］、ｖ　Ｅ遺伝子を微生
   物において発現させて活性アミントランスフェラーゼの
   合成に導びき、Ｃ）該アミノトラセフェラーゼにより作
   用を受けつる基質におけるアミン基転移を触媒さ１−こ
   とを包含する、ａｅｐ　ＣＸｔｙｒ　Ｂまたは１ｌｖＦ
   、遺伝子の生成物による、作用を受けうる基質における
   アミノ基転移を速度を増さす方法。 ００）　　アミン基を受は取る基質がフェニルピルビン
   酸である上記（９）項記載の方法。 α１）　アミノ酸アミン基転移反応が律速反応であるア
   ミノ酸の生産のために微生物を用いる方法において、ア
   ミノ酸のケト酸プリカーサ−にアミン基を転位させうる
   アミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子の１種ま
   たは１ｍより多くを含治するプラスミドを微生物中に導
   入することを包含する改良方法。 ０２）アミノ酸がＬ−フェニルアラニンでケト酸プリカ
   ーサ−がフェニルピルビン酸である上記００項記載の方
   法。 ０３）アミノ酸がチロシンであり、ケト酸プリカーサ−
   がｐ−ヒドロキシフェニルピルベートである上記０１）
   項記載の方法。 （１４）アミノトランスフェラーゼがａｓｐ　Ｏ遺伝子
   の生成物である、上記０１）現記゛載の方法。 −〇５）　　アミントランスフェラーゼがｔｙｒ　Ｂ遺
   伝子の生成物である、上記Ｑｌ）項記載の方法。 ０６）　　アミントランスフェラーゼがｉｌｖ　Ｂ遺伝
   子の生成物−である、上記圓項記載の方法。 θ７）アミノ酸アミン基転移反応が律速段階である、微
   生物を用いるアミノ酸製造方法において、アミノ酸のケ
   ト酸プリカーサ−にアミン基を転位させうるアミノトラ
   ンスフェラーゼをマードする追加の遺伝子を微生物の染
   色体に導入することを包含する改良方法。 ０（至）該微生物が腸内細菌である上記００項記載の方
   法。 （１■　　該腸内、微生物がＫｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　
   Ｃ０１ｉ　　である上記（１０項記載の方法。 （２０）　　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　　菌
   株ＡＴＣ！Ｏろ９２６０を包含する組成物。 ０υ　ｐＭＥ　９８　（ＡＴＯＣ！ろ９５０１　）と称
   する上記（２）項記載のプラスミド。 （２３ｔｙｒ　Ｂ遺伝子がニュクレオチド配列からなる
   上記第３項のプラスミド。 （２３）　　アミノ酸配列 を包含するｔｙｒＢアミノトランスフェラーゼ。