DE3524585C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft das mit dem Anspruch 1 definierte Hybridoma, das Verfahren zu dessen Herstellung gemäß Anspruch 2 und dessen Verwendung gemäß Anspruch 6. Die Ansprüche 3 bis 5 nennen Ausgestaltungen des erfindungs­ gemäßen Verfahrens nach Anspruch 2.

Lactoferrin ist ein eisenbindendes Protein, das in nach außen sekretierten Fluiden wie Milch und dergleichen gefunden wird. Es ist nicht nur bei der Ernährung von Kindern vom Ernährungsstandpunkt aus in hohem Maße heilsam, sondern es besitzt auch die physiologische Wirkung, daß es eine bakteriostatische Wirkung auf pathogene Bakterien ausübt, die in dem Intestinum auf­ treten, und weist einen hohen Grad an Eisenbedarf we­ gen seiner charakteristischen eisenbindenden Fähigkeit auf. Das heißt also, daß Lactoferrin als ein wichti­ ges Milchprotein angesehen werden kann, das nicht nur als ein Nahrungsmittel dient, sondern auch eine phar­ makologische Signifikans als ein Anti-Infektionsmit­ tel besitzt, in gleicher Weise wie in der Milch vor­ handene Immunglobuline und Lysozym.

Im Hinblick auf die vorstehend beschriebenen charakte­ ristischen Eigenschaften von Lactoferrin wurden bereits eine Anzahl von Verfahren zur Abtrennung von Lactofer­ rin von Milch und seine Reinigung vorgeschlagen. Da je­ doch Lactoferrin ein Protein mit einer hoch-reaktions­ fähigen Molekularstruktur ist und auch zur Wechselwir­ kung mit anderen Milchproteinen neigt, war es bisher schwierig, eine hochreine Form von Lactoferrin leicht und mit gutem Wirkungsgrad nach herkömmlichen Verfahren zu isolieren.

So umfaßt beispielsweise ein herkömmliches Verfahren zum Abtrennen und Reinigen von Lactoferrin, daß von Magermilch, von der Fett abgetrennt worden ist, durch isoelektrische Ausfällung bei pH 4,6 Kasein abgetrennt wird, die entstehende Molkefraktion mit Ammoniumsulfat ausgesalzt wird, die entstehende Fraktion gegen ent­ ionisiertes Wasser dialysiert wird und dann das Dialy­ sat mehrere Male durch ein Ionenaustauschharz geschickt wird (Gordon et al.: Biochim. Biophys. Acta, 60, 410-411, 1962; Merton L. Gloves et al.: Biochim. Biophys. Acta, 100, 154-162, 1965; Johansson, D. G. et al.: Acta Chem. Scand., 23, 683, 1969). Weiterhin schließen abwand­ lungen des vorstehend beschriebenen Verfahrens das Ver­ fahren ein, bei dem Silica-Teilchen anstelle des Ionen­ austauschharzes verwendet werden (Japanische Patent-Offen­ legungsschrift Nr. 28 233/1983) und das Verfahren, bei dem, nachdem die Dialysatlösung durch ein Ionenaustausch­ harz geleitet worden ist, das entstehende Produkt wei­ terhin der Kupfer-Affinitätschromatographie unterworfen wird (Norihiro Kawakata, Yoshio Yoshino, et al., Ab­ stracts of Lectures at the 1983 Annual Meeting of the Japan Biochemical Society, Seite 1053). Diese Verfah­ ren besitzen jedoch alle keine praktische Brauchbar­ keit, da sie mühsame Verfahrensschritte und eine unge­ wöhnlich lange Behandlungszeit erfordern.

Weiterhin kann bei den vorstehend beschriebenen Verfah­ ren, bei denen ein Ionenaustauschharz verwendet wird, die Verunreinigung des Produktes mit Immunglobulinen und anderen in der Milch vorhandenen Proteinen nicht vermieden werden, da Lactoferrin die Eigeschaft be­ sitzt, mit anderen in der Milch vorhandenen Proteinen in Wechselwirkung zu treten. Demzufolge ist es schwie­ rig, in der Praxis eine hochreine Form von Lactofer­ rin zu isolieren. Darüber hinaus besitzen diese Verfah­ ren auch die Nachteile, daß die wiederholte Behandlung durch Aussalzen und Ionenaustausch nicht nur eine merk­ liche Verringerung in der Rückgewinnung von Lactofer­ rin bewirken, sondern es auch praktisch unmöglich ma­ chen, andere Milchproteine (als Lactoferrin) und ande­ re Milchbestandteile, die in den Rückständen, die wäh­ rend der Separierung und Reinigung von Lactoferrin erhalten werden, vorhanden sind, zurückzugewinnen und widerzuverwenden.

Als ein Ergebnis der Untersuchungen, die zur Lösung der vorstehend beschriebenen, bei den bekannten Ver­ fahren zur Isolierung einer hochreinen Form von Lacto­ ferrin aus Milch auftretenden Probleme durchgeführt wurden, haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung gefunden, daß sich ein monoklonaler Antikörper gegen bovines Lactoferrin mit Lactoferrin spezifisch kombi­ niren kann und daß solch ein monoklonaler Antikörper gegen bonives Lactoferrin durch eine Hybridzelle, ein Hybridoma, erzeugt wird, die durch Verschmelzen von Milzlymphozyten von einer mit bovinem Lactoferrin im­ munisierten Maus mit Mäuse-Myelomzellen gebildet wer­ den kann.

Dementsprechend ist es Aufgabe der vorliegenden Erfin­ dung, ein Hybridoma zu schaffen, das fähig ist, einen monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin zu erzeugen, der mit Vorteil für die Isolation von bovi­ nem Lactoferrin aus Milch in einem hoch-reinen Zustand und mit hoher Ausbeute verwendet werden kann.

Das Verfahren zur Bildung von Hybridomas, die monoklo­ nale Antikörper erzeugen, durch Verschmelzen von Milz- Lymphozyten von einer immunisierten Maus mit Mäuse-Mye­ lomzellen wurde zuerst von G. Köhler und C. Milstein ver­ öffentlich (Nature, 256, 495-497, 1975). Seit dieser Zeit sind viele Berichte über die Bildung von Hybrido­ mas durch Zellfusion erschienen und auch wissenschaft­ liche Forschungen über Antikörper, die durch diese Hy­ bridomas erzeugt werden, und ihre Anwendung durchge­ führt worden.

Beim Anwenden dieses allgemeinen Verfahrens zur Bildung von Hybridomas auf die Erzeugung eines neuen Hybridoma, das zur Erzeugung eines besonderen monoklonalen Anti­ körpers fähig ist, treten jedoch vom Standpunkt des Be­ triebsverfahrens verschiedene Schwierigkeiten auf. So können in Abhängigkeit von dem Typ des als Antigen verwendeten Proteins bei der Bildung eines Hybridoma spezielle Maßnahmen in späteren Verfah­ ren für Immunisierung und Zellfusion erforderlich sein, und es können Einflüsse auf die Auswahltechnik zum Iso­ lieren des gewünschten Hybridoma ausgeübt werden.

Das zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines Lactoferrin fähige Hybridoma gemäß der vorlie­ genden Erfindung kann gebildet werden, indem Milzlympho­ zyten von der Milz aufgesammelt werden, die von einer mit Lactoferrin immunisierten Maus herausgeschnitten worden ist, und diese Milzlymphozyten mit Mäuse-Myelom­ zellen auf die herkömmliche Weise verschmolzen werden. Das Verfahren zur Bildung des vorstehend beschriebenen Hybridoma wird nachfolgend beschrieben.

Eine Human-Lactoferrin-Zubereitung mit einer Reinheit von 98% ist zwar Handelsprodukt, aber bovines Lactoferrin ist nicht kommerziell erhältlich. Deshalb wird Kasein von bovinem Colostrum durch isoelektrische Ausfällung entfernt, und die entstehende Molke- oder Milchserumfraktion wird nach einem herkömmlichen Ver­ fahren behandelt (z. B. Johansson, B. G. et al.: Acta Chem. Scand., 23, 683, 1969), um eine bovine Lactoferrin­ fraktion mit einer Reinheit von etwa 60% zu erhalten.

Dann wird eine Lösung von bovinem Lactoferrin herge­ stellt (üblcherweise unter Verwendung einer Phosphat­ puffersalzlösung (PBS), pH 7,2, die 0,15 M Natrium­ chlorid enthält) und mit einer gleichen Menge Freundschem Adjuvans gemischt, um eine Emulsion zu bil­ den. Durch Injizieren dieser Emulsion in die Bauchhöhle wird eine Maus (die üblicherweise 6 bis 8 Wochen alt ist) dreimal mit Intervallen von zwei Wochen immuni­ siert. Für diesen Zweck muß eine hochreine Form von bovinem Lactoferrin verwendet werden.

Zu diesem Zweck ist es wünschenswert, die Reinheit von bovinem Lactoferrin zu erhöhen, indem ein Antiserum gegen bovine Immunglobuline verwendet wird, um Immun­ globuline aufzunehmen, die die Hauptverunreinigungen sind, die in der bovinen Lactoferrinfraktion vorhanden sind.

Wenn die Reinheit von bovinem Lactoferrin niedrig ist, ist es schwierig, das gewünschte Hybridoma zu erhalten. Der Grund hierfür ist, daß eine Maus leichter mit bo­ vinem Immunglobulinen als mit bovinem Lactoferrin immu­ nisiert wird, und deshalb wird der Titer des Antikör­ pers gegen bovines Lactoferrin nicht vollständig ange­ hoben.

Es gibt keine besondere Beschränkung für den Typ Mäuse, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Es ist jedoch üblicherweise wünschenswert eine Maus vom BALB/c-Stamm zu verwenden.

Gemäß dem Stand der Technik werden üblicherweise Milz­ lymphozyten für die Verwendung bei der Herstellung eines zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers fähigen Hybridoma von einer Mäusemilz aufgesammelt, die 3 oder 4 Tage nach der Endimmunisierung mit einem spezifischen Antigen herausgeschnitten worden ist. Im Falle von bo­ vinem Lactoferrin, auf das die vorliegende Erfindung gerichtet ist, erreicht der Titer des Antikörpers, der in der Maus gemessen worden ist, nicht ein Maximum 3 oder 4 Tage nach der Endimmunisierung, und die anti­ körpererzeugenden Zellen unter den Milzlymphozyten sind zu dieser Zeit nicht ausreichend aktiviert. Dem­ zufolge ist die Rate der Bildung eines gewünschten Hybridoma, das zur Erzeugung eines monoklonalen Anti­ körpers gegen bovines Lactoferrin fähig ist, unzufrie­ denstellend niedrig.

Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, daß die Rate der Bildung des besagten Hybridoma stark erhöht werden kann, indem Milzlymphozyten verwendet werden, die von einer Milz aufgesammelt werden, die aus einer Maus 6 oder 7 Tage nach der Endimmunisierung mit Lactoferrin herausgeschnitten wird.

Die Milzlymphozyten (hier im folgenden als Milzzellen bezeichnet), die von der Mäusemilz auf die vorstehend angegebene weise aufgesammelt worden sind, werden dann mit Mäuse-Myelomzellen (hier im folgenden als Myelom­ zellen bezeichnet) verschmolzen.

Es besteht keine besondere Beschränkung für den Typ der Myelomzellen, die bei der vorliegenden Erfindung ver­ wendet werden. Wenn es jedoch gewünscht wird, sie mit Milzzellen, die von einer Maus vom BALB/c-Stamm erhal­ ten worden sind, zu verschmelzen, ist es vorzuziehen, SP 2/O-Ag 14-Zellen (als ATCC CRL 1581 erhältlich) zu verwenden, die nicht die K-Kette von IgG sekretieren. Die Verschmelzung kann nach irgend­ einem herkömmlichen Verfahren durchgeführt werden. Wenn jedoch SP 2/O-Ag 14-Zellen als Myelomzellen verwen­ det werden, ist es wesentlich, daß die Verschmelzungs­ zeit, einschließlich der Zugabe eines Verschmelzungs­ beschleunigers (Verschmelzungseinleiters), des Mischens und der Verdünnung, im Bereich von 5 bis 15 Minuten und vorzugsweise 9 bis 11 Minuten liegen sollte.

Wenn die Verschmelzungszeit kürzer als 5 Minuten ist, wird die Verschmelzung unvollständig sein, während dann, wenn sie länger als 15 Minuten ist, die Zellen durch Vergiftung durch Polyäthylenglycol, das als Verschmel­ zungsbeschleuniger (Fusionspromoter) vrwendet wird, absterben werden. In diesem Zusammehang ist zu bemer­ ken, daß dann, wenn die Verschmelzungszeit im Bereich von 9 bis 11 Minuten liegt, die Rate der Koloniebil­ dung 100% annähern wird. Wenn Milzzellen von einer Maus vom BALB/c-Stamm, die mit bovinem Lactoferrin immunisiert ist, mit SP 2/O-Ag 14-Zellen verschmolzen werden, kann die Rate der Koloniebildung (die Ver­ schmelzungsrate) stark erhöht werden, indem Polyäthy­ lenglycol von gaschromatischer Qualität (Molekularge­ wicht 4000) als ein Verschmelzungs­ beschleuniger mit einer Konzentration von 50% verwen­ det wird.

Nach Abschluß der Verschmelzung können die verschmolze­ nen Zellen auf die herkömmliche Weise behandelt werden. Typischerweise werden die geschmolzenen Zellen in HT- Medium (Dulbecco-modofiziertes MEM-Medium, das Hypo­ xanthin, Thymidin und 10% fötales Kalbserum enthält) dispergiert, über eine 96-Löcher-Mikrotiterplatte ge­ sprüht und bei einer Temperatur von 37°C unter einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid kultiviert. Von dem folgenden Tag an wird Auswahl von Hybridomas in HAT- Medium (Dulbecco-modifiziertes MEM-Medium, das Hypo­ xanthin, Aminopterin, Thymidin und 10% fötales Kalb­ serum enthält) durchgeführt.

Sobald die Kolonien bis zu einer ausreichenden Größe angewachsen sind, werden die Hybridomas nach dem Fe­ ste-Phase-Verfahren klassiert. Dann werden die Hybri­ domas, die eine positive Reaktion zeigen, nach dem be­ grenzten Verdünnungsverfahren geklont.

In einer Ausführungsform wird das Feste-Phase-Verfahren durchgeführt, indem bewirkt wird, daß ein lösliches Antigen an einer sanft arbeitenden oder weichen 96-Lö­ cher-Mikrobohrungseinheit ad­ sorbiert wird, die Bohrungen mit bovinem Serumalbumin (BSA) behandelt werden, um die Abschnitte zu blockie­ ren, an denen das Antigen nicht adsorbiert ist, und die überstehende Flüssigkeit des vorgenannten Kultur­ mediums in die Bohrungen gegeben wird, um Reaktion mit dem Antigen zu bewirken. Nach Beendigung der Reaktion werden die Bohrungen gründlich gewaschen, und Antikör­ per gegen biotinylierte Mäuse-Antikörper werden als zweite Antikörper dort hinzugegeben. Danach werden die Bohrungen mit Avidin und Fluoreszein-markiertem Biotin behandelt, um die gewünschten Antikörper durch die Erzeugung von Fluores­ zenz zu erfassen und nachzuweisen.

Das lösliche Antigen, das für diesen Zweck verwendet wird, muß bovines Lactoferrin sein, das eine Reinheit besitzt, die so groß wie möglich ist. Der Grund dafür ist, daß dann, wenn die Reinheit des bovinen Lacto­ ferrins gering ist, die Hybridomas auch für Verunrei­ nigungsantigene eine positive Reaktion zeigen, und dies macht es schwierig, ein gewünschtes Hybridoma heraus­ zufinden, das einen monokonalen Antikörper gegen bo­ vines Lactoferrin erzeugt.

In einer Ausführungsform wird das begrenzte Verdünnungs­ verfahren folgendermaßen durchgeführt: Eine Dispersion von 10⁸ Mäuse-Thymuszellen und 50 Hybridomazellen in 10 ml HT-Medium wird über eine 96-Löcher-Mikrotiterplatte so gesprüht, daß eine oder weniger Hybridomazellen in jeder Bohrung vorhanden sein wird, und auf diese Weise werden einzelne Kolonien von dem Hybridoma gebildet. Die Mäuse-Thymuszellen werden als Beschickungszellen oder Feeder-Zellen hinzugegeben, weil Hybridomazellen bei niedrigen Zelldichten nicht wachsen können.

Das vorstehend bechriebene Kolonierungsverfahren wird drei oder mehr Male wiederholt, um ein monogeklontes Hybridoma zu erhalten.

Dann kann das entstehende Hybridoma, das zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines Lactoferrin fähig ist, auf die übliche Weise weitergezüchtet werden. Spezieller wird das Hybridoma in die Bauchhöhle von Mäusen injiziert und deren aszitisches Fluid rückge­ wonnen. Alternativ dazu wird das Hybridoma in einem geeigneten Medium kultiviert und dessen überstehende Flüssigkeit zurückgewonnen. Das rückgewonnene aszitische Fluid oder die überstehende Flüssigkeit wird dann durch Ausfällen mit Ammoniumsulfat und Ionenaustauschchroma­ tographie gereinigt, um den monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin zu gewinnen.

In einer Ausführungsform kann der monoklonale Antikör­ pr gegen bovines Lactoferrin folgendermaßen herge­ stellt werden:

Zellen von dem vorgenannten Hybridoma werden in einer Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) dis­ pergiert und in die Bauchhöhle von Mäusen vom BALB/c- Stamm injiziert, denen vorher Pristan (2,6,10,14-Tetra­ methylpentadecan) verabreicht worden war. Nach 7 bis 10 Tagen wird hier aszitisches Fluid aufgesammelt, durch Zentrifugieren geklärt oder gereinigt, mit PBS so ver­ dünnt, daß eine Proteinkonzentration von der Größen­ ordnung von 10 bis 12 mg/ml entsteht, und dann mit 45% Sättigungs-Ammoniumsulfat ausgesalzt. Eine Lösung von der entstehenden Ausfällungsfraktion wird dialy­ siert und dann durch Ionenaustauschchromatographie ge­ reinigt.

Dann können die so erhaltenen monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin bei der Abtrennung und Rei­ nigung von bovinem Lactoferrin verwendet werden. Dies kann durchgeführt werden, indem eine Affinitäts-chroma­ tographische Säule von dem Antikörper nach dem im fol­ genden beschriebenen Verfahren hergestellt wird und eine Lösung von bovinem Roh-Lactoferrin, die von Milch abgetrennt worden ist, durch die Affinitäts-chromato­ graphische Säule hindurchgeschickt wird.

Herstellung einer Affinitäts-chromatographischen Säule:

Der monoklonare Antikörper gegen bovines Lactoferrin, der auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt worden ist, wird mit einer gleichen Menge eines unlös­ lichen Trägers für die Verwendung bei Affinitäts-Chro­ matographie (z. B. Affigel-10) gemischt, und diese Mischung wird bei niedriger Temperatur ge­ rührt, um den Antikörper an dem Träger zu binden und zu fixieren. Nach dem Waschen werden diejenigen funk­ tionellen Gruppen auf dem Träger, an denen der besagte Antikörper nicht anhaftet oder nicht gebunden ist, in­ aktiviert, und der Träger wird dann gewaschen. Das ent­ stehende Affinitätsgel wird in eine Säule mit geeigne­ ter Größe gepackt, um eine Affinitäts-chromatographi­ sche Säule zu bilden. Bovines Roh-Lactoferrin, das von Milch erhalten worden ist, wird in einer Phosphatpuffer- Salzlösung (PBS) gelöst, und die entstehende Lösung wird durch die vorstehend beschriebene Säule geleitet. Dann wird das Affinitätsgel innerhalb der Säule mit PBS gewaschen, um die nicht adsorbierte Fraktion zu entfernen, woraufhin gründliches Waschen mit PBS, die 0,5 M Natriumchlorid enthält, und dann 0,15 M Natrium­ chloridlösung folgt. Danach wird das adsorbierte bo­ vine Lactoferrin mit einer Acetatpufferlösung, pH 2,7, die 0,15 M Natriumchlorid enthält, eluiert. Die Eluat­ fraktion, die bovines Lactoferrin enthält, wird auf pH 7 eingestellt, gegen entionisiertes Wasser dialy­ siert und dann gefriergetrocknet, um bovines Lactofer­ rin mit einer Reinheit von 98% oder höher zu erhalten.

Die vorliegende Erfindung wird weiterhin durch das fol­ gende Beispiel näher erläutet.

Beispiel

Unter Verwendung eines Ionenaustauschharzes wurde eine bovine Lactoferrinfraktion von bovinem Colostrum oder boviner Vormilch nach dem herkömmlichen Verfahren ab­ getrennt (Johansson, B. G. et al.: Acta Chem.Scand., 23, 683, 1969). Diese bovine Lactoferrinfraktion besaß eine Reinheit von 60%.

Zu der vorstehenden bovinen Lactoferrinfraktion wurde ein Antiserum gegen bovine Immunglobuline hinzugegeben. Auf diese Weise wurden bovine Immunglobuline, die die Hauptverunreinigungen bildeten, aufgenommen, um die Reinheit des bovinen Lactoferrins auf etwa 90% zu er­ höhen.

Das so erhaltene bovine Lactoferrin wurde in einer Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS), pH 7,2, die 0,15 M Natriumchlorid enthielt, so gelöst, daß sich eine Konzentration von 0,3% ergab. Diese Lösung wurde mit einer gleichen Menge Freundschem vollsätndigem Adju­ vans (Freund's complete adjuvant) gemischt, um eine Emulsion zu bilden. Eine Maus vom BALB/c-Stamm, die 6 bis 8 Wochen alt war, wurde durch Injizieren der Emulsion in ihre Bauchhöhle immunisiert. Diese Immu­ nisierung wurde dreimal in Intervallen von 2 Wochen wiederholt. Sieben Tage nach der Endimmunisierung wurde die Milz von der Maus herausgeschnitten und Milzzellen wurden davon entnommen. Diese Milzzellen wurden in DMEM-Medium (Dulbecco-modifiziertes-Minimum-essentiel­ les-Medium) dispergiert und mit SP 2/O-Ag 14 Mäuse-Myelom­ zellen in einem Verhältnis von 2 : 1 gemischt. Zu dieser Mischung wurde eine 50%ige Lösung von Polyäthylenglycol (gaschromatographische Qualität, Molekulargewicht 4000) als Verschmelzungsbeschleuniger oder Fusionspromotor hinzugegeben. Auf diese Weise wurde die Verschmelzung der Zellen in 10 Minuten fertiggestellt. Die entstandenen verschmolzenen Zellen wurden durch Zentrifugieren von Polyäthylenglycol abgetrennt, in HT-Medium so dispergiert, daß sich eine Zelldichte von 1 × 10⁷ Zellen/ml oder weniger ergab, über 96 Löcher- Mikrotiterplatten gesprüht und bei 37°C unter einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid kultiviert. Von dem Ta­ ge nach dem Beginn der Kultur (d. h. dem ersten Tag) wurde die Hälfte des Mediums kontinuierlich mit HAT- Medium ausgetauscht. An dem 17. Tag wurden Hybridomas nach dem Feste-Phase-Verfahren klassiert. Als Ergebnis hatten 100% der Hybridomas eine Kolonie gebildet und 8,3% der Hybridomas zeigten eine positive Reaktion für bovines Lactoferrin.

Dann wurden die Hybridomas, die eine positive Reaktion zeigten, zu 24-Löcher-Mikrotiterplatten überführt und geklont, sobald sie zu einer Zelldichte von 1 × 10⁵ Zellen/ml gewachsen waren. Danach wurden sie in HT- Medium zwei Wochen lang kultiviert, und die Hybridomas, die eine einzige Kolonie in der Bohrung bildeten, wur­ den einem zweiten Klonen unterworfen.

Dieses Klonierungs- und Klassierungsverfahren wurde dreimal wiederholt. Auf diese Weise wurden Monoklone von einem Hybridoma erhalten, das fähig war, einen Antikörper gegen bovines Lactoferrin zu erzeugen.

Eine Probe von dem entstandenen Hy­ bridoma, das fähig ist, einen monoklonalen Antikörper gegen bovines Lactoferrin zu erzeugen, wird in der American Type Culture Collection, 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20 852-1776 unter der Hinterlegungs­ nummer (Deposition No.) ATCD HB 8852 aufbewahrt.

Claims (6)

1. Zur Erzeugung eines monoklonalen Antikörpers gegen bovines Lactoferrin fähiges Hybridoma, das sich spezifisch mit bovinem Lactoferrin kombinieren kann, dadurch gekennzeichnet, daß es durch Verschmelzen von Milzlymphozyten von einer mit bovinem Lactoferrin immunisierten Maus mit Mäuse-Myelomzellen erhalten worden ist.

2. Verfahren zur Bildung des Hybridomas nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Milzlymphozyten von einer mit bovinem Lacto­ ferrin immunisierten Maus mit Mäuse-Myelomzellen verschmilzt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Lösung von bovinem Lactoferrin, das von der Molke- oder Milchserumfraktion von Milch abgetrennt worden ist, hergestellt wird; eine Maus mit einer Emulsion, die durch Mischen gleicher Mengen der Lactoferrinlösung und Freudschem vollständigen Adjuvans gebildet wird, immunisiert wird;
Milzlyphozyten von der Milz der Maus entnommen werden;
Milzlympho­ zyten mit Mäuse-Myelomzellen verschmolzen werden und die entstehenden verschmolzenen Zellen kulti­ viert werden;
die gebildeten Hybridomas in HAT- Medium selektiert werden;
die selektierten Hybri­ domas nach dem Feste-Phase-Verfahren gesiebt oder klassiert werden, um ein Hybridoma zu erhalten, das eine positive Reaktion zeigt;
und das Hybridoma einem Klonierungsverfahren unterworfen wird, um einen Monoklon des Hybridomas zu erhalten.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lösung aus bovinem Lactoferrin durch Abtrennen von bovi­ nem Lactoferrin von der Molkefraktion von Rinder­ vormilch oder bovinem Colostrum hergestellt wird, ein Antiserum gegen bovine Immunglobuline zu dem bovinen Lactoferrin hinzugegeben wird, um die bovinen Imunglobuline und andere darin vorhandene Verunreinigungen aufzunehmen und zu entfernen, und das entstehende gereinigte bovine Lactoferrin in einer Phosphatpuffer-Salzlösung (PBS) gelöst wird.

5. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß Milzlymphozyten, die von einer Mäusemilz entnommen sind, die 6 oder 7 Tage nach der Endimmunisierung mit bovinem Lactoferrin herausgeschnitten wird, als die ge­ nannten Milzlymphozyten verwendet werden, SP 2/O- Ag 14-Zellen als die besagten Mäuse-Myelomzellen verwendet werden und diese Zellen über eine Zeit­ dauer von 5 bis 15 Minuten und vorzugsweise 9 bis 11 Minuten miteinander verschmolzen werden.

6. Verwendung des Hybridomas nach Anspruch 1 zur Herstellung eines monoklonalen Antikörpers, der zur Isolation von Lactoferrin aus Milch in einem hochreinen Zustand fähig ist.