DE3811083C2

DE3811083C2 -

Info

Publication number: DE3811083C2
Application number: DE3811083A
Authority: DE
Inventors: Kyoko Katsuta Jp Imai; Yasushi Mito Jp Nomura
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1987-04-01
Filing date: 1988-03-31
Publication date: 1993-02-18
Also published as: DE3811083A1; JP2564540B2; US5055415A; JPS63246671A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Immunoassay, insbe sondere ein Immunoassay bei dem die Antigensubstanz, die elektrisch neutral ist oder nur eine geringe elektrische Ladung trägt, mit einer elektrischen Ladung versehen wird damit sie in den Zustand versetzt wird unter Elektrophorese zu wandern, oder bei dem die Antigensubstanz die bereits eine elektrische Ladung trägt, zum Zwecke der Verbesserung ihrer Wanderungsfähigkeit noch zusätzlich elektrisch geladen wird, wodurch diese Substanz in vorteilhafter Weise quanti tativ bestimmt werden kann.

Ein typisches Beispiel für eine praktisch durchgeführte Methode ist der Radioimmunoassay. Der Radioimmunoassay macht jedoch problematische Arbeitsvorgänge erforderlich. Aus diesem Grunde wurde unter Ausnutzung der Elektrophorese ein hochempfindlicher Immunoassay entwickelt. Diesbezüg liche Methoden sind z. B. bei Strecker et al., Chemiker-Zeitung 103 (1979), S. 53-68, in der DE-PS 24 06 959 und in der US-PS 46 28 035 beschrieben. Bei dem Elektrophorese-Immunoassay aus US-PS 46 28 035 wird ein Reaktionsträger zwischen der Anode und der Kathode eines Elektrophoresege rätes plaziert, wobei zuvor an den Reaktionsträger ein Antikörper, der spezifisch mit der zu bestimmenden Substanz reagiert, gebunden worden ist. Durch elektrophoretische Wanderung wird die zu bestimmende Substanz an den Reaktions träger herangeführt und einer Antigen-Antikörper-Reaktion unterworfen, wobei der Antikörper spezifisch mit der zu bestimmenden Substanz im Träger reagiert. Gemäß dieser Methode werden bei der quantitativen Bestimmung einer Substanz in der Probe kontaminierende Materialien in der Probe, die Meßfehler verursachen, lediglich durch Elektro phorese durch den Reaktionsträger hindurch geführt, wodurch eine Zurückhaltung im Träger und eine hierdurch bedingte Beeinträchtigung der Antikörper-Reaktion im Träger vermieden werden. Deshalb ist die Meßgenauigkeit hoch, und weil die zu bestimmende Substanz durch Elektrophorese im Reaktionsträger konzentriert wird, können selbst Spurenbestandteile von Blut mit hoher Empfindlichkeit bestimmt werden.

Weiterhin beschreibt EP-A 01 86 799 ein analytisches Mittel zum Nachweis einer Komponente eines bioaffinen Bindungspaares in einer Flüssigkeit, wobei mehrere hintereinander angeordnete Funktionsfelder des Mittels, die für die nachzuweisende Komponente einen bioaffinen Bindungspartner an eine Festphase gebunden enthält, mit der Flüssigkeit in Berührung gebracht werden. D. h. die Reaktion des bioaffinen Bindungspaares erfolgt an der festen Phase.

Um jedoch eine Substanz nach der oben beschriebenen Methode bestimmen zu können ist es wesentlich, daß die zu bestim mende Substanz durch elektrophoretische Wanderung beim Reaktionsträger ankommt. Bei Substanzen mit einer elektri schen Ladung, wie Proteinkomponenten, kann der Elektro phorese-Immunoassay erfolgreich eingesetzt werden. Auf Substanzen ohne elektrische Ladung läßt sich die Elektro phorese jedoch nicht anwenden. Aus diesem Grunde ist die beschriebene Methode für die quantitative Bestimmung von Substanzen, die elektrisch neutral sind oder keine oder nur eine geringe elektrische Ladung tragen, wie Haptene oder Steroidhormone, nicht in Erwägung gezogen worden. Ein weiterer Nachteil besteht darin, daß bei einer zu bestimmen den Substanz, die zwar eine elektrische Ladung besitzt, jedoch in einer Probe in einer sehr niedrigen Konzentration vorliegt, diese Substanz keine guten Wanderungseigenschaften aufweist und aus diesem Grund nicht mit hoher Empfindlich keit bestimmt werden kann.

Eine Aufgabe der Erfindung besteht somit darin, einen Immunoassay bereitzustellen, bei dem mit hoher Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit mittels Elektrophorese ein Antigen bestimmt werden kann.

Diese Aufgabe wird durch die Immunoassays gemäß Anspruch 1 oder 2 gelöst.

Der Immunoassay der Erfindung beinhaltet die Reaktion eines Antigens, das bestimmt werden soll, mit einer definierten Menge eines Antikörpers, der spezifisch mit diesem Antigen reagiert, mit dem Zweck, dieses Antigen mit einer elektri schen Ladung zu versehen oder dieses Antigen mit einer höheren elektrischen Ladung zu versehen; die Wanderung der Reaktionsprodukte durch Elektrophorese zu einem Reaktions träger zwischen Anode und Kathode in einer Elektrophorese vorrichtung; das direkte oder indirekte Fixieren des Anti körpers der nicht mit dem zu bestimmenden Antigen reagiert hat oder des Antikörpers der mit dem zu bestimmenden Antigen reagiert hat, auf dem Reaktionsträger; die direkte oder indirekte Bestimmung der Menge des nicht umgesetzten Anti körpers oder umgesetzten Antikörpers durch Markierung und damit quantitative Bestimmung des Antigens, das in der Probe bestimmt werden soll.

Als elekrisch neutral werden hierbei solche Stoffe ange sehen, die sich im Elektrophoresefeld elektrisch neutral verhalten.

Zur Bestimmung eines Antigens mit dem Immunoassay der Erfindung werden vorzugsweise die vier folgenden Varianten angewandt.

Die erste Immunoassay-Variante beinhaltet die Reaktion des zu bestimmenden Antigens mit einer definierten Menge eines markierten Antikörpers, der spezifisch reaktiv ist für das zu bestimmende Antigen; das vorherige Aufbringen des glei chen Antigens, wie das zu bestimmende Antigen auf den Reaktionsträger; die elektrophoretische Wanderung der Reaktionsprodukte in Richtung des Reaktionsträgers; die Durchwanderung des Reaktionsproduktes aus dem zu bestimmen den Antigen und dem damit reagierten markierten Antikörper durch den Reaktionsträger; die Bindung des nicht umgesetzten markierten Antikörpers an das gleiche Antigen wie das an den Reaktionsträger gebundene Antigen, das bestimmt werden soll, um nicht umgesetzten markierten Antikörper auf dem Reak tionsträger zu halten; die Bestimmung der Menge des nicht umgesetzten markierten Antikörpers durch Markierungsmessung; und hierdurch quantitative Bestimmung des in der Probe enthaltenen Antigens.

Eine zweite Immunoassay-Variante beinhaltet die Reaktion des zu bestimmenden Antigens und einer definierten Menge eines Kopplungsproduktes aus dem gleichen Antigen wie das zu bestimmende und einer geladenen Substanz mit einer definier ten Menge eines markierten Antikörpers, der spezifisch mit dem zu bestimmenden Antigen reagiert; das vorherige Aufbrin gen eines Antikörpers der spezifisch mit der geladenen Substanz reagiert, auf den Reaktionsträger; die elektro phoretische Wanderung der Reaktionsprodukte in Richtung des Reaktionsträgers; die Durchwanderung des Reaktionsproduktes aus dem zu bestimmenden Antigen und dem hiermit reagierten markierten Antikörper durch den Reaktionsträger; die Bindung des Reaktionsproduktes aus dem markierten Antikörper und dem Kopplungsprodukt aus dem gleichen Antigen wie es bestimmt werden soll und der geladenen Substanz an den Antikörper, der die spezifische Reaktivität für die geladene Substanz besitzt, die an den Reaktionsträger aufgebracht worden ist, um den markierten Antikörper auf dem Reaktionsträger zu halten; Bestimmung der Menge an markiertem Antikörper, der auf dem Reaktionsträger gehalten wird, durch Markierungs messung; wodurch das zu bestimmende Antigen in der Probe quantitativ erfaßt wird.

Eine dritte Immunoassay-Variante besteht in der Reaktion des Antigens, das bestimmt werden soll, und einer definierten Menge eines Kopplungsprodukts aus demselben Antigen wie es zu bestimmen ist und einer markierten geladenen Substanz mit einer definierten Menge eines ersten Antikörpers, der spezifisch mit dem zu bestimmenden Antigen reagiert; dem vorherigen Aufbringen bzw. Binden eines zweiten Antikörpers, der spezifisch mit dem ersten Antikörper reagiert, auf bzw. an den Reaktionsträger; der elektrophoretischen Wanderung der Reaktionsprodukte zum Reaktionsträger; der Bindung des Reaktionsprodukts aus dem zu bestimmenden Antigen und dem ersten Antikörper, der damit reagiert hat, und des Reak tionsprodukts aus dem Kopplungsprodukt desselben Antigens wie das zu bestimmende und der markierten geladenen Substanz und dem ersten Antikörper, der mit diesem Kopplungspro dukt reagiert hat, an den zweiten Antikörper, der an den Reaktionsträger gebunden ist, um sie auf dem Reaktionsträger zu halten; der Bestimmung der Menge des ersten Antikörpers aus der Reaktion mit dem Kopplungsprodukt aus demselben Antigen wie das zu bestimmende und der markierten Substanz unter den auf dem Träger gehaltenen Reaktionsprodukten durch Markierungsmessung; und hierdurch quantitative Erfassung des in der Probe zu bestimmenden Antigens.

Eine vierte Immunoassay-Variante umfaßt die Reaktion des zu bestimmenden Antigens und einer definierten Menge des markierten gleichen Antigens wie das zu bestimmende mit einer definierten Menge eines ersten Antikörpers, der spezifisch mit dem zu bestimmenden Antigen reagiert; das vorherige Aufbringen eines zweiten Antikörpers, der spezi fisch mit dem ersten Antikörper reagiert, auf den Reaktions träger; die elektrophoretische Wanderung der anderen Reak tionsprodukte als das nicht umgesetzte markierte Antigen zum Reaktionsträger; die Bindung des Reaktionsprodukts aus dem zu bestimmenden Antigen und dem ersten Antikörper, der hiermit reagiert hat, und des Reaktionsprodukts aus dem markierten Antigen und dem damit reagierten ersten Antikör per, an den zweiten Antikörper der an den Reaktionsträger gebunden ist, um die Reaktionsprodukte auf dem Reaktions träger zu halten; die Bestimmung der Menge des ersten Antikörpers, der mit dem markierten Antigen reagiert hat, unter den anderen Reaktionsprodukten, die auf dem Reaktions träger gehalten werden, durch Markierungsmessung; und damit quantitative Bestimmung des Antigens aus der Probe.

Neben diesen drei Varianten kann noch eine vierte Variante angewandt werden, in der die verschiedenen nicht markierten Substanzen im anfänglichen Stadium der Reaktion eingesetzt werden, wobei dann nach der Elektrophorese ein markierter Antikörper an den auf dem Reaktionsträger gehaltenen bzw. fixierten Antikörper gebunden wird, und nachfolgend die quantitative Bestimmung durch Markierungsmessung durchge führt wird. Im Detail beinhaltet diese Variante den Einsatz des zu bestimmenden Antigens zusammen mit einem damit spezifisch reaktiven Antikörper oder zusammen mit diesem Antikörper und einem Kopplungsprodukt aus dem gleichen Antigen wie das zu bestimmende und einer geladenen Substanz; Reaktion in der Anfangsphase in gleicher Weise wie in den oben beschriebenen ersten, zweiten und dritten Variante, ohne daß jedoch ein markierter Antikörper oder die markierte geladene Substanz benutzt wird; elektrophoretische Wanderung der Reaktionsprodukte zum Reaktionsträger; Kombination des Antikörpers oder der geladenen Substanz, die auf dem Reak tionsträger gehalten werden, mit einem markierten Antikör per, der spezifisch reaktiv hiermit ist; und Bestimmung der Menge des so kombinierten markierten Antikörpers durch Markierungsmessung, wobei damit das zu bestimmende Antigen in der Probe quantitativ bestimmt wird.

Nachfolgend ist die Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1 eine schematische Darstellung des Immunoassays der Erfindung

Fig. 2 eine Thyroxin (T₄)-Eichkurve gemäß der ersten Immunosassay-Variante der Erfindung

Fig. 3 eine Cortisol (Hydrocortison)-Eichkurve gemäß der zweiten Immunoassay-Variante der Erfindung

Fig. 4 eine T₄-Eichkurve gemäß der dritten Immunosassay-Variante der Erfindung

Fig. 5 eine Cortisol-Eichkurve gemäß der vierten Immunoassay-Variante der Erfindung

Fig. 6 eine T₄-Eichkurve gemäß der modifizierten ersten Immunoassay-Variante der Erfindung, und

Fig. 7 AFP-Eichkurven gemäß der ersten Immunoassay-Variante der Erfindung und einer konventionellen Methode.

Der Immunoassay der Erfindung beinhaltet die Reaktion eines zu bestimmenden Antigens, das elektrisch neutral ist oder keine oder nur eine geringe elektrische Ladung trägt, mit einer definierten Menge eines Antikörpers um dem Antigen eine elektrische Ladung zu verleihen; oder die Reaktion eines zu bestimmenden Antigens, das ursprünglich eine elektrische Ladung trägt, mit einer definierten Menge Antikörper um dem Antigen eine höhere elektrische Ladung zu verleihen; die Wanderung der Reaktionsprodukte zum Reak tionsträger; das Zurückhalten des nicht umgesetzten Antikör pers oder des umgesetzten Antikörpers auf dem Reaktions träger; und die Bestimmung der Menge des in einer Probe zu bestimmenden Antigens basierend auf der Menge des nicht umgesetzten Antikörpers oder des umgesetzten Antikörpers auf dem Reaktionsträger.

Die oben beschriebenen Varianten 1 bis 4 werden im folgenden unter Bezug auf die schematische Darstellung von Fig. 1 erläutert.

Die erste Variante ist in Fig. 1 (1) gezeigt. Hierbei wird z. B. ein in einer Probe zu bestimmendes Antigen A, das elektrisch neutral ist oder keine oder nur eine geringe elektrische Ladung trägt, mit einem markierten Antikörper BL, der spezifisch mit dem Antigen A reagiert, zur Reaktion gebracht. In der Reaktionslösung verbleiben ein Antigen- Antikörper-Reaktionsprodukt A-BL und der nicht umgesetzte Antikörper BL. Das das Antigen A an den elektrisch geladenen Antikörper BL gebunden ist, ist es damit mit einer elektrischen Ladung versehen worden, die es ihm ermöglicht, elektrophoresisch zu wandern. Bei der Elektrophorese wandert das Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukt A-BL durch einen Reaktionsträger T, während der nicht umgesetzte (überschüssige) Antikörper BL an das zuvor auf den Reaktionsträger T aufgebrachte Antigen A gebunden wird, so daß der überschüssige Antikörper BL hierauf festgehalten wird. Daraufhin wird die Menge des markierten Antikörpers BL auf dem Reaktionsträger gemessen. Aus diesem Grunde kann das Antigen A quantitativ dadurch bestimmt werden, daß die Menge des überschüssigen Antikörpers von der bekannten definierten Menge des markierten Antikörpers BL vor der Reaktion sub trahiert wird. Alternativ dazu kann mit Hilfe einer Eich kurve das Antigen A sofort aus dem Markierungswert für das Antigen A in der Probe bestimmt werden, wenn zuvor eine Eichkurve aufgestellt wurde, in der der Markierungswert gegen die Menge an Antigen aufgetragen wird.

Die zweite Variante wird in Fig. 1 (2) gezeigt. Ein in einer Probe zu bestimmendes Antigen A, eine definierte Menge eines Kopplungsprodukts aus demselben Antigen wie es zu bestimmen ist, und einer geladenen Substanz werden mit einer definierten Menge eines markierten Antikörpers BL, der spezifisch mit dem Antigen A reagiert, umgesetzt. In diesem Fall gehen das Antigen A und das Kopplungsprodukt AC eine Konkurrenzreaktion mit dem Antikörper BL ein, wobei jede resultierenden Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukte A-BL und AC-BL eine elektrische Ladung tragen und Elektrophorese-Wanderungsfähigkeit besitzen. Ein Antikörper BC′, der spezifisch mit der geladenen Substanz C reagiert, wird vorher auf dem Reaktionsträger T aufgebracht bzw. fixiert. Obwohl in Fig. 1 (2) die geladene Substanz C mit (- -) gekennzeichnet ist, und der Antikörper BC′ mit (+ +), ist dies lediglich als Beispiel zu sehen und konträre elektronische Ladungsverhältnisse sind als ebenso möglich anzusehen. Werden nun die Reaktionsprodukte einer Elektrophorese unterzogen, so wandert das Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukt A-BL durch den Reaktionsträger T, das Reaktionsprodukt AC-BL und das überschüssige Kopplungsprodukt AC werden jedoch durch den Antikörper BC′, der an den Reaktionsträger T gebunden ist, zurückgehalten. Die Menge des markierten Antikörpers im Reaktionsprodukt AC-BL, die auf dem Reaktionsträger zurückgehalten wird, wird durch Markierungsmessung bestimmt. Das überschüssige Kopplungsprodukt AC ist nicht markiert und zeigt deshalb keine Aktivität bei der Markierungsmessung. Auf diese Weise kann das in der Probe zu bestimmende Antigen A durch Messung des Markierungswertes des markierten Antikörpers im Reaktionsprodukt AC-BL quantitativ erfaßt werden.

Beispiele für geladene Substanzen, wie in der zweiten Variante verwendet, sind Proteine, wie Albumin, einschließ lich Rinderserum-Albumin, Kaninchenserum-Albumin und Human serum-Albumin, Globuline, einschließlich α-, β- oder Γ-Globulin, und Lipide, wie Dicetylphosphorsäure. Die geladene Substanz kann mit dem Antigen auf konventionelle Weise unter Verwendung eines Vernetzungsmittels, wie Glutaraldehyd, verknüpft werden. Der Antikörper kann an den Reaktionsträger zum Beispiel mittels Acrolein (US-PS 46 28 035) gebunden werden.

Die dritte Variante ist in Fig. 1 (3) gezeigt. Ein in der Probe zu bestimmendes Antigen A, eine definierte Menge eines Kopplungsproduktes ACL aus demselben Antigen wie das zu bestimmende, und eine markierte geladene Substanz, werden mit einer definierten Menge eines ersten Antikörpers B₁ mit Reaktionsspezifität für das Antigen A zur Reaktion gebracht. In diesem Fall gehen das Antigen A und das Kopplungsprodukt ACL mit dem Antikörper B₁ eine Konkurrenzreaktion ein und bilden Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukte A-B₁ und ACL-B₁, die in der Elektrophorese wandern können. Ein zweiter Antikörper B₂, der spezifisch mit dem ersten Antikörper B₁ reagiert, ist zuvor auf dem Reaktionsträger T fixiert worden. Wenn nun die Reaktionsprodukte einer Elektrophorese unterzogen werden, werden das Antigen-Antikörper- Reaktionsprodukt A-B₁ und das Reaktionsprodukt ACL-B₁ durch den zweiten Antikörper B₂, der auf dem Reaktionsträger T fixiert ist, zurückgehalten, das unumgesetzte Kopplungsprodukt ACL wandert jedoch durch den Reaktionsträger T. Die Menge des Reaktionsproduktes ACL-B₁, das auf dem Reaktionsträger T zurückgehalten wird, wird durch die Markierungsmessung bestimmt. Auf diese Weise kann das zu bestimmende Antigen A quantitativ bestimmt werden, basierend auf dem Markierungswert des Reaktionsproduktes ACL-B₁.

Für die dritte Variante kommen als geladene Substanzen die vorgenannten Substanzen in Frage. Die geladenen Substanzen können mittels konventioneller Methoden markiert werden.

Die vierte Variante ist in Fig. 1 (4) gezeigt. Ein in der Probe zu bestimmendes Antigen A und eine definierte Menge des markierten gleichen Antigens wie das zu bestimmende werden mit einer definierten Menge eines ersten Antikörpers B₁ zur Reaktion gebracht, der spezifisch mit dem Antigen A reagiert. In diesem Fall gehen das Antigen A und das markierte Antigen AL eine Konkurrenzreaktion um den ersten Antikörper B₁ ein und ergeben Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukte A-B₁ und AL-B₁, die unter Elektrophorese wandern können. Ein zweiter Antikörper B₂ mit spezifischer Reaktion zum ersten Antikörper B₁ wird zuvor auf einem Reaktionsträger T fixiert. Wenn die Reaktionsprodukte einer Elektrophorese unterzogen werden, werden das Antigen-Antikörper- Reaktionsprodukt A-B₁ und das Reaktionsprodukt AL-B₁ auf dem Reaktionsträger T aufgrund des dort vorhandenen zweiten Antikörpers B₂ zurückgehalten. Für den Fall jedoch, daß das markierte Antigen AL z. B. ein Hapten ist, z. B. ein Steroidhormon, ist das nicht umgesetzte markierte Antigen AL elektrisch neutral und kann aus diesem Grunde nicht wandern. Die Menge des Reaktionsproduktes AL-B₁, das auf dem Reaktionsträger T zurückgehalten wird, wird durch die Markierungsmessung bestimmt. Auf diese Weise kann das zu bestimmende Antigen A quantitativ bestimmt werden, basierend auf dem Markierungswert des Reaktionsproduktes AL-B₁.

Man kann aber auch zur Bestimmung eines Antigens in einer Probe eine Methode anwenden, in der gleichen Weise, wie in einer der oben erwähnten Variante, jedoch mit dem Unter schied, daß keine markierte Substanz für die Reaktion des Antigens und eines Antikörpers vor der Durchführung der Elektrophorese verwendet wird. In diesem Fall kann das betreffende Antigen dadurch quantitativ bestimmt werden, daß das Antigen mit dem nicht markierten Antikörper zur Reaktion gebracht wird, die Reaktionsprodukte durch elektrophore tische Wanderung an den Reaktionsträger herangebracht werden und daß dann weiter die Reaktionsprodukte oder die nicht reagierten nicht markierten Antikörper, die auf dem Reak tionsträger zurückgehalten werden, mit einem markierte Antikörper korrespondierend zu der markierten Substanz, so wie in den vorgenannten Methoden benützt, zur Reaktion gebracht werden. Eine Modifikation der ersten Variante des Immunoassays sieht z. B. wie folgt aus. Ein in einer Probe zu bestimmendes Antigen A wird mit einem für dieses Antigen spezifischen, nicht markierten Antikörper BL (ein erster Antikörper) zur Reaktion gebracht; man läßt die Reaktionsprodukte in der gleichen Weise wie oben beschriebenen, wandern. Das aus der oben erwähnten Reaktion resultierende Antigen-Antikörper-Reaktionsprodukt A-BL wandert durch einen Reaktionsträger. Der nicht umgesetzte erste Antikörper BL jedoch reagiert mit dem zuvor auf dem Reaktionsträger fixierten Antigen und wird im Reaktionsträger festgehalten. Dann wird ein markierter Antikörper (ein zweiter Antikörper) mit Reaktionsspezifität für den ersten Antikörper BL hinzuge fügt. Durch Messung der Markierungsmenge des Reaktionspro duktes aus dem ersten Antikörper, der auf dem Träger zurückgehalten wird, und dem zweiten Antikörper, der damit reagiert hat, kann das zu bestimmende Antigen quantitativ erfaßt werden. Der nicht reagierte markierte zweite Antikörper wandert durch den Reaktionsträger.

Auf ähnliche Weise kann die zweite Immunoassay-Variante wie folgt modifiziert werden. Ein in einer Probe zu bestimmendes Antigen A und ein Kopplungsprodukt AC werden mit einem nicht markierten Antikörper BL (ein erster Antikörper) zur Reaktion gebracht; die Reaktionsprodukte werden in der gleichen Weise wie nach Variante 2 durch Elektrophorese zur Wanderung gebracht. Daraufhin wird der Antikörper BL im Reaktionsprodukt AC-BL, der wegen des Antikörpers BC′ auf dem Träger zurückgehalten wird, mit einem markierten Antikörper (ein zweiter Antikörper), der spezifisch mit dem Antikörper BL reagiert, zur Reaktion gebracht; durch Messung der Markierungsmenge des zweiten reagierten Antikörpers kann das in der Probe zu bestimmende Antigen quantitativ erfaßt werden.

In ähnlicher Weise kann eine Modifikation der dritten Immunoassay-Variante unter Verwendung einer nicht markierten geladenen Substanz und eines markierten Antikörpers, der hiermit spezifisch reagiert, durchgeführt werden.

Wie oben beschrieben, wird erfindungsgemäß ein in einer Probe zu bestimmendes Antigen, das elektrisch neutral ist oder keine oder nur eine geringe elektrische Ladung trägt, durch Reaktion dieses Antigens mit einem Antikörper mit spezifischer Reaktivität für dieses Antigen befähigt, elektrophoresisch zu wandern; danach wird der Immunoassay unter Elektrophorese ausgeführt. Aus diesem Grunde kann das zu bestimmende Antigen mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit quantitativ bestimmt werden. Bevorzugte Bei spiele für zu bestimmende Antigene sind Steroidhormone, wie Thyroxin, Triiodothronin, Cortisol (Hydrocortison), Östro gen, Progesteron und Testosteron; Herzmittel, wie Digoxin und Digitalis; Antileptica, wie Phenobarbital und Amobarbi tal; sowie Vitamine, wie Vitamin D₃.

Obwohl in den oben beschriebenen Immunoassay-Varianten eine Markierungssubstanz, die am Reaktionsträger fixiert ist, gemessen wird, ist es aber auch möglich, das zu bestimmende Antigen quantitativ zu bestimmen, dergestalt, daß eine Markierungssubstanz in den Reaktionsprodukten, die durch den Reaktionsträger hindurch gewandert sind, gemessen wird.

Wie oben beschrieben, wird der Immunoassay an dem zu bestim menden Antigen, das elektrisch neutral ist oder keine oder nur eine geringe elektrische Ladung trägt, ausgeführt; selbstverständlich kann der Immunoassay aber auch mit geladenen Antigenen ausgeführt werden. Insbesondere kann ein Immunoassay mit einem geladenen Antigen geringer Konzentra tion gemäß der vorliegenden Erfindung vorteilhaft ausgeführt werden, da im Falle der vorliegenden Erfindung das geladene Antigen durch Antigen-Antikörper-Reaktion weitere Ladung erhält und damit die Wanderungseigenschaften verbessert werden. Beispiele für bevorzugte zu bestimmende Antigene sind Proteinantigene, wie α-Fetoprotein und Schilddrüsen stimulierende Hormone. Insbesondere kann das Protein-Antigen vorzugsweise nach der ersten Variante oder ihrer Modifika tion gemäß der vorliegenden Erfindung quantitativ bestimmt werden.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein in einer Probe zu bestimmendes Antigen, das elektrisch neutral ist oder nur eine geringe oder keine elektrische Ladung trägt, mit einem markierten und für dieses Antigen spezifischen Antikörper zur Reaktion gebracht. Als Antigen lassen sich z. B. Hap tene, wie Triiodothyronin (T₃) oder Thyroxin (T₄) bestimmen. Als Markierungssubstanz kommen z. B. in Frage fluoreszieren de Substanzen, wie Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und Tetramethylrohdaminisothiocyanat; phosphorescierende Sub stanzen, wie Luminol; Enzyme, wie alkalische Phospatase, Peroxidase und Glucosidase. Hinsichtlich der Markierungssub stanzen bestehen jedoch keine besonderen Beschränkungen. Die Markierungssubstanzen können an das Antigen oder den Anti körper nach bekannten Methoden gebunden werden (Advances S. Immunochemistry 6 (1969)43). Ein Reaktionsträger ist zwi schen Anode und Kathode einer Elektrophoresevorrichtung vorgesehen, wobei z. B. bei der ersten Immunoassay-Variante auf diesem Träger das gleiche Antigen wie das zu bestimmende zuvor fixiert wird. Ein Antigen oder ein Antikörper kann unter Verwendung eines Proteins, wie Rinderserum-Albumin, auf dem Reaktionsträger fixiert werden. Als Reaktionsträger können alle üblichen Materialien eingesetzt werden, z. B. Polyacrylamidgel- und Celluloseacetatmembranen.

Entsprechend der Variante 1 wird das in der Probe zu bestim mende Antigen mit einer definierten Menge des markierten Antikörpers umgesetzt, wobei das Reaktionsprodukt aus dem zu bestimmenden Antigen und dem markierten Antikörper eine elektrische Ladung trägt und aus diesem Grunde unter Elek trophorese wanderungsfähig ist. Die Menge des zu bestimmen den Antigens wird grob geschätzt und der markierte Antikör per wird in einem geringen Überschuß in Abhängigkeit von der geschätzten Menge des Antigens eingesetzt. Dann werden die Reaktionsprodukte elektrophoretisch an den Reaktionsträger herangebracht. In diesem Falle wandert das Reaktionsprodukt aus dem zu bestimmenden Antigen und dem markierten Antikör per durch den Reaktionsträger ohne mit dem zuvor auf dem Reaktionsträger fixierten Antigen (welches das gleiche ist wie das zu bestimmende) zu reagieren. Der nicht umgesetzte markierte Antikörper reagiert jedoch mit dem auf dem Reak tionsträger fixierten Antigen und wird auf diese Weise im Reaktionsträger zurückgehalten. Nach der Elektrophorese wird die Menge des markierten Antikörpers, der auf dem Reaktions träger zurückgehalten wird, durch Markierungsmessung be stimmt. Durch die Differenz der Mengen des markierten Antikörpers vor der Reaktion der Menge des unumgesetzten markierten Antikörpers, der auf dem Reaktionsträger zurück gehalten wird, wird die Menge des in der Probe zu bestimmen den Antigens mit hoher Empfindlichkeit und mit hoher Ge nauigkeit quantitativ bestimmt werden.

Bestimmung von T₄ gemäß der ersten Immunoassay-Variante der Erfindung

Eine detaillierte Erklärung wird im folgenden gegeben am Beispiel der quantitativen Bestimmung eines Haptens T₄ als Bestimmungsantigen. Ein Kopplungsprodukt aus T₄ und Albumin wurde hergestellt als vorbereitender Schritt um das T₄ an die Reaktionsmembran, die als Reaktionsträger dient, zu binden. Dazu wurden 200 g Rinderserum-Albumin (BSA) in 500 µl eines 0,1 molaren Phosphatpuffers (pH 6,8) gelöst. Des weiteren wurden 2 mg T₄-freier Säure (Hersteller: Sigma Chemical Co.) in 4 ml Dimethylformamid gelöst, und von der resultierenden Lösung eine Menge, die 50 µg T₄ entspricht, (100 µl) der BSA-Lösung hinzugefügt. Zu der resultierenden Lösung wurden 10 µl einer 1,5%igen Lösung, hergestellt durch Verdünnung von 0,3 ml einer 25%igen Glutaraldehyd lösung mit Phosphatpuffer, hinzugefügt. Danach wurde das resultierende Gemisch 2,5 Stunden bei 25°C stehen gelassen. Daraufhin wurde das Gemisch einer Sephadex G-100-Säule aufgegeben und das T₄-BSA-Kopplungsprodukt mit Hilfe eines Phosphatpuffers getrennt.

Das T₄-BSA-Kopplungsprodukt wurde auf einer Polyacryl amidgelmembran als Reaktionsträger nach folgendem Verfahren immobilisiert. Zu 0,5 ml der T₄-BSA-Kopplungsproduktfrak tion, wie nach obigen Verfahren erhalten, wurde eine 0,25 %ige wäßrige Lösung von Acrolein hinzugefügt; die resul tierende Lösung wurde unter Eiskühlung 30 Minuten stehen gelassen. Diese Lösung wurde dann ausreichend gegen einen 0,1 molaren Phosphatpuffer vom pH 7,4 und einem 1/15 molaren Anteil von NaCl (nachfolgend als PBS bezeichnet) dialysiert. Im Folgeschritt wurden zur dialysierten Lösung 1,5 ml einer 0,32 g/ml Acrylamid enthaltenden Lösung, 1,5 ml einer 0,016 g/ml enthaltenden Lösung von N,N′-Methylenbisacrylamid, 1,25 ml einer 46 µl/ml enthaltenden wäßrigen Lösung von N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin und 5,75 ml einer 1,25 mg/ml enthaltenden Ammoniumpersulfatlösung hinzugefügt und im folgenden ausreichend gerührt. Das resultierende Gemisch wurde anschließend in ein Gelmembran-bildendes Werkzeug aus Glas gegossen und stehen gelassen, wobei sich unter Gelierung die Membran bildete. Eine kreisförmige Membran mit einem Durchmesser von 9 mm wurde aus der gebildeten Membran ausgeschnitten und als Reaktionsträger benützt.

Als Elektrolyt für die Elektrolyse wurde ein Trisglycin puffer benutzt.

Die Messung wurde wie folgt ausgeführt. Eine T₄-Standard probe bekannter Menge wurde in einem leichten Überschuß mit einem kommerziell erhältlichen Fluorescein markierten Anti-T₄-Antikörper (FITC-markiert) zur Reaktion gebracht. Nach der Reaktion wurde die Lösung in den Reaktionsträger in einer Elektrophoresevorrichtung gegeben um die Elektro phorese bei einer Spannung von 250 Volt für 30 Minuten durchgeführt. Danach wurde der Reaktionsträger herausge nommen mit PBS gewaschen, und die Fluoreszenzintensität des nicht reagierten FITC-markierten Anti-T₄-Antikörpers wie er auf dem Reaktionsträger zurückgehalten wurde, gemessen. Für die Messung betrug die Anregungswellenlänge 485 nm und die Fluoreszenzmessungswellenlänge 520 nm.

Die Fluoreszenzintensität wurde an verschiedenen Proben, die T₄ in verschiedenen Konzentrationen enthielten, gemessen. Eine T₄-Eichkurve, wie sie auf Basis dieser Art Messungen erhalten wurde, ist in Fig. 2 gezeigt. Wie ersichtlich, wird in der Reaktionslösung bei geringen T₄-Konzentrationen in der Probe nur eine geringe Menge des Reaktionsprodukts aus dem T₄ in der Probe und dem markierten Anti-T₄-Antikörper gebildet; eine große Menge des nicht umgesetzten Anti-T₄- Antikörpers wird jedoch an das T₄-BSA-Kopplungsprodukt gebunden, das auf dem Reaktionsträger immobilisiert vor liegt, so daß die Fluoreszenzintensität höher wird, die durch Markierungsmessung für den gebundenen markierten Anti-T₄-Antikörper bestimmt wird. Mit wachsender T₄-Konzen tration wird die Menge des nicht umgesetzten markierten Anti-T₄-Antikörpers abnehmen und damit auch die Menge des an den Reaktionsträger gebundenen nicht umgesetzten Antikör pers, was zu einer niedrigen Fluoreszenzintensität führt. Auf diese Weise ist erfindungsgemäß die T₄-Konzentration mit hoher Genauigkeit mit der Fluoreszenzintensität korreliert, und beim Vorliegen einer Eichkurve für die T₄-Konzentration kann die T₄-Konzentration direkt durch Messung der Fluores zenzintensität bestimmt werden.

Beispiel 2 Bestimmung von Cortisol (Hydrocartison) nach Variante 2 der Erfindung

Als ein in der Probe zu bestimmendes Antigen wurde Cortisol verwendet. Ein Kopplungsprodukt aus Cortisol und Rinder serum-Albumin (BSA) und ein Reaktionsträger mit einem daran gebundenen Anti-BSA-Antikörper wurden in gleicher Weise wie in Beispiel 1 hergestellt.

Eine Probe mit Cortisol und dem Cortisol-BSA-Kopplungs produkt wurde mit einer bekannten Menge eines mit alkali scher Phosphatase markierten Anti-Cortisol-Antikörpers umgesetzt. 100 µl Reaktionslösung wurden in einem Elektro phoresegerät in den Reaktionsträger gegeben und anschließend 30 Minuten einer Elektrophorese bei 250 Volt unterzogen. Danach wurde der Reaktionsträger herausgenommen und mit PBS gewaschen. Daraufhin wurde der Reaktionsträger 30 Minuten in eine Lösung aus Substrat für alkalische Phosphatase in Puffer getaucht, und das auf dem Reaktionsträger zurückgehaltene Reaktionsprodukt aus dem Cortisol-BSA-Kopplungsprodukt und dem markierten Anti-Cortisol-Antikörper wurde durch Zugabe eines Färbemittels angefärbt. Die Menge des auf dem Reaktionsträger befindlichen Reaktionsproduktes wurde durch Messung der Absorption bei einer Wellenlänge von 500 nm bestimmt.

Die Absorption wurde bei verschiedenen Proben mit Cortisol bei verschiedenen Konzentrationen gemessen. Auf der Basis dieser Meßergebnisse wurde eine Eichkurve erhalten wie sie in Fig. 3 gezeigt ist. Wie im Fall der T₄-Konzentration des Beispiels 1 korreliert auch hier die Cortisol-Konzentration mit hoher Genauigkeit mit der Absorption, woraus sich deutlich ergibt, daß das Cortisol mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit quantitativ bestimmt werden kann.

Beispiel 3 Bestimmung von T₄ nach der dritten Variante der Erfindung

Als ein in einer Probe zu bestimmendes Antigen wurde T₄ benutzt. Zuvor wurde das Kopplungsprodukt aus T₄ und BSA in gleicher Weise wie im Beispiel 1 beschrieben hergestellt und mit FITC mittels einer bekannten Methode markiert. Ein Antikörper (ein zweiter Antikörper) gegen den Anti-T₄-Anti körper wurde auf dem Reaktionsträger fixiert.

Die T₄ enthaltende Probe und das mit FITC markierte T₄-BSA- Kopplungsprodukt wurden mit dem Anti-T₄-Antikörper zur Reaktion gebracht. In einem Elektrophoresegerät wurden 100 µl der Reaktionslösung in den Reaktionsträger gegeben und 30 Minuten einer Elektrophorese bei 250 Volt unterzogen. Nachfolgend wurde der Reaktionsträger herausgenommen, mit PBS gewaschen und anschließend die Fluoreszenzintensität des am Reaktionsträger festgehaltenen Reaktionsprodukts aus dem mit FITC markierten T₄-BSA-Kopplungsprodukt und dem Anti-T₄-Antikörper gemessen. Die Anregungswellenlänge betrug 485 nm und die Fluoreszenzwellenlänge 520 nm. Auf der Basis dieses Ergebnisses wurde eine Eichkurve erhalten, die in Fig. 4 gezeigt ist. Die T₄-Konzentration korreliert mit der Fluoreszenzintensität, wobei deutlich wird, daß T₄ mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit quantitativ bestimmt werden kann.

Beispiel 4 Bestimmung von Cortisol (Hydrocortison) nach der vierten Variante der Erfindung

Als in einer Probe zu bestimmendes Antigen wurde Cortisol benutzt. Ein Cortisol-alkalische Phosphatase-Kopplungs produkt wurde auf folgende Weise hergestellt. Nach dem Zentrifugieren von 50 µl einer Suspension von alkalischer Phosphatase in 2,6 molarem Ammoniumsulfat wird der Nieder schlag in 300 µl Wasser gelöst. Nachdem man die erhaltene Lösung mit 10 mg 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-4-ethyl)-car bodiimidomethyl-p-toluol-sulfonat und 200 µl einer Lösung aus Cortisol-21-Hemisuccinat in Dimethylformamid versetzt hat, wird die Reaktion 16 Stunden bei Raumtemperatur durch geführt. Die so erhaltene Emulsion wird einer Sephadex G-100-Säule aufgegeben und mit 10 ml eines Phosphatpuffers eluiert. Die alkalische Phosphataseaktivität des Eluates wurde gemessen, die zwei Fraktionen mit der höchsten Aktivi tät wurden vermischt und dann auf ein Volumen von 10 ml mit 0,05 molarem Phosphatpuffer (pH 8,0) verdünnt. Die erhaltene Verdünnung wurde als alkalische Phosphatase-markiertes Cortisol benutzt.

Die Cortisol und alkalische Phosphatase-markiertes Cortisol enthaltende Probe wurde mit Anti-Cortisol-Antikörper zur Reaktion gebracht. In einer Elektrophoresevorrichtung wurden 100 µl der so erhaltenen Reaktionslösung in den Reaktions träger gegeben und 30 Minuten einer Elektrophorese bei 250 Volt unterworfen. Es wurde ein Reaktionsträger verwendet, der einen Antikörper (ein zweiter Antikörper) gegen Anti- Cortisol-Antikörper gebunden enthielt. Nach der Elektro phorese wurde der Reaktionsträger herausgenommen und mit PBS gewaschen. Daraufhin wurde der Reaktionsträger 15 Minuten in eine Lösung eines Substrats für alkalische Phosphatase getaucht, und durch Messung der Absorption bei 500 nm wurde die Menge des auf dem Reaktionsträger zurückgehaltenen Reaktionsprodukts aus dem alkalische Phosphatase-markierten Cortisol und Anti-Cortisol-Antikörper bestimmt. Auf der Basis der Meßergebnisse wurde eine Eichkurve erhalten, die in Fig. 5 gezeigt ist. Die Cortisol-Konzentration korreliert mit der Absorption, wobei deutlich wird, daß Cortisol mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit bestimmt werden kann.

Beispiel 5 Bestimmung von T₄ mittels modifizierter erster Variante der Erfindung

Als in der Probe zu bestimmendes Antigen wurde T₄ benutzt. Die Probe mit T₄ wurde mit einem Anti-T₄-Antikörper zur Reaktion gebracht. Das T₄ war zuvor auf einem Reaktions träger aufgebracht worden. In einer Elektrophoresevorrich tung wurde die Reaktionslösung in den Reaktionsträger gegeben und dann 30 Minuten einer Elektrophorese bei einer angelegten Spannung von 250 Volt unterzogen. Anschließend wurde ein FITC-markierter Antikörper (ein zweiter Antikör per) zum Anti-T₄-Antikörper 15 Minuten der Elektrophorese bei 250 Volt unterzogen. Der Reaktionsträger wurde herausge nommen und mit PBS gewaschen. Anschließend erfolgte die Messung der Menge an FITC-markiertem zweiten Antikörper umgesetzt mit dem Anti-T₄-Antikörper umgesetzt mit T₄, gebunden an den Reaktionsträger. Bei der Messung betrug die Anregungswellenlänge 485 nm und die Fluoreszenzwellenlänge 520 nm. Die Eichkurve, wie sie auf der Basis der Meßergeb nisse erhalten wurde, ist in Fig. 6 wiedergegeben. Die Fluoreszenzintensität korreliert mit der T₄-Konzentration, wobei deutlich wird, daß die T₄-Konzentration mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit quantitativ bestimmt werden kann.

Beispiel 6 Bestimmung eines Protein-Antigens gemäß Variante 1 der Erfindung

Als ein in einer Probe zu bestimmendes Antigen wurde α-Fetoprotein (AFP), das eine elektrische Ladung trägt, benutzt. AFP wurde zuvor auf einem Reaktionsträger fixiert.

Die AFP enthaltende Probe wurde mit einem FITC-markierten Anti-AFP-Körper zur Reaktion gebracht. Nachfolgend wurden in einem Elektrophoresegerät 200 µl der Reaktionslösung auf den Reaktionsträger gegeben und 30 Minuten einer Elektrophorese bei 250 Volt angelegter Spannung unterworfen. Anschließend wurde der Träger herausgenommen und mit PBS gewaschen. Die Menge des vom Reaktionsträger zurückgehaltenen FITC-markierten Anti-AFP-Antikörpers wurde mit einer Anregungswellenlänge von 485 nm und einer Fluoreszenzwellen länge von 520 nm bestimmt.

Die auf Basis dieser Meßergebnisse erhaltene Eichkurve ist in Fig. 7 gezeigt. Eine Eichkurve, die mit einer konven tionellen Methode erhalten wurde, ist ebenfalls in Fig. 7 gezeigt. Die konventionelle Methode ist im folgenden be schrieben. Ein Anti-AFP-Antikörper wurde zuvor auf einem Reaktionsträger fixiert. Eine AFP enthaltende Probe wurde der Elektrophorese unterzogen, gefolgt von der Elektro phorese eines FITC-markierten Anti-AFP-Antikörpers. Durch Messung der Markierungsmenge des auf dem Reaktionsträger zurückgehaltenen FITC-markierten Anti-AFP-Antikörpers gemäß der sogenannten Sandwich-Methode wurde die AFP-Konzentration bestimmt.

Wie aus Fig. 7 ersichtlich ist, kann AFP erfindunggemäß selbst bei kleinen Konzentrationen mit hoher Empfindlichkeit und hoher Genauigkeit quantitativ bestimmt werden.

Gemäß dem Immunoassay der Erfindung wird einem zu bestimmen den Antigen, das elektrisch neutral ist oder keine oder nur eine geringe elektrische Ladung trägt, durch Reaktion mit einem Antikörper eine elektrische Ladung verliehen. Aus diesem Grunde kann ein solches Antigen mittels Immunoassay unter Anwendung der Elektrophorese quantitativ bestimmt werden, wobei eine hohe Empfindlichkeit selbst bei sehr geringen Konzentrationen gegeben ist. Zusätzlich ist die quantitative Bestimmung mit hoher Genauigkeit und Zuver lässigkeit möglich. Das Verfahren der Erfindung ist insbe sondere für die genaue Bestimmung von Steroidhormonen geeignet.

Des weiteren kann erfindunggemäß ein Protein-Antigen, das ursprünglich eine elektrische Ladung trägt, ebenso mit hoher Genauigkeit und hoher Empfindlichkeit quantitativ bestimmt werden.

Claims

1. Immunoassay unter Verwendung eines in einem Elektrophoresefeld angeordneten Reaktionsträgers mit einem darauf fixierten immunologischen Reaktionspartner, bei dem man

a) ein zu bestimmendes Antigen (A) mit einer definierten Menge eines elektrisch geladenen Antikörpers (BL, B1) unter Erhalt eines elektrisch geladenen Antigen-Antikörper- Reaktionsproduktes umsetzt, mit der Maßgabe, daß der verwendete Antikörper ein markierter (BL) oder ein nicht markierter Antikörper (B1) ist, und mit der weiteren Maßgabe, daß bei Verwendung des nicht markierten Antikörpers (B1) markiertes Antigen (AL, ACL) zusätzlich in der Reaktion verwendet wird;
b) das Reaktionsprodukt einer elektrophoretischen Wanderung unterwirft;
c) entweder markierte Antikörper in einer freien Form (BL) oder gebunden an ein Antigen (AC-BL) oder markierte Antigene gebunden an Antikörper (AL-B1, ACL-B1) auf dem Reaktionsträger mittels darauf fixierter immunologischer Reaktionspartner zurückhält; und
d) die Menge der auf dem Reaktionsträger zurückgehaltenen nicht umgesetzten Antikörper (BL) oder der Antigen- Antikörper-Reaktionsprodukte (AC-BL, ACL-B1, AL-B1) durch Markierungsmessungen bestimmt.

2. Immunoassay unter Verwendung eines in einem Elektrophoresefeld angeordneten Reaktionsträgers mit einem darauf fixierten immunologischen Reaktionspartner, bei dem man

a) ein zu bestimmendes Antigen (A) mit einer definierten Menge eines elektrisch geladenen Antikörpers (BL, B1) unter Erhalt eines elektrisch geladenen Antigen-Antikörper- Reaktionsproduktes umsetzt;
b) das Reaktionsprodukt einer elektrophoretischen Wanderung unterwirft;
c) entweder Antikörper in einer freien Form (BL) oder gebunden an Antigen (AC-BL, ACL-B1) auf dem Reaktionsträger mittels darauf fixierter immunologischer Reaktionspartner zurückhält;
d) die auf dem Reaktionsträger in Schritt c) zurückgehaltenen Antikörper mit markierten Antikörper umsetzt, die spezifisch mit den Antikörpern aus Schritt a) reagieren; und
e) die Menge des Reaktionsproduktes zwischen den in Schritt c) zurückgehaltenen Antikörpern und den markierten Antikörpern aus Schritt d) mittels Markierungsmessungen bestimmt.

3. Immunoassay nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

- der Antikörper von Schritt a) ein markierter Antikörper (BL) ist,
- nicht umgesetzte Antikörper aus Schritt a) in Schritt c) auf dem Reaktionsträger zurückgehalten werden, indem man zuvor auf dem Reaktionsträger Antigene vom Typ des zu bestimmenden Antigens fixiert, und
- die Markierung des zurückgehaltenen Antikörpers (BL) quantitativ gemessen wird.

4. Immunoassay nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

- der Antikörper von Schritt a) ein markierter Antikörper (BL) ist,
- eine definierte Menge eines Kopplungsproduktes (AC) zwischen Antigenen vom Typ des zu bestimmenden Antigens und einer elektrisch geladenen Substanz dem Reaktionsgemisch aus Schritt a) zugefügt wird,
- die in Schritt a) zwischen den markierten Antikörpern und dem Kopplungsprodukt gebildeten Reaktionsprodukte (AC- BL) und nicht umgesetztes Kopplungsprodukt in Schritt c) auf dem Reaktionsträger zurückgehalten werden, indem man zuvor Antikörper (BC), die spezifisch mit der elektrisch geladenen Substanz aus Schritt a) reagieren, auf dem Reaktionsträger fixiert,
- die Markierung des in Schritt a) gebildeten Reaktionsproduktes (AC-BL) quantitativ mißt.

5. Immunoassay nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

- der Antikörper von Schritt a) ein unmarkierter Antikörper (B1) ist,
- eine definierte Menge eines Kopplungsproduktes (ACL) zwischen Antigenen des zu bestimmenden Types und einer markierten elektrisch geladenen Substanz zu dem Reaktionsgemisch aus Schritt a) gegeben wird,
- umgesetzte Antigene (A-B1) und umgesetzte Kopplungsprodukte (ACL-B1) aus Schritt 1 in Schritt c) auf dem Reaktionsträger zurückgehalten werden, indem man zuvor Antikörper (B2), die spezifisch mit den Antikörpern aus Schritt a) reagieren, auf dem Reaktionsträger fixiert, und
- die Markierung des umgesetzten, in Schritt a) gebildeten Kopplungsproduktes (ACL-B1) quantitativ gemessen wird.

6. Immunoassay nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß

- der Antikörper in Schritt a) ein unmarkierter Antikörper (B1) ist,
- eine bestimmte Menge eines markierten Antigens des zu bestimmenden Typs dem Reaktionsgemisch von Schritt a) zugesetzt wird,
- sowohl markierte als auch unmarkierte umgesetzte Antigene aus Schritt a) in Schritt c) auf dem Reaktionsträger zurückgehalten werden, indem zuvor Antikörper (B2), die spezifisch mit den Antikörpern aus Schritt a) reagieren, auf dem Reaktionsträger fixiert werden, und
- die Markierung des in Schritt a) gebildeten umgesetzten markierten Antigens (AL-B1) quantitativ gemessen wird.

7. Immunoassay nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, daß die elektrisch geladene Substanz ein Protein oder ein Lipid ist.

8. Immunoassay nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein Rinderserumalbumin, Kaninchenserumalbumin, Humanserumalbumin oder Globulin ist.

9. Immunoassay nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Lipid Dicetyl-Phosphorsäure ist.

10. Immunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das zu bestimmende Antigen elektrisch neutral ist oder nur eine geringe elektrische Ladung trägt.

11. Immunoassay nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das zu bestimmende Antigen ein Steroidhormon, ein Herzmittel, ein Antiepileptikum oder ein Vitamin ist.

12. Immunoassay nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das zu bestimmende Antigen ein Protein ist.

13. Verwendung eines Immunoassay-Kit enthaltend einen markierten Antikörper gegen das zu bestimmende Antigen und einen Reaktionsträger mit daran gebundenen Antigenen des zu bestimmenden Typs zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 3.

14. Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Reaktionsträger eine Polyacrylamidgel-Membran oder eine Cellulose- Acetatmembran ist.