JPS61192285A - 活性化血小板に対するモノクロ−ナル抗体 - Google Patents

活性化血小板に対するモノクロ−ナル抗体

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JPS61192285A
JPS61192285A JP60256453A JP25645385A JPS61192285A JP S61192285 A JPS61192285 A JP S61192285A JP 60256453 A JP60256453 A JP 60256453A JP 25645385 A JP25645385 A JP 25645385A JP S61192285 A JPS61192285 A JP S61192285A
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JP
Japan
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platelets
activated
antibody according
platelet
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JP60256453A
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English (en)
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ブルース・イー・フユーリー
バーバラ・シー・フユーリー
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Tufts Medical Center Inc
Original Assignee
Tufts Medical Center Inc
New England Medical Center Hospitals Inc
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Publication date
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は一部は政府の支援によってなされたものであり
、政府が発明の権利をもつ。
本特許願は１９８４年１１月１５日出願の米国特許願第
Ｎｏ、　６７１．７５９号の継続出願である。
本発明は抗体、抗体を用いる診断方法、および血液血小
板に関するものである。
血小板は休止した不活性の形では血液中で循環する無核
細胞である。止血開始の間に、これらの細胞は活性化さ
れ、生化学的または形態学的に観察することができる大
きな機能的変化を受ける。
休止血小板および活性化血小板の上の表面構造を比較す
る研究は、アクチンと活性化血小板上で出現するもう一
つの高分子量プロティンとを同定した（ジョークら、（
１９８０年）、Ｊ、Ｃ１１ｎ、　Ｉｎｖｅｓｔ。
６６．１−９）。
ニ一つエンヒュイスら（１９８３年）のＴｈｒｏｒｎｂ
。
Ｈａｅｍｏｓｔａｔｓｉ、ｓ　５０．　１００は活性化
ヒト血小板、好アズル性顆粒球および単核球と反応性で
あるといわれているモノクローン抗体を記述している。
発明の総括 一般的には、本発明は一面においては、活性化ヒト血小
板と反応性であり、かつ、休止ヒト血小板、好アズル性
単核球顆粒および顆粒球と実質上非反応性である抗体を
特徴とする。
好ましくはこの抗体は活性化ヒト血小板上で抗原決定因
子を認識し、この抗原決定因子はグリコプロティン■ａ
と区別されるグリコプロティンである（グリコプロティ
ン■ａは例えばフィリップスら（１９７７年〕のＪ、Ｂ
ｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、　２５２（６）　：　２１２１−２
１２６に記載される血小板表面抗原である）。
抗体は好ましくは工、！７Ｇ、最も好ましくはＩｇＧ。
アイソタイプのものであり、活性化血小板の表面上で約
１４．０．０００の分子量のグリコプロティン抗原決定
因子を認識する。
本発明の抗体は検出可能標識例えば、放射性標識、蛍光
団、あるいはＮＭＲコントラスト剤を形成する常磁性イ
オンで以て標識をつけ、ヒトの患者における活性化血小
板含有部位を検出するのに、患者へ標識化抗体を投与し
そして標識化された免疫複合体を検出することを含む方
法において、使用される。
本発明の抗体は、休止血小板上ではなく活性化血小板上
でのみ出現する抗原決定因子に対する特異性のゆえに、
活性化血小板含有部位（例えば血栓）の位置に関するき
わめて正確々情報を提供でき、休止血小板あるいは単核
球および顆粒球のような他の生物学的粒子からの基底値
（ｂａｃｋｇｒｏｕ、ｎｄ）をごく少ししかもたない。
この抗体はまた活性化血小板についてヒトの血液試料を
検定するのに使用して診断的に有用な情報を得ることが
できる。
上記結合特性をもつすべてのモノクローン抗体は本発明
によって包括されている。これらのモノクローン抗体は
慣用的なハイブリッド化およびスクリーニングの技法を
使ってつくられるハイノリラド細胞によってつくシ出さ
れる。モノクローン抗体分野においてよく知られている
とおり、同じ抗原決定因子について特異的であるモノク
ローン性抗体を生成する、各々の独立につくり出された
ハイブリッド細胞系統はやはりすべての他のものとは異
なっている。羊ツクローン抗体の各々カッのようにして
つくり出されるからである。したがって、ここで述べる
過程の繰返しは活性化血小板上で記述の抗原決定因子に
ついて特異的である有用なモノクローン性抗体をつくり
出すハイブリッド細胞系統の生成をもたらすけれども、
以下に述べるモノクローン抗体と化学的に全く同一のコ
ピーであるモノクローン性抗″体をつくり出す細胞系統
を生ずることはきわめてまれである。
モノクローン性抗体のほかに、本発明はポリクローン性
抗体、特に上記の精製された分子量が１４０．０００の
グリコプロティン抗原決定因子による動物の免疫化によ
って生産されるポリクローン性抗体も包括する。
好ましい具体化の説明 ここで、図面の簡単な説明したのち、本発明の好ましい
具体化を説明する。
図　　面 第１図は本発明の抗体と休止および活性化血小板との相
互作用の比較を示すグラフである。
第２図は本発明の抗体と活性化血小板との相互作用のス
カツチャード分析のグラフである。
第３図は本発明の抗体の活性化および休止血小板への結
合に及ぼすカルシウムおよびＥＤＴＡの効果を描くグラ
フである。
第４図は分泌機能と活性化血小板における活性化血小板
特異的抗原出現との間の関係を描くグラフである。
第５図は本発明の抗体によって認識される抗原がグリコ
プロテインＩＩａと区別されることを示すゲル電気泳動
グラフである。
本発明のモノクローン性抗体は活性化血小板の単離から
はじめて次のとおシつくられる。
血液を正常のヒトのドナーから得て、ウェアー溶液（０
１Ｍクエン酸塩緩衝液）で以て９：１（容積／容積）の
比で凝血防止した。このクエン酸塩含有血液を１６０Ｘ
Ｐ−で１５分間遠心分離することによってつくられる血
小板リッチ血漿（ＰＲＰ）をＢＳＡ非連続グレジェント
へ適用し、血小板濃縮体を単離した。血小板はさらにＨ
ＥＰＥＳ緩衝液（７）Ｈ７，３５）で以て平衝化したセ
ファロース２Ｂカラム上でゲル渥過によって精製した。
トロンビン活性イヒ血小板は、このゲル濾過血小板懸濁
液へ０．１５単位／ｍｌの最終濃度までトロンビンを添
加することによってつくり、攪拌なしで２分間保温した
。トロンビーン活性化血小板を３チグルタルアルデヒド
の添加によって固定した。この懸濁液をゆっくりと３０
分間攪拌し、ＴＢＳ（２０ｍＭトリ、Ｘ−ＨＧＩＩ、　
　０．１５　ＭＮａＧ７．　ｐＨ７，５）で以て２回洗
滌し、−７０Ｃにおいて６０％（容積／容積）グリセリ
ン中で貯えた。
Ｂａｌ　ｂ　／　ｃマウスを腹膜腔内的に、２５０μｌ
のＨＥＰＥＳ緩衝液（ＰＨ７，３５）中に懸濁した１−
５×１０トロンビン活性化凝集血小板で以て免疫化した
。これらのマウスは別のドナーからの類似血小板製剤で
以て２週間毎に２ケ月間、ブースター注射を施こした。
これらのマウスを３ケ月間休ませ、最後のブースター注
射を細胞融合の３日前に実施した。融合はコーラ−とミ
ルシュタインのＮａｔｕｒｅ、　（１９７５）　２５６
　：　４９５−４９７に記載の方法により、融合相手と
して、９ｐ２１０細胞を使って実施した。融合細胞から
の上澄み培地を抗血小板抗体の生成について検定した。
選択した陽性カルチャーは、マツク・キアーンのＭｏｎ
ｏｃｌ、ｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｊ、ｅｓ　（１９８０
）　（ケネット、　　Ｒ，Ｈ，、マツク・キアーンＴ、
Ｊ、およびベクトール、に、９編集）（プレナム・プレ
ス、ニューヨーク）に記載の限界稀釈法によってクロー
ンを発生させ、”　Ｋ　Ｇ　４　”と命名したクローン
をＥＬ工ＳＡ抗体スクリーニング法を実施することによ
って次のとおりに単離した。
グルタルアルデヒド固定化トロンビン活性化血小板ある
いはアセチルサリチレート処理体止血小板をｐＨ７，５
のＴＢＳ中テ１×１０８血小板／　ｍｌｌの濃度で懸濁
させた。この血小板懸濁液（１００μｍ３’）を各々の
マイクロタイターウェル（イムロン■、グイナテツク・
ラボラトリーズ社）へ添加し５分間１０００　Ｇで遠心
分離した。プレートをＴＢＳで以て洗滌したのち、２０
０μｌのＴＢＳを０．５　％のゼラチンおよび５０μｆ
／−／　ｍｌのヒトＴｇＧと一緒に添加し、それらのプ
レートを３７Ｃで３０分間保温した。
マイクロタイタ−ウェルを３回ＴＢＳで以て洗滌し、１
００μｌのハイブリドーマ・カルチャ上澄液を添加し、
３７Ｃで１時間保温した。マイクロタイターウェルを３
回ＴＢＳ、２ｍＭ　β−メルカプトエタノール、１．５
　ｍＭ　ＭｇＧ１２、で以て洗滌し、次いでβ−ガラク
トシダーゼ（ベセスダ・リサーチ・ラボラリ−ズ）に結
合された羊の抗マウス免疫グロブリンの５０μｌを添加
し、２２Ｃで２時間保温した。
ＴＢＳｌ　２ｒｎＭのβ−メルカプトエタノール、００
５Ｍ燐酸ナトリウム中の１００μｌのｐ−ニトロフェニ
ルβ−ローガラクトシド（１ｍ９７ｍｅ　）で以て３回
洗滌したのち、１．５７７１ＭのＭｙＧＩ！、、　（ｐ
Ｈ７，２）を添加した。血小板／抗体結合の尺度として
ｐ−ニトロフェノールの放出を３０−６０分にわたって
４０５１′ＬｍにおいてグイナテツクＭＲ５８０マイク
ロエリザ−オート・リーダーで追跡した。このＫＣ４ク
ローンを、休止血小板と比較して活性化血小板と選択的
に反応する抗体をつくり出すものとして単離した。
抗血小板抗体（”ＫＣ４抗体”″）を生成するＫＣ４ク
ローンの雑種細胞をＢα］、　ｂ　／　ｃマウス中へ腹
膜腔内的に注射した。生ずる腹水を回収し、ＫＣ４抗体
をプロティンＡ−セファロース・アフィニテイクロマト
グラフイを使って単離した。結合した免疫グロブリンを
０．１　Ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ６０）によって溶
離した。この抗体調製物は非還元条件下でＳＤＳゲル中
で単独バンドを生じ、還元条件下でＳＤＳゲル中で重鎖
および軽鎖に相当する二つのバンドを生しだ。精製抗体
は型特異的抗血清を使用するオフタロ二−免疫拡散法に
よって測定してエダＧ１にであった。
ＫＣ４抗体の結合特異性 精製したＫＣ４モノクローン抗体に１２５１で以てクロ
ラミン−Ｔを使って標識をつけた。この抗体と非固定化
ゲル濾過トロンビン活性化血小板、および、非固定化ゲ
ル濾過休止血小板との相互作用を液相での放射免疫検定
法で検討した。第１図に示すとおシ、モノクローン抗体
は活性化血小板について著しい選択性を示した。ＫＣ４
抗体とトロンビン活性化血小板との相互作用は飽和曲線
を描いている。しかし、ＫＣ４抗体の休止血小板への結
合は極微であ名。非処理血小板並びにアデノシンおよび
アセチルサリチレートで以て処理した血小板は等しい結
果を示した。
休止血小板よりすぐれた活性化血小板についてのモノク
ローン抗体の選択性はまた顕微鏡写真において例証され
ている。休止血小板およびトロンビン活性化血小板への
結合は蛍光標識化第二抗体を使って検出された。活性化
血小板への結合（パネルＢ）と比べて休止血小板（パネ
ルＡ）への結合は事実上存在しなかった。
ＫＣ４抗体のトロンビン活性化血小板への結合は寸だス
カツチャード分析（５ｃａｔｃｈａｒｄ　ａｎａｌ、ｙ
ｓｊ、ｓ）を使って評価された。以下の表１の実験４か
らの代表的データーを使って、遊離抗体濃度で割った結
合抗体濃度の、結合抗体濃度に対するプロットは直線を
示した（第２図）。これらの結果は血小板表面上での単
一種類の抗体結合部位を示している。この実験の解析に
基づいて、抗体とトロンビン活性化血小板との相互作用
についての結合恒数、Ｋｄ、は６．９７ＣＭであった。
各血小板はＫＣ４抗体によって認識される約１０．００
０−１７．０００個（この１・ゝナーの場合は１０，７
００）の結合部位を含んでいた。
これらの結果はさらに、測定された見掛は結合恒数の均
一性によって示されるとおシ、抗体のモノクローン性を
確認している。
四人の異なるトゞす−からの血小板で実施した四つの独
立の実験の結果を表１に示す。これらのデータにはすぐ
れた一致が存在し、平均の結合恒数ＫＤが７２±０．４
．　ｎＭである。血小板あたシの平均の結合部位数は１
３，４００±３，０００であった。
血小板活性化は、カルシウムイオンの存在下で原形質膜
へ結合するトロンポスポンジン（ｔｈｒｏｍｂｏ−ｓｐ
ｏｎｄｉｎ）のようなプロティンの分泌と関連するので
、ＫＧ４抗体−血小板相互作用に及ぼすカルシウムまた
はＥＤＴＡの効果を評価した。第３図に示すとおシ、Ｋ
Ｃ４抗体−血小板相互作用の結合曲線はカルシウムイオ
ンまたはＥＤＴＡによって変化を受けなかった。これら
の結果はＫＣ４抗体が金属イオンによって安定化される
構造の血小板抗原へ向けて向けられるのではなく、まだ
この抗原が金属イオンの作用を通じて血小板表面と作用
するものではないことを示している。さらに、ヒトの血
漿は血小板への抗体結合を禁止することはなく、正常の
ヒトの血漿はこの血小板抗原を含捷ないことを示してい
た。高イオン強度の緩衝液（ＬＭのＮａ１ｌを含むトリ
ス緩衝液）あるいは４から１０のｐＨをもつ緩衝液は血
小板へのＫＧ４抗体の結合を変えなかった。
血小板抗原の分泌依存発現 ＫＣ４抗体とトロンビン活性化血小板およびその他のア
ゴニストで以て活性化された血小板との相互作用を比較
した。予備的実験において、ＫＣ４抗体はコラーゲン、
、ＡＤＰ、エピネフリン、あるいはトロンビンで以て活
性化および凝固させた血小板へ結合した（表■）。この
相互作用はまた凝固しない非攪拌のトロンビン活性化ゲ
ルｐ過血小板の中でも観察された。それゆえ、ＫＣ４抗
体の血小板への結合はアゴニストおよび血小板凝集と実
質上独立であると思われた。
表■ 結合した抗体 トロンビン（０１５単位／ｍｌ）　　　　　　１００Ａ
ＤＰ（１，０μＭ）　　　　　　　　　　　　４６エビ
ネフリン（１０μＭ）　　　　　　　　　６６コラ゛−
ゲン（０，４５ｍ９／ｍｅ）　　　　　　　　　７２ア
ゴニスト無し　　　　　　　　　　０活性化血小板特異
的抗原の出現が分泌と関連があるかどうかを評価するた
めに、血小板に（１４Ｇ）セロトニンを負荷した。各種
アゴニストによる活性化の際の血小板からのｃ１４Ｃ〕
セロトニンの放出を１２５１標識ＫＣ４抗体のこれらの
血小板への結合と比較した。第４図に示すとおシ、活性
化血小板への抗体結合は分泌と直接に相関がある。トロ
ンビン活性化血小板は、最大の抗体結合及び最大の分泌
を示した。ＡＤＰ、エピネフリン、あるいはコラーゲン
による刺激はより低い水準の分泌と抗体結合をもたらす
。はじめにアセチルザリチレート（これは分泌を損なう
）で以て処理されそしてＡＤＰ、コラーゲン、あるいは
エピネフリンで以て活性化された血小板は活性化特異抗
原を出現しなかった。これらの結果は活性化特異抗原の
出現は分泌依存性であるが、しかし、アゴニストおよび
凝固と無関係であることを暗示している。
活性化特異抗原は’ＰＡＤＧＥＭ’“クリコブロティｙ
　（Ｐｌａｔｅｌｅｔ　Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｄｅｐ
ｅｎｄｅｎｔ　Ｇｒａｎｕｌｅｔｏ　Ｅｘｔｅｒｎａｌ
　Ｍｅｍｂｒａｎｅ　）と命名される。ＰＡＤＧＥＭグ
リコプロティンが休止血小板中の内部顆粒膜の一部とし
て存在し、そして、活性化および分泌の間に内部顆粒膜
が外部原形質膜と融合するときにＰＡＤＧＥＭグリコプ
ロティンが露出されると信じられる。
血小板抗原についてのＫＣ４抗体の抗原特異性をウェス
タン・プロット法を使って測定した。血小板からの血小
板プロティンをＳＤＳ中で可溶化し、分析した。ＫＣ４
抗体は可溶化された血小板中のシングルバンドへ結合し
た。このバンドは１３９．０００の見掛は分子量と一緒
に移行した。ラクトパーオキシダーゼ法を用いて１２５
Ｉで以て表面標識化した血小板を比較のだめに泳動実験
した。
１２５Ｉ標識化血小板の特徴的バンド模様はＧＰＨｂ。
ＧＰ■α、およびＧＰ■を示した。ＫＣ４抗体のグリコ
プロティン抗原はグリコプロティンＨｂおよび■ａの間
で移行し、それら並びにグリコプロティンＩＩＩとは区
別される。赤血球、好中球、単核球、リンパ球、ＧＭ４
６７２　（ＩＪンパ球系の細胞ライン）、およびアレキ
サングー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）ＰＬＣ／　ＰＲＦ１５
（ヒト肝癌細胞系列）を３ＤＳ中で可溶化し、それらの
プロティンのＫＣ４抗体への結合についてウェスタン・
プロット法を使って同じように検査した。これらの細胞
はどれもこの抗体へ結合されるプロティンを含んでいな
かった。
ＰＡＤ（１，ＥＭダリコプロテインを粗血小板膜からア
フイニテイクロマトグラフイによって精製した。
プロティンを膜からトライトンＸ−１００を使って抽出
し、これらのプロティンをアガロースへ共有結合された
ＫＣ４抗体を含むアフイニテイ・カラムへ施用した。カ
ラムへ施用された物質は不均質であり、これらのプロテ
ィンの大部分はＫＯ４−アガロースへ結合でき々かった
。結合したプロティンは、ジエチルアミンで以て溶離さ
れ、ＳＤＳゲル上で非還元条件における電気泳動の際に
主要拡散バント９として移動し、実質的（８０チよシ大
きい）純度を示した。主要部のプロティン・バンドは１
４０，０００の見掛は分子量に相当した。このノミンド
の特性はＣａ１升またはＥＤＴＡの存在下で不変であっ
た。還元条件下で実験したＳＤＳゲル中においては、精
製ＰＡＤＧＥＭ　グリコプロティンは単独の狭いバンド
として移動し、同じ＜１４０，０００の分子量をもって
いた。これらの結果はＰＡＩＤ）ＧＥＭグリコプロティ
ンが一本のポリ投プチド鎖で構成されていることを示す
。このプロティンは過沃素酸−／ラフ試薬で以て染色さ
れ、それがグリコプロティンであることを示す。
ＰＡＤＧＥＭグリコプロティンの差別性第５図を参照す
ると、ＰＡＤＧＥＭグリコプロティンとＧＰＩＩｈおよ
びＧＰｌａとの差別性がゲル電気泳動を用いて次のとお
り示された。精製したＰＡＤＧＥＭグリコプロティンに
　　１で以て標識をつけ１２５■標識化ＰＡＤＧＦＩ：
Ｍグリコプロティンを得た。休止血小板に　１で以てラ
クトパーオキシダーゼ法を使って、標識をつけ、ＧＰＩ
　ｂ　、　ＧＰＩＩａおよびＧＰ■を含む血小板膜プロ
ティンに１３１１で以て標識をつけた。ドデシル硫酸ナ
トリウムで以て処理したのち、　　■標識血小板グリコ
プロテイン（Ｏ）と　　Ｉ標識ＰＡＤＧＥＭグリコプロ
ティン（０）とをゲル電気泳動によって同時分析した。
ＰＡＤＧＥＭグリコプロティンはＧＰ［ＡとＧＰＩＩ（
Ｚの間に移動し、ＧＰｎａとのその物理的差別性を示し
た。
ＰＡＤＧＦ、Ｍグリコプロティンの使用ＰＡＤＧＥＭグ
リコプロティンは本発明のモノクローン抗体をつくり出
す免疫源として使用できる。
ＰＡＤＧＥＭグリコプロティンを使用する抗体の生成は
免疫源としての活性化血小板の使用と比較して、ＰＡＤ
ＧＥＭグリコプロティンに対する抗体のみを生成し、活
性化および休止の両面小板の表面上で出現される抗原に
対する抗体を生成しないという利点をもつ。ＰＡＤＧＥ
Ｍグリコプロティンはまた、以下に述べる生体外検定で
使用できるポリクローン抗体をつくり出す免疫源として
も使用できる。
ＰＡＤＧＥＭグリコプロティンはマウスを免疫化してＫ
Ｃ４抗体と類似の機能的性質をもつモノクローン抗体生
成性ハイノリド−マ細胞を生成させントゞアジュバント
中の２５μＪのＰＡＤＧＥＭグリコプロティンで以て一
度、腹膜腔内的に免疫化し、次いで、２週間間隔で２度
、食塩水中の２０μｆのＰＥＤＧＥＭグリコプロティン
で以て免疫化した。
さらに６週間後マウスに静脈投与による食塩水中の２０
μｍのＰＡＤＧＥＭグリコプロティンで以て最終的ブー
ストを与えた。これらのモノクローン抗体生成性細胞の
一次培養株をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレク
ション（ロックビルメアリーラントゞ州）に寄託し、Ａ
ＴＣＣ寄託番号Ｎｏ、ＨＢ８６７０が与えられた。
出願人、ニュー・イングランド・メディカル・センター
・ホスピタルはもしこの培養株がそれの特許期限終了前
に死んだ場合にはそれを取換える責任を認めておシ、そ
してその特許の公告についてＡＴＣＣに知らせる責任を
もつものであり、その時点においてその寄託が一般に利
用できるようになる。その時点までは、その寄託は３７
ＣＦＲＳ１・１４および３５ＵＳＣＳ　１１２の約定の
下に米国特許庁長官に提出される。
上述のとおシ、ＰＡＤＧＥＭグリコプロティンはまた本
発明の単一特異的ポリクローン抗体をっくシ出す免疫源
として使用できる。ポリクローン抗ＰＡＤＧＥＭプロテ
ィン抗血清は１ケ月間隔の５０μｍの精製ＰＡＤＧＥＭ
プロティンによる、ニューシーラント白色家兎の免疫化
によってつくり出される。
ＰＡＤＧＥＭプロティンに特異的な抗体はそのＰＡＩＤ
ＥＭ上で精製された。これらの精製された抗ＰＡＤＣ，
ＥＭプロティンポリクローン抗体の単一特異性はウェス
タン・プロット法によって確立された。この抗ＰＡＤＧ
ＥＭプロティン抗体はＳＤＳ処理血小板中の単一プロチ
インとのみ反応し、そしてまた精製ＰＡＤＧＥＭプロテ
ィンと反応することも発見された。
抗体の使用 本発明の抗体は、活性化血小板に対するそれらの特異性
のゆえに、生体内活性化血小板、特に血脈の傷害および
病気、例えば血塞、虚血性心疾患、胃腸出血、および末
梢および脳血管病、から由来する血栓において蓄積する
ことが知られている不動化活性住血、Ｊぐ板の凝集体、
を検出しかつ位置をつきとめるのに使用できる。基底値
および誤った正の結果は、この抗体が休止血小板と反応
することがないだけでなく顆粒球のような他の血液成分
とも反応し得ないので、回避される。この抗体の高い結
合親和性は良好な感度を提供する。
これらの抗体は任意の慣用的標識、例えば、放射性標識
または蛍光団を使って標識化することができる。好まし
い放射性標識は１１１インジウムであシ、これはヒトの
血小板動力学を規定するのに適切である半減期をもつ。
ｌ１１１１Ｌ標識抗体はニッケルマンら（１９７５年）
のＰｂａｒｍ、５ｃｉ−＋　６４７０４に記載の方法に
従って、抗体をジエチレンジアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）
無水物で以て変性し次いで１１１インジウムでキレート
化することによってつくることができる。１１１インジ
ウム標識のモノクローンおよびポリクローン抗体は生体
外で活性化血小板へ結合することが示された。
血栓と活性化血小板の検出および位置ぎめにおいて生体
内影像化を実施するには、約５００μＣ１の無菌で発熱
因子を含まない、生理学的食塩水中の１１１１、標識抗
体の静脈内注射を患者に行なう。全身走査シンチグラム
は次にコンピュータとインターフェースさせかつ中位エ
ネルギの平行ホールコリメーターをとりつけたガンマ−
カメラを使って取ることができ、１１１インジウム像が
１１１インジウムのフ第１・ピークの周りで得られる。
本発明の抗体はまた標的となるＮＭＲコントラスト剤を
提供するために、常磁性イオン例えばＧｄ″−１または
Ｍｎ＋＋で以て標識化することができる。常磁性イオン
は、例えばホーら（１９８２）のＪ、Ｎｕ、ｃｌ。
Ｍｅｄ、　２３（ＩＩ）：　１０１１−１０１９に記載
の方法のような慣用的技法を使って、ＥＤＴＡのような
キレート剤を経て抗体と複合化することができる。コン
トラスト剤を患者へ投与し、ＮＭＲ影像化を実施するこ
とができ、それらの薬剤は標的剤が結合されている活性
化血小板と循環系の他の領域との間にＮＭＲコントラス
トを提供する。
本発明の放射性標識化抗体はまた次のとおり、血液試料
（好ましくはＰＲＰ）を生体外で活性化血小板について
検定するのに用いることができる。
全血をウェアー浴液（上述）中で集め１６０Ｘ４で、女
性患者からの場合には１２分間、男性患者からの場合に
は１５分間遠心分離にかけてＰＲＰを得る。プラスチッ
ク管（２本）の中の４００μｌのＰＲＰへ１００μｌの
１２５Ｉ標識化ＫＣ４抗体を添加し、一方の管へ、トロ
ンビンを同時的に添加して血小板を活性化する。これら
の管を２３Ｃで１５−２０分間保温し、管の中味を次に
１．５　ｍｌのミクロ遠心管へ４００μｌのアビニシン
（Ａｐｉｅｚｏｎ　）　油（ｎ−ブチルフタレート、９
．３部；アビ０ニシン、０７部）と−緒に移す。
これらの管をばツクマン超遠心分離器中で３分間遠心分
離にかけドライアイスとアセトンの混合物中に置いてＲ
レットを冷凍する。血小板含有投レットを次にプラスチ
ック製計数管の中へ切りとり、標識化した免疫複合体を
ガンマ−・シンチレーションカウンター中でそれらの管
を計数することによって測定し、１００μｌの１２５Ｉ
標識化抗体の対照標準試料を同時に計数した。
標識化抗体は活性化血小板へのみ結合するので、上記の
過程は血液試料中の活性化血小板の定量的測定値を提供
する。この情報は診断的に有用であり、゛循環する活性
化血小板は患者の血液が過度凝固性（すなわち、異常に
高い凝血傾向をもり）であり、患者が潜在的に危険々前
血栓症的状態にあるということを示している。
活性化血小板の位置ぎめおよび特性化について有用であ
ることのほかに、本発明の標識化抗体を用いる生体内影
像化は、血栓崩壊剤例えばウロキナーゼ、ストレプトキ
ナーゼ、および組織プラスミノーゲンアクチベータ−の
、急性心臓冠状動脈血基に続く心筋壊死の程度の軽減に
関する有効性を評価する高感度手段を提供することがで
きる。
さらに、本発明の抗体はヒトの患者における活性化血小
板含有血餅を溶解できる化合物へ共有結合的に結合する
ことができる。その化合物はフイノリン溶解酵素、組織
プラスミノーゲンアクチベーター、ストレプトキナーゼ
、ウロキナーゼ、あるいはプラスミンの一つであること
ができる。抗体の特異性は酵素を血餅へ集中させ、酵素
の特異性を増し、従って必要投与量を減らし、全身性の
繊維素溶解現象の危険性を軽減する。
本発明の抗体は、一般的にはボードら（１，９８５年）
の１ＩＡｎｔｉｂｏｄｙ　Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｕｒｏｋ
ｉ−ｎａｓｅ　：Ａ　５ｐｅｃｉｆｉ、ｃＦｉ−ｂｒｙ
ｎｏｌｙｔｊ、ｃ　Ａｇｅｎｔ、Ｓｅｊ、ｅｎｃｅ　２
２９．７６５に記載されているとおり、次のとおりに、
ウロキナーゼのような繊維素溶解酵素へ共有的に結合で
きる。還元されたウロキナーゼはそれの固有のスルフヒ
ドリル基によって、架橋剤としてのＮ−スクシンイミジ
ル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネ−）　（ＳＰ
ＤＰ）で以て抗体へ結合される。この架橋剤（無水エタ
ノ−＃　０．０５　ｍｌ！中の２ＱｙｙｈＭ）を抗体〔
０１Ｍ燐酸ナトリウムとＱ、　ｌ　Ｍ　Ｎａ、Ｇｌから
成るｐＩ−（７，４の燐酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）の３
．０　ｍ／！の中の６．３ｍ？〕へ添加し、混合物を３
０分間室温で反応させた。
この溶液を１１のＰＢＳに対して３回次に透析した。
この抗体−酵素の結合体を生理学的々に許容性の担持体
（食塩水のような）の中で、血餅溶解の必要な患者に、
非結合酵素について通常用いられる投与量と匹敵するか
それより低い投与量で注射する。
その他の具体化は特許請求の範囲の中にある。
【図面の簡単な説明】
第１図は本発明の抗体と休止血小板および活性化血小板
との相互作用の比較を示すグラフである。 血小板へ結合した抗体はピコモル／１０８血小板として
表現される。 第２図は本発明の抗体と活性化血小板との相互作用のス
カツチャード分析のグラフである。縦軸のＢはピコモル
／１０　血小板として表現した、血小板へ結合した抗体
量、Ｆは抗体の遊離モル濃度である。 第３図は本発明の抗体の活性化血小板および休止血小板
への結合に及ぼすカルシウムおよびＥＤＴＡの効果を描
くグラフである。 第４図は分泌機能と活性化血小板中の活性化血小板特異
性抗原出現との間の関係を描くグラフである。 第５図は本発明の抗体により認識される抗原がグリコプ
ロテインＩＩａと区別されることを示すゲル電気泳動グ
ラフである。 （外５名）

Claims (22)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）活性化ヒト血小板と反応性であり、かつ、休止ヒ
    ト血小板、好アズル性単核球顆粒および顆粒球と実質上
    非反応性である、抗体。
  2. （２）上記抗体が活性化ヒト血小板表面上の、かつ休止
    ヒト血小板、好アズル性単核球顆粒、あるいは顆粒球の
    表面に存在しない抗原決定因子と反応性である、特許請
    求の範囲第１項に記載の抗体。
  3. （３）上記抗体が活性化ヒト血小板上の抗原決定因子を
    認識し、その抗原決定因子はそれがグリコプロテインI
    Iａと区別されるプロテインであることを特徴としてい
    る、特許請求の範囲第１項に記載の抗体。
  4. （４）上記抗体がＩｇＧアイソタイプのものである、特
    許請求の範囲第１項に記載の抗体。
  5. （５）上記抗体がＩｇＧ＿１アイソタイプのものである
    、特許請求の範囲第４項に記載の抗体。
  6. （６）上記抗原決定因子が約１４０，０００の分子量を
    もつ活性化血小板表面上のグリコプロテインである、特
    許請求の範囲第１項に記載の抗体。
  7. （７）上記抗体が活性化ヒト血小板上で１０，０００と
    １７，０００個の間の結合部位を認識する、特許請求の
    範囲第１項に記載の抗体。
  8. （８）上記の抗原決定因子が活性化ヒト血小板上で、カ
    ルシウムイオンによる安定化を受けることがない、特許
    請求の範囲第１項に記載の抗体。
  9. （９）上記抗原決定因子が正常のヒト血漿の成分ではな
    い、特許請求の範囲第１項に記載の抗体。
  10. （１０）上記抗体の活性化血小板への結合が血小板凝集
    と実質的に無関係である、特許請求の範囲第１項に記載
    の抗体。
  11. （１１）標識化した、特許請求の範囲第１項に記載の抗
    体。
  12. （１２）放射性標識化した、特許請求の範囲第１１項に
    記載の抗体。
  13. （１３）ＮＭＲコントラスト剤を形成する常磁性イオン
    と複合化された、特許請求の範囲第１１項に記載の抗体
    。
  14. （１４）モノクローン性である、特許請求の範囲第１項
    に記載の抗体。
  15. （１５）ポリクローン性である、特許請求の範囲第１項
    に記載の抗体。
  16. （１６）特許請求の範囲第１４項に記載のモノクローン
    抗体をつくり出すことができる雑種細胞、またはそれの
    変種。
  17. （１７）特許請求の範囲第１０項に記載の標識化抗体を
    ヒトの患者へ投与し標識化された免疫複合体を検出する
    ことから成る、ヒトの患者の中の活性化血小板含有部位
    を検出する方法。
  18. （１８）上記部位の位置が上記方法を使つて決定される
    、特許請求の範囲第１７項に記載の方法。
  19. （１９）血小板含有試料を特許請求の範囲第１１項に記
    載の標識化抗体と接触させ、標識化された免疫複合体を
    上記試料中の活性化血小板の尺度として測定することか
    ら成る、血小板含有試料の活性化血小板について検定す
    る方法。
  20. （２０）実質上純粋のグリコプロテインであつて；ゲル
    電気泳動によつて測定して約１４０，０００の分子量を
    もち、 過沃素酸−シッフ試薬により染色することができ、そし
    て、 活性化および分泌中にヒト血小板の表面上で露出される
    、 ことを特徴とする、グリコプロテイン。
  21. （２１）ヒト患者内で活性化血小板含有血餅を溶解する
    ことができる化合物へ共有結合されている、特許請求の
    範囲第１項に記載の抗体。
  22. （２２）上記の血餅溶解性化合物が組織プラスミノーゲ
    ンアクチベーター、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ
    、あるいはプラスミンである、特許請求の範囲第２１項
    に記載の抗体。
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