DE3687871T2

DE3687871T2 - Einsetzbarer gas enthaltender biosensor und verfahren zur bestimmung einer analyte wie glukose.

Info

Publication number: DE3687871T2
Application number: DE8686307174T
Authority: DE
Inventors: Leland C Clark Jr
Original assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Current assignee: Cincinnati Childrens Hospital Medical Center
Priority date: 1985-09-18
Filing date: 1986-09-17
Publication date: 1993-06-17
Anticipated expiration: 2006-09-18
Also published as: CA1284454C; EP0215678A2; US4721677A; DE3687871D1; JPS6287135A; EP0215678A3; US4680268A; ATE86307T1; JP2638593B2; EP0215678B1

Description

Im Laufe der Jahre sind erhebliche Anstrengungen unternommen worden, mit dem Ziel, analytische Methoden zur Bestimmung biologischer Substanzen im Zusammenhang mit medizinischen und industriellen Anwendungen zu entdecken und zu verbessern. Als Beispiel einer solch entwickelten Technik sei ein Verfahren genannt bei dem polarographische Elektrodensysteme eingesetzt wurden um verschiedene biologische Materialien quantitativ und qualitativ zu bestimmen, wobei hier Bezug genommen wird auf das U.S. Patent Nr. 2,913,386 in dem ein solches polarographisches Elektrodensystem zur Messung von Sauerstoff und ähnlichem beschrieben wird. Ferner wird hier Bezug genommen auf das U.S. Patent Nr. 3,380,905 welches eine Verbesserung des im oben genannten polarographischen Elektrodensystems betrifft.
Vor etwa zwanzig Jahren wurde über Enzym-gekoppelte Elektroden berichtet, die bei der polarographischen Analyse biologischer Substanzen eingesetzt wurden. Zum Beispiel wurden in den U.S. Patenten 3,539,455 und 3,912,386 membran-polarographische Elektrodensysteme und -verfahren zur schnellen und genauen quantitativen Analyse biologischer Substanzen beschrieben, die bis dahin nicht direkt durch polarographische Methoden analysiert werden konnten. Gemäß dem U.S. Patent Nr. 3,539,455 konnten klein-molekulare Substanzen wie Glukose mit einem membran-polarographischem Elektrodensystem bestimmt werden. Durch Verwendung von Zellulose oder einer anderen Membran welche kleinen Molekülen, wie etwa denen der Glukose, gegenüber durchlässig, Proteinen jedoch gegenüber undurchlässig ist, wurde durch die Membran das Glukose-Oxydase-Enzym auf der Seite der Membran mit der Anode zurückgehalten, so daß es mit der Glukose reagieren konnte. Es wurde zum Beispiel eine Blutprobe auf die der Anode gegenüberliegenden Seite der Membran gebracht, und eine wäßrige Lösung des Enzyms und Sauerstoff auf die andere, d. h. auf die Elektrodenseite; dabei gelangten jene Bestandteile der Blutprobe mit niedrigem Molekulargewicht, wie etwa Glukose, durch die Membran, so daß im Bereich der Elektrode eine enzymatische Reaktion stattfand. Nach einer gewissen Zeit war ein Fließgleichgewichtszustand erreicht, als nämlich die Konzentrationen von Hydrogen-Peroxid und Glukose ein direkt proportionales Verhältnis zueinander aufwiesen, und die Zelle einen Stromfluß als Funktion der Menge des gebildeten Hydrogen- Peroxids lieferte, was wiederum als Anzeige für die Menge der vorhandenen Glukose diente. Wie ich bereits in meinem Artikel "Electrode Systems for Continuous Monitoring In Cardiovascular Surgery", N.Y. Acad of Sciences, 102:29-45 (1962) geoffenbart habe, konnte die Clark-Sauerstoffelektrode so eingerichtet werden, daß sie als Glukose- Anzeige dienen konnte und zwar aufgrund der Tatsache, daß Sauerstoff im Verhältnis zum Glukoseinhalt durch die enzymatische Reaktion verbraucht wird. In jener Vorrichtung war die innere Membran glukose-undurchlässig, und die Reaktion wurde anhand des Sauerstoffabfalls kontrolliert. Bei meinen früheren Techniken im Zusammenhang mit der Membran-Polarographie zur Bestimmung von Hydrogen-Peroxid war die Anwendung auf die Ermittlung kleiner Moleküle beschränkt, die in der Lage sind die Membran zu durchdringen und mit dem auf der Elektrodenseite der Membran befindlichen Enzym eine enzymatische Reaktion einzugehen.
Neuerdings sind enzymatische Verfahren zur Bestimmung von Makromolekülen wie etwa Cholesterin durchgeführt worden. Im Allgemeinen wurden bei diesen enzymatischen Verfahren zwei Enzyme, Cholesterinoxydase und Cholesterinester-Hydrolase mit kalorimetrischen Verfahren kombiniert. Diese kalorimetrischen Verfahren beruhten auf der enzymatischen Umwandlung von Cholesterin oder Cholesterinester zu Cholestenon und Hydrogen-Peroxid und dann auf der Reaktion des Hydrogen-Peroxids mit verschiedenen Verbindungen zu meßbaren Chromagenen und Fluoragenen. Im U.S. Patent Nr. 4,040,908 wird eine membran-polarographische Anode beschrieben zur Bestimmung von makromolekularen Substanzen, wie etwa Cholesterin und zwar durch die Verwendung enzymatischer Reaktionen als Möglichkeit solche makromolekularen Substanzen zu bestimmen.
Es sind zusätzliche Techniken entwickelt worden, durch die auch weitere Substanzen im Blut bestimmt werden können. Zum Beispiel wird z.Z. Äthanol im Blut entweder direkt oder durch eine Pusteprobe, durch klassische, chemische, gaschromatographische und enzymatische Methoden bestimmt. Eine dieser Alkohol-Enzym Methoden zum Beispiel beruht auf der polarographischen Bestimmung von Hydrogen-Peroxid, während andere sich nach dem Sauerstoffverbrauch richten. U.S. Patent Nr. 4,458,686 offenbart den Einsatz einer polarographischen Elektrode, die als Hautkontakt-Analysator zur transkutanen Messung von Sauerstoff zwecks Bestimmung von Blutsubstanzen wie etwa Alkohol oder Glukose sowie auch zur Messung von durch die Haut gehenden Alkohols verwendet wird.
Bei der Glukose handelt es sich um eines der wichtigsten biologischen Substanzen. Das ist deshalb der Fall, weil Glukose im Zusammenhang mit dem Stoffwechsel des Körpers im gesunden als auch im kranken Zustand, insbesondere bei Diabetes, eine wichtige Rolle spielt. Zum Beispiel, deuten die meisten der heute zur Verfügung stehenden wissenschaftlichen Ergebnisse darauf hin, daß es die hohe Glukosekonzentration per se des Blutes und des Gewebes, und nicht der zu niedrige Insulinspiegel oder das Beisein anomaler Metaboliten wie etwa Hydroxybuttersäure und Ähnlichem, sind, wodurch bei den verschiedenen Formen der Diabetis mellitus Organschäden verursacht werden. Diese Schäden können durch die Glyzylation vieler der zehntausenden von Proteinen im Körper verursacht werden. Eine solche Glyzylation zeigt sich im Glukose-Hämoglobin-AlC-Spiegel des Blutes, einer Substanz die häufig bestimmt wird um einen zeit-integrierten Spiegel des Blut-Glukose-Wertes darzustellen. Da es sich bei allen Enzymen um Proteine handelt, wirkt sich der hohe Glukosewert wahrscheinlich beeinträchtigend auf die katalytischen Funktionen in allen Körperteilen aus. Typische ernste mit Diabetes im Zusammenhang stehende Schäden sind Blindheit, der Verlust von Gliedern, Herz- und Kreislaufversagen und Tod.
Zur Kontrolle des Blut-Glukose-Wertes wird gegenwärtig Insulin verabreicht, und zwar entweder im Laufe des Tages in Abständen durch Einspritzung oder, bei einem sehr geringen Teil der Diabetes-Bevölkerung, durch eine programmierbare Pumpe die das Insulin subkutan injiziert. Je nach Schwere der Krankheit führt dies zu erheblichen, unter Umständen gefährlichen Schwankungen des Blut-Glukose- Wertes. Bei einigen Formen der Diabetes werden die das Insulin herstellenden Betazellen vollständig zerstört, so daß der Patient zum Überleben vollständig insulinabhängig wird.
In Anbetracht der oben beschriebenen Umstände wäre eine Vorrichtung wünschenswert, die kontinuierlich Glukose im Blut von Diabetikerpatienten abtasten (lesen) könnte, so daß das Insulin oder die Glukose wirksamer verabreicht und geregelt werden könnte. Es sind erhebliche Anstrengungen unternommen worden mit dem Ziel einen einpflanzbaren Glukoseabtaster (-leser) zu entwickeln, der in der Lage wäre, eine Insulinpumpe zu steuern oder zumindest ein kontinuierliches Signal zu liefern, durch das die Blut- Glukose-Konzentration wiedergespiegelt wird. Es wird jedoch weitverbreitet die Meinung vertreten, daß ein eingepflanzter Glukoseabtaster (-leser) auf Enzymbasis) nicht funktionieren kann oder, falls er funktionieren würde, nur wenige Tage nach der Einpflanzung im Blut oder in einer Körperhöhle brauchbare Ergebnisse liefern würde. In Schichiri, M. et al: Glycaemic Control In Pancreatectomized Dogs With A Wearable Artificial Endocrine Pancreas, Diabetologia. 24:179-184 (1983), wurde von einem Glukoseabtaster (-leser) berichtet, der eingepflanzt und sechs Tage lang, nach dem Datum der in vivo Einpflanzung, funktionierte. Bis zu diesem Zeitpunkt wurde ein solcher Erfolg, wenn auch begrenzt, als bemerkenswert erachtet. Nichtdestoweniger hat die begrenzte Betriebbarkeit solcher Abtaster (Leser) in der wissenschaftlichen Gemeinschaft dazu geführt, daß eingepflanzte Glukoseabtaster (-leser) auf der Basis von Glukoseoxydase nicht praktikabel sind. Zur Untermauerung dieser Ansicht werden halbschattige Begründungen gegeben. Zum Beispiel wird allgemein davon ausgegangen, daß das Enzym Glukosoxydase nicht ausreichend stabil ist um auch nur geringe Zeit im Körper eines Menschen bei Körpertemperatur aktiv zu bleiben. Ferner wird angenommen, daß Glukosoxydase durch Bakterien oder durch Pilze zerstört werden würde. Es besteht auch die Annahme, daß die durchlässige Membran der Elektrode durch Gewebezellen und Enzyme zerstört werden und durch sich darauf ansammelnde große Moleküle, Zelltrümmer und weiße und rote Blutkörperchen verstopft werden würde. Ferner wird davon ausgegangen, daß für die enzymatische Reaktion keine ausreichenden Mengen an Sauerstoff zur Verfügung stehen würden; oder daß Koenzyme durch die glukosedurchlässige Membran vom Enzym hinweg diffundieren würden; oder daß die Platinoberfläche der Elektrode metallisiert, vergiftet, deaktiviert oder passiv gemacht werden würde, so daß die Reduktion des erzeugten Hydrogen-Peroxids verhindert werden würde; oder daß die Reizbeantwortung des Gewebes in die Durchdringung der Membran durch Glukose eingreifen würde.
Zusammenfassend sei gesagt, daß, obwohl es verschiedene Vorrichtungen und Techniken zur Bestimmung biologischer Substanzen gibt, ein Bedarf besteht an neuen einpflanzbaren Vorrichtungen und Verfahren zur Messung, Verabreichung und/oder Regulierung biologischer Schlüsselsubstanzen wie etwa Blut-Glukose und Insulin. Es wäre von besonderem Vorteil, wenn eine zufriedenstellende einpflanzbare Vorrichtung zur Verfügung gestellt werden könnte, die bei der Kontrolle und Linderung von Diabetes eingesetzt werden könnte.
Die europäische Patentanmeldung Nr. 0035480 beschreibt eine Enzymelektrode, die über eine sich nahe bei einem aus einer Sauerstoffelektrode bestehenden Basisabtaster (-leser) befindliche enzymbeschichtete Anode mit durch Wasserelektrolyse gewonnenen Sauerstoff versorgt wird.
Gemäß einem Aspekt der Erfindung, wird eine Abtastvorrichtung zur Bestimmung eines Analyts durch Abtasten (Lesen) eines Produktes oder Reaktants aus einer Enzym- Reaktion mit dem Analyt, mit einer gasdurchlässigen Membran, die gegenüberliegende Seiten hat, einem Enzym an einer Seite der Membran für die enzymatische Reaktion mit dem Analyt im Beisein von Sauerstoff, um das Produkt oder den Reaktanten bereitzustellen, Mitteln zum Zuführen von Sauerstoff durch die Membran für die enzymatische Reaktion und Mitteln zum Abtasten (Lesen) des Produktes oder Reaktants als eine Funktion des Analyts, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Zuführen von Sauerstoff einen geschlossenen Behälter zum Fassen von Sauerstoff an der Enzymseite der Membran umfaßt.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung, umfaßt eine Methode zur Bestimmung eines Analyts durch Abtasten (Lesen) eines Produktes oder Reaktants aus einer Enzymreaktion mit dem Analyt, die Bereitstellung einer gasdurchlässigen Membran, die gegenüberliegende Seiten hat, die Bereitstellung eines Enzyms an einer Seite der Membran für die enzymatische Reaktion mit dem Analyt im Beisein von Sauerstoff, um das Produkt oder den Reaktanten zu erzeugen, Mitteln zum Zuführen von Sauerstoff durch die Membran für die enzymatische Reaktion und Mitteln zum Abtasten (Lesen) des Produktes oder Reaktants als Funktion des Analyts, dadurch gekennzeichnet, daß die Methode die Bereitstellung eines geschlossenen Sauerstoff enthaltenden Behälters auf der gegenüberliegenden Seite der Membran zum Zuführen von Sauerstoff durch die Membran für die enzymatische Reaktion mit einschließt.
Die Abtastvorrichtung (Lesevorrichtung) welche entweder optische oder elektrische Mittel zur Abtastung (Lesung) beinhalten kann, tastet das Produkt oder den Reaktanten, wie etwa Hydrogen-Peroxid, welches aus den enzymatischen Reaktionen zwischen den Enzymen und den Analyten gewonnen worden ist, ab, um somit die Menge der Analyten zu bestimmen. Die Erfindung begründet sich zum Teil auf die Entdeckung, daß Probleme die bei früheren Enzymabtastern (-lesern) erfahren wurden, dadurch überwunden werden können, daß eine Struktur bereitgestellt wird, durch die eine ausreichende und/oder gleichmäßige Sauerstoffzufuhr für die enzymatische Reaktion an der Abtasteroberfläche gewährleistet wird. Die Abtastvorrichtung eignet sich auch für eine in Vivo Einpflanzung und zur Meßung von Analyten, wie etwa Glukose, in unverdünntem Vollblut. Es ist entdeckt worden, daß ein Enzym und eine Elektrode der Vorrichtung sechs Monate oder noch länger nach der Einpflanzung aktiv bleiben. In Anbetracht des neuesten Standes der Technik ist dies bemerkenswert. In einer bevorzugten Form wird die Menge oder der Pegel des Hydrogen-Peroxids abgetastet um die Menge der im Tierkörper befindlichen Glukose zu bestimmen. Die Arten der tierischen Gewebe oder Flüssigkeiten, die für die Einpflanzung gewählt wurden, beinhalteten sowohl Bereiche mit Blut als auch Bereiche ohne Blut, wie etwa intravaskulär, Rückenmarkfluid, Peritonalfluid sowie intra- und extrazellulare Fluide.
Die Abtastvorrichtungen werden vorzugsweise eingesetzt um ein Produkt oder einen Reaktanten einer sauerstoffabhängigen enzymatischen Reaktion abzutasten, und sind in der Lage, aus einem an der Seite der Membran befindlichen Behälter, gegenüber dem Enzym, die enzymatische Reaktion mit einer stetigen Zufuhr von Sauerstoff zu versorgen, wobei der Sauerstoff entweder aus der Umgebung entnommen wird oder unabhängig von der Umgebung hergeleitet wird. Die Abtastvorrichtungen sind passenderweise so konstruiert, daß der Behälter zur Erzeugung von Sauerstoff angepaßt ist, wobei letzteres dann auf Anforderung an die enzymatische Reaktion geliefert werden kann. Mit anderen Worten, die enzymatische Reaktion bestimmt, wieviel Sauerstoff erforderlich ist, damit das Analyt zu dem schließlich abzutastenden Produkt umgewandelt werden kann. Es sollte jedoch erkannt werden, daß der zu verbrauchende Sauerstoff, der als Reaktant auf Anforderung der enzymatischen Reaktion zugeführt wird, und zwar durch eine Servovorrichtung oder ähnliche Konstruktion, auch als Maß für das zu untersuchende Analyt fungieren kann. Da entdeckt worden ist, daß die enzymatischen Reaktionen sauerstoff-begrenzend sind, können die Abtastvorrichtungen so konstruiert werden, daß der Behälter eine kontinuierliche Sauerstoffzufuhr für die enzymatische Reaktion liefert und zwar so, daß Sauerstoff immer für die enzymatische Reaktion im Überschuß vorliegt.
Die Methode durch die ein Analyt durch Abtasten eines Produktes oder Reaktanten einer enzymatischen Reaktion zwischen dem Analyt und einem Enzym im Beisein von Sauerstoff bestimmt wird, kann entweder in vivo oder in vitro durchgeführt werden.
Im folgenden wird nun diese Erfindung beschrieben, dabei wird auf die beigefügten Figuren Bezug genommen. Fig. 1 ist ein Querschnitt einer Form einer elektrischen Vorrichtung, die eine der Ausführungsformen der Erfindung veranschaulicht;
Fig. 2 zeigt in vitro erzeugte zyklische Polarogramme der sich verändernden Glukosekonzentrationen in einer flüssigen Probe, z. B. Gomori-Pufferlösung, sauerstoff-frei unter Anwendung der in Beispiel 1 beschriebenen elektrischen Vorrichtung;
Fig. 3a zeigt in vitro erzeugte zyklische Polarogramme der sich verändernden Glukosekonzentrationen in einer flüssigen Probe, z. B. Gomori-Pufferlösung, sauerstoff-frei unter Anwendung eines elektroenzymatischen Glukose-Abtasters der vorliegenden Erfindung; und
Fig. 3b zeigt in vitro erzeugte zyklische Polarogramme der sich verändernden Glukosekonzentrationen in unverdünntem Ziegen-Vollblut unter Anwendung des gleichen in Fig. 3a genannten Abtasters.
Mit dem hierin verwendeten Begriff "Tiergewebe" sind alle Tiergewebe einschließlich Körperflüssigkeiten und Blut gemeint.
Bei dem in dieser Spezifikation genannten "geschlossenen Behälter" ist ein Behälter zu verstehen, der gegenüber solchen Substanzen wie Flüssigkeiten und Zellen undurchlässig ist, die möglicherweise die Fähigkeit des Behälters oder der mit dem Enzym im Zusammenhang stehenden Membran die enzymatische Reaktion mit Sauerstoff zu versorgen stören könnte. Mit dem Begriff "Produkt" der enzymatischen Reaktion wird das durch eine solche Reaktion erzeugte Produkt bezeichnet, wie etwa Hydrogen-Peroxid oder Glukonsäure oder Benztraubensäure, oder Produkte, die aus dem "Produkt" erzeugt werden. Der Begriff "Reaktant" wird gemeint, daß damit Substanzen bezeichnet werden, die direkt oder indirekt in der enzymatischen Reaktion einbezogen sind, wie z. B. Sauerstoff. Es sollte somit erkannt werden, daß der Bioabtaster und die angewandte Methode die Produkte oder Reaktanten der enzymatischen Reaktion, oder die Nebenprodukte, die aus den erzeugten Produkten entstehen und die als Bestimmungsmaß für das Analyt gelten, abtasten können.
Der hierin verwendete Begriff "Analyt" bezieht sich auf irgendeine Substanz, die sich als geeignet erweist um durch polarographische, potentiometrische, optische oder andere Verfahren analysiert zu werden. Als Beispiel eines der vielen anderen Verfahren sei erwähnt ein auf Leitfähigkeit beruhendes Verfahren, z. B. ist Glukose nicht leitfähig, aber Glukonsäure kann erfaßt werden und als Maß für das Analyt dienen. Ferner kann Hydrogen-Peroxid durch die Elektronenspin-Resonanz erfaßt werden, und so weiter. Zu den Beispielen solcher Analyten, die bestimmt werden können, gehören Glukose und Laktat. Das durch die enzymatische Reaktion zwischen einem Analyt und einem Enzym, im Beisein von Sauerstoff, erzeugte Produkt, z. B. Hydrogen- Peroxid, kann durch Anwendung üblicher elektrischer oder optischer Verfahren bestimmt werden und als Maß für das untersuchte Analyt verwendet werden. Zum Beispiel kann Hydrogen-Peroxid in einem elektrischen System einen Anodenstrom erzeugen, wenn er einer ausreichenden Spannung ausgesetzt wird; oder, in einem optischen System kann es mit der optischen Substanz reagieren oder zwecks Reaktion reduziert werden, so daß Chromagene oder Fluorogene erzeugt werden, die dann optisch bestimmt werden können.
Die Vorrichtungen können Hydrogen-Peroxid abtasten, welches bei der enzymatischen Reaktion mit Glukose oder Laktat in einer flüssigen Probe und in der Gegenwart von Sauerstoff erzeugt wird; das gilt dann als Maß für die Glukose und das Laktat. Alternativ kann auch Sauerstoff abgetastet werden und als Maß für das Analyt dienen. Die Vorrichtungen eignen sich besonders für die in vivo Einpflanzung und die Meßung solcher Analyten in unverdünntem Vollblut. Die Bioabtaster sind so konstruiert, daß sie für die enzymatische Reaktion eine unabhängige Sauerstoffquelle zur Verfügung stellen, so daß dadurch anscheinende Sauerstoffmängeln entgegengewirkt werden kann, die sonst in der untersuchten Flüssigkeit auftreten würden. Mit anderen Worten, es ist festgestellt worden, daß Probleme, die bisher im Zusammenhang mit enzymatischen Elektroden oder optischen Strukturen auftraten, durch die Vorrichtung überwunden werden. Die Vorrichtungen haben sich als ideal geeignet erwiesen um in Spannungsbereichen mit geringem Sauerstoff, wie etwa die Bauchfellhöhle, verwendet oder eingepflanzt zu werden um dort den darin enthaltenen Glukosewert zu ermitteln.
Bezugnehmend nun auf die Fig. 1, wobei es sich um eine schematische Darstellung einer geeigneten Vorrichtung handelt, zeigt diese einen Abtaster (Leser) 5, der sich auf jener Seite einer gasdurchlässigen Membrane 6a befindet, die gegenüber des als unabhängigen Sauerstoffspeichers zur Versorgung der enzymischen Reaktion dienenden Enzyms liegt; dieser Abtaster ist mit einer Luftraum-Gastasche 12 versehen. Spezieller noch, zeigt Fig. 1 einen Abtaster 5 der einen geschlossenen Behälter oder eine Kammer 6 umfaßt, die ein Ober- und Unterteil sowie gegenüberliegende Seiten 6a, 6b, 6c, bzw. 6d aufweist. Es sollte ohne weiteres zu erkennen sein, daß aus illustrativen Gründen in Fig. 1, es sich bei dem Deckel 6a der Kammer 6 um die gasdurchlässige Membran handelt. An der Außenfläche der Seite 6a der Kammer 6 ist ein Enzym 7 angebracht, welches mit einer Anode 8 in Berührung steht. Vorzugsweise handelt es sich bei dieser Anode um Platin, welches auf der Oberfläche 6a der Kammer 6 verteilt oder ausgefächert ist. Anode 8 hat vorzugsweise die Form eines Gitters oder einer Vielzahl von Drähten (nicht dargestellt), die über das Oberteil 6a der Membran herauszweigen, so daß Sauerstoff leichter um die Anode herum diffundieren kann. Die Anode 8, die sich in und durch die Kammer 6 erstreckt, ist in der Kammer 6 mit einem isolierten Draht 9 - Isolierung etwa Polytetrafluoräthan, allgemein unter dem Warenzeichen Teflon bekannt, bedeckt. Der Draht 9 kann sich außerhalb der Kammer befinden. Das Enzym 7 und die Anode 8 überlagernd befindet sich eine analyt-durchlässige Membran 10, welche auch mit der Kammer 6 verbunden ist. Fig. 1 zeigt die Membran 10, die durch irgendeine geeignete Methode mit der Kammer 10 versiegelt ist. Die analyt-durchlässige Membran kann aus irgendeinem geeigneten Material bestehen, wie etwa Zellulose. Vorzugsweise handelt es sich bei der Membran 10 um ein gegenüber kleinen Molekülen, wie etwa Glukose und Laktat, durchlässiges, jedoch gegenüber Makromolekülen, wie etwa Proteinmolekülen und ähnlichen undurchlässiges Material. Die in der Tabelle 1 von Thevenot, D.R.: Problems In Adapting A Glucose-Oxidase Electro Chemical Sensor Into An Implantable Glucose-Sensor Device, Diabetes Care. 5(3): 184-189 geoffenbarten Substanzen dienen veranschaulichend für weitere geeignete Membrane, die im Zusammenhang mit den Abtastern (Lesern) eingesetzt werden können. Dabei wird der gesamte Inhalt dessen hierin durch entsprechende Bezugnahme aufgenommen. Die Kammer 6 wird vorzugsweise aus einem Material hergestellt, daß gasdurchlässig aber gegenüber Flüssigkeiten undurchlässig ist. Als ideales Material mit diesen Eigenschaften erweist sich verstärktes Silastik, wie etwa organisches Silikonpolymer, (wie beim Dow Corning subdermalen Implantat Nr. 501-1, 0.007 Zoll (= 0,18 mm) verwendet). Folgendes gilt als weitere Darstellung der bevorzugten Verwendung von Silastic zur Formulierung der Kammer: es ist entdeckt worden, daß nach der Einpflanzung in ein Tier die Kammer über einen gewissen Zeitraum verhältnismäßig flüssigkeitsfrei bleibt. Es handelt sich hierbei um eine ziemlich bedeutungsvolle Entdeckung, insbesondere in Anbetracht der Tatsache, daß Silastik gegenüber Wasserdampf durchlässig ist. Es sollte jedoch erkannt werden, daß auch andere Materialien mit ähnlichen Eigenschaften, wie etwa Tetrafluoräthylen, im Allgemeinen unter dem Warenzeichen Teflon bekannt, verwendet werden können.
Obwohl dies in den Figuren nicht gezeigt wird, sollte erkannt werden, daß die Abtaster (Leser) eine "dritte" Membran mit einschließen können, die über die Anode 8 plaziert werden könnte um das Enzym 7 von der Anode 8 zu trennen. Es handelt sich hierbei um das sogenannte "Sandwich"-Konzept welches veranschaulicht wird in Clark, L.C., Jr. et al: Rapid Micromeasurement of Lactate in Whole Blood, Critical Care Medicine. 12(5) 461-464 (Mai, 1984 sowie in Clark, L.C., Jr, and Duggan, C.A.: Implanted Electroenzymatic Glucose Sensors, Diabetes Gase. 5(3) 174- 180 (Mai-Juni 1982), die in ihrer Gesamtheit hierin durch Bezugnahme aufgenommen sind. Die "dritte" Membran kann zum Beispiel aus Acetatzellulose oder ähnlichem Material gebildet sein. Die Vorteile, die mit solch einer Membran im Zusammenhang stehen, sind mindestens von zweifacher Art. Erstens erlaubt eine solche Membran die selektive Diffusion des enzym-erzeugten Produktes, zum Beispiel Hydrogen- Peroxid, zur Anode hin, wo das Peroxid oxidiert wird, was zu einem Stromfluß führt, der als Maß für das Enzymsubstrat, z. B. Glukose oder Laktat dient. Zweitens, da mehrere unter Umständen unvorteilhaft wirkende Substanzen im Körper vorliegen könnten, z. B. Askorbinsäure und phenolische Verbindungen wie etwa Azetaminophenol, wirkt der Einsatz einer "dritten" Membran wie eine Barriere gegen solche störenden Substanzen, wodurch die Gefahr eines ungenauen oder unrichtigen Meßergebnisses verringert wird. In dieser Technik ist ein Azetatzellulose-Membran eingesetzt worden um den störenden Einfluß solcher Verbindungen auszuschließen.
Die Vorrichtung ist so konstruiert worden, daß sie Sauerstoff aus der um die Kammer herum befindlichen Umgebung entnehmen kann. Ist zum Beispiel der Abtaster (Leser) eingepflanzt worden, ist der geschlossene Behälter vorzugsweise so angepaßt, daß der Sauerstoff aus dem in der direkten Nähe befindlichen Tiergewebe extrahieren kann, so daß eine konstante und selbstversorgende Sauerstoffzufuhr zur enzymatischen Reaktion gewährleistet ist. Wie bereits erwähnt, eignet sich das silastische Material hierzu besonders.
Aufgenommen in dem geschlossenen Behälter oder der Kammer 6 der. Vorrichtung befindet sich ein Sauerstoffträger, wie etwa Perfluorkohlenstoff oder Derivate davon, Siliziumöl oder andere organische Lösemittel. Bei Perfluorkohlenstoff und Derivaten davon wird ein Perfluor-Zyklokohlenstoff bevorzugt. Eine veranschaulichende Liste geeigneter Perfluorkohlenstoffe kann den U.S. Patent Nummern 4,443,480 und 3,911,138 entnommen werden, die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit vollständig aufgenommen werden. Das Enzym zusammen mit einer Emulsion bestehend aus Perfluorkohlenstoff oder ein Derivat davon kann auch in der Kammer 6 aufgenommen werden. In einem solchen Fall sollte die das Enzym beinhaltende Kammer 6 entsprechend so angepaßt werden, daß das Enzym das Oberteil 6a durchdringen kann, so daß das Enzym die enzymatische Reaktion versorgen kann. Nachdem das Enzym in der Kammer 6 und im Oberteil 6a, d. h. die Membrane so vorbereitet worden ist, daß sie vom Enzym durchdrungen werden kann, muß sich das Enzym nicht notwendigerweise an der äußeren Oberfläche des Oberteiles 6a befinden, d. h. es muß nicht so ausgerichtet sein, wie dies in der Fig. 1 abgebildet wird.
Die Bioabtaster können audio und visuelle Vorrichtungen beinhalten, die als Maß des untersuchten Analyts dienen können, und diese Information können über audio oder visuelle Möglichkeiten zum Beispiel im Falle eines einpflanzbaren Sensors an ein Implantat übertragen werden; solche Vorrichtungen könnten so programmiert werden, daß sie den ganzen Tag oder zu bestimmten Tageszeiten einen Ton von sich geben, aus dem z. B. die jeweils vorhandene Blut- Glukosekonzentration entnommen werden könnte. Es können radiotelemetrische Vorrichtungen eingesetzt werden. Bei visuellen Vorrichtungen könnten diese so programmiert werden, daß sie den ganzen Tag oder zu bestimmten Tageszeiten Licht von sich geben könnten, dessen Stärke als Funktion des Analyts variieren würde.
Wenn ein elektrischer Sensor eingesetzt wird, kann die zugeführte Spannung fest, geschaltet, zyklisch geregelt oder durch Pulse zugeführt sein. Hat die zugeführte Spannung einen festen Wert, kann dieser Wert im Bereich zwischen ca. 0,5 und 1,0 Volt positiv oder negativ liegen und zur Abtastung des erzeugten Produktes, wie etwa Hydrogen-Peroxid dienen, so daß das Analyt bzw. der Sauerstoff bestimmt werden können. Vorzugsweise sollte die festeingestellte Spannung den Wert +0,6 V oder -0,6 V betragen, zur Meßung des Analyts bzw. des Sauerstoffes. Solche Methoden zur Bestimmung sowohl des Sauerstoffes als auch des Analyts werden im U.S. Patentantrag Seriennummer 650,344 beschrieben; ihr gesamter Inhalt ist durch Bezugnahme hierin aufgenommen. Bei einer zyklischen Spannungszufuhr kann die Spannung in einer Schleife zugeführt werden, wobei zum Beispiel die Spannung zu Beginn der Schleife zunächst positiv, dann negativ und dann wieder positiv wechseln würde zwischen den Bereichen +0,5 bis -0,5 bis +0,5 Volt und vorzugsweise von ca. +0,6 bis -0,6 bis + 0,6 Volt variieren würde. Mit anderen Worten, die Spannung wird innerhalb eines geeigneten Bereiches zyklisch zugeführt. Die Vorteile der zyklischen Spannungsversorgung sind mehrfach. Zum Beispiel indem die Spannung zyklisch zugeführt wird, kann der molekulare Sauerstoff nahezu simultan mit dem zu untersuchenden Analyt abgetastet werden, so daß sichergestellt wird, daß eine für die Reaktion ausreichende Sauerstoffversorgung gewährleistet ist. Ferner ist festgestellt worden, daß die zyklische Spannungszufuhr zu einer saubereren Elektrode führt, z. B. wird dadurch die Metallisierung, die jetzt bei Platinelektroden beobachtet wird, reduziert. Es ist auch festgestellt worden, daß die zyklische Spannungszufuhr die direkte Umgebung des Sensors neutralisiert. Dies ist besonders deshalb von Vorteil, weil ein Anodenstrom Wasserstoffionen und ein Ionenstrom Hydroxylionen erzeugt. Bei einer pulsierenden Spannung, wird die Spannung für kurze Momente eingeschaltet, z. B. alle fünf Minuten 10 Sekunden bis etwa 60 Sekunden lang, mit dem Ziel ein erzeugtes Produkt, wie etwa Hydrogen-Peroxid abzutasten (zu lesen), nachdem um den Sensor herum ein stationärer Zustand erreicht worden ist. Es wird angenommen, daß die Anwendung eines solchen pulsierenden Verfahrens zu höheren Strömen und zu besseren Meßungen führt, eben weil ein stationärer Zustand erreicht wird. Solche pulsierenden Verfahren werden im U.S. Patent Nr. 4,464,320 beschrieben, und der gesamte Inhalt dessen wird hier durch Bezugnahme aufgenommen.
Ein mit zwei Elektroden oder mit drei Elektroden ausgerüstetes System kann eingesetzt werden. Im Allgemeinen eignet sich ein zwei-Elektroden System zur Meßung von Analyten in wäßrigen Lösungen mit hoher Leitfähigkeit, wobei ein drei-Elektroden System sich zur Meßung von Analyten in Lösungen mit niedriger Leitfähigkeit eignet. Für beide Systeme sollte erkannt werden, daß die "Referenz"- und "Zähler"elektroden weit ab vom Abtaster, oder in der Nähe des Abtaster oder auch als Teil des Abtasters eingerichtet werden können. In der bevorzugten Ausführungsform werden die Elektroden als Teil des Abtasters ausgeführt, wobei dann bevorzugt wird, daß sich die Elektroden alle auf der selben Seite der Membran befinden, insbesondere dann, wenn es um die Analyse von Analyten in Proben mit geringer Leitfähigkeit geht.
Zusätzlich zur Bereitstellung einer elektrischen Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyts durch Abtastung des daraus sich bildenden Hydrogen-Peroxids oder anderer Produkte, kann ein optischer Sensor bereitgestellt werden, der einen Farbstoff im Zusammenhang mit monochromatischem, dichromatischem oder mehrfachchromatischem Licht verwendet, welches durch optische Lichtträger übertragen werden kann, wobei das empfangene Lichtspektrum mit bekannten Instrumenten untersucht werden kann um die Analytkonzentration einer flüssigen Probe zu ermitteln. Beim Einsatz eines chromatischen Lichtsensors kann der Farbstoff z. B. auf die Membran 6a plaziert werden, in Berührung mit Enzym 7 um mit Hydrogen-Peroxid zu reagieren, oder um mit einem sich daraus ergebenden Produkt zu reagieren und daraus eine Farbe zu erzeugen, die optisch abgetastet werden kann, wodurch sich eine Grundlage zur Bestimmung des untersuchten Analyts ergibt. Ferner kann sich aus der enzymatischen Reaktion eine Fluoreszenz oder eine Phosphoreszenz ergeben. Durch Anwendung einer geeigneten enzym-enthaltenden Vorrichtung, einen fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Farbstoff und das photoaktivierendende Produkt, d. h. Hydrogen-Peroxid oder ein sich daraus ergebendes Derivatprodukt der enzymischen Reaktion, kann eine Analytkonzentration dadurch bestimmt werden, daß die von der durch die Reaktion zwischen dem Hydrogen-Peroxid oder dem daraus derivierten Produkt und dem fluoreszierenden oder phosphoreszierenden Farbstoff durch die Glasfaseroptik strahlende Lichtmenge abgetastet wird. Es sind solche Farbstoffe bekannt, die in der Gegenwart von Hydrogen-Peroxid fluoreszieren. Ferner ist die Färbung von Phenol-rot pH-abhängig. Es wechselt (von rot nach gelb) je mehr Glukonat aus Glukose produziert wird, und eine solche Methode könnte auch verwendet werden.
Die Vorrichtungen können sowohl in vitro als auch in vivo) verwendet werden. Beim Einsatz der Vorrichtung in vitro, sollte die Meßung vorzugsweise, z. B. in einer geeigneten Menge magnetisch gerührten Puffers oder Vollblut durchgeführt werden, z. B. in einer Glaskammer ummantelt mit 37º zirkulierendem Wassers. Beispiele für geeignete Puffer sind u. a. Phosphatpuffer, wie etwa Gomori-Puffer. Die Glukosemessung kann unter Einsatz eines temperatur-kompensierten vorkalibrierten Sensors direkt am Finger im Vollblut durchgeführt werden.
In Bezug auf die Einpflanzung, d. h., in vivo, der Vorrichtung in ein Tier einschließlich des Menschen kann irgendeine Technik, die keine Inkompatibilitäten mit den hierin beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren aufweist, verwendet werden. Beispiele solcher Verfahren werden von Clark, L.C. et al.: Theoretical And Practical Basis For Implantable Glucose Sensors With Special Reference To The Peritoneum, Proceedings of the Symposium on Biosensors. Los Angeles, Calif. A.R. Potvin und Mr. Neuman (Eds.). Institute of Electrical and Electronics Engineering (IEEE). New York, N.Y. pp. 69-74 (Sept. 15-17, 1984) und Clark, L.C. und Duggan, A.: Implanted Electroenymatic Sensor, (Diabetes Care). 5(3) 174-180 (Mai-Juni 1982) beschrieben, die hierin vollständig durch Bezugnahme aufgenommen sind.
In bezug auf den Ort der Einpflanzung, können die Vorrichtungen sowohl in Blut als auch in blut-freien Bereichen eingepflanzt werden. Beispiele für blut-freie Zonen sind subkutane, intramuskuläre, epihepatische, intraperitoneale Bereiche sowie Bereich des Gehirns, und bevorzugterweise intraperitoneale Bereiche. In Bezug auf die intraperitonealen Bereiche, kann die Abtastvorrichtung auf oder in der Nähe von, jedoch nicht darauf beschränkt, der Bauchspeicheldrüse, Leber, Bauchfell, Magen oder Darm eingepflanzt werden. Natürlich wird hier in Betracht gezogen, daß wenn solche Vorrichtungen implantiert werden, sie zur Anwendung mit Insulinpumpen oder anderen verwandten Vorrichtungen in vivo oder in vitro bei Diabetikerpatienten angepaßt werden können. Beispiele solcher Anwendungen sind in Albisser, A.M.: Insulin Delivery Systems: Do They Need A Glucose Sensor, Diabetes Case. 5(3) :166-173 (Mai-Juni 1982) enthalten, welches hierin durch Bezugnahme vollständig aufgenommen ist.
In Bezug auf das Enzym 7, wird es vorzugsweise an der äußeren Fläche der Seite 6a einer Kammer 6 in Berührung mit einer Platinanode 8 plaziert. Die Enzyme werden vorzugsweise dort durch eine Glutaraldehydbehandlung immobilisiert und stabilisiert. Zum Beispiel wird der Abtaster, nachdem er zusammengebaut worden ist, über Nacht in eine Glaskammer mit Glutaraldehyddampf plaziert. Der Dampf wird durch eine 25%ige Glutaraldehydschicht erzeugt, die sich im unteren Teil der Kammer befindet. Diese Behandlung, die bei Raumtemperatur durchgeführt wird, dient dazu die Enzyme, wie z. B. Glukoseoxydase, unlöslich und/oder stabil zu machen, und den Abtaster zu sterilisieren. Nach dieser Behandlung wird er vorzugsweise in 70%igem Äthanol bis zum Gebrauch kalt aufbewahrt. Es ist festgestellt worden, daß Spuren von residualem Glutaraldehyd durch zyklische Voltammetrie aufgespürt werden können. Auf diese Weise ist es möglich, sicherzustellen, daß das überschüssige Glutaraldehyd entfernt worden ist. Weitere empfindliche Tests für Glutaraldehydspuren, wie etwa solche, die nach dem Gebrauch von klinischen Dialysegeräten und nach ihrer Sterilisation zwecks Wiederverwendung behandelt werden, werden gelegentlich verwendet. Bei der Bestimmung von Glukose, könnte Glukoseoxydase, die aus Quellen wie Penicillium notatum oder Aspergillus niger stammt, verwendet werden.
Zusätzlich zu Glukoseoxidase und Laktatoxidase können eine Anzahl weiterer Enzyme eingesetzt werden um eine Vielzahl von Analyten in vivo oder in vitro aufzuspüren und zu messen. Die folgende Tabelle führt Beispiele vieler dieser Enzyme an, ihre Kennzahlen, Quellen und typische Analyten mit denen sie zwecks Messung reagieren. Tabelle Enzym Nummer Quelle Typische Substrate Glykolatoxydase Spinat Rattenleber Glykolat L-Laktat D-Laktat (+)-Mandalat Laktatoxydase M.phlei L-Laktat Glukoseoxidase Aspergillus niger Penicillium amagasakieneses Honig (Biene) Penicillium notatum β-D-Glukose 2-Dioxy-D-Glukose 6-Dioxy-6-Fluoro-D-Glukose 6-Methyl-D-Glukose Hexoseoxydase β-D-Glukose D-Galaktose D-Mannose L-Gulonolaktonoxydase Rattenleber L-Gulono-λ-Lakton L-Galaktonolakton D-Manonolakton D-Altronolakton Galaktoseoxydase Dactylium dendroides Polyporus circinatus D-Galaktose Stachyose Laktose L-2-Hydroxylsäureoxidase Schweine-Nierenrinde L-2-Hydroxylsäure Aldehydoxydase Kaninchenleber formaldehyd Acetaldehyd Xanthinoxidase Rindermilch Schweineleber Purin Hypoxanthin Benzaldehyd Xanthin Tabelle (Fortsetzung) Enzym Nummer Quelle Typische Substrate Pyruvatoxydase Pyruvat erfodert Thiaminphosphat Oxalatoxydase Dihydro-Orotat-Dehydrogenase Zymobacterium oroticum Oxalat L-4, 5-Dihydro-Orotat NAD D-Aspartatoxydase Kaninchen Niere D-Aspartat D-Glutamat L-Aminosäureoxydase Diamant Klapperschlange Cotton mouth mocassin Rattenleber L-Methionin Phenylalanin 2-Hydroxylsäuren L-Laktat Monoaminoxydase Rinder-Plasma Placenta Monoamin Benzylamin Oktylamin Pyridoxamin Phosphatoxydase Kaninchen Leber Pyridoxaminphosphat Diaminoxydase Rinder-Plasma Erbsensämlinge Schweine Plasma Diamine Spermidin Tyramin Sarkosinoxydase Macaca mulatta Rattenleber Mitochondrien Sarkosin Tabelle Enzym Nummer Quelle Typische Substrate N-Methyl-L-Aminosäureoxydase N-Methyl-L-Aminosäuren Sperminoxydase Neisseria perflava Serratia marcescens Spermin Spermidin Nitroäthanoxydase Nitroäthan aliphatische Nitroverbindungen Uratoxydase Schweineleber Ochsenniere Urat Sulfitoxydase Rinderleber Sulfit Alkoholoxydase Basidiomyceten Äthanol und Methanol Carbohydratoxydase Basidiomyceten Polyporus obtusus D-Glukose D-Glukopyranose D-Xylopyranose l-Sorbose δ-Glukonolakton NADH-Oxydase Rinderherz Mitochondrien NADH Malatoxydase L-Malat Cholesteroloxydase Cholesterol N-Acetylindoxyloxydase L-Acetylindoxyl Thioloxydase R: CR-SH Ascorbatoxydase Zitronensaft L-Ascorbat
Es wird ebenfalls hierin in Betracht gezogen, daß eine elektrolytische Vorrichtung in, auf oder nahe bei der eingegeschlossenen Kammer 6 aufgenommen werden kann zwecks Erzeugung von Sauerstoff, unabhängig von der die Kammer umgebende Umwelt, so daß der Sauerstoffspeicher in der Kammer wieder nachgefüllt werden kann. Bei einer solchen Vorrichtung oder einem solchen Gerät könnte es sich um eine kleine Batterie (nicht dargestellt) handeln die in, auf oder nahe bei der Kammer 6 angebracht wird, mit dem Zweck in der Kammer Sauerstoff zu erzeugen, oder eine Sauerstoffzelle (nicht dargestellt) bestehend aus Phosphorsäure welche elektrolysiertem Wasser ausgesetzt wird, das .durch gelösten Wasserdampf innerhalb der Kammer 6 entstanden ist und wodurch Sauerstoff dann erzeugt werden kann. Durch die Elektrolyse entstandener Sauerstoff diffundiert vom Abtaster hinweg zum Körper hin; konstruktiv veränderbar durch die Elektrolytzelle in der Trommel.
Ein elektroenzymatischer Glukose-Abtaster und eine veranschaulichende Darstellung ihres Einsatzes in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung soll nun unter Bezugnahme auffolgende Beispiele beschrieben werden.

Beispiel 1

Ein elektroenzymatischer Abtaster wurde wie folgt bereitgestellt.
Die Trommel wurde aus einem Stück Dow Corning Silastikschlauch 0,1875 Zoll (4,75 mm) I.D. X 0,3125 Zoll (7,95 mm) A.D. bereitet. Ein etwa ein Zentimeter langes Stück Schlauch wurde abgetrennt und mit Dow Corning Silastik medizinischem Kleber, Katalog-Nr. 891 Kleber auf einen Silastikbogen geklebt. In den von der Dow Corning Company hergestellten 0,010 Zoll (0,25 mm) starken Silastikbogen, oder die Silastikmembrane, wurde eine Kreisfläche mit Durchmesser 1 cm ausgeschnitten. Die Trommelköpfe wurden an beide Enden des Silastikrohres befestigt so daß sich eine umschlossene Trommel ergab. Bei dem verwendeten Draht handelt es sich um Platin-Iridium-Draht von der Firma MedWire Corp., der aus neun 0,0011 Zoll (0.028 mm) mit Teflon isolierten Strängen besteht. Etwa 5 mm der Drahtisolierungen wurden entfernt wodurch die 9 Stränge sichtbar wurden die auf der Oberfläche der Trommel verteilt waren. Der Draht wurde dann in 0,025 Zoll (0,635 mm) I.D. x 0,047 Zoll (1,20 mm) A.D. Silastikröhrchen eingeführt und dann mit Seidefaden am Rand des Röhrchens befestigt. Dann wurde über das Ende der Elektrode, dort wo der Platin-Iridiumdraht verteilt gewesen war, ein Stück regenerierte Zellulosemembran, welche Glukose gegenüber durchlässig ist, angebracht. Die sich als am geeignetsten erweisende Art heißt Spectropor und es handelte sich dabei um Dialyseröhrchen die im Viscos-Verfahren hergestellt werden. Nach dem Aufblasen hatte das von der Arthur H. Thomas Co., Philadelphia,. PA mit der Katalognummer 3787-F45 erworbene Röhrchen einen Durchmesser von ein-einviertel Zoll (31,75 mm). Diese Röhrchen wurden lediglich als Membran verwendet. Vor dem Anbringen der Röhrchen wurden diese in Wasser getränkt, und sie wurden angebracht nachdem die Glukoseoxidase auf die Platindrähte am Ende der Silastiktrommel beschichtet wurde. Die Membrane wurde über den Rand gestreckt und dann mit vielen Windungen des Seidefadens befestigt. Die neun Platin-Iridiumdrähte wurden mit dem Enzym Glukoseoxydase beschichtet welches von der Sigma Chemical Co., St Louis, MO in gefrorener Puderform mit der Katalognummer G-2133 erworben wurde; dabei bestand dieses Puder aus kristallinem Glukoseoxydase, ein hell gelbes Puder, zu gleichen Mengen gemischt mit Glukonsäure als Konservierungsmittel. Glukoseoxydase, wo die Glukonsäure durch Dialyse entfernt und gefriergetrocknet wurde, kann auch verwendet werden. Das Glukoseoxydase-Puder wurde einfach in Wasser gelöst, und zu einer konzentrierten Mischung angereichert und dann auf dem Draht verteilt. Danach wurde, wie bereits erwähnt, die Zellulosemembran über die Enzym-beschichteten Drähte gezogen. Danach wurde der gesamte Abtaster in die durch etwa 25% wäßriges Glutaraldehyd über Nacht erzeugte Dampfphase gestellt, wobei die Glutaraldehyd-Lösung unten in eine Glaskammer gegossen wurde. Nach der Behandlung mit dieser mittels Glutaraldehyd erzeugten Dampfphase, die dazu diente das Enzym unlöslich zu machen und zu immobilisieren, wurde sie entnommen und in einer gerührten Küvette mit Phosphat gepuffertem 7.4 getan und geprüft; es wurde zum Gleichgewicht gebracht oder mit Luft durchblasen. Die Meßungen wurden bei einer Temperatur von ca. 40ºC durchgeführt. Eine solche elektroenzymatische Elektrode eignet sich als einpflanzbare Elektrode oder zur Anwendung mit unverdünntem Vollblut, als Tauchelektrode. Nach der Kalibrierung der eingepflanzten Elektrode, wobei zunehmende Mengen Glukose dem gerührten Puffer hinzugefügt wurden, wurde der Glukose- Abtaster in 70% Alkohol in der Kälte des Kühlschrankes gelagert bis es in ein Tier eingepflanzt wurde.

Beispiel 2

Fig. 2 zeigt die zyklischen in vitro erzeugten Polarogramme die durch den elektroenzymatischen Glukose- Abtaster aus Beispiel 1, mir der sich verändernde Glukosekonzentrationen in der Thermostat-geregelten Küvette die den Gomori-Puffer enthielt, gemessen wurden. Das PO&sub4; des Gomori-Puffers wurde zunächst nahezu auf Null gebracht, indem Stickstoff hindurch geblasen wurde. Die Glukose wurde hinzugeführt, zuerst um 200 mg% zu erreichen, danach 400 mg%. Die Strom-reaktion (unterer linker Quadrant) zeigt, daß die Sauerstoffzufuhr (oberer rechter Quadrant) war ausreichend und mußte von innen aus dem geschlossenen Behälter der Abtastvorrichtung heraus kommen.

Beispiel 3

Die Fig. 3a und 3b veranschaulichen zyklische in vitro Polarogramme die mit einem Elektroenzymatischem Sensor, der Veränderungen der Glukosekonzentration in einer thermostatisch geregelten Küvette mit Gomori-Puffer merkt und sie reflektiert. Der PO&sub2;-Wert des Gomori-Puffers wurde zunächst nahe auf Null gebracht indem Stickstoff durchgeblasen wurde. Die Glukose wurde dann hinzugeführt, zuerst bis auf 200 mg% dann auf 400 mg%, wie dies aus Fig. 3a hervorgeht.
Die gleichen Vorrichtungen können verwendet werden um sich verändernde Glukosekonzentrationen in unverdünntem frischen Ziegen-Vollblut zu ermitteln, wie dies in Fig. 3b zu erkennen ist. Es sollte beachtet werden, daß in beiden Figuren Fig. 3a und 3b, der PO&sub2;-Wert nicht abnimmt (oberer rechter Quadrant) während Glukose zugeführt wird. Somit zeigen die Stromreaktionen (unterer linker Quadrant) zeigen daß
TEXT FEHLT

Claims

1. Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyts durch Abtasten (Lesen) , eines Produkts oder Reaktants aus einer Enzym-Reaktion mit dem Analyt, mit einer gasdurchlässigen Membran, die gegenüberliegende Seiten hat, einem Enzym an einer Seite der Membran für die enzymatische Reaktion mit dem Analyt im Beisein von Sauerstoff, um das Produkt oder Reaktant bereitzustellen, Mitteln zum Zuführen von Sauerstoff durch die Membran für die enzymatische Reaktion und Mitteln zum Abtasten (Lesen) des Produkts oder Reaktants als eine Funktion des Analyts, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Zuführen von Sauerstoff durch eine Membran (7) einen geschlossenen Behälter (6) zum Fassen von Sauerstoff an der gegenüberliegenden Seite der Membran (6a) umfaßt.

2. Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyts durch Abtasten (Lesen) eines Produkts oder Reaktants aus einer Enzym- Reaktion mit dem Analyt, mit einer gasdurchlässigen Membran, die gegenüberliegende Seiten hat, einem Enzym an einer Seite der Membran für die enzymatische Reaktion mit dem Analyt im Beisein von Sauerstoff, um das Produkt oder Reaktant bereitzustellen, Mitteln zum Zuführen von Sauerstoff durch die Membran für die enzymatische Reaktion und Mitteln zum Abtasten (Lesen) des Produkts oder Reaktants als eine Funktion des Analyts, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel zum Zuführen von Sauerstoff (6a) einen geschlossenen Behälter (6) zum Fassen von Sauerstoff an der Enzymseite der Membran (6a) umfaßt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 2, worin die Membran (6a) Enzym-durchlässig ist und der Behälter (6) sowohl das Enzym (7) als auch eine Emulsion enthält,

4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Gefäß (6) eine Sauerstoff-Transportsubstanz enthält.

5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, worin die Sauerstoff-Transportsubstanz oder Emulsion entweder ein Perfluorcyclocarbonat, ein Perfluorcarbonat oder ein Derivat davon ist.

6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche weiterhin eine Analyt-durchlässige Membran (10) umfaßt, welche das Enzym überlagert, um dem Analyt zu gestatten, dort hindurchzutreten um daß Analyt für die enzymatische Reaktion zuzuführen.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, worin die Analyt-durchlässige Membran (10) Zellulose umfaßt.

8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die gasdurchlässige Membran, (6a) mindestens einen Teilbereich der Wandstruktur des geschlossenen Behälters (6) umfaßt.

9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Abtast- (Lese-)mittel angeordnet ist, um zur Bestimmung des Analyts Hydrogen-Peroxid oder Sauerstoff abzutasten (zu lesen).

10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Abtast- (lese-)mittel entweder ein elektrischer oder ein optischer Sensor ist.

11. Vorrichtung nach Anspruch 11, worin das Abtast- (Lese-)mittel ein optischer Sensor ist, mit einer optischen Substanz, welche zur optischen Reaktion mit dem Produkt oder Reaktant der enzymatischen Reaktion in Kontakt mit dem Enzym ist und mit einer optischen Faser zum Abtasten (Lesen) der optischen Reaktion mit, Funktionen zur Bestimmung des Analyts.

12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die optische Substanz entweder ein chromatischer Farbstoff oder ein fluoreszierender Farbstoff ist.

13. Vorrichtung nach Anspruch 10, worin das Abtast- (Lese-)mittel ein elektrischer Sensor mit einer Platinanode (8) ist, welche zum elektrolytischen Abtasten (Lesen) des Produkts oder Reaktants der enzymatischen Reaktion in Kontakt mit dem Enzym ist.

14. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Behälter (6) gasdurchlässig und flüssigkeitsdurchlässig ist.

15. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Behälter Mittel zum Erzeugen von Sauerstoff zur Zuführung von Sauerstoff für die enzymatische Reaktion enthält.

16. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die sauerstoffdurchlässige Membran oder Behälterwand aus organischem Silikonpoymer gebildet ist.

17. Verfahren zur Bestimmung eines Analyts durch Abtasten (Lesen) eines Produkts oder Reaktants aus einer Enzym- Reaktion mit dem Analyt mit den Schritten, daß eine gasdurchlässige Membran mit gegenüberliegenden Seiten vorgesehen wird, daß ein Enzym an einer Seite der Membran für die enzymatische Reaktion mit dem Analyt im Beisein von Sauerstoff vorgesehen ist und daß das Produkt oder Reaktant zur Bestimmung des Analyts abgetastet (gelesen) wird, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die Schritte umfaßt, einen geschlossenen Behälter vorzusehen, welcher an der gegenüberliegenden Seite der Membran Sauerstoff enthält, um durch die Membran Sauerstoff für die enzymatische Reaktion zuzuführen.

18. Verfahren nach Anspruch 17, welches weiterhin die Schritte umfaßt, eine Analyt-durchlässige Membran über dem Enzym vorzusehen, um dem Analyt zu gestatten, dort hindurchzutreten, um das Analyt der enzymatischen Reaktion zuzuführen.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, worin das Abtasten (Lesen) mit einem elektrischen oder optischen Sensor durchgeführt wird.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, welches weiterhin die Verwendung eines Gastransportmittels innerhalb des Behälters umfaßt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, welches innerhalb des Behälters weiterhin die Verwendung von Mitteln zur Erzeugung von Sauerstoff für die enzymatische Reaktion umfaßt.