DE3780206T2

DE3780206T2 - Verfahren zur photochemischen spaltung von nukleinsaeure mit hilfe von 2,7-diazapyrenium-dikationen, diazapyren-derivate.

Info

Publication number: DE3780206T2
Application number: DE8787400980T
Authority: DE
Inventors: John Blacker; Jaroslaw Jazwinski; Jean-Marie Lehn
Original assignee: CIS Bio International SA
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1986-04-29
Filing date: 1987-04-29
Publication date: 1993-02-11
Anticipated expiration: 2007-04-30
Also published as: FR2597871B1; DE3780206D1; JPH01500189A; US4925937A; EP0244320B1; EP0244320A1; FR2597871A1; WO1987006584A1; ATE78036T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur photochemischen Spaltung von Nucleinsäuren mit 2,7-Diazapyrenium- Dikationen DAP²&spplus; oder ihrer dimeren Species bis-DAP&sup4;&spplus;.
Sie hat daneben neue Diazapyren-Derivate zur Aufgabe. Dabei handelt es sich um Salze, die in Lösung DAP²&spplus; Dikationen oder bis-DAP&sup4;&spplus; Tetrakationen freisetzen.
Schließlich können 2,7-Diazapyrenium-Dikationen, die an Oligonucleotide gebunden sind, Reagenzien der spezifischen Photoexcision für die Nucleinsäuren darstellen.
In den letzten Jahren wurden umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um künstliche Reagenzien zur Spaltung von Nucleinsäuren und insbesondere von Desoxyribonucleinsäure oder Ribonucleinsäure, die im allgemeinen DNS und RNS genannt werden, aufzufinden.
Die Mehrzahl der Untersuchungen wurden mit Metallkomplexen durchgeführt, die die DNS über einen sauerstoffabhängigen Redoxprozess oder durch Photoaktivierung spalten. Für den Photoabbau von DNS wurden daneben Farbstoffe vom Acridintyp verwendet.
Unter den verwendeten Metallkomplexen können insbesondere die Verbindungen mit EDTA-Fe(II)-Gruppen und 1,10-Phenanthrolin-Kupferkomplexe genannt werden.
Beispielsweise beschreiben BOUTORIN et al. (FEBS LETTERS Vol. 172, No. 1, Juni 1984) Reagenzien, die EDTA-Fe(II)- Gruppen enthalten, die für die direkte Spaltung von einsträngigen Nucleinsäuren geeignet sind.
TULLIUS et al. verwendet in SCIENCE Vol. 230, 1985, S. 679 - 681 ebenfalls EDTA-Fe(II) zur Spaltung von DNS.
HERTZBERG et al. (J. Am. Chem. Soc. 1982 (104), S. 313-315) empfiehlt für eine Anzahl von Antibiotika mit Antitumorwirkung die Verwendung von Methidiumpropyl-EDTA-Fe(II) als Cofaktor für die Spaltung von DNS.
Die Verwendung des 1,10-Phenanthrolin-Kupferkomplexes für die Spaltung von DNS wird insbesondere von REICH et al. in J. Am. Chem. Soc. Vol. 103, Nr. 12 (1981) und R. FAGGIANI et al. in J. Am. Chem. Soc., Vol. 102, S. 5419-5421 (1980), beschrieben.
Andererseits ist bekannt, daß Farbstoffe auf Acridinbasis die DNS schädigen. Beispielsweise haben FREIFELDER et al. (Biophysical Journal Vol. 1 (1961)) gezeigt, daß DNS, die mit sichtbarem Licht in Gegenwart von Acridinorange bestrahlt wird, depolymerisiert und gespalten wird.
4,4'-Bipyridiniumionen und insbesondere Methylviologen wurden in verschiedenen Redox- oder Photoredoxprozessen verwendet (AMOUYAL et al., Israel Journal of Chemistry 22 (1982), S. 117-123). Diese können nur in Gegenwart eine Photosensibilisators oder unter UV-Bestrahlung durchgeführt werden.
Methylviologen, 1,1'-Dimethyl-4,4'-bipyridiniumchlorid, gewöhnlich als MV²&spplus; bezeichnet, kann unter diesen Bedingungen die DNS beschädigen.
US 3 652 149 betrifft eine Vorrichtung zur Ausfilterung von Licht, wobei eine Redoxverbindung gebildet wird, die durch Elektronenaddition zur Bildung eines stabilen und farbigen freien Radikals fähig ist. Die als Redoxverbindungen gemäß diesem US-Patent verwendeten Diazapyrenverbindungen besitzen die folgende Formel:
worin R&sub1; und R&sub2; ausgewählt werden unter Wasserstoff, einem Alkylrest, einem Aralkylrest und einem Arylrest und A&supmin; ein Anion ist.
Es wurde nun gefunden, daß für die photochemische Spaltung von Nucleinsäuren mit sichtbarem Licht Diazapyren-Derivate und insbesondere 2,7-Diazapyrenium-Dikationen verwendet werden können, ohne daß Photosensibilisatoren verwendet werden müssen.
So betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur photochemischen Spaltung von Nucleinsäuren, bei dem eine Nucleinsäure mit einer Lösung eines 2,7-Diazapyrenderivats wie unten definiert in Kontakt gebracht und das erhaltene Reaktionsgemisch einer Bestrahlung mit sichtbarem Licht unterzogen wird.
Die für die Erfindung geeigneten Diazapyren-Derivate besitzen die untenstehende Formel (I):
worin R' Wasserstoff oder eine C&sub1;-C&sub6;-Alkylgruppe und R Wasserstoff oder eine substituierte Alkylgruppe sind, die ausgewählt wird unter den folgenden Gruppen: -(CH&sub2;)n-SH, -(CH&sub2;)n-OH und -(CH&sub2;)n-NH&sub2;, worin n eine Zahl zwischen 1 und 10, und X&supmin; ein Anion, wobei die Bedingung gilt, daß R und R' nicht gleichzeitig Wasserstoff sind,
oder worin R und R' identisch sind und (a) die Gruppe der Formel -R&sub1;Y- darstellen, worin R&sub1; eine -(CH&sub2;)&sub3;Gruppe und Y&supmin; ein Sulfonation, SO , sind oder (b) die Gruppe der folgenden Formel:
und X&supmin; ein Anion ist.
Die Verbindungen der Formel I, worin R und R' identisch sind und Wasserstoff oder eine Methylgruppe darstellen, sind bekannte und von Hunig et al. (Angew. Chem. 1980, Nr. 19 (1968)) beschriebene Verbindungen.
Beim Verfahren der Erfindung können ebenso bis-Diazapyren- Derivate der allgemeinen Formel (II) verwendet werden:
worin R und R' gleich oder verschieden sind und je ein Wasserstoffatom oder eine C&sub1;-C&sub6;-Alkylgruppe darstellen, X&supmin; ein Anion ist und Z ausgewählt wird unter den zweiwertigen Resten der folgenden Formeln:
In den obenstehenden Formeln (I) und (II) besitzen die aliphatischen Kohlenwasserstoffreste vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatome. Lineare oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffstomen sind insbesondere bevorzugt.
Die Diazapyren-Derivate der Formeln (I) und (II) können ausgehend von 2,7-Diazapyren oder DAP nach einem der untenstehenden Verfahren erhalten werden. Zur Vereinfachung werden in der nun folgenden Beschreibung die Diazapyren-Derivate der Formel (I) mit "DAP²&spplus;-Derivate" und die der Formel (II) mit "bis-DAP&sup4;&spplus;-Derivate" bezeichnet. Synthese der DAP²&spplus;-Derivate Verfahren A
X&sub1; und X&sub2;, die gleich oder verschieden sein können, besitzen die gleiche Bedeutung wie X.
Dieses Verfahren umfaßt im wesentlichen zwei Stufen der N- Substitution des DAP durch die beiden Reste R und R', wobei die erhaltene Verbindung anschließend durch Ionenaustausch evtl. in die entsprechende Verbindung überführt werden kann, in der X&sub1; und X&sub2; identisch sind. Es wird angemerkt, daß, wenn R und R' identisch sind, die beiden Substitutionsstufen gleichzeitig durchgeführt werden. Diese Stufen werden in einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise Dimethylformamid (DMF), Chloroform oder Acetonitril durchgeführt. DMF ist geeignet, wenn gewünscht ist, die beiden Substitutionen gleichzeitig zu erhalten (beispielsweise bei R=R'=CH&sub3;), wobei die Reaktion bei Umgebungstemperatur durchgeführt wird, während die Verwendung von Chloroform für die erste Substitutionsstufe und von Acetonitril für die zweite (R ≠ R') geeignet ist, wobei vorteilhaft in der ersten Substitutionsstufe bei Umgebungstemperatur und für die zweite unter Rückfluß gearbeitet wird.
Das Verfahren ist insbesondere zum Erhalt von DAP²&spplus;-Derivaten geeignet, in denen R und R' ein aliphatischer Kohlenwasserstoffrest, wie oben definiert, sind, und insbesondere zum Erhalt von N,N'-Dimethyl-2,7-Diazapyreniumdichlorid, das im folgenden als MDAP²&spplus;(Cl&supmin;)&sub2; bezeichnet wird, wie im folgenden Schema dargelegt: Verfahren B Ionenaustausch mit Ts&supmin; = Anion, beispielsweise Tosylat
Es wird angemerkt, daß Ts&supmin; durch ein anderes Anion ersetzt sein kann.
Das Verfahren ist geeignet zum Erhalt von DAP²&spplus;-Derivaten, in denen der Rest R einen mit einer Hydroxygruppe substituierter aliphatischer Kohlenwasserstoffrest, insbesondere eine Hydroxyalkylgruppe, und R' eine Alkylgruppe, beispielsweise Methyl, darstellen. In diesem Verfahren wird zunächst ein 2-Dinitrophenyl-2,7-Diazapyreniumsalz, beispielsweise das Tosylat, als Synthesezwischenprodukt durch Reaktion des DAP mit einem 2,4-Dinitrophenylsalz, wie dem Tosylat, in einem geeigneten Lösungsmittel, beispielsweise einem Chloroform/Methanol-Gemisch, am Rückfluß gebildet, und anschließend dieses Zwischenprodukt mit einem mit einem Rest R substituierten Amin umgesetzt. Die zweite Stufe ist eine Stufe der N-Substitution mit einem Halogenid der Formel R'X wie in Verfahren A.

Verfahren C

Dieses Verfahren ist geeignet zum Erhalt von DAP²&spplus;-Derivaten, worin R' eine Alkylgruppe, beispielsweie Methyl, und R ein mit einer Aminogruppe substitutierter aliphatischer Kohlenwasserstoffrest ist. Dieses Verfahren ist dem obengenannten Verfahren B ähnlich mit dem einzigen Unterschied, daß als Amin ein Diamin verwendet wird, dessen eine Aminfunktion geschützt ist, wobei vor der zweiten Substitutionsstufe die Schutzgruppe entfernt wird. Das Verfahren kann wie folgt dargestellt werden: Entfernung da ungeschützt Schutzgruppe mit R&sub3; Alk - NH&sub2; (geschützt).
Das 2-Dinitrophenyl-2,7-Diazapyreniumtosylat ist eine neue Verbindung, die als Synthesezwischenprodukt nützlich ist; es stellt eine weitere Aufgabe der Erfindung dar.

Verfahren D

Dieses Verfahren ist geeignet zum Erhalt des DAP²&spplus;-Derivats, worin R und R' gleich sind und einen R&sub1;Y&supmin;-Rest darstellen, wie vorher definiert;
Bei diesem Verfahren werden in wasserfreiem Aceton teilweise aufgelöstes DAP und Propansulton bei der Rückflußtemperatur umgesetzt.

Verfahren E

Dieses Verfahren ist geeignet zum Erhalt des DAP²&spplus;-Derivats, worin R und R' gleich sind und die Gruppe der Formel darstellen: Collidin Collidiniumchlorid
Bei diesem Verfahren wird also das DAP mit Aziridin in Gegenwart von Collidin und Collidiniumchlorid umgesetzt.

Synthese von bis-DAP&sup4;&spplus;-Derivaten

Das Verfahren zum Erhalt der bis-DAP&sup4;&spplus;-Derivate besteht im wesentlichen darin, zwei Moleküle DAP mit einem Molekül eines Dihalogenids der Formel X&sub1;- -X&sub1; umzusetzen, worin X&sub1;, X&sub2; und das gleiche bedeuten wie oben, und anschließend die N-Substitution der verbleibenden Stickstoffatome in den DAP-Molekülen durchzuführen. Jede Stufe wird vorteilhaft in Acetonitril bei der Rückflußtemperatur durchgeführt.
Das Verfahren kann wie folgt dargestellt werden:
Die erfindungsgemäßen Diazapyren-Derivate sind fluoreszierende Verbindungen.
Das als Ausgangsprodukt in den obenstehenden Synthesen verwendete Diazapyren (DAP) kann ausgehend von 1,4,5,8-Naphtalintetracarbonsäureanhydrid der Formel (VI), das im Handel erhältlich ist, gemäß dem nachstehenden Reaktionsschema erhalten werden: Umgebungstemp. Rückfluß
Gemäß einer Abwandlung des Verfahrens nach Hünig et al., Angew. Chem. 180 (1968), Nr. 19, wird das 1,4,6,8-Naphtalintetracarbonsäureanhydrid der Formel IV durch Reaktion mit Methylamin bei Umgebungstemperatur zunächst in das entsprechende bis-(N-Methylimid) der Formel X überführt. Das Imid X wird anschließend mit einem LiAlH&sub4;/AlCl&sub3;-Gemisch in Tetrahydrofuran am Rückfluß behandelt, um die Verbindung der Formel XI herzustellen, die anschließend über ungefähr 4 Stunden in Gegenwart von Selen bei einer Temperatur zwischen 265 und 300ºC umgesetzt wird, um DAP zu erhalten.
Die für die Zwecke der Erfindung insbesondere geeigneten Verbindungen sind die folgenden:
1) die Verbindungen der Formel (1), worin R und R' eine Methylgruppe sind, oder MDAP²&spplus;-Derivat;
2) die Verbindungen der Formel (I), worin einer der Substituenten R oder R' eine niedere Alkylgruppe, beispielsweise eine Methylgruppe, und der andere eine mit einer Hydroxy-, Thio- oder Aminogruppe substituierte Alkylgruppe, insbesondere die Gruppen der Formeln -(CH&sub2;)n-OH, -(CH&sub2;)n-SH, -(CH&sub2;)n-NH&sub2;, sind, in denen n vorzugsweise zwischen 1 und 10 liegt;
3) die Verbindungen der Formel (II), worin einer der Formeln III bis V entspricht und R und R' eine niedere Alkylgruppe, beispielsweise eine Methylgruppe, sind.
Die Diazapyren-Derivate der Formeln (I) oder (II), die ein oder zwei 2,7-Diazapyrenium-Dikationen enthalten, besitzen eine planare Struktur. Aufgrund dieser planaren Struktur treten diese Verbindungen auf die gleiche Art wie die intercalierenden Medikamente, wie Actinomycin und Bleomycin, mit den Nucleotiden der DNS oder RNS in Wechselwirkung. Darüber hinaus können die erfindungsgemäßen Derivate bei Einwirkung von sichtbarem Licht DNS oder RNS in mehrere Stränge spalten.
Es muß angemerkt werden, daß die Derivate der Formel (II) oder bis-DAP&sup4;&spplus;-Derivate reaktiver sind als die Derivate der Formel (I) oder DAP²&spplus;-Derivate, da in ihrem Molekül zwei 2,7-Diazapyrenium-Kationen vorliegen. Sie weisen andererseits bei der photochemischen Spaltung eine größere Selektivität und Stabilität auf.
Andererseits können die Derivate der Formel (I), in denen einer der Substituenten R oder R' ein mit einer Hydroxy- oder Aminogruppe substituierter aliphatischer Kohlenwasserstoffrest ist, durch eine kovalente Bindung an ein Oligonucleotid oder ein Oligodesoxynucleotid gebunden werden, die eine Abfolge natürlicher Nucleotide enthalten, die eventuell modifiziert oder synthetisch sind.
Diese Kupplung kann mit dem Fachmann bekannten Verfahren durchgeführt werden. Beispielsweise können die in FR 83 01 223, das in der vorliegenden Erfindung angeführt wird, genannten Syntheseverfahren angewandt werden. Bei diesen Verfahren wird u.a. der Hydroxyrest des DAP²&spplus;-Derivats mit einem 3'-Phosphodiester- oder 5'-Phosphodiesteroligonucleotid, mit einem 3',5'-bis-(Phosphodiester)-oligonucleotid oder mit einem 2'-Phosphodiesteroligodesoxynucleotid gekuppelt werden, wobei die Oligonucleotide oder Oligodesoxynucleotide korrekt geschützt sind. So können Kupplungsprodukte Oligonucleotid- (oder Oligodesoxynucleotid)-DAP²&spplus; oder DAP²&spplus;-Oligonucleotid- (oder Oligodesoxynucleotid)-DAP²&spplus; erhalten werden, die sehr selektive Reagenzien zur Photoexcision darstellen können.
Die Oligonucleotid- oder Oligodesoxynucleotidkette des Kupplungsproduktes kann selektiv mit jeder Komplementärsequenz binden. Aufgrund der Tatsache, daß im Kupplungsprodukt mindestens ein 2,7-Diazapyrenium-Kation vorliegt, können DNS oder RNS sehr leicht selektiv an bestimmten Stellen gespalten werden, deren Position durch das Oligonucleotid festgelegt wird, das mit der komplementären Sequenz bindet.
Es wird festgestellt, daß das Oligonucleotid-DAP²&spplus;-Kupplungsprodukt zuletzt mit einem anderen Reagenz gekuppelt werden kann, das irgendein Entwicklungsmittel, beispielsweise ein Marker wie insbesondere ein Farbstoff auf Acridinbasis oder ein intercalierendes Mittel sein kann, wobei sich ein bifunktionelles Kupplungsprodukt ergibt, wobei die eine Funktion in der photochemischen Spaltung besteht und die andere Funktion durch das zweite Reagenz bestimmt wird.

Photochemische Spaltung von DNS

Das erfindungsgemäße Verfahren wird nun aus Gründen der Vereinfachung ohne Beschränkung auf diese Derivate unter Bezugnahme auf MDAP²&spplus; oder die dimere Species bis-MDAP&sup4;&spplus; beschrieben.
An DNS unter den nachstehenden Bedingungen durchgeführte Versuche haben gezeigt, daß das MDAP²&spplus;-Dikation oder die dimere Species bis-MDAP&sup4;&spplus; die DNS bei Bestrahlung mit sichtbarem Licht spalten.
Die Versuche wurden durch Bestrahlung einer wäßrigen Lösung, die zirkuläre doppelsträngige supercoiled DNS (2,6 10&supmin;&sup8; mol/l) und ein MDAP²&spplus; oder bis-MDAP&sup4;&spplus; Chlorid (2,6 10&supmin;&sup4; mol/l) in tris-Puffer bei pH 7,8 enthielt, über eine Stunde bei 3 ± 1ºC mit sichtbarem Licht (Schlitzprojektor mit 250 W mit einem geeigneten Filter, um nur Anteile sichtbaren Lichts mit λ > 395 nm hindurchzulassen, durchgeführt. Die Reaktion wurde in Gegenwart oder Abwesenheit von Luft (Sauerstoff) oder EDTA durchgeführt.
Die zirkuläre doppelsträngige supercoiled DNS, im folgenden DNSsc genannt, wurde unter Verwendung von mit dem Plasmid pBR 322 infizierten E. Coli-Bakterien nach bekannten Verfahren hergestellt und schließlich durch Elektroelution so gereinigt, daß sie praktisch frei von fragmentierter DNSsc war.
Das Plasmid pBR 322 ergibt über die Inkubation mit dem Restriktionsenzym Eco RI ein lineares Plasmid oder lineare doppelsträngige DNS, die als Marker der nach dem oben angegebenen Versuch zur photochemischen Spaltung durchgeführten Analyse durch Elektrophorese diente.
Zum Vergleich wurde der gleiche Versuch durchgeführt, wobei das erfindungsgemäße Derivat durch Methylviologen MV²&spplus; ersetzt war. Dabei wurde die gleiche Behandlung (Bestrahlung mit sichtbarem Licht unter den oben angegebenen Bedingungen) einer Lösung von DNSsc allein oder einer sauerstoffhaltigen Lösung von DNSsc oder einer sauerstoff- und EDTA-haltigen Lösung von DNSsc als Kontrollversuche durchgeführt.
Die erhaltenen Resultate sind in Fig. I im Anhang dargestellt, die eine Photographie der Gelelektrophorese der Lösungen der verschiedenen Versuche ist; diese werden im folgenden kommentiert. In der Figur werden die folgenden Benennungen verwendet:
I DNSsc, II fragmentierte DNSsc und III lineare DNS; die verwendeten Abkürzungen bedeuten:
M = Marker
C = Kontrolle
V = sichtbares Licht
O = Sauerstoff
A = EDTA
Die Messung der optischen Dichten jeder Bande ergab die folgenden Verhältnisse der Formeln I, II und III in % Nr. der Bande Formel I Formel II Formel III

A) Versuche mit MDAP²&spplus;

1) Wie die Banden 9 bis 13 in Fig. 1 zeigen, spaltet MDAP²&spplus; bei Bestrahlung mit sichtbarem Licht unter den verwendeten Bedingungen DNSsc wirksam, wobei sich durch Spaltung eines Einzelstranges hauptsächlich fragmentierte DNSsc ergibt, daneben aber auch durch Spaltung beider Stränge lineare DNS, wenn die Reaktion länger fortgesetzt wird.
Mit kleineren Konzentrationen an MDAP²&spplus; ergibt sich ein geringerer Anteil an Spaltung, wobei der Übergang in die Form der fragmentierten DNSsc (ADNsc coupé) bei einer Konzentration von 2 10&supmin;&sup5; mol/l nahezu vollständig und nur gering bei 2 10&supmin;&sup6; mol/l und unter den im folgenden angegebenen Bedingungen ist.
2) Es wurde festgestellt, daß in Abwesenheit von Licht keine nennenswerte Spaltung der DNSsc eintrat.
3) Die Entfernung von Sauerstoff durch Entgasen mit Einfrieren-Auftauen vermindert den Wirkungsgrad der photochemischen Spaltung etwas.
4) Die Zugabe von EDTA beeinflußt die Reaktion in Gegenwart von Sauerstoff nicht, scheint sie aber zu vermindern, wenn sie in Abwesenheit von Sauerstoff durchgeführt wird.
5) Es wurde festgestellt, daß die Wanderung von DNSsc durch das verwendete Reagenz zur photochemischen Spaltung etwas verlangsamt ist, was darauf schließen läßt, daß dieses in die DNSsc intercaliert.

B) Versuche mit bis-MDAP&sup4;&spplus;

1) Unter den gleichen Bedingungen scheint bis-MDAP&sup4;&spplus; wirksamer als MDAP²&spplus;, wobei sich durch multiple Spaltungen beider Stränge kleine DNS-Fragmente ergeben (Banden 14 bis 18).
2) Die Spaltungsreaktion ist so wirksam, daß der Ausschluß von Licht schwierig wird. Man kann nichtsdestoweniger beobachten, daß die Wanderung von DNSsc merklich verzögert ist, was darauf hinweist, daß eine starke und vielleicht multiple Wechselwirkung des bis-MDAP&sup4;&spplus; mit dem Plasmid pBR322 eintritt.
3) Wenn die Wirksamkeit der Reaktion feststeht, ist es nicht möglich, irgendeinen Einfluß von Sauerstoff oder EDTA festzustellen.
Die Wirkung von bis-MDAP&sup4;&spplus; nimmt bei kleineren Konzentrationen ab, wobei die Spaltung bei 10&supmin;&sup5; mol/l noch vollständig, bei einer kleineren Konzentration aber nur schwach ist.

C) Versuche mit MV²&spplus; (Banden 6 bis 8) und Kontrollversuche (Banden 2 bis 5)

Diese Versuche zeigen, daß unter den gleichen Bedingungen mit MV²&spplus; keine oder praktisch keine Spaltung stattfindet. Andererseits tritt in Abwesenheit des Reagenz zur photochemischen Spaltung keine Reaktion auf.
Unter der Voraussetzung, daß andere Versuche gezeigt haben, daß MDAP²&spplus; unter Bestrahlung mit sichtbarem Licht verschiedene Substrate photooxidiert, kann man, ohne sich auf irgendeine Theorie zu beschränken, annehmen, daß die Spaltungsreaktion über eine lokale Photooxidation am Ort der Wechselwirkung über den angeregten Zustand der MDAP²&spplus;- Species stattfindet. Der Elektronendonator kann Ribose sein, denn es wurde gefunden, daß Ribose selbst MDAP²&spplus; photoreduziert.
Die verzögernde Wirkung von EDTA in Abwesenheit von Sauerstoff weist darauf hin, daß die Oxidation des externen Donators eine Konkurrenzreaktion zur Oxidation des internen Donators ist.
Die durch die Entfernung von Sauerstoff hervorgerufene schwache, aber nicht vernachlässigbare Wirkung weist darauf hin, daß die Spaltungsreaktion auch mit dem Reaktionssystem wie mit den lichtempfindlichen reduzierten Metallkomplexen in Wechselwirkung treten kann. Das anfänglich durch Photoreduktion erzeugte DAP&spplus;-Kation könnte also mit dem Sauerstoff reagieren, wobei sich ein Peroxid ergeben würde, wie mit MV&spplus; selbst (Biochim. Biophys. Acta (1973) 314, 372).
Es wurden unter den gleichen Bedingungen wie oben angegeben mit Proflavin Versuche durchgeführt, das ein Farbstoff auf Acridinbasis ist, und es wurde gefunden, daß Proflavin ein Reagenz zur photochemischen Spaltung von DNS ist, das vergleichbar ist mit bis-MDAP&sup4;&spplus;, und daß dieses bei einer Konzentration von 2 10&supmin;&sup4; mol/l eine ausgedehnte Spaltung von DNS zu linearer DNS ergibt. Bei kleineren Konzentrationen von 2 10&supmin;&sup6; mol/l bis 2 10&supmin;&sup7; mol/l wird die Wirksamkeit vermindert.
Es wird angenommen, daß der Prozeß der photochemischen Spaltung mit Proflavin eine Photooxidation der DNS am Ort der Intercalation mit Erzeugung eines reduzierten Farbstoffes umfaßt. Von den Farbstoffen auf Acridinbasis ist tatsächlich bekannt, daß diese eine Photoreduktion mit Oxidation des Substrats erfahren.
Die erfindungsgemäßen Derivate wechselwirken als planare Moleküle auf die gleiche Art mit den Nucleotiden in DNS oder RNS wie intercalierende Medikamente, wie Actinomycin, Bleomycin etc. Es wurde andererseits festgestellt, daß die Fluoreszenz der Derivate verschwindet, wenn eine Bindung an DNS stattfindet. Daher ist es möglich, den Fortschritt der photochemischen Spaltungsreaktion über die Fluorescenz zu verfolgen.
Andere mit einsträngiger DNS oder DNSsc durchgeführte Versuche sind im folgenden angegeben.
Es wurden zweimal Lösungen von MDAP²&spplus; und bis-MDAP&sup4;&spplus; bei Konzentrationen von 4 10&supmin;&sup4; mol/l mit destilliertem Wasser hergestellt und mit Salzsäure auf pH 7,6 eingestellt.
Zirkuläre DNSsc und zirkuläre DNSss wurden ausgehend von den Plasmiden pBR322 bzw. M13mp19 hergestellt und mit herkömmlichen Elektroelutionsverfahren gereinigt.
In zum Erhalt von Konzentrationen an Diazapyren-Derivaten von 5 10&supmin;&sup6; mol/l und 10&supmin;&sup5; mol/l geeigneten Mengen wurden in Reagenzgläser eingegeben und sorgfältig gemischt:
- das Diazapyren-Derivat MDAP²&spplus; oder bis-MDAP&sup4;&spplus;,
- DNSss oder DNSsc,
- tris-PufferpH 7,6.
Jedes Reagenzglas wurde unter einem konstanten Sauerstoffdruck gehalten, wobei bekannte Mittel verwendet wurden, und über eine halbe Stunde mit sichtbarem Licht bestrahlt (250- Watt-Strahler; λ > 395 nm) wobei die Reagenzgläser bei 3ºC in einem Eiswasserbad gehalten wurden.
Nach der Bestrahlung wurden die Reagenzgläser im dunkeln gehalten und bei 3ºC gelagert. Proben aus jedem Reagenzglas wurden mit Glycerin gemischt und eine Elektrophorese auf Agarosegel durchgeführt (Sigma-Typ II EEO) (6 Stunden bei 120 V und 80 mA). Das Agarosegel wurde mit Ethidiumbromid gefärbt und photographiert. Fig. II im Anhang ist eine Photographie dieses Gels, auf der die Banden den verschiedenen durchgeführten Versuchen entsprechen, wobei die Konzentrationen waren wie unten angegeben. Nr. der Bande Diazapyren-Derivat Konzentration des Derivates
Banden 1 bis 20 entsprechen den Markern und die Banden 2 und 3 entsprechen in Abwesenheit des Diazapyren-Derivats bestrahlter DNSsc bzw. DNSss, wobei diese DNS durch Einwirkung des Enzyms Eco RI bzw. der Nuclease S&sub1; in bekannter Weise erhalten wurden.
Diese Photographie zeigt, daß die zirkulären DNSsc und DNSss in Gegenwart der erfindungsgemäßen Diazapyren-Derivate gespalten werden. Es wurde festgestellt, daß die beim erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Diazapyren-Derivate ihre Fähigkeit zur photochemischen Spaltung von DNS beibehalten, selbst wenn sie in Micellen oder Liposomen eingeschlossen sind. Daher kann man Micellen und Liposomen als Träger für Diazapyren-Derivate verwenden, um diese bis zur zu spaltenden DNS zu transportieren.
Die einen langkettigen Kohlenwasserstoffrest enthaltenden Diazapyren-Derivate sind für diesen Verwendungszweck insbesondere geeignet, da der Kohlenwasserstoffrest eine bessere Fixierung auf dem Liposom oder der Micelle erlaubt.
Die Erfindung wird im folgenden durch die unten angegebenen Beispiele im Detail beschrieben. BEISPIEL 1: Herstellung von N-Methyl-N'-benzyl-2,7-diazapyrenium-Dichlorid
1 g (0,0049 Mol) DAP wurden in 20 ml Chloroform aufgelöst. Anschließend wurde Methyljodid im Überschuß zugegeben (3 ml; 0,048 Mol). Das erhaltene Reaktionsgemisch wurde für 24 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt. Dabei fiel ein gelber Feststoff aus. Dieser gelbe Feststoff wurde durch Filtration vom Reaktionsgemisch abgetrennt, mit Chloroform gewaschen und im Vakuum getrocknet. Es wurden 1,61 g (0,0047 mol) des N-Methyl-2,7-diazapyreniodids (MDAP&spplus;J&supmin;) erhalten (Ausbeute: 96 %).
Dieses teilweise protonierte Rohprodukt wurde durch Behandlung mit einem schwach alkalischen Wasser (pH ungefähr 7,8; Wasser + Spuren an NH&sub4;OH) deprotoniert.
Das Rohprodukt wurde anschließend in kochendem Methanol umkristallisiert, wobei gelbe Kristalle erhalten wurden.
Das Produkt besaß die nachstehenden physikalisch-chemischen Eigenschaften:
Elementaranalyse: C&sub1;&sub5;H&sub1;&sub1;N&sub2;J x 0,25 H&sub2;O M = 350,7
Berechnet: C 51,37 ; H 3,31 ; N 7,99
Gefunden: C 51,31 ; H 3,19 ; N 8,05
¹H-NMR (D&sub2;O / CF&sub3;COOD ; TMPS als Standard)
10,05 ppm (s)
10,03 ppm (s)
δo = 8,89 ppm (AB-q J = 9,19 Hz)
5,00 ppm (s) Methyl.
Das oben erhaltene Produkt (1 g; 0,0029 Mol) wurde anschließend in 150 ml wasserfreiem Acetonitril in Suspension gebracht und Benzylbromid (3 ml; 0,025 Mol), das vorher über eine neutrale Al&sub2;O&sub3;-Säule filtriert wurde, zugegeben. Das sich dabei ergebende Reaktionsgemisch wurde am Rückfluß unter Rühren für 12 Stunden erwärmt.
Das erhaltene gelbe Produkt wurde filtriert, mit Chloroform gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 1,15 g (0,0022 Mol) entsprechend 77 %.

Das so erhaltene Rohprodukt wurde im dunkeln für 24 Stunden mit Wasser (100 ml) und Silberchlorid (erhalten ausgehend von 3 g AgNO&sub3; und NaCl, sorgfältig mit Wasser gewaschen) gerührt. Der gebildete Feststoff wurde filtriert, mit warmem Wasser gewaschen und das Filtrat im Vakuum aufkonzentriert und mit Aceton (90 ml) verdünnt, wobei ein gelber Niederschlag gebildet wurde. Das Gemisch wurde für eine Nacht stehengelassen, filtriert und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 0,81 g (0,00213 Mol) entsprechend 73 %.

Das erhaltene Produkt ist N-Methyl-N'-benzyl-2,7-diazapyreniumdichlorid, das die nachstehenden physikalisch-chemischen Eigenschaften besitzt:
Elementaranalyse: C&sub2;&sub2;H&sub1;&sub8;N&sub2;Cl&sub2; M = 381,3
Berechnet: C 69,29; H 4,72; N 7,35
Gefunden: C 69,07; H 4,89; N 7,38
¹H-NMR-Spektrum (Lösungsmittel: D&sub2;O; TMPS als Standard)
9,98 ppm (s)
9,88 ppm (s)
8,675 ppm (AB - q)
7,41 ppm (m - Benzyl)
6,24 ppm (s)
4,81 ppm (s, Methyl) BEISPIEL 2: Herstellung des Diazapyren-Derivats bis-MDAP&sup4;&spplus; (Formel II: R = R' = CH&sub3;
4,4-bis-(Brommethyl)-diphenylmethan (0,174 g) wurde in wasserfreiem Acetonitril (15 ml) am Rückfluß über 4 Stunden unter Rühren mit 2,7-Diazapyren (0,2 g) umgesetzt. Der gebildete gelbe Niederschlag wurde durch Filtration abgetrennt, mit Chloroform gewaschen und unter Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 0,34 g entsprechend 85 %

Das Rohprodukt wurde in warmem Wasser umkristallisiert und analysiert; es besaß die folgende Formel:
die die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften besaß:
Elementaranalyse: C&sub4;&sub3;H&sub3;&sub0;N&sub4;Br&sub2; x 3H&sub2;O M = 816,6
Berechnet: C 63,24 H 4,44 N 6,86
Gefunden: C 63,17 H 4,25 N 6,65
¹H-NMR-Spektrum (Lösungsmittel: D&sub2;O / CF&sub3;COOD; TMPS als Standard)
10,09 ppm (s)
10,00 ppm (s)
δo = 8,81 ppm (AB-q J = 9,37 Hz)
δo = 7,91 ppm (AB-q J = 7,61 Hz)
6,29 ppm (s)
3,98 ppm (s)
Das Produkt wurde in 50 ml Acetronitril und 0,5 ml Methyljodid in Suspension gebracht (0,3 g) und für 4 Stunden unter Rühren am Rückfluß erwärmt. Es wurde ein rotbrauner, in Acetonitril unlöslicher Feststoff erhalten. Dieser Feststoff wurde filtriert mit Chloroform gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 0,37 g entsprechend 90 %

Anschließend wurde ein Ionenaustausch durchgeführt, indem das so erhaltene Disalz (Jodid/Bromid) mit Silberchlorid in Wasser in Suspension gebracht und für 24 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt wurde. Der gebildete Feststoff wurde durch Filtration abgetrennt und mit warmem Wasser gewaschen. Das Rohprodukt (gelber Feststoff, gut wasserlöslich) wurde mehrmals in Methanol oder einem Methanol/Ether- Gemisch umkristallisiert.
Gemäß einer anderen Verfahrensweise kann man den Methylierungsschritt durchführen, indem das Produkt der oben angegebenen Formel mit Methylbromid bei 40 - 50ºC über drei Tage in geschlossenen Kolben gemischt wird. Dabei wird ein gelbes wasserlösliches Produkt erhalten.
Das im einen und im anderen Fall erhaltene Produkt wies die im folgenden angegebenen physikalisch-chemischen Eigenschaften auf:
Elementaranalyse: C&sub4;&sub5;H&sub3;&sub6;N&sub4;Cl&sub4; x 9H&sub2;O M = 937
Berechnet: C 57,70 H 5,81 N 5,98
Gefunden: C 57,80 H 5,04 N 5,86
¹H-NMR-Spektrum (Lösungsmittel: D&sub2;O; TMPS als Standard)
10,15 ppm (s)
10,09 ppm (s)
8,87 ppm (AB-q; J 9,47 Hz)
7,55 ppm (AB-q; J = 8,18 Hz)
6,39 ppm (s)
5,20 ppm (s) Methyl
4,13 ppm (s) BEISPIEL 3: Herstellung von bis-DAP&sup4;&spplus;-Derivaten oder -CH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-O-C&sub6;H&sub4;-CH&sub2;-
Es wurde nach der in Beispiel 2 beschriebenen Vorgehensweise verfahren, wobei das 4,4'-bis(Brommethyl)-diphenylmethan ersetzt wurde durch:
- 4,4'-bis(Brommethyl)-diphenyl-2,2'-propan
- 4,4'-bis(Brommethyl)-diphenylether
wobei erhalten wurden:
- die Verbindung der Formel:
mit dem folgenden NMR-Spektrum:
10,28 ppm (s); 10,21 ppm (s); 9,00 ppm (q-AB)
7,7 ppm (q-AB); 6,52 ppm (s); 5,14 ppm (s); 2,39 ppm (s) bzw.
- die Verbindung der Formel: &spplus;DAP&spplus;-CH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-O-C&sub6;H&sub4;-CH&sub2;-&spplus;DAP&spplus; mit dem folgenden NMR-Spektrum:
10,27 ppm (s); 10,18 ppm (s); 8,97 ppm (q-AB); 7,82 ppm (d) 7,34 ppm (d); 6,51 ppm (s); 5,10 ppm (s) BEISPIEL 4: Herstellung des 2,4-Dinitrophenyl-2,7-diazapyreniumtosylats (Synthesezwischenprodukt)
0,81 g (2,4 10&supmin;³ ol) des 2,4-Dinitrophenyltosylats (hergestellt durch Umsetzung von Tosylchlorid mit 2,4-Dinitrophenol) und 0,49 g (4 10&supmin;³ Mol ) 2,7-Diazapyren wurden in einem Gemisch (50/50 V/V) von Chloroform und Acetonitril erwärmt.
Der gebildete gelbe Niederschlag wurde abfiltriert und in Methanol gelöst. Der daraufhin neu gebildete Niederschlag wurde mit einem Überschuß an Ether gewaschen. Der erhaltene gelbe Niederschlag wurde anschließend im Vakuum getrocknet.

Ausbeute: 0,96 g entsprechend 73 %

Schmelzpunkt: 252 - 254ºC (Zersetzung)
Elementaranalyse:
Berechnet: C 59,78 H 3,34 N 10,33
Gefunden: C 59,82 H 3,10 N 10,41
¹H-NMR-Spektrum (Lösungsmittel D&sub2;O; TMPS als Standard)
10,285 ppm (s)
9,975 ppm (s)
9,4 ppm (s)
9,0 ppm (d,d J = 0,05 p)
8,90 ppm (d J = 0,05 P)
8,675 ppm (d J = 0,05 p)
8,5 ppm (d J = 0,05 p)
7,575 ppm (d J = 0,041 p)

BEISPIEL 5: Herstellung des Diazapyren-Derivats der Formel I

wobei R = H und R' = -(CH&sub2;)&sub2;-NH&sub2;.
Es wurde nach der Verfahrensweise C vorgegangen, wobei das Amin der Formel H&sub2;N-(CH&sub2;)&sub2;NH&sub2; verwendet wurde, dessen eine Aminfunktion mit der Carboxybenzoxygruppe C&sub6;H&sub4;-CH&sub2;-O-CO- geschützt war.
0,44 g DAP&spplus;-DNP Ts&supmin; wurden in 40 ml wasserfreiem Methanol gelöst und die erhaltene Lösung in eine Brom enthaltende Ampulle eingegeben.
Daneben wurde das Amin ausgehend vom entsprechenden Ammoniumsalz hergestellt und dieses (1,6 10&supmin;³ Mol) unter Rühren in 20 ml wasserfreiem Methanol gelöst. Anschließend wurden dem Reaktionsgemisch unter ständigem Rühren einige Tropfen Collidin beigegeben.
Dann wurde tropfenweise über eine Stunde die DAP&spplus;-DNP-Ts&supmin;- Lösung zugegeben. Die Farbe der Lösung wechselte von tiefem Rot zu Braun. Das Rühren wurde für eine weitere Stunde fortgeführt, worauf das Lösungsmittel in einer Büchner- Apparatur entfernt wurde. Anschließend wurden 300 ml wasserfreiem Ether zugegeben, worauf sich ein schwachbrauner Niederschlag bildete. Die Lösung wurde für 1 Stunde 30 Minuten gerührt und filtriert. Der erhaltene Feststoff wurde für eine Nacht in einem Exsiccator getrocknet.

Ausbeute: 0,41 g entsprechend 94 %

Die erhaltene Verbindung besitzt die folgenden physikalischchemischen Eigenschaften:
Elementaranalyse: M = 537
Berechnet: C 64,53 H 5,94 N 7,51
Gefunden: C 64,58 H 5,00 N 7,32
NMR-Spektrum (ppm) 9,87 (s); 8,53 (d); 8,77 (d); 9,92 (s) 5,19 (t); 3,98 (t); 6,6 (s); 4,8 (s) 7,1 (s); 7,2 (d); 7,7 (d); 2,07 (s)
Anschließend wurde die Schutzgruppe von der Aminfunktion entfernt, indem das erhaltene Produkt mit einem Gemisch aus Essigsäure und Bromwasserstoffsäure bei Umgebungstemperatur umgesetzt wurde.
Das erhaltene Produkt besaß die Formel &spplus;DAP&spplus;-(CH&sub2;)&sub2;-NH&sub3; x 3Br&supmin;.
Elementaranalyse:
Berechnet: C 39,19 H: 3,28 N: 8,57
Gefunden: C 34,11 H: 3,22 N: 7,43
Das NMR-Spektrum (D&sub2;O, TMPS) dieses Produkts wies Peaks bei 9,93 ppm, 8,80 ppm, 8,86 ppm, 10,09 ppm, 5,56 ppm und 4,00 ppm auf. Durch Einwirkung einer Base auf das erhaltene Produkt wird das erwartete Produkt erhalten.

BEISPIEL 6: Herstellung des N-Methyl-N'-hydroxypentyl-2,7- diazapyrenium-Dibromids

(Formel I: R = CH&sub3;; R = -(CH&sub2;)&sub5;-OH)
5-Amino-1-pentanol wurde in wasserfreiem Methanol aufgelöst und unter wasserfreien Bedingungen unter Argon in einen trockenen Behälter eines Fassungsvermögens von 100 ml eingegeben.
wurde in wasserfreiem Methanol aufgelöst und tropfenweise über eine Brom enthaltende Ampulle bei 20ºC unter Rühren zur 5-Amino-1-pentanol-Lösung zugegeben. Die erhaltene Lösung ist rot, anschließend tiefrot. Es wurde für zwei weitere Stunden gerührt und das Methanol unter Vakuum bis fast zur Trockne entfernt. Anschließend wurden dem Rückstand 250 ml Ether zugegeben, wobei sich ein brauner Niederschlag bildet. Dieser wurde durch Filtration abgetrennt, in Methanol aufgenommen und getrocknet.
Bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel mit Elution mit einem CHCl&sub3;/CH&sub3;OH-Gemisch (5 % - 95 %) wurde eine einzige Bande festgestellt.

Ausbeute: 72 % - Schmelzpunkt über 250ºC

NMR-Spektrum (D&sub2;O/TMPS.
δ = 9,65 (s)
δ = 9,3 (s)
δ = 8,23 (q)
δ = 7,49 (d) AB-System
δ = 7,18 (d)
δ = 5,11 (t)
δ = 3,67 (t)
δ = 2,32 (p)
δ = 1,60 (pp) BEISPTEL 7: Herstellung des Diazapyren-Derivats der Formel I
25 mg (1,22 10&supmin;&sup4; Mol) DAP wurden in 5 ml kaltem Collidin aufgelöst. Zu dieser Lösung wurde sofort nacheinander zugegeben:
48,2 mg (2,44 10&supmin;&sup4; Mol) Tosylaziridin und
38,4 mg (2,44 10&supmin;&sup4; Mol) Collidiniumchlorid
Das Reaktionsgemisch wurde über 2 Stunden von 20 auf 100ºC unter Rühren erwärmt. Die Lösung ging von tiefbraun zu tiefgelb über und wurde dekantiert und anschließend durch Erwärmen bei 50ºC zur Trockne eingedampft.
Das erhaltene Produkt ergab bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Elution mit Methanol/CH&sub2;Cl&sub2; 2%/98%) eine einzige Bande.

Ausbeute: 48 %

NMR-Spektrum des Produkts:

δ = 9,5 (s)
δ = 8,4 (s)
δ = 7,8
δ = 7,75
δ = 7,43
δ = 7,39 AB-System
δ = 3,5 (t)
δ = 3,2 (t)
δ = 2,4 (s)

BEISPIEL 8: Herstellung des Diazapyren-Derivats der Formel I

mit R = R' = R&sub1;Y&supmin; acétone reflux
25 mg DAP wurden teilweise in wasserfreiem Aceton (1 ml) aufgelöst und am Rückfluß erwärmt, das Propansulton (45 mg) zugegeben und das Gemisch über eine Nacht am Rückfluß gerührt.
Das erhaltene Produkt ergab bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel (Elutionsmittel: Methanol/CH&sub3;Cl&sub3; 10%/90%) eine einzelne Bande.
Das Aceton wurde unter vermindertem Druck entfernt.

NMR-Spektrum in CF&sub3; CO&sub2;&supmin; D&spplus;:

δ = 8,26 (s)
δ = 6,9 (s)
δ = 3,44 (t)
δ = 1,32 (t)
δ = 0,77 (t)

BEISPIEL 9: Herstellung des Diazapyren-Derivats der Formel II

wobei
Dieses Derivat wird gemäß dem vorher beschriebenen Verfahren C hergestellt. A - Herstellung der Verbindung
1,6 g des Bromids C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub7; Br in Lösung in 10 ml Ethanol wurden am Rückfluß mit 10 ml einer 33%igen Lösung des Amins (CH&sub3;)&sub2; NH in Ethanol umgesetzt, wobei 1,42 g des tertiären Amins C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub7; N(CH&sub3;)&sub2; erhalten wurden.
Dieses Amin wurde, nachdem das erhaltene Reaktionsgemisch zur Trockne eingedampft wurde, durch Extraktion mit CHCl&sub3; und mit basischem, LiOH enthaltendem Wasser gereinigt. Die CHCl&sub3;-Fraktion wurde filtriert und getrocknet.
1,4 g des so erhaltenen Amins wurden mit 4 ml des Dibromids BR - (CH&sub2;)&sub3; - Br und 10 ml Ethanol umgesetzt, wobei das Reaktionsgemisch für 20 Stunden am Rückfluß gehalten wurde. Die Lösungsmittel wurden anschließend entfernt und der Rückstand in 5 ml CHCl&sub3; gelöst. Die erhaltene Lösung wurde, bis ein Niederschlag entstand, in Ether gegossen. Der rosafarbene gebildete Niederschlag wurde filtriert und getrocknet. Es wurden 1,8 g des Produkts erhalten, das in 40 ml Ethylacetat umkristallisiert wurde. Es wurden 1,5 g Kristalle des erweiterten Bromids erhalten (Ausbeute 98 %), wobei das Produkt das folgende ¹H-NMR-Spektrum besaß:
δ (ppm): 0,875 (t); 1,25 (s)
1,45 (t); 2,39 (p); 3,00 (p);
3,39 (p); 3,45 (t); 3,58 (t);
3,80 (t).
499 mg des erhaltenen Bromids wurden unter Erwärmen bei 110ºC über 4,5 Stunden mit 83,4 ul Propylendiamin umgesetzt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand mit herkömmlichen Verfahren isoliert.
¹H-NMR-Spektrum des erhaltenen Amins:
δ (ppm) : 0,78 (t) ; 1,15 (s); 1,25 (m) ; 1,6 (t);
1,61 (t); 1,8 (m); 2,55 (t); 2,72 (t);
3,00 (s); 3,15 (t); 3,40 (m). B - Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung
Es wurde gemäß der Vorgehensweise C vorgegangen, indem 43,5 mg (8,05 10&supmin;&sup5; mol) DAP&spplus;-DNP Ts&supmin; in 15 ml Methanol gelöst und die erhaltene Lösung tropfenweise zu einer Lösung des Amins (39,5 mg; 8,05 10&supmin;&sup5; mol) in 6 ml Methanol zugegeben wurden. Die langsame Zugabe wurde über 1/2 Stunde durchgeführt und anschließend über 4,5 Stunden unter Stickstoff gerührt, wonach das Lösungsmittel entfernt wurde. Anschließend wurde Ether zugegeben, wobei sich ein Niederschlag bildete, der isoliert und mit herkömmlichen Verfahren gereinigt wurde.
Anschließend wurden 18,6 mg (2,2 10&supmin;&sup5; Mol) des so erhaltenen Produkts mit Methyliodid (3 ul; 2,2 10&supmin;&sup4; Mol) in DMF über 15 Stunden bei 70ºC umgesetzt. Das erhaltene Produkt wurde auf eine Ionenaustauschersäule (Cl&supmin;) aufgegeben und die Verbindung der untenstehenden Formel erhalten:
deren Molekülmasse 787 beträgt und die das folgende NMR- Spektrum besitzt: BEISPIEL 10: Herstellung des Diazapyren-Derivats der Formel II
Dieses Derivat wird ebenfalls nach Verfahren B, wie oben definiert, hergestellt, indem DAP&spplus;-DNP Ts&supmin;
mit dem Amin der Formel
umgesetzt wird.
A. Herstellung des Amins
1,5 g des Amins in 20 ml CH&sub3;CN werden bei 80ºC erwärmt, 1,1 ml Formaldehyd zugegeben und die Lösung gekühlt. Anschließend wurden 0,19 g in NaCNBH&sub3;, dann 1 ml Eisessig langsam über 10 Minuten zugegeben. Die Lösung wird dann über zwei Stunden gerührt und anschließend über 1/2 Stunde erneut 2 ml Eisessig zugegeben. Die erhaltene Lösung wird in Ether gegossen, dreimal mit 20 ml 1M NaOH und einmal mit 20 ml Salzlösung extrahiert. Die Etherphase wurde über K&sub2;CO&sub3; getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel entfernt. Es wurden 1,39 g des erwarteten Produktes erhalten.
Unter Rückfluß wurden über 14 Tage gerührt:
200 mg des tertiären Amins (erhalten unter a)) in 3 ml CH&sub2;Cl&sub2;, 1 ml des Dibromids Br-(CH&sub2;)&sub3;-Br und ein KJ-Kristall. Das Lösungsmittel wurde anschließend entfernt, worauf 274 mg des erwarteten Produktes erhalten wurden (Ausbeute 100 %).
Es wurde gemäß der in Beispiel 9 c beschriebenen Vorgehensweise verfahren, wobei das Produkt mit dem folgenden ¹H-NMR- Spektrum erhalten wurde:
δ (ppm): 0,83 (t); 1,20 (s); 1,67 (t); 1,92 (p); 2,69 (t); 2,85 (t); 3,21 (t); 3,31 (t) und 3,57 (t).

B. Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung

Die in Beispiel 9 B angegebene Verfahrensweise wurde wiederholt und nacheinander erhalten: 1) Die Verbindung der Formel:
mit dem folgenden ¹H-NMR-Spektrum:
δ (ppm): 0,94 (t); 1,33 (s); 1,59 (p); 2,29 (s); 2,78 (p); 3,11 (s); 3,20 (t); 5,35 (t); 7,14 (d); 7,61 (d) (AB System) 8,63 (d) und 8,76 (d) (AB System); 9,84 (s); 10,11 (s). 2) Die Verbindung der Formel:
mit dem folgenden ¹H-NMR-Spektrum (DMSO-d&sub6;):
δ (ppm): 4,32 (s); 4,67 (t); 6,5 (d) und 6,83 (d) (AB-System)
8,34 (q) und 9,73 (s) (AB System); 9,94 (s)

Claims

für alle Vertragsstaaten ausser ES

1. Diazapyren-Verbindung der Formel :

worin R' Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und R Wasserstoff oder eine substituierte, von den Gruppen der Formeln -(CH&sub2;)n-SH, -(CH&sub2;)n-OH und -(CH&sub2;)n-NH&sub2; gewählte Alkylgruppe ist, in denen n zwischen 1 und 10 liegt, X&supmin; ein Anion ist, unter der Bedingung, dass R und R' nicht gleichzeitig Wasserstoff sind.

2. N-Methyl-N'-Benzyl-2,7-Diazapyreniumdichlorid.

3. Diazapyren-Verbindung der Formel :

worin die beiden Gruppen R und R' identisch sind und (a) die Gruppe der Formel -R&sub1;Y- darstellen, worin R&sub1; -(CH&sub2;)&sub3;- und Y&supmin; das Sulfonat-Ion SO , ist oder (b) die Gruppe der Formel :

X&supmin; ein Anion ist.

4. Diazapyren-Verbindung der Formel :

worin R und R' identisch oder verschieden sind, und jeweils Wasserstoff oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellen; X&supmin; ist ein Anion und Z wird von den zweiwertigen Radikalen der Formeln :

gewählt.

5. Diazapyren-Verbindung der Formel :

worin R und R' Methylgruppen sind, X&supmin; das Chlorion ist und Z -CH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-CH&sub2;-C&sub6;H&sub4;-CH&sub2;- ist.

6. Verfahren zur photochemischen Spaltung von Nukleinsäuren, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, in der Gegenwart oder Abwesenheit von Luft (Sauerstoff) oder von EDTA, eine wässerige Lösung einer Nukleinsäure mit einer Lösung eines Diazapyren-Derivats, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 definiert, reagieren zu lassen und die erhaltene Reaktionsmischung einer Bestrahlung bei sichtbarem Licht auszusetzen.

7. Verfahren zur Herstellung einer Diazapyren-Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es im wesentlichen aus zwei Verfahrensschritten für die N-Substitution des 2,7-Diazapyrenium oder DAP nach den folgenden Reaktionsschemen :

besteht, worin X&sub1; und X&sub2;, identisch oder verschieden, dieselbe Bedeutung haben wie X; und dass es eventuell darin besteht, die erhaltene Verbindung durch Ionenaustauch in die entsprechende Verbindung, in der X&sub1; und X&sub2; identisch sind, umzusetzen.

8. Verfahren zur Herstellung einer Diazapyren-Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, in welcher R eine durch eine Hydroxygruppe substituierte Alkylgruppe ist und R' eine Alkylgruppe, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, zunächst in einer geeigneten Lösung durch Reaktion des 2,7-Diazapyrenium mit einem 2,4-Dinitrophenyl-Salz, wie Tosylat, ein 2-Dinitrophenyl-2,7-Diazapyrenium-Salz herzustellen, dann das genannte Zwischenprodukt mit einem durch ein R-Radikal substituierten Amin reagieren zu lassen und dann eine N-Substitution mit einem Halogenid der Formel R'X nach Anspruch 7 durchzuführen.

9. Verfahren zur Herstellung einer Diazapyren-Verbindung der Formel I nach Anspruch 1, in welcher R eine durch eine Aminogruppe substituierte Alkylgruppe ist und R' eine Alkylgruppe, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, zunächst in einer geeigneten Lösung durch Reaktion des 2,7-Diazapyrenium mit einem 2,4-Dinitrophenyl-Salz, wie Tosylat, ein 2-Dinitrophenyl-2,7-Diazapyrenium-Salz herzustellen, dann das genannte Zwischenprodukt mit einem Diamin, von dem die eine Aminofunktion geschützt ist, die dann vor dem N-Substitutionsschritt mit einem Halogenid der Formel R'X nach Anspruch 7 entschützt wird.

10. Verfahren zur Herstellung einer Diazapyren-Verbindung der Formel I nach Anspruch 3, in der R und R' identisch sind und ein Radikal R&sub1;Y&supmin; darstellt, wie in Anspruch 1 definiert, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, in wasserfreiem Aceton teilweise gelöstes 2,7-Diazapyrenium (DAP) und Propansulton bei der Rückflusstemperatur zusammen reagieren zu lassen.

11. Verfahren zur Herstellung eines Diazapyren-Derivates der Formel I nach Anspruch 3, in der R und R' identisch sind und die Gruppe der Formel :

darstellen, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, 2,7-Diazapyrenium in Gegenwart von Kollidin und Kollidiniumchlorid mit Azidin reagieren zu lassen.

12. Verfahren zur Herstellung eines Diazapyren-Derivates nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass es darin besteht, zwei 2,7-Diazapyrenium (DAP) Moleküle mit einem Dihalogenid Molekül der Formel X&sub1;-Z-X&sub2; reagieren zu lassen, in der Z wie in Anspruch 4 definiert ist, X&sub1; und X&sub2;, identisch oder verschieden, dieselbe Bedeutung haben wie X, und dann die N-Substitution der in den DAP Molekülen verbleibenden Stickstoffe nach dem folgenden Reaktionsschema vorzunehmen :