JPH01500189A

JPH01500189A - ２，７‐ジアザピレニウムジカチオンによる核酸の光切断法および新規ジアザピレン誘導体

Info

Publication number: JPH01500189A
Application number: JP62502670A
Authority: JP
Inventors: レーン　ジャン　マリー; ジャズヴィンスキー　ジャロースロー; ブラッカー　ジョン
Original assignee: コムパニー　オーリス　アンデュストリエ
Priority date: 1986-04-29
Filing date: 1987-04-29
Publication date: 1989-01-26
Also published as: WO1987006584A1; FR2597871B1; US4925937A; EP0244320A1; DE3780206T2; DE3780206D1; ATE78036T1; EP0244320B1; FR2597871A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】２．７−ジアザピレニウムジカチオンによる核酸の光切断法および新規ジアザピレン誘導体本発明は２．７−ジアザピレニウムジカチオン、ＤＡＰ”、またはその二量体種、ビス−ＤＡＰ”、による核酸の光切断法に関する。

本発明はまた新規ジアザピレン誘導体に関し、これらは溶液中でシカチオン、ＤＡＰ２＋、またはテトラカチオン、ビス−ＤΔＰ　４＋、を遊離する塩である。

最後に、オリゴヌクレオチドに結合した２、７−ジアザピレニウムジカチオンは核酸に対し特異性の光切断試薬を形成することができる。

近年、核酸、より特定的には通常ＤＮＡおよびＲＮＡと称されるデオキシリボ核酸およびリボ核酸、を切断できる合成試薬を発見するために多くの研究が行なわれた。

多くの研究は、酸素依存性レドックスプロセスにより、または光活性化によりＤＮＡを切断する金属錯体で行なわれた。アクリジン型の色素がＤＮＡの光損傷に使用された。

使用された金属錯体の中から、殊にＥＤＴＡ−Ｆｅ　（ｉｆ）基および１．１０ −フェナントロリン−銅錯体を挙げることができる。

例えば、Ｆ、　Ｅ、　Ｂ、Ｓ、レターズ（１’Ｅ口Ｓ　ＬＣＴＴＥＲＳ）　。

１７２巻、１号、１９８４−６にブートリフ　（ＢＯＩＩＴＯＲＩＮ）　ホカは一本釦核酸の直接切断に適するＥＤＴＡ−Ｆｅ　（ＩＩ）基をもつ試薬を記載している。

同様に、サイエンス（ＳＣＩＥＮＣＥ）、　２３０巻、１９８５．６７９〜６８１号中にトウリウス（ＴＵＬＬＩＵＳ）ほかはＤＮＡの切断にＥＤＴＡ−Ｆ　（ＩＩ）を使用している。

ヘルツベルブ（ＨＥＲＴＺＢＥＲＧ）はか〔ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ−（Ｊ、Ａｍ　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）＋１９８２．１０４．３１３〜３１５頁〕は多くの抗腫瘍抗生物質に対するＤＮＡの切断における補助因子として（メチジウムブロピルーＥＤＴＡ）−Ｆｅ　（ＩＩ）の使用を推奨している。

ＤＮＡの切断に対する１、１０−フリナンドロリン−銅錯体の使用は殊にライヒ（ＲＥＩＣＨ）ほかによりジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ−（Ｊ、Ａｍ　Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、）。

１０３巻、１２号、１９８１中に、およびファジアニ（ＦＡＧＧ［ＡＮＩ）ほか、ジャーナル・オプ・ジ・アメリカン・ケミカル・ソサイエティ−（Ｊ、Ａｉ＋、Ｃｈｅ＋ｓ、Ｓｏｃ、）、１０２巻、５４１９〜５４２１頁、１９８０中に記載されている。

さらに、アクリジン型の色素がＤＮＡを損傷することが知られている。例えば、フライフエルダー（ＦＲＥＩＦＥＬＤＥＲ）はが〔バイオフィジカル・ジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ）＋　１巻。

１９６１３はアクリジンオレンジの存在下に可視光で照射したＤＮＡが解重合し、切断されることを示した。

さらに、４．４′−ビピリジニウムイオン、殊にメチルビオローゲンが種々のレドックスおよび光レドックスプロセスに使用されたことが認められよう〔アモウヤル（八ＭＯＵＹＡＬ）ほか、イスラエル・ジャーナル・オブ・ケミストリー（Ｉｓｒａｅｌ　Ｊｏｕｒｎａｌｏｆ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、２２．　１９８２．　１１７〜１２３頁〕、これらのプロセスは光増感剤の存在下、または紫外線照射下にのみ起ることができる。

メチルビオローゲン、すなわち１，１′−ジメチル−４，４′−ビピリジニウムクロリド、通常ＭＶ”と称される、はこれらの条件下にＤＮＡを損傷することができる。

今回、ジアザピレン誘導体、殊に２，７−ジアザビレニウムカチオン、が可視光中で、光増感剤を必要としないで核酸の光切断に使用できることが認められた。

従って、本発明は核酸の光切断プロセスに関し、そのプロセ触させ、生じた反応混合物を可視光で照射することからなる。

本発明の目的に適するジアザピレン誘導体は次の式（１）に相当する：ＲおよびＲ′は同一であるかまたは異なり、水素、あるいは１個またはそれ以上のへテロ原子例えば酸素、硫黄または窒素により適宜中断されることができる直線形または枝分れ、飽和または不飽和脂肪族炭化水素基であって、また炭化水素基に対し適宜ヒドロキシル、アミノまたはチオ基により、アリール基によりあるいは複素環基により置換されることができる脂肪族炭化水素基を表わすか、あるいはＲおよびＲ′が同一であり、式Ｒ，Ｙ−（式中、Ｒ１は基（ＣＨｔ　）　３−であり、Ｙ−はスルホナトイオ７ＳＯ，−である）の基、または式％式％Ｘ−はアニオンであるかまたは、置換基ＲおよびＲ′の少くとも１つが式、Ｒ，Ｙ−のちのであれば存在せず、その場合に誘導体は分子内塩である〕この説明において、「適宜１個またはそれ以上のへテロ原子により中断されることができる脂肪族炭化水素基」という語はまた相当するオニウムカチオンを含む脂肪族炭化水素基、殊に１個またはそれ以上の第四級窒素原子を含む脂肪族炭化水素基、（式中、Ａｌｃ、およびＡｌｃｚは、例えば１〜ＩＯ個の炭素原子を含む同一かまたは異なるアルキレン基であり；Ｒ′、およびＲ１２は同一であるかまたは異なり、水素または１〜６個の炭素原子を含む低級アルキル基であり；　Ｒ’　３　、Ｒ’　ａおよびＲ１，は同一であるかまたは異なり、水素あるいは飽和または不飽和脂肪族炭化水素基、好ましくは１〜２５個の炭素原子を含むアルキル基である）の基を示す。

ＲおよびＲ′が同一であり、水素またはメチル基を表わす式■の化合物はヒュニグ（Ｈｕｎｉｇ）はか〔アンゲバンテ・ヘミ−（Ａｎｇｅｗ、　Ｃｈｅｍ、）、１９８０．ｍ１９　（１９６８）　）により記載された公知化合物である。

本発明の方法において、一般式（Ｉ［）Ｒ，Ｒ’およびＸは前記のとおりであり、■は１個またはそれ以上のへテロ原子により適宜中断されることができ、および（または）１個またはそれ以上の二価芳香族または複素環基により適宜中断されることができる飽和または不飽和、直線形または枝分れ炭化水素鎖を表わす二価基である〕に相当するビスジアザピレン誘導体の使用もまた可能である。

基■を形成する炭化水素鎖は２個またはそれ以上の炭素原子を含み、酸素、硫黄および窒素原子から選ばれる１個またはそれ以上のへテロ原子により中断されることができる。

二価基■の好ましい例は弐■〜■：の基である。

式（１）および（Ｉ［）において、脂肪族炭化水素基は好ましくは１〜１０個の炭素原子を有する。１〜６個の炭素原子を有する直線形または枝分れアルキル基が殊に好ましい。

本発明による方法において、一般式（ＩＩＩ）（式中、ｐは１〜１５の整数であり、好ましくは８に等しい）に相当するジアゾピレン（ｓｉｃ）大環状化合物の使用もまた可能である。

式（ｓｉｃ）　（１）および（１１）のジアザピレン誘導体は、すべて２．７− ジアザピレン、またはＤＡＰ、から次のプロセスの１つにより得ることができる０便宜上、式（１）のジアザピレン誘導体および式（Ｉ［）の誘導体は以下の記載にそれぞれｒＤＡＰ”誘導体」および「ビス−ＤＡＰ”″誘導体」という語により示される。

ＤＡＰ　＋　ＲＸ、　ロＡＰ”　＋　ＲＸ、−ＤＡＰ”　−ＲＸ、−＋Ｒ’　Ｘ２　＋　Ｒ−”ＤＡＰ”　−Ｒ’　Ｘ、−Ｘ２−（Ｘ、およびＸ２は同一かまたは異なり、Ｘと同じ意味を有する）このプロセスはそれぞれ基ＲおよびＲ′によるＤＡＰのＮｗ換を含む実質的に２つの段階を含み、次いで得られた化合物をイオン交換により、ｘｌおよびＸ２が同一である相当する化合物に適宜転化することができる。ＲおよびＲ′が同一であれば、２＠換段階が同時に行なわれることが認められよう。これらの段階は適当な溶媒、例えばジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、クロロホルムまたはアセトニトリル中で行なわれる。２置換を同時に行なうことが望まれれば（例えばＲ＝Ｒ’　＝ＣＨ５）、ＤＭＦが適当であり、反応は室温で行なわれ；そうでなければ第１置換段階にクロロホルトを、第２段階（Ｒ６Ｒ’）にはアセトニトリルが使用され、その場合に第１置換段階は有利には室温で、第２段階は還流下に行なわれる。

このプロセスは殊にＲおよびＲ′が前記型の脂肪族炭化水素基であるＤＡＰ”誘導体の製造、殊にＮ、　Ｎ’−ジメチル−２，７−ジアザビレニウムジクロリド、以下ＭＤＡＰ″’（ＣＩ　−）ｚと称する、の製造に適し、それは次の図式：％式％（）により示される。

プロセスＢＲ′−″ＤＡＰ　”　−Ｒ，２ＣＩ− （式中、Ｔ　ｓ−−アニオン、例えばトシラート：である）Ｔｓ−を他のアニオンにより置換できることが認められよう。

このプロセスは、Ｒがヒドロキシル基により置換された脂肪族炭化水素基、殊にヒドロキシアルキル基であり、Ｒ′がアルキル基例えばメチルであるＤＡＰ”誘導体の製造に適する。このプロセスは初めにＤＡＰと２．４−ジニトロフェニル塩例えばトシラートとを適当な溶媒例えばクロロホルム／メタノール混合物中で還流下に反応させることにより２−ジニトロフェニル−２，７−ジアザビレニウム（ｓｉｃ）塩例えばトシラートを合成中間体として製造し、次いでこの中間体と、基Ｒにより置換されたアミンとを反応させることからなり、第２段階にはプロセスＡのように式Ｒ’ＸのハライドによるＮ置換が含まれる。

プロセスにのプロセスはＲ′がアルキル基、例えばメチル、であり、Ｒがアミノ基により置換された脂肪族炭化水素基であるＤＡＰ”°誘導体の製造に適する。このプロセスは前記プロセスＢに類似し、唯一の差異は、用いたアミンが、アミノ基の１つが保護されたジアミノであることであり、前記基は次に第２置換段階の前に保護基を除去される。このプロセスは次の図式により表わすことができる。

ＤＡＰ”　−Ａｌｋ−ＮＨｚ　・Ｔｓ−＋Ｒ’　Ｘ　＝　Ｒ’　−”ＤＡＰ”　 −Ａ６に−ＮＨｚ　・Ｔｓ−Ｘ−〔式中、Ｒｓ　−Ａｊ！ｋ　ＮＨｚ　（保護された）である〕〕２−ジニトロフエチルー２．７−ジアザビレニウム　ｓｉｃ　）トシラートは合成中間体として有用である新規化合物であり、本発明の他の主題を構成する。

プロセスＤこのプロセスは、ＲおよびＲ′が同一であり、前記型の基ＲＩＹ−を表わすＤＡＰ”誘導体の製造に適する：このプロセスはＤＡＰの無水アセトン中の部分溶液とプロパンスルトンとの還流温度における反応からなる。

このプロセスは、ＲおよびＲ′が同一であって式：の基により表わされるＤＡＰ ”誘導体の製造に適する。

Ｔｓ従ってこのプロセスはＤＡＰとアジリジンとのコリジンおよびコリジニウムクロリドの存在下の反応からなる。

ビス−ＤＡＰ”銖　のムこれらのビス＝ＤＡＰ’″″誘導体の製法は実質的にＤＡＰ２分子と式Ｘ、−■ −Ｘ＋（式中、ＸｒＸｚおよび■は前記のとおりである）のシバライド１分子とを反応させ、次いでＤＡＰ分子中の残留窒素のＮｉｌ換を行なうことからなる。

各段階は有利にはアセトニトリル中で還流温度で行なわれる。

このプロセスは次の図式により表わすことができる：Ｒ’　−”ＤＡＰ”−〇− ＤＡＰ”　−Ｒ２Ｘ、−２Ｘ、−ビス−ＤＡＰ”大環状化合物の合成式■の大環状化合物（また「ビス−ＤＡＰ”大環状化合物」と称される）の製法は式■のナフタレン−１，４，５，８−テトラカルボン酸無水物と弐ＮＨ２−（ＣＨ２）、−ＮＨ２のジアミンとのジメチルホルムアミド中、酢酸の存在下の反応からなる。この反応により形成された大環状化合物を次いで水素化アルミニウムリチウムおよび塩化アルミニウムの存在下に還元して式■の化合物を形成させ、それを次いで式■の化合物に転化させる。このプロセスの第１段階はレフィル・ジャーナル・オブ・ザ・ローヤル・ネザランズ・ケミカル・ソサイエティ（Ｒｅｃｕｅｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｒ　ｔｈｅ　Ｒｏｙａｌ　Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉ−ｅｔｙ）、９５／４．　１９７６−４．　８９頁中にベルヘーベン（Ｊ、　Ｈ，Ｖｅｒｈｏｅｖｅｎ）により記載されたプロセスの改変形である。

このプロセスの第２および第３段階はヒュニグ（ＩＩＩＩＮＩＧ）ほか、アナーレン・デル・ヘミ−（八ｎｎ、ＣＩ＋ｅｍ、）、１９７３．　３３９により記載されたプロセスの適応である。

このプロセスの反応図式は次のとおりである：■ ■　■ 本発明によるジアザピレン誘導体は螢光性化合物である。

上記合成に出発物質として用いたジアザピレン（ＤＡＰ）は市販の式■のナフタレン−１，４，５，８−テトラカルボン酸無水物から次の反応図式に従って得ることができる：ＣＨ。

會ＶＩ　ＣＨ，ＸＩヒュニグ（Ｈｕｎｉｇ）はか；アンゲバンテ・ヘミ−（Ａｎｇｅｉｉ、Ｃｈｅ＋ｗ、）　＋１８０　（１９６８）、Ｎａ１９のプロセスの適応において、式■のナフタレン１，４．６．８−カルボン酸（ｓｉｃ）無水物を初めにメチルアミンとの室温における反応により式Ｘの相当するビス（Ｎ−メチルイミド）に転化する。イミドＸは次いでテトラヒドロフラン中で還流下にＬｉＡ　Ｉ　Ｈａ／　Ａ　Ｉ　Ｃｌ　ｓ混合物で処理して弐ＸＩの化合物を形成し、次いでそれをセレンの存在下に２６５〜３００℃の温度で約４時間反応させるとＤＡＰが得られる。

本発明の目的に殊に適切である化合物は、１）ＲおよびＲ′がメチル基である式（Ｉ）の化合物、またはＭＤＡＰ”誘導体（ｓｉｃ）；２）置換基ＲまたはＲ′の１つが低級アルキル、例えばメチルであり、他のヒドロキシルまたはチオ基あるいはアミノ基により置換されたアルキル基、すなわち式−（ＣＨｚ）ゎ−ＯＨ。

−（ＣＨｇ　）、−３Ｈまたは−（ＣＨｚ）−ＮＨｇ（式中、ｎは好ましくは１〜１０である）の基、である式（１）の化合物、および３）■が式■〜Ｖの１つに相当し、ＲおよびＲ′が低級アルキル基例えばメチルである式（ＩＩ）の化合物、である。

１〜２個の２．７−ジアザピレニウムジカチオンを含む式（１）または（ＩＩ）のジアザピレン誘導体は平面構造を有する。

この平面構造によってこれらの化合物は挿入薬例えばアクチノマイシンおよびプレオマイシンと同様にＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチドと相互作用する。さらに、可視光のイリジェーション（ｉｒｒｉｄｉａｔｉｏｎ）　（ｓｉｃ）の作用下に本発明による誘導体はＤＮＡまたはＲＮＡを数鎖に切断することができる。

式（ｎ）の誘導体またはビス−ＤＡＰ”誘導体は、２個の２．７−ジアザビレニウムカチオンがそれらの分子中に存在するので、式（りの誘導体またはＤＡＰ” 誘導体より一層反応性であることを記載すべきである。それらはまた光切断中に一層大きい選択性および大きい安定性を有する。

さらに、置換基ＲまたはＲ′の１つがヒドロキシルまたはアミノ基により置換された脂肪族炭化水素基である式（Ｉ）の誘導体は、修飾または合成することができる天然ヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴデオキシヌクレオチドに共有結合によりカンプリングすることができる。

この結合は当業者に知られたプロセスにより行なうことができる０例えば、フランス特許第８３　０１　２２３号により記載された合成プロセスを用いることができ、その特許は参照として本出願に引用される。これらのプロセスはとりわけＤＡＰ”誘導体のヒドロキシルとオリゴヌクレオチド３′−ホスホジエステルまたは５′−ホスホジエステルとの、オリゴヌクレオチド３’、５’−ビス（ホスホジエステル）との、またはオリゴデオキシヌクレオチド２′−ホスホジエステルとのカップリングからなり、オリゴヌクレオチドまたはオリゴデオキシヌクレオチドは正しく保護される。従って、オリゴヌクレオチド（またはオリゴデオキシヌクレオチド）／ＤＡＰ”またはＤ　Ａ　Ｐ　”／オリゴヌクレオチド（またはオリゴデオキシヌクレオチド）／ＤＡＰ”カンプリング生成物を得ることができ、それらが非常に選択的な光切断試薬を構成することができる。

カップリング生成物のオリゴヌクレオチドまたはオリゴデオキシヌクレオチド鎖は相補的配列に選択的に結合することができる。このカップリング生成物中の少（とも１つの２．７−ジアザピレニウムジカチオンの存在によりＤＮＡまたはＲＮＡは容易に特定部位で選択的に切断されることができ、その部位は相補的配列に結合するオリゴヌクレオチドにより決定、される。

オリゴヌクレオチド／ＤＡＰ”カップリング生成物は次に他の試薬とカンプリングさせることができ、それは任意の種類の指示試薬例えば標識例えば、殊にアクリジン型色素または挿入試薬であることができ、また官能の１つが光切断であり他の官能が第２試薬により与えられる２官能カンプリング生成物を生ずることができる。

１下）Ｊυ艷１凱本発明のプロセスは次に、便宜上、またそれによりこれらの誘導体のみに制限することなく、単にＭＤＡＰ”°またはその二量体種ビス−ＭＤＡＰ”について記載される。

下記条件下にＤＮＡで行なった試験はシカチオンＭＤＡＰ”またはその二量体種ビス−ＭＤＡＰ”が可視光による照射下にＤＮＡを切断することを示した。

試験は二本鎖超コイルＤＮＡ（２，６・１０−”Ｍ）およびＭＤＡＰ”またはビス−ＭＤＡＰ”の塩化物（２，６・１０−’Ｍ）を含むトリス緩衝液中のｐＨ７，８および３±１℃における水溶液を可視光（λ＞３９５ｎｍの可視光のみを通過させる適当なフィルターを備えた２５０Ｗスリットプロジェクタ−）により１時間照射することにより行なった０反応は空気（ｉ２素）またはＥＤＴＡの存在下または存在なく行なった。

二本鎖超コイル環状ＤＮＡ　（以下５ｃＤＮＡと称する）はプラスミドｐＢＲ３２２で感染した大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｉ）を用いて公知操作により製造し、次いで事実上カント５ｃＤＮＡのないように電気溶離により精製した。

制限酵素ＥＣＯＲＩとともにインキュベートするとプラスミドｐＢＲ３２２は線状プラスミドまたは二本鎖線状ＤＮＡを与え、それを上記光切断試験後に行なった電気泳動分析における標識として用いた。

比較として、本発明の誘導体の代りにメチルビオローゲン、ＭＶ”″、を用いて同一試験を行なった。５ｃＤＮＡのみの溶液、酸素を含む５ｃＤＮＡの溶液、または酸素およびＥＤＴＡを含む５ｃＤＮＡの溶液もまた同一処理（前記条件下の可視光による照射）にかけ対照として役立てた。

得られた結果は第１図に示され（ｓｉｃ）、それは種々の試験における溶液の電気泳動後のゲルの写真であり、以下に注釈される０図■中：Ｉは５ｃＤＮＡを示し、■はカント５ｃＤＮＡを示し、■は線状ＤＮＡを示し、用いた略号は次のものを示す：Ｍ＝標識Ｃ＝対照 ■＝可視光０＝酸素Ａ＝ＥＤＴＡ各バンドの光学濃度の測定は次の形ＤＩ、■および■の比率を％で与えた。

（１）　第１図中のバンド９〜１３により示されるように、ＭＤＡＰ”は用いた条件のもとで可視光による照射下に５ｃＤＮＡを有効に切断し、主に一本鎖の切断によるカット５ｃＤＮＡを、しかしまた反応を続けたときに両値の切断による線状ＤＮＡを与える。

ＭＤＡＰ”の低濃度では生ずる切断が少な−（、カント５ｃＤＮＡ形態への転化は２・１０−’Ｍの濃度でほぼ完全であり、２・１０−’Ｍおよびそれ以下で単にわずかにすぎない。

（２）光が存在しないと５ｃＤＮＡの有意な切断がないことが認められよう。

（３）　凍結−融解による脱気によって酸素を除去すると光切断の効率がわずかに低下する。

（４１Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａの添加は酸素の存在下の反応に影響を与えないが、しかし反応を酸素の存在なく行なうと反応が低下すると思われる。

ｔ５）ｓｃＤＮＡの移動が用いた光切断試薬により若干遅延することが認められ、後者が５ｃＤＮＡ中へ挿入することを示唆する。

Ｂ）ビス−ＭＤＡＰ”による゛（１１同一条件のもとで、ビス−ＭＤＡＰ’°はＭＤＡＰ”よりも一層有効であり、両鎖の多重切断による小ＤＮＡフラグメントを与えると思われる（バンド１４〜１８）。

（２）切断反応は非常に有効であり、光の排除が困難になる。しかし、５ｃＤＮＡの移動がかなり遅延されることを認めることができ、ビス−ＭＤＡＰ”とプラスミドｐＢＲ３２２との強い、おそらく多重の相互作用を示唆する。

（３）反応の効率を考えるといかなる種類の酸素またはＥＤＴＡの効果も認めることができない。

ビス−ＭＤＡＰ’°の効果は低濃度で低下し、切断は１０−５Ｍでなお完全であるが、しかしより低い濃度では単にわずかにすぎない。

これらの試験は同一条件のもとてＭＶ”で切断がないかまたは実質的に切断がない、さらに、光切断試薬が存在しないと反応がない。

他の試験が、ＭＤＡＰ”が種々の基質を可視光による照射下に光酸化することを示したので、いかなる方法によっても任意特定の理論に制限されることなく、切断反応が種ＭＤＡＰ”の励起状態により相互作用の部位における局部的光酸化を経て起ると考えることができる。リボース自体がＭＤＡＰ”を光還元　−することが認められたので、電子供与体はリボースであることができる。

酸素の存在のないＥＤＴＡの遅延効果は外部供与体の酸化が内部供与体の酸化と競争することを示すであろう。

わずかであるが無視できない酸素の除去により生ずる効果は切断反応がまた感光性還元金属錯体によるような反応系を含むことができることを示す。光還元により初めに生じたＤＡＰ”カチオンは次いでＭＶ”自体〔ビオシミ力・工・ビオフイジ力・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ　）、１９７３．　３１４゜３７２〕で起るように酸素と反応して超酸化物を生ずることができよう。

アクリジン型色素であるプロフラビンで前記と同じ条件のもとて他の試験を行ない、プロフラビンがビス−ＭＤＡＰ”に匹敵するＤＮＡ光切断試薬であること、および２・１０−’Ｍの濃度でＤＮＡの線状ＤＮＡを与える示量切断を生ずることが認められた。２・ｌｏ−６〜２・１０１Ｍの範囲内の低濃度で効率が低下する。

プロフラビンによる光切断過程は還元された色素の発生で挿入の部位におけるＤＮＡの光酸化を含むと思われる。アクリジン型色素が基質の酸化とともに光還元されることについて実際によく知られている。

平坦分子であるので本発明の誘導体は挿入薬例えばアクチノマイシン、プレオマイシンなどと同様にＤＮＡまたはＲＮＡ中のヌクレオチドと相互作用する。さらに、ＤＮＡに対する結合が起ると誘導体の螢光が消えることが認められた。従って光切断反応の過程を蛍光により追跡することができる。

−零値ＤＮＡまたは５ｓＤＮＡを用いて他の試験を行ない、以下が報告される。

４・１０−’Ｍまでの範囲の濃度におけるＭＤＡＰ”およびビス−ＭＤＡＰ”の溶液を再蒸留水で調製し、塩酸でｐＨ７゜６に調整した。

環状５ｃＤＮＡおよび環状５ｓＤＮＡをそれぞれプラスミドｐ　Ｂ、Ｒ３２２およびＭｌ　３ｍｐ　１９から得て普通の電気溶離法により精製した。

次のニジアザピレン誘導体ＭＤＡＰ”またはビス−ＭＤＡＰ”５ｓＤＮＡまたは５ｃＤＮＡトリス緩衝液ｐＨ７，６を適量ガラス試験管中で注意深く混合し、５・１０−’Ｍおよび１０−’Ｍのジアザピレン誘導体の濃度を与えた。容管を公知方法を用いて一定圧の酸素下に保ち、可視光（２５０Ｗプロジェクタ−；λ＞３９５ｎｍ）で２時間照射し、管は氷水の浴中で３℃に保持した。

照射後、管を暗所に保ち３℃で貯蔵した。容管から試料をグリセリンと混合し、アガロースゲル〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）　ＩＩ　型ＥＥＯ）上で電気泳動にかけた（１２０Ｖおよび８０ｍＡで６時間）、アガロース・・・（ｓｉｃ）をエチジウムプロミドで染色し、写真にとつた。添付第■図（ｓｉｃ）はこのゲルの写真であり、その上のバンドは行なった種々の試験に相当し、濃度は次に示される。

標識に相当するバンド１〜２０　（ｓｉｃ）並びにバンド２および３はジアザピレン誘導体の存在なく照射した５ｃＤＮＡおよび５ｓＤＮＡを表わし；これらのＤＮＡはそれぞれ酵素ＥｃｏＲ１およびＳ１ヌクレアーゼによる反応により、公知の方法で得られた。

この写真は環状５ｃＤＮＡおよび５ｓＤＮＡが本発明のジアザピレンの存在下に切断されることを示す。

本発明によるプロセスに用いたジアザピレン誘導体が、それらがミセルまたはリポソーム中に組込まれたときでもＤＮＡを光切断する性質を保持することが認められよう、従ってミセルおよびリポソームはジアザピレン誘導体を切断されるＤＮＡに運ぶビヒクルとして使用できる。

長鎖炭化水素基を含むジアザピレン誘導体は、炭化水素基がリポソームまたはミセルに対する良好な付着を可能にするのでこの型の使用に殊に適する。

本発明は次に次の実施例により一層詳細に記載される。

実施例１：Ｎ−メチル＝Ｎ′−ベンジル−２，７−・・・・・・（ｓｉｃ）ジクロリドＤＡＰ　１　ｇ　（，０，００４９−ｒ−ル）をクロロホルム２ｏ−に溶解した０次いで過剰のヨウ化メチル（３ｍ、０．０４８ミリモル）を加えた。得られた反応混合物を室温で２４時間がくはんした。

そのとき黄色固体が沈殿した。この黄色固体を濾過により反応媒質から分離し、クロロホルムで洗浄し、真空で乾燥するとＮ−メチル−２，７−シアザピレンヨージド（ＭＤＡＰ″″　Ｉ−）１．６１ｇ（０，００４７モル）が得られた（収率：９６％）。

一部プロトン付加しているので、この粗生成物を多少アルカリ性の水（ｐＨｘ　７．８０　；水＋微量のＮＨ，ＯＨ）で処理することにより脱プロトンさせた。

次いで粗生成物を沸謄メタノールから再結晶すると黄色結晶が得られた。

この生成物は次の物理化学的特徴を有した：元素分析：　Ｃｌ５Ｈ＋ｒＮｘ　Ｉ　、０．２５Ｈ２０ＭＷ−３５０，７計算値　：　Ｃ５１，３７；　Ｈ３，３１ｉ　Ｎ　７．９９測定値　：　Ｃ５１，３１；　Ｈ３，１９；　Ｎ　８．０５’ ＨＮＭＲスペクトル（溶媒Ｄｔ　Ｏ／　ＣＦ　ｓ　ＣＯＯＤ　；標準ＴＭＰＳ）１０、０５　ｐｐｍ（ｓ）１０、０３　ｐｐｍ（ｓ） δ。：　８．８９ｐｐｍ（Ｊ−９，１９Ｈｚ、　ＡＢ、　ｑ）５、００　ｐｐｍ（ｓ）メチル上に得られた生成物（１ｇ　；　０．００２９モル）を次いで無水アセトニトリル１５０−中に懸濁させ、予め中性ｋｉｔｅｓカラムで濾過した臭化ベンジル（３ｄ、０．０２５ｄ）を加えた。生じた反応混合物をかくはん下に１２時間還流した。

得られた黄色生成物を濾過し、クロロホルムで洗浄し、真空で乾燥した。

収量：　１．１５　ｇ　（０，００２２モル）、すなわち７７％。

得られた粗生成物を水（１００ｍりおよび塩化１ｉ　（Ａｇ　Ｎ　Ｏｓ３ｇおよびＮａＣｊから得られ、水で正しく洗浄した）とともに暗所で２４時間かくはんした。生じた固体を濾過し、熱水で洗浄し、次いで濾液を減圧で濃縮し、アセトン（９０ｄ）で希釈すると黄色沈殿が生じた。この混合物を一夜放置し、沈殿を濾過し、真空で乾燥した。

収量：　０．８１　ｇ　（０，００２１３モル）、７３％。

得られた生成物はＮ−メチル−Ｎ゛−ベンジル−２，７−ジアザピレンジクロリドであり、それは次の物理化学的特徴を有する：元素分析：　ＣｚＪ＋ｓＮｚ　Ｃｊ　ｔ　ＭＷ　＝３８１．３計算値　：　Ｃ６９，２９ｉ　Ｈ４，７２；　Ｎ　７．３５測定値　：　Ｃ６９，０７：　Ｈ４，８９，Ｎ　７．３８ＩＨＮＭＲスペクトル（溶媒：Ｄ、Ｏｉ積標準ＴＭＰＳ）９．９　８　ｐｐｍ（ｓ）９．８　８　ｐｐｍ（ｓ）８．６７５ｐｐｍ（ＡＢ　ｑ　）７、４１　ｐｐｍ（ｍ−ベンジル）６．２　４　ｐｐｍ（ｓ）４、８１　ｐｐｍ（ｓ、メチル）実施例２ニジアザピレン誘導体、ビス−〇ＡＰ”（式ＩＩ　：　Ｒ＝Ｒ’　−ＣＨ３ ■＝　ＣＨｚ　Ｃｂ　Ｈａ　ＣＨｚ　Ｃｈ　Ｈａ　ＣＨｚ）−の製造４．４−ビス（ブロモメチル）ジフェニルメタン（０，１７４ｇ）を２，７−ジアザピレン（０，２ｇ）と無水アセトニトリル（１５Ｔａ１）中でかくはんしながら還流下に４時間反応させた。

生じた黄色沈殿を濾過により分離し、クロロホルムで洗浄し、真空で乾燥した。

収量：０．３４ｇ；８５％粗生成物を熱水から再結晶し、分析した。生成物は式：を有し、それは次の物理化学的特徴を有する：元素分析：　Ｃ４５ｌｌｉｏＮａＢｒｚ　Ｈ３Ｈｔｏ　ＭＷ　＝８１６．６計算値　：　Ｃ６３，２４Ｈ４，４４Ｎ　６．８６測定値　：　Ｃ６３，１７Ｈ４，２５Ｎ　６．６５’ＨＮＭＲスペクトル（溶媒：　Ｄ、Ｏ／ＣＦ、Ｃ００Ｄ標準ＴＭＰＳ）１０、０９　ｐｐｍ（ｓ）１０、　ＯＯｐｐｍ（ｓ） δｏ　＝　８．８　１ｐｐｍ（Ｊ　−９，３７Ｈｚ、ＡＢ　−ｑ）δｏ　＝　７．９１ｐｐｍ（Ｊ　＝７．６１Ｈｚ、　ＡＢ　−ｑ）６．２９ｐｐ■（ｓ）３．９８ｐｐ■（ｓ）生成物（０，３ｇ）をアセトニトリル５０ｗ１ｌおよびヨウ化メチル０．５−中に懸濁させ、かくはん下に４時間還流するとアセトニトリル不溶性の褐赤色固体が得られた。この固体を濾過し、クロロホルムで洗浄し、真空中で乾燥した。

収量：０．３７ｇ；９０％次いで、生じたジ塩（ヨーシト／プロミド）を塩化銀とともに水中に懸濁させ、室温で２４時間かくはんすることによりイオン交換を行なった。生じた固体を濾過により分離し、熱水で洗浄した。粗生成物（黄色固体、水中に非常に可溶性）をメタノールまたはメタノール／エーテル混合物から数回再結晶した。

他の操作に従って、上式の生成物と臭化メチルとを４０〜５０℃で密封フラスコ中で２〜３日間混合することによりメチル化段階を行なうことができる。これは水溶性黄色生成物を与える。

どの場合にも得られた生成物は次の物理化学的（ｓｉｃ）特徴を有した：元素分析：　ＣａＪｘＪａ　Ｃｌ　、・９ＨｚＯＭＷ＝９３７計算値　：　Ｃ５７，７０Ｂ　５．８１　Ｎ　５．９８測定値　：　Ｃ５７，８０Ｈ５，０４Ｎ　５．８６１ＨＮＭＲスペクトル（溶媒：Ｄ、Ｏ；標準ＴＭＰＳ）１０、１５　ｐｐｍ（ｓ）１０、０９　ｐｐｓｉ（ｓ）８．８７ｐｐｍ（ＡＢ　−ｑ；　Ｊ　＝９．４７Ｈｚ）７．５５ｐｐｍ＋（ＡＢ　−ｑ；　Ｊ＝８．１８Ｈｚ）６、３　９　ｐｐｓｉ（ｓ）５、２０　ｐｐｍ（ｓ）メチル４．１　３　ｐｐｍ（ｓ）実施例３：ビス−ＤＡＰ”誘導体または　−ＣＨｚ　−Ｃ４Ｈ６−０−ＣｈＨａ−ＣＨｚ−）の製造実施例２に記載の操作に従い４．４′−ビス（ブロモメチル）ジフェニルメタンの代りに２．２’−（４，４’−ビス（ブロモメチル）ジフェニル〕プロパン（ｓｉｃ）および４．４′−ビス（ブロモメチル）ジフェニルエーテルを用いるとそれぞれ：次のＮＭＲスペクトル：１　０．２　８ｐｐｍ（ｓ）　；　１　０．２　１ｐｐｍ（ｓ）　；　９．０　０ｐｐｍ（ｑ−ＡＢ）；７．７　ｐｐｍ（ｑ−ＡＢ）；　６．５　２ｐｐｍ（ｓ）；　５．１　４　ｐｐｍ（ｓ）；　２．３　９ｐｐｍ（ｓ）を有する式：の化合物、および次のＮＭＲスペクトル：１０．２７ｐｐｍ　（ｓ）；１０．１８ｐｐｍ　（ｓ）：８．９７ｐｐｍ（ｑ−Ａ［ｌ）；７．８２ｐｐｏ＋　（ｄ）；７．３４ｐｐｍ　（ｄ）　；６．５１ｐｐ１１１（ｓ）；５、１０　ｐｐｍ　（Ｓ）を有する式：％式％の化合物が得られた。

実施例４　：　２．　４−ジニトロフェニル−２，７−ジアザピレニウムシラート（合成中間体）の製造２．４−ジニトロフェニルトシラート〔トシルクロリドと２．４−ジニトロフェニル（ｓｉｃ）との反応により製造１０．８１ｇ（２，４・１０−ｓモル）および２．７−ジアザピレン０．４９　ｇ（４・１０−’モル）をクロロホルムとアセトニトリルとの混合物（５０１５０ｖ／ｖ）中で還流した。

生じた黄色沈殿を總過し、メタノール中に再溶解し、生じた新沈殿を過剰のエーテル中で洗浄した。得られた黄色沈殿を次いで真空で乾燥した。

収１０．９６ｇ、７３％融点：２５２〜２５４℃（分解）この生成物の元素分析は次のとおりであった：計算値　：　Ｃ５９，７８Ｉ＋　３．３４　Ｎ　１０．３３測定値　：　Ｃ５９，８２１１３，１０Ｎ　１０．４１’　ＨＮ　Ｍ　Ｒｘ　ベクトル（溶媒Ｄ２ｏ；標＃；ＴＭＰＳ）１０．２８５　ｐｐｍ（ｓ）９、９７５　ｐｐｍ（ｓ）９、４　ｐｐｍ（ｓ）９．０ｐｐｍ（ｄ、ｄ　Ｊ＝０．０５　ｐ）８、９０ｐｐｍ（ｄ、　Ｊ＝０．０５　ｐ）８、６７５ｐｐｍ＜ｄ　Ｊ　＝０．０５　ｐ）８、５ｐｐｍ（ｄ　Ｊ　＝０．０５　ｐ）７．５７５ｆｌｐｍ（ｄ　Ｊ　＝０．０４　ｉ　ｐ）実施例５：式Ｉのジアザピレン誘導体（Ｒ＝ＨおよびＲ’　−−（ＣＨ，）　２−ＮＨ，）（７）製造プロセスＣの操作に従い、１アミン基をカルボベンゾキシ基、Ｃ，Ｈ，−ＣＨ２−０−ＣＯ−１により保護した式、Ｈ，Ｎ−（ＣＨ，）、ＮＨ，のアミンを用いた。

ＤＡＰ＋−ＤＮＰ　Ｔｓ−０，４４ｇを無水メタノール４０ｍ（！に溶解し、得られた溶液を滴下漏斗に入れた。

アミンは別に相当するアンモニウム塩から製造し、無水メタノール２Ｍ中にかくはんして溶解した（１．６・１０−’モル）。

次いでコリジン数滴を反応混合物に連続かくはん下に加えた。

次いでＤＡＰ”−ＤＮＰＴｓ−を１時間にわたり滴加した。溶液は濃赤色から褐色に変った。かくはんをさらに１時間続け、その後溶媒をブフナー漏斗で除去した。次いで無水エーテル３００ｄを加えると多少褐色の沈殿が生じた。溶液をさらに１時間３０分かくはんし、濾過した。得られた固体をデシケータ−中で一夜乾燥した（ｓｉｃ）。

収量：０．４１ｇ；９４％。

得られた化合物は次の物理化学的特徴を有する：元素分析：　ＭＷ＝５３７計算値　：　Ｃ６４，５３Ｈ５，９４Ｎ　７．５１測定値　：　ｃ　６４．５８　Ｈ５，００Ｎ　７．３２ＮＭＲ（ｐｐｍ）　９．８７（ｓ）；８．５３（ｄ）；８．７７（ｄ）；９．９２（ｓ）；５、１９　（ｔ）；３．９８　（ｔ）；６．６　（ｓ）；４．８　（ｓ）；７．１　（ｓ）；７．２　（ｄ）；７、７　（ｄ）；　２．０７　（ｓ）次いで得られた生成物を、酢酸と臭化水素酸との混合物と室温で反応させることによりアミン基を脱保護した。

得られた生成物は弐′″ＤＡＰ″″−（ＣＨｘ）ｚ　ＮＨ３”　・３Ｂｒ−に相当し、次の元素分析値を有する：計算値　：　Ｃ３９，１９Ｈ３，２８Ｎ　８．５７測定値　：　３４．１１　Ｈ３，２２７，４３この生成物のＮＭＲスペクトル（Ｄｉ　Ｏ，ＴＭＰＳ）は９．９３ｐｐｍ　、８．８０ｐｐｍ　、　８．８６ｐｐｍ　、　１０．０９ｐｐｍ　、　５．５６ｐｐ−および４．００ｐｐｍにピークを示した。予期生成物は、塩基と生じた生成物とを反応させることにより得られる。

実施例６：Ｎ−メチル−Ｎ′−ヒドロキシペンチル−２，７−ジアザビレニウムプロミド（式１：Ｒ＝ＣＨ３、Ｒ（ｓｉｃ）−−（ＣＨｚ）ｓ−ＯＨ）の製造５−アミノペンタン−１−オールを無水メタノールに溶解し、アルゴン下、無水条件のもとて乾燥１００ｄ容器中へ入れた。

より５−アミノペンタン−１−オールの溶液に２０℃でかくはん下に滴下した。

赤色、次いで暗赤色（ｓｉｃ）の溶液が得られる。

か（はんをさらに２時間続け、次いでメタノールを真空で除きほとんど乾固させた０次いでエーテル２５０ｗｄを残留物に加えると褐色沈殿が生じ、これを濾過により分離し、メタノールに吸収させ、乾燥した。

ＣＨＣｊ！　＊　／　ＣＨ３０Ｈ混合物（５％／９５％）を溶離剤として用いたシリカゲル上の薄層クロマトグラフィーに単一スポットが認められた。

収量：　７２％−融点２５０℃以上ＮＭＲＤｚ　Ｏ／ＴＭＰＳ　： δ＝９．６５ｓ δ＝３．６７ｔ δ−２，３２ｐ δ＝ｔ、５ｏｐｐ実施例７：式■の誘導体ＤＡＰ　２５ｅ＋ｇ　（１，２２・１０−’モル）を冷コリジン５ｙｄに溶解した。この溶液に次のニドシルアシリジン４８．２鵬ｇ（２，４４・１ｏ−４モル）およびコリジニウムクロリド３８．４＋＋ｇ　（２，４４・１ｏ−４モル）を直読で加えた。

全混合物をかくはん下に２時間にわたり２０℃から１００℃に加熱した。溶液は暗褐色から暗黄色に変化し、デカントし、次いで５０℃に加熱するこ２により蒸発乾固した。

得られた生成物はシリカゲル上の薄層クロマトグラフィー（メタノール／ＣＨ，ＣＩ、２％７９８％で溶離）に単一スポットを与えた。

収量＝４８％生成物のＮＭＲスペクトルは次のとおりである：実施例８：式■のジアザピレン誘導体（Ｒ＝Ｒ’＝Ｒ，Ｙ−）の製造ＤＡＰ２５ｍｇを無水アセトン（１ｄ）に部分溶解し、還流温度に加熱し、プロパンスルトン（４５ｍｇ）を加え、混合物を一夜還流下にかくはんした。

得られた生成物はシリカゲル上の薄層クロマトグラフィー（溶離剤：メタノール／ＣＨｓ　Ｃｊ！ｓ　（ｓｉｃ）１０％／９０％）に単一スポットを与えた。アセトンを減圧下（こ除去した。

ＣＦ、Ｃｏ２−　Ｄ”中のＮＭＲスペクトルは次のピークを与実施例９：式Ｉのジアザピレン誘導体この誘導体は前記プロセスＣにより製造される。

（ａ）　ＩＩＪｓ　ＮＨ＋Ｃ＋５ＨｓＪｒ−一一一〉Ｃ＋５Ｈｉｔ　Ｎ　（ＣＨ３）！プロミドＣ＋＊ＨｓＪｒ１．６のエタノール１０ｄ中の溶液をアミン（ＣＨｓ）ｚ　ＮＨのメタノール中の３３％溶液１０−と還流下に反応させると第四級アミンＣ＋ａＨｓｙＮ　（ＣＨｓ）ｚｌ、　４２　ｇが得られた。

生じた反応混合物を真空で乾固した後、アミンをＣＨｃｌ。

および塩基性水（ＬｉＯＨを含む）で抽出することにより精製した。ＣＨＣ１Ｓ百分を濾過し、乾燥した。

得られたアミン１．４ｇを次いでジブロミドＢｒ−（ＣＨｚ）　５−Ｂｒ４Ｍ１およびエタノール１０−と反応させ、反応混合物を２０時間還流した。次いで溶媒を除去し、残留物をＣＨＣ１，５−に溶解した。得られた溶液を、沈殿が生ずるまでエーテル中へ江刺した。生じたピンク色沈殿を濾過し、乾燥すると生成物１．８ｇが得られ、それを酢酸エチル４０ｗｌ１から再結晶させた。これは予期プロミドの結晶１．５ｇ（収率９８％）を与え、次の’ＨＮＭＲスペクトルを有する：δ（ｐｐ＋＊　）＝　０．８７５　（ｔ）；　１．２５（ｓ）：　１．４５（ｔ）：　２．３９（ｐ）；３、　ＯＯ（ｐ）　；　３．３９（ｐ）　：　３．４５（ｔ）　；　３．５８（ｔ）　；　３．８０（ｔ）と反応させ、混合物を１１０℃で４時間３０分加熱した。溶媒を除去し、残留物を常法により分離した。

得られたアミンの’ＩＩＮＭＲスペクトルは次のとおりである： δ（ｐｐｍ　）：０．７８（Ｌ）　；１．１５（ｓ）　；　１．２５（ｍ）　；１．　Ｇ　（ｔ）　；１．６１（Ｌ）　；１、８　（ｍ）　；２．５５（ｔ）　；　２．７２（ｔ）　；３．００　（ｓ）　；３．１５（Ｌ）　；３．４０（＋ａ）Ｂ０発明の化合物の製造プロセスＣの方法に従い、ＤＡＰ”　−ＤＮＡ　Ｔｓ−４３，５＋ｏｇ（＆０５・１０−５モル）をメタノール１５ｒｎ１に溶解し、得られた溶液をアミン（３９，５ｍｇ；８．０５　・ｔｏ−’モル）のメタノール６ｄ中の溶液に滴加した。緩慢な添加に２時間を要し、次いで窒素下に４時間３０分か（はんし、その後溶媒を除去した。

次いでエーテルを加えると沈殿が生じ、それを常法により分離し、精製した。

得られた生成物１８．６ｍｇ（２，２・１０−’モル）を次いでヨウ化メチル（３μｆ；２．２・１０−４モル）とＤＭＦ中で７０℃で１５時間反応させた。得られた生成物をイオン交換カラム（Ｃｊ！−）に通すと式：の化合物が得られ、それは７８７の分子量を有し、そのＮＭＲスペクトルは次の特徴を有する： δ−０，７８ｔ　δ寓３．００ｓ　δ−１０，４４ｇδ＝１．１５ｓ　δ＝３．２４ｓ　δ−１０，５２ｇδ＝１．２５■　δ＝３．４０醜 δ＝１．６ｔ　６＝５．０５ｓ δ−１，Ｅｌｓ　δ−５，４５ｔ δ＝２．５５ｔ　δ＝９．０９ＡＢ系 δ＝２．７２ｔ　δ＝１０．２６ｓ実施例１０：式■のジアザピレン誘導体この誘導体はまた前記プロセスＢにより製造され、ＤＡＰ”　−ＤＮＡ　Ｔｓ−を式：のアミンと反応させる。

アミン１．５ｇをＣＩｌ、ＣＮ　２０ｍ１ｌ！中で８０℃に加熱し、ホルムアルデヒド１．１ｍＪ！を加え、溶液を冷却する。次いでＮａＣＮＢＨ−０，１９ｇを加え、その後氷酢酸１ｄを除々に１０分間にわｔこって加える。溶液を次に２時間かくはんし、次いでさらに氷酢酸２ｄを４時間にわたって加える。得られた溶液をエーテルに江刺し、Ｉ　Ｍ−ＮａＯＨ２０ｍｌ、で３回、およびブライン２０ｄで１回抽出する。エーテル相をに、ＣＯ３上で乾燥し、濾過し、溶媒を除去した。予期生成物１．３９　ｇが得られた。

次のものを還流下に１４日間かくはんした：ＣＨ２（Ｊ！２３ｍｊｊ中の第四級アミン（（ａ）で得られた）２００ｍｇ、ジブロミド［ｌｒ　−（ＣＨ２）３− 　［１ｒ　１＋ｎｊ！およびＫｉ　（ｓｉｃ　）１結晶。

次いで溶媒を除去すると予期生成物２７４ｍｇが得られた（収率１００％）。

実施例９（Ｃ）に記載した操作に従い、次の’ＨＮＭＲスペクトルにより確認された生成物が得られた：δ（ｐｐｍ　）　：　０．８３（ｔ）；　１．２０（Ｓ）；　１．６７（ｔ）；　１．９２（ｐ）；２．６９（Ｕ　；　２．８５（ｔ）；　３．２Ｈｔ）；　３．３１（ｔ）；および３．５７（ｔ）Ｂ６発明の化合物の製造実施例９Ｂの操作を繰返し、連続して次のものを得た：（１）次の’ＨＮＭＲスペクトル： δ（ｐｐｍ　）：　０．９４（ｔ）；　１．３３（ｓ）；　１．５９（ｐ）：　２．２９（ｓ）：２．７８（ｐ）；　３．ＩＨｓ）：　３．２０（ｔ）；　５．３５（ｔ）；　７．１４（ｄ）および７．６１　（ｄ）　（ＡＢ系）；８．６３ｄおよび８．７６ｄ（ＡＢ系）；９、８４　（ｓ）および１０．１１　（ｓ）を有する式：％式％）：により確認される式：実施例１１：式ｍ　（ｐ＝８）の大環状化合物の製造２溶液を調製した。

溶液Ｉ：ナフタレン−１，４，５，８−テトラカルボン酸無水物２．’１５　ｇ　（０，００８モル）を熱ＤＭＦ＜５０〜６０ｔ）３００ｒｎＩ！に溶解し、溶液を濾過した。

溶液ｎ：１．８−ジアミノオクタン１．１５ｇ（０，００８モル）を熱ＤＭＦ（５０〜６０℃）２００ｍｆに溶解し、次いでＣＨ，Ｃ００Ｈ３０ｒｎｌを加え、溶液を濾過しｔコ。

ＤＭＦ２５０ｍｆを三ロフラスコに入れ、油浴（１１０〜１２０℃）中で加熱した。溶液Ｉおよび■を同時に３〜４時間にわたってＤＭＦに加えた。淡褐色沈殿が添加中に生じた。

２溶液の添加後、反応混合物をさらに１時間加熱し、溶媒を減圧で蒸発させた。

得られた固体をＣＨＣ＃、　２０　Ｏｍｆ中に懸濁させ、懸濁液を１５分間還流し、濾過した。この操作を引続き３回行なった。

所望粗生成はＣＨＣｌ、に不溶性であったものである。

補集した濾液をＮａＣ０−の１０％水溶液１００ｍ１およびブラインＩＯＭで洗浄し、Ｎａ２５Ｏａ上で乾燥した。

全有機相をシリカカラム上に通しＣｌ−１２ｃｚ、で溶離した。副生物で汚染された予期生成物は帯黄ピンク色スポットの形態で移動した。

得られた生成物をＣＨ２Ｃｌ２２５ｍｌ中に懸濁させ、懸濁液を還流温度に加熱し、冷却し、濾過した。予期生成物はＣＨ，Ｃ１２にほんの少し溶性である。事実上純粋な生成物０．３ｇが、シリカゲル上のＣＨＣ１３／ＣＨ，ＯＨ混合物（９９／１）を溶離剤としだ薄層クロマトグラフィーにより得られた（収率：１０％）。

得られた化合物（イミド）は熱ニトロベンゼンから結晶化することができる。それは次の物理化学的特徴を有する：元素分析：　ＣａａＨａ。Ｎ４０．　肚＝７５２．８計算値　：　Ｃ７０，２０Ｈ５，３６Ｎ　７．４４測定値　：　Ｃ７０，２９Ｈ５，１９Ｎ　７．４０’ＨＮＭＲスペクトル（溶媒Ｓ　ＣＤ　Ｃ１Ｍ＞ δ　（ｐｐｍ）　：　８．５３（ｓ、Ａｒ）：　４．１６（ｔｒ；　ＮＣＨｚ− ；Ｊ＝６．３１Ｈｚ）；１、６５　（ｍ）および１．５６（ｓ）Ａｎ　ＣＩ！、、　０．２６　ｇ　（０，００２モル）を無水ＴＨＦ　ｌ　５ａｄに溶解し、Ｌｉ　Ａｊ２　Ｈａ　０．２１８　ｇ　（０，００５８モル）を加えた。混合物をかくはんし、還流温度に加熱し、次いで先に得られたイミド（０，３ｇ　；　０．０００４モル）を数部分で加えた。生じた混合物を５時間還流し、次いで冷却した。過剰のＬｉＡＺＨｎをＴＨＦ／Ｈ，Ｏ（１：　１）の添加により分解し、固体を濾過し、ＴＨＦ１５ａｄに懸濁させ、懸濁液を１０分間還流し、濾過した。この抽出を３回繰返した。

捕集した有機濾液を減圧で蒸発させ、粗生成物を乾燥した。

次いで粗生成物をＣＨｚＣｌｚ　１２０ｍｌに溶解し、溶液を濾過し、溶媒を蒸発させ、それにより無機化合物を除去した。生じた生成物を真空で乾燥した。

化合物（帯黄縁ゲルの形態にある）を、さらに精製することなく次の段階（ＮＢＳによる芳香族化）に用いることができる。

この化合物は次の操作によりその塩酸塩の形態で精製した：粗生成物、すなわち式■のアミン、をエタノールｌＯ−およびｐＨ１までの３７％水性塩酸に溶解し、次いで溶媒を減圧で蒸発させた。生成物（帯温赤色油状混合物）を小容積の水に溶解させ、アセトン２００−の添加により沈殿させた。沈殿を濾過し、ＣＨｓ　ＯＨ／Ｈｚ　ＯまたはＣＨ３０Ｈ／ＴＨＦ混合物から再結晶するとアミンがその塩酸塩の形態で０．１５　ｇ得られた（収率４８％）。

元素分析：　ＣａａＨｓｈＮａ　・４ＨＣＩ　ＭＷ　”７８６．８計算値　：　Ｃ６４，２２Ｈ７，８４Ｎ　６．８１測定値　：　Ｃ６４，５０Ｈ７，９２Ｎ　６．２７’ＨＮＭＲスペクトル（遊離塩基、ＣＤ　Ｃ１１ｓ　）　：δ（ｐｐｍ　）：　７．０４（ｓ　、８Ｈ，Ａｒ）；　４．００（ｓ　、１６Ｈ，ＮＣＨｚＡｒ）；２．４７　（Ｔｒ、８）１．ＮＣＨｚ−（ＣＨｚ）−（ｓｉｃ））；　１．６および１．２（ｍ、２４Ｈ，−脂肪族鎖）ＩＨＮＭＲスペクトル（塩酸塩、Ｄ、Ｏ）：δ（ｐｐｍ）ニア、５０（ｓ　、Ａｒ）；　３．１（ブロード）；１．８（ブロード）；１．２（ブロード）；約４．８　ｐｐｍに溶媒ピーク。

質量スペクトルｍ／ｅ＝６４０（遊離塩基に対し）。

先に得られたアミンを熱ＣＨｚ　Ｃ０ＯＨ（約５０℃）８０１Ｒ１に溶解し、溶液を濾過し、次いで還流温度に加熱した。

ＮＢＳ　０．９３ｇ　（０，００５３モル）を加えた。帯赤褐色固体が直ちに沈殿した。

混合物を３０分間還流し、溶媒を減圧で蒸発させた。得られた粗生成物（褐色油状物質）を多量の水（約２４）と混合し、混合物を約８０℃で３０分間加熱し、濾過した。濾液（淡橙色溶液）をアンバーライト（Ａｍｂｅｒｉｔｅ）　Ｄ　Ｃ５０Ｈカラム（酸型）に通し、カラムを水で十分に洗浄した。

所望生成物を水性塩酸（１０％、次いで２０％、最後に３８％）でカラムから除去し、減圧で蒸発させた０次いで少量の水に溶解し、アセトンの添加により沈殿させ、濾過し、真空で乾燥した。

収量：０．１１ｇ−すなわちイミド基準２６％元素分析：　Ｃａ４ＨａｓＮａ　ＣＪ　４　ＭＷ　＝７７４．７’ＨＮＭＲ７，ベクトル（Ｄ、Ｏ）： δ（ｐｐｍ　）：　１０．０９（ｓ　、Ａｒ）；　８．８１（ｓ　、Ａｒ）；２．４（ブロード、脂肪族鎖）；１．５（ブロード、脂肪族鎖）。

手続補正書（方式）特許庁長官　吉　１）文　毅　殿１、事件の表示　ＰＣＴ／ＦＲ８７１０Ｏ１４２３、補正をする者事件との関係　出願人名称　コムパニー　オーリス　アンデュストリエ５、補正命令の日付　昭和６３年９月２７日６、補正の対象　（１）明細書及び請求の範囲の翻訳文（２）法人国籍証明書国際調査報告国際調査報告ＰＪｎｉＥＸ　Ｔｏ　’ｈｒ：Ｅ　ＩＮＴＥＲＮＡτｌ０ＮＡＬ　５ＥＡＲＣ！！　ＲＥ：’ＯＲＴ　０ＮＩＮＴＥＲ）ＪＡτ工０ＮＡＬ　ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮ　Ｎｏ、　ＰＣτ／ｌ　８７１００１４２　（ＳＡ　１７００４）

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸をジアザピレン誘導体の溶液に接触させ、生じた反応混合物を可視光の照射にかけることからなる核酸を光切断する方法であって、前記ジアザピレン誘導体が、（１）式Ｉの化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中、ＲおよびＲ′は同一であるかまたは異なり、水素、あるいは１個またはそれ以上のヘテロ原子例えば酸素、硫黄または窒素により適宜中断されることができる直線形または枝分れ、飽和または不飽和脂肪族炭化水素基であって、また炭化水素基に対し適宜ヒドロキシル、アミノまたはチオ基により、アリール基によりあるいは複素環基により置換されることができる脂肪族炭化水素基を表わすか、あるいはＲおよびＲ′が同一であり、式Ｒ１Ｙ−（式中、Ｒ１は基−（ＣＨ２）３−であり、Ｙ−はスルホナトイオンＳＯ３−である）の基、または式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の基を表し、Ｘ−はアニオンであるかまたは、置換基ＲおよびＲ′の少くとも１つが式、Ｒ１Ｙ−のものであれば存在せず、その場合に誘導体は分子内塩である〕（２）式ＩＩの化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）〔式中、Ｒ、Ｒ′およびＸは前記のとおりであり、■は１個またはそれ以上のヘテロ原子により適宜中断されることができ、および（または）１個またはそれ以上の二価芳香族または複素環基により適宜中断されることができる飽和または不飽和、直線形または枝分れ炭化水素鎖を表わす二価基である〕および（３）式ＩＩＩの化合物： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩＩ）（式中、ｐは１〜１５の整数であり、好ましくは８に等しい）から選ばれる方法。２．核酸がＤＮＡまたはＲＮＡである、請求の範囲第１項記載の方法。３．新規生成物の、式ＩまたはＩＩ： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔式中、ＲおよびＲ′は同一であるかまたは異なり、水素、あるいは１個またはそれ以上のヘテロ原子例えば酸素、硫黄または窒素により適宜中断されることができる直線形または枝分れ、飽和または不飽和脂肪族炭化水素基であって、また炭化水素基に対し適宜ヒドロキシル、アミノまたはチオ基により、アリール基によりあるいは複素環基により置換されることができる脂肪族炭化水素基を表わすか、あるいは、ＲおよびＲ′が同一であり、式、Ｒ１Ｙ−（式中、Ｒ１は基−（ＣＨ２）３−であり、Ｙ−はスルホナトイオンＳＯ３−である）の基、または式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の基を表わし、Ｘ−はアニオンであるかまたは、置換基ＲおよびＲ′の少くとも１つが式、Ｒ１Ｙ−のものであれば存在せず、その場合に誘導体は分子内塩である、ただし、ＲおよびＲ′は同時には水素またはメチル基でない〕 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）〔式中、Ｒ、Ｒ′およびＸは前記のとおりであり、■は１個またはそれ以上のヘテロ原子により適宜中断されることができ、および（または）１個またはそれ以上の二価芳香族または複素環基により適宜中断されることができる飽和または不飽和、直線形または枝分れ炭化水素鎖を表わす二価基である〕の１つに相当するジアザピレン誘導体。４．式Ｉに相当し、Ｒが低級アルキル基例えばメチル基であり、Ｒ′がチオ、ヒドロキシルまたはアミノ基により置換されたアルキル基、すなわち式−（ＣＨ２）ｎ−ＳＨ、−（ＣＨ２）ｎ−ＯＨまたは−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（式中、ｎは１〜１０である）の基である、請求の範囲第３項記載の誘導体。５．ＲおよびＲ′が低級アルキル基例えばメチルであり、■が式：（ＩＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼；（ＩＶ）▲数式、化学式、表等があります▼；または（Ｖ）▲数式、化学式、表等があります▼の二価基から選ばれる、請求の範囲第３項記載の誘導体。６．Ｎ−メチル−Ｎ′−ベンジル−２，７−ジアザビレニウムジクロリドである、請求の範囲第３項記載の誘導体。７．Ｒ＝Ｒ′＝ＣＨ３であり、 ■＝−ＣＨ２−Ｃ４Ｈ４−ＣＨ２−Ｃ４Ｈ４−ＣＨ２−である式ＩＩのテトラクロリドである、請求の範囲第３項または第５項記載の誘導体。８．新規中間体、２−ジニトロフェニル−２，７−ジアザビレニウム（ｓｉｃ）塩。９．式： ▲数式、化学式、表等があります▼ の２−ジニトロフェニル−２，７−ジアザビレニウム（ｓｉｃ）トシラートである、請求の範囲第８項記載の中間体。